一、人脑胶质细胞瘤分化相关基因GDR1全长cDNA的克隆和鉴定（论文文献综述）
孙广卫[1]（2018）在《MicroRNA-17对胶质瘤细胞生物学特性的影响及机制研究》文中指出胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤之一,胶质瘤很少可治愈,高级别患者预后较差,尤其是老年患者。恶性胶质瘤患者1年死亡率为50%,2年死亡率为25%。其中,多形性胶质母细胞瘤的预后较差,平均生存时间在诊断后1年以内。目前,胶质瘤的研究热点是寻找新的有效治疗靶点及有价值的生物诊断标记物,以提高胶质瘤的诊断及治疗效果。微小RNA（microRNAs,miRNA）是一类长度约19-22核苷酸的RNA,通过与靶基因mRNA的3’-UTR非编码区互补匹配来调控基因转录后表达。这种相互作用导致翻译阻遏,多数情况下降低mRNA的表达水平。研究表明,多种miRNA在人肿瘤中表达下调或上调,包括胶质瘤,为肿瘤发生提供了新的分子基础。miR-17在肿瘤发生中起重要作用,然而其在胶质瘤中的作用尚未明确。本研究的主要目的是阐明miR-17在胶质瘤发生发展中的作用,为深入理解胶质瘤发病的潜在分子机制和开发新的有效分子治疗靶点提供实验基础。本研究分为三个部分,主要研究方法和结果如下:第一部分 MicroRNA-17在人脑胶质瘤中的表达研究目的:研究miR-17在脑胶质瘤组织及正常脑组织中的表达情况,及其与肿瘤恶性程度之间的关系。方法:采用RT-PCR法检测脑胶质瘤及正常脑组织中miR-17的表达量。结果:检测脑胶质瘤组织中miR-17的表达量明显高于正常脑组织的表达量;miR-17在高级别胶质瘤中的表达量显着高于其在低级别胶质瘤中的表达量,差异具有统计学意义（P<0.01）。结论:miR-17的表达随着胶质瘤级别的升高而升高,可能是胶质瘤发生发展过程中的潜在致癌基因。第二部分 MicroRNA-17对胶质瘤细胞系生物学特性的影响目的:研究miR-17对胶质瘤细胞增殖、侵袭、凋亡和体内生长的影响。方法:采用RT-PCR法检测miR-17在胶质瘤细胞系和正常星形胶质细胞的表达水平。利用细胞转染、MTT、Transwell、流式细胞术和体内成瘤的方法检测miR-17过表达/沉默对脑胶质瘤细胞的增殖、侵袭、凋亡和体内成瘤能力的影响。结果:miR-17在胶质瘤细胞系中的表达显着高于其在正常星形胶质细胞中的表达量。将miR-17 mimic/inhibitor转染U251后,miR-17表达量分别明显升高或下降。miR-17过表达后,U251细胞的增殖、侵袭和体内生长能力均明显升高,而凋亡细胞则明显减少;而miR-17沉默则明显抑制U251细胞的增殖、侵袭和体内生长能力,促进细胞凋亡。结论:过表达miR-17可促进胶质瘤细胞的增殖、侵袭和体内生长。第三部分 MicroRNA-17通过靶向CCND1调控胶质瘤细胞的增殖和侵袭目的:筛选miR-17在胶质瘤细胞中的靶向调控基因,探索miR-17在胶质瘤中起促癌作用可能的分子机制。方法:利用Western blot、荧光素酶活性分析、MTT、Transwell、流式细胞术等方法,检测miR-17对靶基因CCND1的调控作用,及沉默CCND1表达后胶质瘤细胞的增殖、侵袭能力和凋亡的影响。结果:通过3个生物信息学软件,我们预测CCND1的基因3’UTR区域存在一个潜在的miR-17结合位点。过表达miR-17导致U251细胞中CCND1的蛋白水平增加。促进miR-17增强了携带野生型3’-UTR的荧光素酶活性。CCND1的内源性缺失抑制了miR-17模拟物的促进细胞增殖和侵袭作用。结论:CCND1是miR-17的靶基因,miR-17的上调在胶质瘤的发生发展过程中起着重要的作用。
王云[2]（2013）在《重组人IL-24对胶质瘤干细胞增殖、分化的影响》文中研究说明胶质瘤是人类最常见的颅脑肿瘤，传统的治疗方法包括手术、放疗和化疗，治疗效果有限。研究发现脑肿瘤干细胞（brain tumor stem cell，BTSC）的存在是胶质瘤复发、转移的主要原因，以BTSC为治疗靶细胞，尤其是诱导BTSC的分化治疗为胶质瘤治疗提供了新途径。白介素-24（Interleukin-24，IL-24）是近年发现的、具有细胞因子样特性的肿瘤抑制基因，具有抑制肿瘤生长、诱导细胞凋亡的广谱抗肿瘤活性。最近研究发现IL-24在造血系统恶性肿瘤中能够诱导肿瘤细胞向成熟单核-巨噬系分化。IL-24对肿瘤干细胞的增殖和分化的影响尚未见报道。因此，本课题拟研究IL-24对BTSC增殖和分化的作用，本研究分以下三部分阐述：第一部分IL-24表达质粒的构建及重组蛋白的表达、纯化目的：构建白介素-24（Interleukin-24，IL-24）的原核表达质粒pET28a-IL24，利用其转化BL21（DE3）菌株，表达重组蛋白IL-24，通过鉴定、纯化、复性获得重组蛋白IL-24。方法：利用分子生物学技术，将IL-24的cDNA插入到表达质粒pET28a（+），通过酶切、测序鉴定重组载体。鉴定正确重组质粒转化菌株BL21（DE3）进行蛋白表达，SDS-PAGE电泳和Western Blotting鉴定，确定目的蛋白的表达。通过重组工程菌的诱导培养，获得重组蛋白IL-24包涵体。洗涤后利用目的蛋白携带的6×His纯化标签，采用镍离子亲合层析纯化蛋白IL-24。通过透析复性使目的蛋白正确折叠。结果：成功构建IL-24表达质粒pET28a-IL24，DNA测序结果显示，IL-24序列与Genebank（NCBI Reference Sequence: NG029565.1）序列完全吻合。重组表达质粒pET28a-IL24转化表达菌株后，经诱导培养，收获菌体总蛋白经SDS-PAGE电泳并考马斯亮蓝染色后，分析表达目的蛋白IL-24约占菌体总蛋白的36.47%，且目的蛋白的表达形式主要为包涵体。洗涤溶解后采用镍离子亲合层析得到纯度为90%以上的重组人IL-24（Recombinant Human Interleukin-24，rhIL-24）。复性的rhIL-24蛋白冷冻抽干后-20℃保存。结论：成功构建IL-24的原核表达质粒pET28a-IL24，在大肠杆菌高效表达重组蛋白IL-24，采用镍离子亲合层析法获得rhIL-24，为下一步实验奠定基础。第二部分胶质瘤细胞U251中脑肿瘤干细胞的分选、鉴定目的：采用无血清悬浮培养和免疫磁珠分选相结合的方法进行人脑胶质瘤U251细胞系中脑肿瘤干细胞（brain tumor stem cell，BTSC）的分选，并鉴定。方法：首先将U251细胞接种于含有生长因子的无血清培养基，通过悬浮培养法得到含有大量BTSC的脑肿瘤干细胞球。细胞免疫荧光检测CD133和Nestin在脑肿瘤干细胞球上的表达。分离脑肿瘤干细胞球中的BTSC，运用CD133标记的免疫磁珠对BTSC进行分选和纯化，并用流式细胞仪检测分选后BTSC的CD133表达阳性率。通过MTT法和细胞单克隆形成率实验检测分选的CD133+的BTSC的增殖活性。结果：U251细胞在含血清的培养液中呈贴壁生长，增殖活跃。U251细胞接种于无血清培养基后，24至48小时内大部分细胞贴壁，一部分细胞呈单细胞悬浮状态；并有一部分细胞发生非特异聚集。培养72小时后开始形成细胞球，悬浮于培养基中，随后细胞球逐渐增大，形成典型的脑肿瘤干细胞球。细胞免疫荧光检测显示CD133和Nestin在脑肿瘤干细胞球上的高表达。利用免疫磁珠分选技术纯化CD133+细胞，流式细胞仪检测脑肿瘤干细胞球中的细胞经分选后，CD133+细胞比例达到95.8％。MTT检测发现CD133+细胞的增殖能力显着强于CD133-细胞；同时CD133+细胞单克隆形成率高，而CD133-细胞几乎不能形成典型的脑肿瘤干细胞球。结论：U251经含有生长因子的无血清培养液悬浮培养后，能够形成典型的脑肿瘤干细胞球，且CD133+细胞比例显着增高。利用免疫磁珠分选技术从脑肿瘤干细胞球中分选获得高纯度的CD133+细胞，且其增殖能力强。第三部分rhIL-24对胶质瘤干细胞增殖、分化的影响目的：研究rhIL-24对CD133+的BTSC的增殖和分化的影响。方法：通过MTT实验检测CD133+BTSC在经rhIL-24治疗后细胞的增殖活性；通过细胞形态学观察及细胞免疫荧光检测NeuN和GFAP的表达研究rhIL-24对CD133+BTSC分化的影响；流式细胞分析研究rhIL-24对CD133+BTSC中CD133表达的影响；裸鼠移植瘤成瘤实验，观察rhIL-24治疗后的CD133+BTSC成瘤能力。结果：MTT实验显示rhIL-24能够显着抑制CD133+BTSC的增殖。经rhIL-24诱导培养的CD133+BTSC在含生长因子的无血清培养液中培养7天后，细胞形态多样，突起增多变长；神经元标记物NeuN和星形细胞标记物GFAP的表达显着增高，而BTSC标记物CD133的表达明显降低，但没有完全消失，说明BTSC分化不彻底，细胞不能达到终末分化。在裸鼠移植瘤成瘤实验中，经rhIL-24诱导培养的CD133+BTSC在裸鼠中的成瘤能力显着降低。结论：rhIL-24能够抑制CD133+BTSC的增殖，降低BTSC中CD133的表达，细胞进入分化，成瘤能力显着下降。说明IL-24对脑肿瘤干细胞的增殖和分化起着重要作用，为IL-24治疗脑胶质瘤提供新思路和方法。
王江[3]（2012）在《NOK基因在人脑胶质细胞瘤增殖和侵袭中的作用及其机制研究》文中进行了进一步梳理脑胶质细胞瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，其发生率约占全部颅内肿瘤的40%；目前尽管脑胶质细胞瘤的治疗方法在不断地改善和提高，但其治疗仍然没有显着提高，而且患者预后较差，平均生存期还不到一年。治疗困难的主要原因在于脑胶质细胞瘤的恶性生物学特性；因此，为了进一步改善脑胶质细胞瘤的治疗效果，寻找和研究在脑胶质细胞瘤的恶性进展中发挥重要作用的相关分子具有重要的科学意义和临床应用价值。NOK（Novel Oncogene with Kinase-domain）基因是2004年从人扁桃体癌中克隆的一个新的癌基因（基因登录号为Genebank AAT01226），属于受体型酪氨酸蛋白激酶家族的一员。NOK基因组全长2.79kb，位于染色体12q13.2，mRNA全长1269bp，能够编码422个氨基酸，分子量约为47.6kD的蛋白质。NOK基因广泛高表达于多种肿瘤细胞和肿瘤组织，如肺癌（A549）、乳腺癌（MDA-MB-231）、急性髓系白血病（HL-60、U937和K562）、卵巢癌（HS832、OvCar3和CaOv3）和前列腺癌（LNCaP）等；这些都预示着NOK蛋白可能对肿瘤生成有一定的调控作用。但是目前尚未有关NOK基因与脑胶质细胞瘤相关性研究的报道。NOK分子能否成为有价值的脑胶质细胞瘤治疗的新靶点需要进一步的研究证实。本课题系统地研究了NOK分子在脑胶质细胞瘤中的表达特征，揭示了NOK分子在脑胶质细胞瘤中的表达特征及其与肿瘤病理分级的关系；本研究还初步探讨了NOK分子在不同表达水平下对于脑胶质瘤细胞体外增殖、侵袭、凋亡以及裸鼠致瘤性的影响，这些都有助于揭示NOK分子在脑胶质细胞瘤恶性进展中所发挥的作用。本课题主要包括以下四方面研究：1. NOK在人脑胶质细胞瘤中的表达及意义本研究首先从mRNA和蛋白水平研究了NOK分子在83例人脑胶质细胞瘤组织、10例正常人脑组织以及3株人脑星形胶质瘤细胞系（U251、BT325和U87）中的表达。反转录聚合酶链反应（Reverse-transcription PCR，RT-PCR）和Western blot研究结果发现，NOK mRNA和蛋白在U251和U87细胞中表达水平均较高，而BT325细胞中NOK mRNA和蛋白表达较低；在10例正常人脑组织中，只有1例检测到NOK mRNA和蛋白表达，其余9例均未见NOK的表达；而NOK mRNA和蛋白在不同病理级别的神经胶质瘤中均有表达，并且其表达强度随着临床病理级别的增高，NOK的表达有增高的趋势。本研究进一步采用免疫组织化学法检测了NOK蛋白在人脑胶质细胞瘤组织和正常脑组织中的表达。结果提示：NOK蛋白阳性染色定位于胞浆和/或胞膜；在83例人脑胶质细胞瘤标本中，57例标本表达检测到NOK表达，表达阳性率为68.7%，而10例正常人脑组织中只有1例表达。在人脑胶质细胞瘤及正常人脑组织中，NOK蛋白阳性表达率存在显着差异（P<0.01）。并且，NOK蛋白表达阳性率随着临床病理级别的增高而显着升高，在IIV级肿瘤组织间差异显着（P<0.05）；但是其与患者性别、年龄、肿瘤大小及肿瘤的发生部位无关（P均>0.05）。本部分研究结果表明，NOK mRNA和蛋白在脑胶质细胞瘤组织和部分细胞系中高表达，其表达强度随着脑胶质细胞瘤病理级别的升高而增高。2. NOK慢病毒表达载体及慢病毒干涉载体转染人脑胶质瘤细胞系的研究根据NOK的cDNA全长特点，设计了PCR引物，成功的从获赠真核表达载体pcDNA3.1-NOK中获得了NOK的cDNA全长，将其克隆入Gateway系统中入门克隆载体pENTR/3C中，重组体pENTR/3C-NOK酶切、PCR和测序鉴定；然后利用重组反应（Gateway LR Clonase Reaction），将pENTR/3C-NOK重组体中的NOK全长导入慢病毒载体pLenti-6.3/V5中，重组体pLenti-6.3/V5-NOK酶切、PCR鉴定和测序；pLenti-6.3/V5-NOK和对照质粒pLenti-6.3/V5-cherry分别与辅助质粒psPAX2, pMD2.G，按照4：3：1的比例混合，分别转染293T细胞进行病毒包装。慢病毒感染BT325细胞，Blasticidin抗性筛选出稳定细胞株分别命名为BT325-NOK和BT325-cherry细胞，RT-PCR和Western blot法检测稳定细胞株中NOK mRNA和蛋白表达水平，结果显示：与BT325-cherry细胞相比，BT325-NOK细胞中的NOKmRNA和蛋白表达水平显着升高。将购买两个NOK慢病毒干涉载体（pLKO.1-NOK-1和pLKO.1-NOK-2）及对照载体scramble分别与辅助质粒psPAX2, pMD2.G，按照4：3：1的比例混合，分别转染293T细胞进行病毒包装。慢病毒感染U251细胞，嘌呤霉素抗性筛选出稳定细胞株分别命名为U251-sh1、U251-sh2和U251-control细胞，RT-PCR和Western blot法检测稳定细胞株中NOK mRNA和蛋白表达水平，结果显示：与U251-control细胞相比，U251-sh1和U251-sh2细胞中的NOK mRNA和蛋白表达水平均受到明显抑制。本部分结果提示：成功构建含有NOK全长的慢病毒表达载体，将该载体和NOK慢病毒干涉载体分别进行病毒包装，分别感染脑胶质瘤细胞系，成功的建立了上调或抑制NOK mRNA和蛋白表达的稳转细胞系，为下一步研究NOK分子在调控脑胶质瘤细胞生物学特性中的作用提供了良好的细胞模型。3.上调或抑制NOK基因的表达对人脑胶质瘤细胞生物学特性的影响本部分针对已经建立的两组稳转细胞系（U251-sh1、U251-sh2、U251-control和BT325-NOK、BT325-cherry）进行实验研究。首先观察了NOK基因对胶质瘤细胞增殖和细胞周期的影响；MTT绘制生长曲线显示：与U251-control细胞相比，U251-sh1和U251-sh2细胞生长、增殖均受到明显抑制（P<0.05）；BT325-NOK细胞的增殖明显增快，显着高于BT325-cherry细胞（P<0.01）。平板克隆形成实验和软琼脂集落形成实验用来测定细胞克隆形成数量，结果发现：U251-sh1和U251-sh2细胞增殖数和克隆形成数均明显低于其对照组（P<0.01）；BT325-NOK细胞增殖数和克隆形成数则显着高于其对照组（P<0.01）。流式细胞术检测细胞周期结果显示发现：与U251-control细胞相比，U251-sh1和U251-sh2两组细胞的G1期细胞均明显增加（P<0.01），G2/M期细胞均明显减少（P<0.01），发生了G1期阻滞；与对照组BT325-cherry细胞相比，BT325-NOK细胞的G0/G1期细胞明显减少（P<0.01），S期细胞显着增多（P<0.01），G2/M期细胞略有增多。其次我们运用划痕实验和Transwell侵袭小室法观察了NOK基因对胶质瘤细胞迁移和侵袭的影响；结果发现：U251-sh1和U251-sh2两组细胞的迁移能力均明显低于其对照组（P<0.01），而且在Transwell实验中，U251-sh1和U251-sh2两组细胞穿过Matrigel的细胞数也均明显低于其对照组（P<0.01）；与BT325-cherry细胞相比，BT325-NOK细胞的迁移和侵袭能力均明显增加（P<0.01）。本部分研究结果表明，NOK基因可能在调控人脑胶质瘤细胞的体外增殖和侵袭等恶性生物学特性中发挥重要作用。4. NOK基因RNAi对人脑胶质瘤细胞裸鼠体内成瘤、增殖以及侵袭的影响本部分研究U251-control、U251-sh1和U251-sh2三种细胞分别接种于裸鼠背部皮下，定期测量肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线，观察其在裸鼠体内的成瘤性。共观察了30天。Western blot方法检测移植瘤组织中NOK蛋白的表达情况。实验结果发现：U251-sh1和U251-sh2两组细胞在裸鼠体内的成瘤能力和生长速度均明显低于其对照组（P<0.01），肿瘤体积和重量也均明显低于其对照组（P<0.01）；结果显示与U251-control组相比，U251-sh1和U251-sh2组的肿瘤中NOK蛋白表达均明显抑制（P<0.01），而U251-sh1和U251-sh2组之间的NOK蛋白表达水平无明显变化（P>0.05）。研究结果进一步证实了下调NOK基因的表达可以抑制脑胶质瘤细胞的体内增殖和侵袭能力。综上所述，我们认为NOK分子可能在人脑胶质瘤的发生与发展中起着重要的促进作用，不仅是一个有价值的人脑胶质细胞瘤生物标记分子，同时NOK分子也可能是人脑胶质瘤基因治疗的一个潜在候选靶点。
刘瑜[4]（2010）在《BTBD10在人脑胶质瘤中的表达及其对U251细胞株增殖和凋亡的影响》文中指出脑胶质瘤是成人中枢神经系统最常见的恶性肿瘤,统计资料表明其发生率约占颅内肿瘤的40-50%,其多呈浸润性生长,与正常脑组织间常无明显分界,易侵犯重要神经结构,难以做到手术完全切除,预后差,复发率、病死率高。而药物化疗和放射治疗不能高度特异性地杀伤肿瘤细胞,并且可能产生严重的不良反应。因此,目前脑胶质瘤仍为神经外科领域的难治性疾病,而阐明其发病机制、寻找新的治疗手段成为神经外科的研究热点。和其他部位肿瘤一样,脑胶质瘤的发生、发展是一个非常复杂的过程,涉及多种肿瘤相关基因的表达异常或失活。胶质瘤本质上是一种多基因异常疾病,其发生是由于原癌基因的激活和抑癌基因的失活导致细胞信号传导通路的异常、细胞循环周期的改变、生命周期的延长以及细胞调亡缺陷等,从而出现细胞增殖失控及恶性转化。与脑胶质瘤的恶性进展密切相关的细胞通路主要有磷脂酰肌醇3-激醇（P13K）信号转导通路、Ras信号转导通路、Wnt信号转导通路和Notch信号转导通路等。寻找与胶质瘤发病相关的基因,在此基础上发现胶质瘤治疗的新靶点、新策略,是神经外科研究领域的主要内容之一。BTBD10基因含BTB/POZ功能域,位于人染色体的11p15.2区域,全长2551bp,含245-16721bp开放阅读框架,编码475氨基酸的蛋白,蛋白分子量51.7Kd。前期研究在对18例脑胶质瘤进行表达谱芯片筛选及聚类分析中发现：芯片数据提示BTBD10表达量在各级别胶质瘤中均发生下调,平均Ratio值为0.218。基因表达谱Hierarchical聚类发现与BTBD10表达谱相近的基因有：血管性肠肽（VIP）、肿瘤蛋白p53结合蛋白（TP53BP1）、p淀粉样蛋白前体（APBB1）、8氧化鸟嘌呤糖基酶（OGG1）、促性腺素诱导阻抑蛋白（GIOT1）、MADS转录增强子2C（MEF2C）。MTC为模板RT-PCR结果显示BTBD10在检测的8种正常组织中,脑组织中高表达,而心、肺、肝、肾、胰腺组织中表达量较低。Northern杂交结果显示BTBD10在正常成人脑组织中表达量高,在7例不同级别胶质瘤中表达量都下降,BTBD10在胶质瘤／正常脑组织的表达量比率与芯片数据基本相符。在肝癌、卵巢癌和肺癌中BTBD10的表达没有显着性差异。提示BTBD10基因与脑胶质瘤高度相关,有可能成为新的脑胶质瘤治疗靶基因。为进一步研究BTBD10基因在胶质瘤发生发展中的作用,本实验通过检测BTBD10在大样本胶质瘤中的表达情况,培养过表达BTBD10基因的细胞株,初步探讨BTBD10基因调节胶质瘤细胞增殖水平的可能机制。第一部分BTBD10在人脑胶质瘤组织中的表达及意义目的：探讨BTBD1OmRNA和BTBD10蛋白在脑胶质瘤中的表达及意义。方法：采用实时荧光定量PCR和Western blot杂交检测BTBD10mRNA和BTBD10蛋白在正常脑组织和各级别胶质瘤中的表达,分析其表达与胶质瘤临床病理特征的关系。结果：在正常脑组织中BTBD10mRNA和蛋白的表达较高；各级别胶质瘤中的表达均低于正常脑组织（P<0.05）；在低级别胶质瘤（Ⅰ-Ⅱ级）中表达量较低,而在高级别胶质瘤（Ⅲ-Ⅳ）中表达水平更低,低级别和高级别之间的表达差异具有统计学意义（P<0.05）。BTBD1OmRNA和蛋白的表达水平与年龄、性别、病理类型等临床病理特征无明显相关（P>0.05）。结论：胶质瘤中BTBD10表达明显低于正常脑组织中的表达,且随病理级别的增高而降低,提示BTBD10在胶质瘤的发生发展中起重要作用,并与胶质瘤的病理分级密切相关。第二部分BTBD10过表达慢病毒载体的构建和鉴定目的：构建BTBD10慢病毒表达载体,为后续实验研究提供依据。方法：以BTBD10基因为模板PCR扩增目的基因,表达载体（pLV-UbC-GFP-3FLAG）酶切后进行胶回收载体片段,目的基因与载体片段同源重组后转化感受态细胞,用菌落PCR鉴定转化子,阳性克隆测序鉴定,质粒抽提,与无内毒素病毒包装质粒、膜蛋白表达质粒共转染293T细胞包装产生慢病毒颗粒,测定慢病毒滴度。结果：PCR扩增和测序结果均证实,插入序列完全正确,包装病毒产生病毒悬液的滴度为3.42×108TU／ml。结论：成功构建了携带BTBD10基因的慢病毒载体,为研究其在胶质瘤细胞中的生物学功能和以其为靶点的基因治疗奠定基础。第三部分BTBD10慢病毒载体转染人胶质瘤细胞株U251及其作用机制研究目的：了解BTBD10重组慢病毒载体转染人胶质瘤细胞株U251后,对U251细胞增殖、凋亡的影响,探讨其发挥肿瘤调控作用的机制。方法：应用BTBD10慢病毒载体、空载体分别转染体外培养的U251人胶质瘤细胞株,正常培养U251细胞作为空白对照。荧光定量PCR检测转染前后BTBD10和CyclinDl mRNA的表达变化,Western blot杂交检测BTBD 10、磷酸化Akt（pAkt）和CyclinD1蛋白水平变化,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡水平,MTT法分析细胞增殖情况并绘制生长曲线。结果：荧光定量PCR和Western blot杂交结果显示,与未转染的U251细胞和转染空白载体的U251细胞相比,转染重组BTBD10病毒载体的U251细胞中BTBD10 mRNA和蛋白水平明显提高,差异具有统计学意义（P<0.05）；Akt的磷酸化水平下调,CyclinDl mRNA和蛋白水平下调,差异具有统计学意义（P<0.05）。流式细胞仪分析各组细胞的凋亡水平,检测结果表明,与未转染的U251细胞和转染空白载体的U251细胞相比,转染BTBD10的U251细胞中凋亡细胞明显增多,早期凋亡细胞达14.64%,统计学上有差异（P<0.05）：细胞周期检测结果显示,未转染的U251细胞和转染空载体的U251细胞的细胞周期和细胞状态基本相同,部分细胞处于G2／M期,转染BTBD10病毒载体的U251细胞则被明显的抑制在G0／G1期,提示增殖活性降低。MTT法检测细胞增值率,发现外源性BTBD10基因转染U251细胞后,细胞生长速度明显下降。结论：慢病毒表达载体对人胶质瘤细胞系U251具有很高的转染效率,感染后可显着上调靶基因BTBD10的表达和活化。BTBD10过表达后将肿瘤细胞阻滞在G0／G1期,抑制肿瘤细胞增殖,促进凋亡,可能与下调pAkt和CyclinD1水平,负调控PI3K/Akt信号通路有关。
王江[5]（2009）在《诱导MSP58基因高表达对人脑胶质瘤细胞系生物学特性的影响》文中研究指明脑胶质细胞瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤,其发生率约占全部颅内肿瘤的30%50%。尽管近年来在手术﹑化疗与放疗方面取得很大进步,但对胶质瘤的治疗效果并没有得到显着提高。脑胶质细胞瘤治疗困难的根本原因在于其所具有的恶性生物学特性,如胶质细胞瘤具有典型的过度增殖、极强的侵袭性等等。因此,深入揭示脑胶质细胞瘤发生与发展的分子生物学机制,阐明决定脑胶质瘤恶性生物学行为的关键基因,对于人类战胜这一顽疾具有重要的科学意义。核微球蛋白58 （58-kDa microspherule protein,MSP58）是我们以抑癌候选基因NDRG2（N-myc down-stream regulated gene 2）为诱饵、利用酵母双杂交的方法筛选到的一个可以与NDRG2相互作用的分子。MSP58全长462个氨基酸。该分子结构中包括:核仁定位信号;一个coiled-coil domain和一个forkheadassociated domain （FHA）。目前国际上对MSP58的研究表明:MSP58的表达与细胞的增殖能力呈正相关,这个分子在细胞中表达具有明显的细胞周期相关的特点,它在细胞中过表达可以引起细胞的克隆形成能力增强及非锚着依赖生长的恶性表型,MSP58系与多种肿瘤发生过程及细胞增殖中具有相互作用的一种癌基因。我们前期的研究发现,MSP58 mRNA和蛋白在脑胶质瘤组织中存在表达。MSP58表达在良性和恶性脑胶质瘤之间,以及脑胶质瘤ⅠⅣ级病理级别间比较均有非常显着的差异性（p <0.01）,提示MSP58在脑胶质瘤的形成和恶性演进中具有重要作用。然而对于MSP58在胶质瘤细胞系中的生物学功能和作用机制仍有待于进一步研究。本研究探讨了MSP58分子诱导高表达对于人脑胶质瘤细胞系体外增殖、侵袭和凋亡等生物学特性的影响,为揭示MSP58分子在人脑胶质细胞瘤恶性进展中的作用提供了实验基础。本课题研究主要包括以下两个方面:1. MSP58真核表达载体转染人脑胶质母细胞瘤细胞系U251的研究我们在前期的研究中,针对四种最高级别恶性度的神经胶质瘤的细胞系:U215,U87,BT325,SHG44,运用RT-PCR和Western blot的实验方法,检测了MSP58 mRNA和蛋白在这四种胶质瘤细胞系中的表达情况。结果发现,MSP58在胶质瘤细胞系均有表达,并且表达量基本一致。根据这四种胶质瘤细胞系的生物学特性及转染效率等特点,我们选取了胶质瘤细胞系U251作为研究对象,根据MSP58分子的cDNA序列,运用PCR得到MSP58全长,并克隆入pCI-neo载体,构建了MSP58真核表达载体pCI-neo-MSP58,经酶切鉴定证实克隆正确。通过脂质体介导、将pCI-neo-MSP58载体和空载体pCI-neo分别转染入人脑胶质母细胞瘤细胞U251,经G418筛选,建立了稳定转染的细胞系U251-P msp58（MSP58过表达组）和U251-P neo（空载体组）,经RT-PCR和Western blot检测证实U251-P msp58细胞MSP58mRNA和蛋白的表达明显上调。本部分结果提示:首次成功获得了能够稳定过表达MSP58的胶质瘤细胞系U251-P msp58,这为进一步研究MSP58表达对于胶质瘤细胞生物学特性的影响提供了良好的细胞模型。2.诱导MSP58高表达对人脑胶质瘤细胞体外增殖及侵袭的影响本研究观察了MSP58基因对胶质瘤细胞增殖和细胞周期的影响。实验分为U251-P msp58组（MSP58过表达组）、U251组（未转染组）和U251-P neo组（空载体组）,运用流式细胞术检测细胞周期,MTT实验绘制细胞生长曲线,平板克隆形成实验和软琼脂集落形成实验测定细胞克隆形成数量。结果发现,U251-P msp58组与其他各对照组相比,G1期细胞明显减少（p<0.01）,S期细胞显着增多（p<0.01）;U251-P msp58组细胞增殖数和克隆形成数均明显高于其他各对照组（p<0.01）。表明MSP58基因对胶质瘤细胞周期有重要影响,MSP58基因表达上调对细胞增殖有较为明显的促进作用。为了探明MSP58基因与胶质瘤的侵袭和迁移能力的关系,运用经典的细胞划痕实验和Transwell侵袭小室法、就MSP58分子对细胞的迁移和侵袭能力的影响进行了研究。结果发现,U251-P msp58组的胶质瘤细胞的迁移能力明显高于其他对照组（p<0.01）,并且在Transwell实验中,U251-P msp58组的胶质瘤细胞能够穿过Matrigel的细胞数也明显高于其他对照组（p<0.01）。从而证明上调MSP58基因的表达能够促进胶质瘤细胞的侵袭和迁移能力。本部分研究结果提示,MSP58的高表达可能与人脑胶质瘤细胞的体外增殖和侵袭等恶性生物学行为密切相关。综上所述,本研究首次建立了具有稳定上调MSP58基因mRNA和蛋白表达的胶质瘤细胞系;阐明了MSP58基因在神经胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭中的作用。作为与NDRG2相互作用的分子,本研究结果为NDRG2功能的研究开辟了新的领域,对于揭示脑胶质瘤发生与发展的分子生物学机制,阐明决定脑胶质瘤恶性生物学行为的关键基因,具有重要的科学意义;也为发展临床神经胶质瘤的治疗提供了新的靶点。
淮亚红[6]（2008）在《牛8个繁殖性状相关基因cDNA克隆，SNPs及组织表达研究》文中认为繁殖性状是一个重要的经济性状,其中产仔性能是影响生产效率的最主要因素,受多基因控制,具有加性-显性基因作用模式,其遗传力很低,牛的群体双胎遗传力和排卵遗传力分别为0.03和0.07。目前普遍的方法是通过一些实践技术（如激素诱导、激素免疫和胚胎移植等）提高双胎率,但其存在遗传选择进展慢,手段繁琐、成本高等一系列问题,所以借助分子生物技术手段来提高产仔数是人们研究的另一个方向。公牛的精液品质是影响母牛受胎率及种公牛利用效率的重要因素,也是影响生产效益的关键因素。克隆精液品质相关基因并探讨其相关功能,这对于揭示动物繁殖性状调控机制及加快动物育种进展有重要作用。因此,本研究利用生物信息学和分子生物学相关技术,选取了与精液品质有关的ACTN1、Dmrt7、Mina53、Trf2、Tbxa2r、CyclinA1、GDNF和CIB1共8个基因作为候选基因,进行cDNA克隆、组织表达谱和SNPs检测及与母牛产仔数性状关联分析,为进一步研究这些基因与种公牛精液品质奠定了理论基础。取得了以下结果:基因的cDNA克隆方面1.利用EST拼接和GenScan技术,结合RT-PCR方法,得到了牛ACTN1、Dmrt7、Mina53、Trf2、Tbxa2r、CyclinA1、GDNF和CIB1共8个候选基因完整的CDS区序列并进行了生物信息学分析。2.通过3’RACE的方法,得到了牛Dmrt7基因完整的3’UTR区序列。向GenBank数据库递交了ACTN1、Dmrt7和Trf2基因的cDNA序列,分别获取登录号EF512630、EF534775和EU140625。组织表达方面3.用RT-PCR的方法对其中的5个候选基因在肝脏、睾丸、肺、瘤胃、子宫、小肠、脾脏、心脏、脂肪、卵巢、肾脏和肌肉共12个组织中的表达情况进行了研究,结果发现,除Dmrt7基因只在睾丸组织中表达外,其余4个基因都有比较广泛的组织表达。4.以SYBR Green I与dsDNA结合后检测荧光强度的方法进行定量。对在睾丸组织中表达量比较高的Trf2和Mina53基因在肝脏、睾丸、肺、瘤胃、子宫、小肠、脾脏、心脏、脂肪、卵巢、肾脏和肌肉共12个组织中表达情况进行了研究。结果发现,Trf2基因在睾丸组织中表达量最高,其次是肝脏和子宫,表达最低的是胃和脾脏。Mina53在睾丸组织中表达最高,其次是肝脏和子宫,表达最低的是卵巢。SNPs检测及关联分析方面5.采用PCR-SSCP方法和测序的方法对Dmrt7基因第1内含子、第2外显子和第2内含子;第4内含子、第5外显子和第5内含子;第7内含子,第8外显子和第8内含子进行了SNP扫描,发现在牛Dmrt7基因第2内含子存在G/A和A/T、第4内含子存在C/G和C/T、第7内含子存在C/G共5个单碱基突变位点。在鲁西单胎牛,西门塔尔牛,水牛,晋南牛和海福特牛群体中,对该基因的第4内含子的C/G突变的分布情况进行了研究,结果发现:CC基因型个体在群体中占绝对优势;在水牛和西门塔尔牛群体中没有发现多态现象,其他3个群体均处于中度多态。6.采用PCR-RFLP方法和测序的方法对ACTN1基因的第8外显子和第9内含子,第9外显子和第10内含子,第10外显子和第11内含子,第12外显子和第13内含子,第14外显子和第15内含子进行SNPs扫描,发现在牛ACTN1基因的第9内含子存在G/A,第10内含子存在A/G和G/A,第11内含子存在G/C,13内含子存在A/G,在第15内含子存在G/A和A/G共7个单碱基突变位点。以下是对6个地方品种（鲁西单胎牛,鲁西双胎牛,南阳牛,晋南牛,中国西门塔尔牛和荷斯坦牛群体）的群体进行检测多态性并且运用SAS 9.1软件,采用GLM对其基因多态性与产犊数进行了最小二乘均值差异显着性检验。对第10内含子的A/G突变位点用ApaⅠ限制性内切酶在6个群体中进行群体遗传学分析及其与产犊数进行关联分析。结果表明:所有群体在该位点都处于低度多态。在内含子10的ApaⅠ酶切位点,AG基因型的产犊数的最小二乘均数极显着（P<0.01）高于基因型GG基因型。用HaeⅢ限制性内切酶对13内含子的A/G突变位点在6个群体中进行群体遗传学分析及关联分析。结果表明:在内含子13的HaeⅢ酶切位点,AA基因型个体与AG基因型个体间的产犊数差异不显着（P>0.05）。对第15内含子的G/A突变用RsaⅠ限制性内切酶在6个群体中进行群体遗传学分析及其与产犊数进行了关联分析。结果表明:所有群体在该位点都处于中度多态。在内含子15的RsaⅠ酶切位点,产犊数性状在3种基因型间的差异均不显着（P>0.05）。Dmrt7基因原核表达7.对在睾丸组织中惟一表达的Dmrt7基因进行构建了Dmrt7基因的pET28a+原核表达载体,并成功地实现了对Dmrt7蛋白的融合表达。探讨其对雄性发育的重要作用。
林伟[7]（2008）在《MSP58基因在人脑神经胶质瘤增殖和侵袭中的作用及其机制研究》文中研究表明神经胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤,在所有颅内肿瘤中胶质瘤约占40%,预后较差,其中恶性胶质母细胞瘤的平均生存期仅为9-12月[1-2]。尽管近年来在手术﹑化疗与放疗方面取得很大进步,但对胶质瘤的治疗效果并没有得到显着提高。现在美国每年大约有20000人被诊断为胶质瘤,另有研究表明在中国的大陆、台湾及香港等地区,胶质瘤在青少年中的发病率呈增长的趋势[3-5]。恶性胶质瘤治疗困难的原因之一在于其所具有的恶性生物学特性,如胶质瘤具有典型的过度增殖和极强的侵袭性。因此寻找关键的治疗胶质瘤的分子靶点,纠正和改善其恶性生物学行为,越来越受到研究者们的高度重视。为了寻找治疗神经胶质瘤的分子靶点,1999年我校生物化学与分子生物学教研室利用基于PCR的削减杂交技术进行神经胶质瘤与正常脑组织的基因表达差异研究时,发现一个在胶质瘤中低表达的新基因NDRG2（N-myc down-stream regulated gene 2）[GenBank登录号AF159092][6]。NDRG2的mRNA全长为2024 bp,编码一个含有357个氨基酸残基、分子量约为41kDa的蛋白。该基因染色体定位在14 q11.2,含有16个外显子,15个内含子。由于该基因在结构上与已经发现的N-myc下游调节基因NDRG1（N-myc down-stream regulated gene 1）具有较高的同源性,将其命名为NDRG2。初步研究表明,过表达NDRG2可以抑制胶质瘤细胞的增殖。但目前国内外对NDRG2功能的研究尚处于起步阶段,对该基因抑制胶质瘤增殖的信号转导途径尚不清楚。阐明相关的分子机制有利于为NDRG2功能的研究提供理论依据,同时也为发展临床胶质瘤的治疗提供新的途径。绝大多数分子在细胞内执行功能都是通过蛋白与蛋白之间的相互作用来实现的。研究一个新基因的功能有多种策略,其中一个重要手段是寻找与之相互作用的蛋白分子,尤其是对于在结构分析中未见到任何功能提示的分子,这更是一个关键策略。为了深入地阐明NDRG2的功能及其在细胞内的作用机制,我们以NDRG2为诱饵利用酵母双杂交的方法筛选了人脑的cDNA文库。结果发现了一个可以与NDRG2相互作用的分子MSP58（58-kDa microspherule protein）,并通过在体内外实验验证了两个分子之间的相互作用[7],通过构建NDRG2和相互作用分子的截短体,确定了它们相互作用的部位。MSP58成为阐明NDRG2基因功能的新线索。MSP58是我们以NDRG2为诱饵利用酵母双杂交的方法筛选到的一个可以与NDRG2相互作用的分子。MSP58全长462个氨基酸。该分子结构中包括:核仁定位信号;一个coiled-coil domain和一个forkhead associated domain（FHA）[8]。目前国际上对MSP58的研究表明:MSP58的表达与细胞的增殖能力呈正相关[9],这个分子在细胞中表达具有明显的细胞周期相关的特点,它在细胞中过表达可以引起细胞的克隆形成能力增强及非锚着依赖生长的恶性表型,MSP58可以与多种在肿瘤的增殖及发生过程中有着重要作用的分子产生相互作用[10],是一个在肿瘤的增殖中有着重要作用的癌基因。那么MSP58基因在神经胶质瘤中是否有表达?其表达的程度如何?增殖和侵袭力强是神经胶质瘤明显的生物学特性,MSP58是否对胶质瘤的增殖和侵袭有作用?其作用的分子机制是什么?本课题就基于这些问题展开了探索工作。本研究收集了41例不同病理级别的神经胶质瘤的标本,应用RT-PCR和Western blot实验方法,探索MSP58基因在神经胶质瘤中mRNA和蛋白的表达情况,并进一步分析了MSP58分子的表达与神经胶质瘤病理级别之间可能存在的相互关系。结果发现,MSP58 mRNA和蛋白在不同病理级别的神经胶质瘤中均有表达,并且随着WHO的临床病理级别的增高,MSP58的表达亦有增高的趋势。本研究进一步采用了四种最高级别恶性度的神经胶质瘤的细胞系:U251,U87,BT325,SHG44,同样应用RT-PCR和Western blot的实验方法,检测了MSP58 mRNA和蛋白在这四种胶质瘤细胞系中的表达情况。结果发现,MSP58在胶质瘤细胞系均有高表达,并且表达量基本一致。根据这四种胶质瘤细胞系的生物学特性及转染效率等特点,我们选取了胶质瘤细胞系U251为研究对象,根据MSP58分子的cDNA序列,设计、合成了针对MSP58 mRNA的特异性RNAi片段,并克隆入pSilencer3.1-H1neo载体,构建了MSP58 shRNA真核干涉表达载体pSilencer-MSP58 ,经酶切鉴定证实克隆正确。通过脂质体介导将pSilencer-MSP58载体和空载体pSilencer3.1-H1neo和阴性对照载体pSilencer-NC分别转染入人脑胶质母细胞瘤细胞U251,经G418筛选,建立了稳定转染的细胞系U251-S（MSP58干涉组）、U251-H1neo（空载体组）和U251-NC（阴性对照载体组）。经RT-PCR和Western blot检测证实U251-S细胞MSP58mRNA和蛋白的表达明显受到抑制。从而首次成功地获得了能够稳定下调MSP58表达的胶质瘤细胞系U251-S。这为进一步研究MSP58在胶质瘤细胞中的功能和作用机制奠定了实验基础。本研究首先观察了MSP58基因对胶质瘤细胞增殖和细胞周期的影响。实验分为U251-S组（MSP58干涉组）、U251组（未转染组）、U251-H1neo组（空载体转染组）和U251-NC组（阴性对照载体转染组）。应用流式细胞术检测细胞周期,MTT实验绘制细胞生长曲线,平板克隆形成实验和软琼脂集落形成实验测定细胞克隆形成数量。结果发现U251-S组与其它各对照组相比,G1期细胞明显增加（p<0.01）,G2/M期细胞明显减少（p<0.01）,细胞周期发生了G1期阻滞现象;U251-S细胞增殖数和克隆形成数均明显低于其它各对照组（p<0.01）。表明MSP58基因对胶质瘤细胞周期有重要影响,MSP58基因表达下调对细胞增殖也有明显的抑制作用。为了探明MSP58基因与胶质瘤的侵袭和迁移能力的关系,采用经典的细胞划痕实验和Transwell侵袭小室法,就MSP58分子对细胞的迁移和侵袭能力的影响进行了研究。结果发现,U251-S组的胶质瘤细胞的迁移能力明显低于其它对照组（p<0.01）,并且在Transwell实验中,U251-S组的胶质瘤细胞能够穿过Matrigel的细胞数也明显低于其它对照组（p<0.01）。从而证明下调MSP58基因的表达能够抑制胶质瘤细胞的侵袭和迁移能力。本研究采用裸鼠荷瘤实验进一步验证了以上结果在体内的重复性。32只裸鼠随机分为四组,将U251-S、U251、U251-H1neo和U251-NC组的细胞分别注入各组裸鼠皮下,观察其在裸鼠体内的成瘤性。共观察了24天。结果显示,U251-S组细胞在裸鼠体内的成瘤能力和生长速度明显低于其它对照组（p<0.01）,肿瘤体积和重量明显低于其它各对照组（p<0.01）。在体实验结果进一步印证了MSP58基因表达的下调抑制了神经胶质瘤的增殖和侵袭能力。在上述研究的基础上,本研究使用美国SuperArray公司推出的第二代功能分类基因芯片,对MSP58对照组和干涉组细胞的细胞周期和肿瘤相关基因进行了基因芯片对比分析研究,探讨MSP58作用的信号途径。美国SuperArray基因芯片对基因进行了有目的的筛选与分类,从而避免了高通量基因芯片因数据过多而难以分析的缺点。基因芯片的分析结果显示:MSP58的下调引起了某些抑癌基因的上调,如BRCA1和P53基因,同时也下调了某些增殖相关基因如Ki-67和E2F2的表达。对于细胞周期相关基因芯片而言,一些与细胞周期中G1-S期细胞周期转换抑制的相关基因,如ATM,ATR,CyclinG1,CyclinG2,Cullin4A以及Cullin5等均出现了上调。同时一些与细胞周期G2/M期有密切关系的基因如ANAPC2,ANAPC4以及ANAPC5出现了上调。本研究发现MSP58基因在神经胶质瘤细胞中的表达,且表达水平随神经胶质瘤病理级别的增高而升高;利用RNAi技术,首次建立了具有稳定下调MSP58基因mRNA和蛋白表达的胶质瘤细胞系;阐明了MSP58基因在神经胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭中的作用,并探索其作用的分子机制与信号转导途径。作为与NDRG2相互作用的分子,本研究结果为NDRG2功能的研究开辟了新的领域,也为发展临床神经胶质瘤的治疗提供了新的靶点。
张海涛[8]（2007）在《基因（上皮膜蛋白1）在人脑胶质瘤中的表达研究》文中认为目的探讨基因EMP1（上皮膜蛋白1）在人脑胶质瘤中的表达及其与肿瘤恶性程度的相互关系。方法分别采用逆转录酶聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫组化染色方法检测正常脑组织、星形细胞瘤及颅内其它肿瘤中EMP1 mRNA及蛋白的表达。结果EMP1无论在基因还是在蛋白表达水平上,在正常脑组织、星形细胞瘤及颅内其它肿瘤中均有不同程度表达,但在星形细胞瘤中表达显着增高,且随着其病理分级的增高而增高,在高、低级别之间存在显着差异（P<0.05）。结论基因EMP1的过度表达与星形细胞瘤的恶性程度密切相关。
陈玉栋[9]（2006）在《病毒诱导牙鲆上调表达基因的筛选及牙鲆色素上皮衍生因子的特征分析》文中指出牙鲆（Paralichthys olivaceus）是我国已经形成规模经济效益的几种重要海水养殖鱼类之一。随着养殖集约化程度的提高,近年来频繁遭受病毒性疾病的侵袭并导致巨大经济损失。因此,深入研究牙鲆免疫系统的分子机制将为牙鲆疾病特别是病毒病的预防提供理论依据。本研究选用紫外灭活的具有双链RNA基因组的草鱼出血病病毒（grass carp hemorrhage virus,GCHV）对牙鲆胚胎细胞（flounder embryonic cells, FEC）进行诱导,运用抑制性差减杂交技术（suppression subtractive hybridization, SSH）,成功构建了dsRNA病毒诱导的牙鲆胚胎细胞基因差异表达的差减cDNA文库。从差减cDNA文库中,通过PCR和斑点杂交两轮筛选,共得到有效ESTs为148个。所得序列通过生物信息学分析表明,这些EST代表的相应基因的功能包括细胞分裂、信号传导、细胞结构、细胞防御、蛋白表达和代谢等几个方面。在上调表达的EST中,有三个为色素上皮衍生因子（pigment epithelium- derived factor, PEDF）的同源基因（PoPEDF）,该基因属于丝氨酸蛋白酶抑制剂（serine protease inhibitor, serpin）超家族中无抑制活性的成员之一,编码蛋白具有抗血管增生、神经营养和保护功能。但关于该基因与病毒诱导研究还未见报道。通过RACE-PCR方法,从SMART cDNA文库得到了PoPEDF基因的全长cDNA共1803bp,开放阅读框长1212bp,编码403个氨基酸。序列同源性比较、蛋白结构分析、基因组DNA的外显子与内含子组合及系统进化分析等都表明PoPEDF为哺乳动物PEDF的同源基因。PoPEDF与GFP共转染细胞及免疫组化结果表明,牙鲆PEDF是一种分泌蛋白,合成后的PEDF主要分布于细胞质而不在细胞核。连续观察发现表达的PEDF逐渐向细胞外分泌。在哺乳动物中,PEDF是一个多功能蛋白,其功能和调节机制非常复杂。以牙鲆和牙鲆胚胎细胞为材料,用不同的诱导剂诱导,对牙鲆PEDF的功能特性作了初步探讨。结果显示,PEDF对ATRA的诱导变化不明显;低葡萄糖浓度可以诱导PEDF的上调表达,随着葡萄糖浓度的升高,PEDF的表达逐渐降低;缺氧时,PEDF先上调表达,随后再下调表达;随着细胞培养时间的增加,
李静琪[10]（2006）在《酵母双杂交文库构建与TMEFF2相互作用蛋白筛选》文中研究说明TMEFF2（transmembrane protein with EGF-like and two follistatin-like domains）基因是近年来新发现的一类与神经发育相关的基因，目前对其功能研究还较少。本实验室通过构建单侧视网膜摘除的鸽模型，用消减抑制杂交法建立了鸽左前脑的cDNA差异表达文库，并且通过反Northern杂交筛选出一些差异表达的EST片段。我们从中选取了一条EST片段，通过RACE法成功的克隆了其全长基因，且经同源性比较证实为TMEFF2基因。为了探究TMEFF2基因的功能，我们将其EGF样功能域作为酵母双杂交的“诱饵”，对正常人脑cDNA文库进行筛选，经DNA序列测定证实为Celsr2、G3BP2、agrin、prosaposin等，因此初步确定TMEFF2基因与神经发育及信号转导相关。为了更进一步探究TMEFF2的功能和作用机理，本文首先构建了TMEFF2基因胞内域的酵母双杂交“诱饵”表达载体，经验证无自激活现象并且对酵母菌株无明显毒性，western印迹对蛋白表达的定性分析显示目的蛋白表达正确；其次利用酵母体内能够发生高频率同源重组的特点，采用CLONTECH SMART（Switching Mechanism at 5’end of RNA Transcript）技术，以人脑总RNA为模板，通过逆转录和长距离PCR构建了酵母双杂交cDNA文库；最后以CLONTECH MATCHMAKER SYSTEM 3为操作平台，利用融合的方法对自行构建的人脑cDNA文库进行筛选，最终得到一个与人ryanodine receptor 2（RYR2）同源的基因和一个未知基因（Homo sapiens mRNA；cDNA DKFZp686C06106），由此推测TMEFF2基因胞内域中潜在的G蛋白激活模序可能与Ca2+或者酪氨酸蛋白激酶介导的信号转导通路相关。此外，在克隆TMEFF2基因全长cDNA的过程中，我们还意外地发现了一个新的TMEFF2剪接体序列。序列测定和分析表明，该剪接体缺失的长度为60bp的序列恰好构成TMEFF2基因的第7个外显子，由此推测该剪接体可能是在大脑mRNA的选择性剪接过程中形成的。有关该剪接体的功能及其在同一个体中所占的比例和在人群中的分布频率，尚有待进一步实验的证实。
二、人脑胶质细胞瘤分化相关基因GDR1全长cDNA的克隆和鉴定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人脑胶质细胞瘤分化相关基因GDR1全长cDNA的克隆和鉴定（论文提纲范文）
（1）MicroRNA-17对胶质瘤细胞生物学特性的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 miR-17在人脑胶质瘤中的表达研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 miR-17对胶质瘤细胞系生物学特性的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 miR-17通过靶向CCND1调控胶质瘤细胞的增殖和侵袭 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表 |
| 攻读学位期间公开发表的论文 |
| 致谢 |
（2）重组人IL-24对胶质瘤干细胞增殖、分化的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 IL-24 表达质粒的构建及重组蛋白的表达、纯化 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 第二部分 脑胶质瘤干细胞的分离、鉴定 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 第三部分 RHIL-24 对胶质瘤干细胞增殖、分化的影响 |
| 一、材料 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 全文总结 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间科研课题和公开发表的论文 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（3）NOK基因在人脑胶质细胞瘤增殖和侵袭中的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 一、NOK分子与受体型酪氨酸蛋白激酶（RPTK） |
| 二、与恶性脑胶质细胞瘤侵袭相关的主要蛋白酶 |
| 三、慢病毒载体系统的研究进展 |
| 实验一 NOK 基因在人脑胶质瘤中的表达及意义 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 NOK 基因慢病毒表达载体及慢病毒干涉载体的制备及转染脑胶质瘤细胞系的研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三 上调或抑制NOK基因的表达对人脑胶质瘤细胞生物学特性的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验四 NOK 基因 RNAI对人脑胶质瘤细胞裸鼠体内成瘤、增殖和侵袭的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（4）BTBD10在人脑胶质瘤中的表达及其对U251细胞株增殖和凋亡的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 BTBD10在人脑胶质瘤组织中的表达及意义 |
| 一、前言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 第二部分 BTBD10慢病毒表达载体的构建和鉴定 |
| 一、前言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 第三部分 BTBD10慢病毒载体转染人胶质瘤细胞株U251及其对细胞增殖、凋亡的影响 |
| 一、前言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 博士在读期间发表论文和科技成果 |
| 致谢 |
（5）诱导MSP58基因高表达对人脑胶质瘤细胞系生物学特性的影响（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 正文 |
| 实验一 MSP58 真核表达载体转染人脑胶质母细胞瘤细胞系的研究 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 诱导MSP58 高表达对人脑胶质瘤细胞体外增殖及侵袭的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（6）牛8个繁殖性状相关基因cDNA克隆，SNPs及组织表达研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 候选基因分析法克隆基因 |
| 1.2 表达序列标签（EST）在基因克隆中的应用 |
| 1.3 DNA 分子标记 |
| 1.3.1 限制性片段长度多态性标记 |
| 1.3.2 单链构象多态性和单核苷酸多态性 |
| 1.4 荧光定量PCR 技术 |
| 1.5 牛的与繁殖相关基因的候选基因 |
| 1.6 待分离基因的研究现状 |
| 1.6.1 α－辅肌动蛋白1 |
| 1.6.2 Doublesex 和mab-3 相关的转录因子7 |
| 1.6.3 MYC 引起的核抗原 |
| 1.6.4 TBP 相关因子2 |
| 1.6.5 细胞周期蛋白A1 |
| 1.6.6 胶质细胞源性神经营养因子 |
| 1.6.7 凝血恶烷 |
| 1.6.8 钙-整合素结合蛋白1 |
| 1.7 本研究的意义 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 用于新基因多态性寻找、检测和基因型频率研究的DNA 样品 |
| 2.1.2 组织样品 |
| 2.1.3 培养基、酶及试剂盒 |
| 2.1.4 菌株 |
| 2.1.5 主要试剂 |
| 2.1.6 其它试剂的配制 |
| 2.1.7 主要仪器设备 |
| 2.1.8 主要分子生物学数据库及软件 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 候选基因cDNA 的克隆 |
| 2.2.2 牛两个基因的SNPs 寻找 |
| 2.2.3 候选基因的组织表达谱分析 |
| 2.3 数据分析方法 |
| 2.3.1 基因频率和基因型频率的计算 |
| 2.3.2 多态信息含量（PIC） |
| 2.3.3 有效等位基因数（Ne） |
| 2.3.4 群体杂合度（He） |
| 2.3.5 Hardy-Weinberg 平衡检测 |
| 2.3.6 统计模型 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 总RNA 的提取与检测 |
| 3.2 牛ACTN1 基因CDNA 克隆及生物信息学分析 |
| 3.2.1 ACTN1 基因cDNA 克隆 |
| 3.2.2 ACTN1 基因cDNA 序列分析 |
| 3.2.3 ACTN1 基因cDNA 所推导的蛋白质特性 |
| 3.2.4 ACTN1 基因的电子定位 |
| 3.2.5 ACTN1 基因的表达谱分析 |
| 3.3 其他几个基因CDNA 克隆及生物信息学分析 |
| 3.3.1 牛Dmrt7 基因的cDNA 克隆及生物信息学分析 |
| 3.3.2 牛Mina53 基因cDNA 克隆及生物信息学分析 |
| 3.3.3 牛Trf2 基因cDNA 克隆及生物信息学分析 |
| 3.3.4 牛C181 基因cDNA 克隆及生物信息学分析 |
| 3.3.5 牛Txa21 基因cDNA 克隆及生物信息学分析 |
| 3.3.6 牛 CyclinA1 基因cDNA 克隆及生物信息学分析 |
| 3.3.7 牛 GDNF 基因cDNA 克隆及生物信息学分析 |
| 3.4 基因多态性检测结果 |
| 3.4.1 牛 Dmrt7 基因的遗传变异 |
| 3.4.2 牛 ACTN1 基因的遗传变异 |
| 3.5 基因多态性与性状关联分析结果 |
| 3.5.1 ACTN1 基因第13 内含子-669 位点SNP 与产犊数的关联分析 |
| 3.5.2 ACTN1 基因第15 内含子-227 和内含子10-3124 位点与产犊数的关联分析 |
| 3.5.3 ACTN1 基因第15 内含子-227 和第10 内含子-3124 位点连锁不平衡 |
| 3.6 REAL-TIME 定量PCR |
| 3.6.1 Trf2 基因的表达特征 |
| 3.6.2 Mina53 基因的表达特征 |
| 3.7 DMRT7 基因的原核表达 |
| 3.7.1 构建重组表达载体 |
| 3.7.2 获得含重组表达质粒的表达菌种 |
| 3.7.3 诱导表达 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 关于RNA 操作的讨论 |
| 4.1.1 总RNA 提取中的质量控制 |
| 4.1.2 DNA 提取质量控制 |
| 4.2 关于PCR 反应 |
| 4.2.1 引物设计 |
| 4.2.2 引物的模板 |
| 4.2.3 关于PCR 产物污染 |
| 4.3 关于基因分离 |
| 4.4 RACE 技术在CDNA 全长克隆中的应用 |
| 4.5 关于基因的SNPS 筛查及SNP 的群体遗传检测 |
| 4.5.1 关于SNPs 的筛查 |
| 4.5.2 SNPs 的群体遗传检测 |
| 4.6 关于基因型与性状的关联分析 |
| 4.6.1 ACTN1 基因多态性及群体遗传分析 |
| 4.6.2 ACTN1 基因与产仔数的的关系 |
| 4.7 关于基因的组织表达 |
| 4.8 生物信息学在核酸、蛋白序列分析中的应用 |
| 4.8.1 生物信息学在核酸序列分析中的应用 |
| 4.8.2 生物信息学在蛋白序列分析中的应用 |
| 第五章 小结 |
| 5.1 本研究得到如下结果 |
| 5.2 本研究的创新点 |
| 5.3 值得下一步研究的问题 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一 GENBANK 收录的牛ACTN1 基因的CDNA 序列 |
| 附录二 GENBANK 收录的牛TRF2 基因的CDNA 序列 |
| 附录三 GENBANK 收录的牛DMRT7 基因的CDNA 序列 |
| 中英文缩写和对照 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（7）MSP58基因在人脑神经胶质瘤增殖和侵袭中的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 实验一 MSP58 基因在人脑胶质瘤中的表达及意义 |
| 1 材料 |
| 1.1 组织标本和细胞系 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 器具准备 |
| 2.2 总RNA提取 |
| 2.3 RT反应 |
| 2.4 PCR反应 |
| 2.5 Western blot |
| 2.6 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 MSP58 在四种人脑胶质瘤细胞系中的表达情况 |
| 3.2 MSP58 在不同级别人脑胶质瘤中的表达情况 |
| 4 讨论 |
| 实验二 稳定整合MSP58 基因RNA干涉载体的胶质瘤细胞系的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞系、菌种、质粒 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 人MSP58 基因RNAi特异性片段的设计及合成 |
| 2.2 人 MSP58 基因 shRNA 真核干涉表达载体 pSilencer-MSP58 的构建和鉴定 |
| 2.3 基因转染及稳定转染细胞系 U251-S、U251-H1neo 和 U251-NC 的建立 |
| 2.4 RT-PCR反应 |
| 2.5 Western blot |
| 2.6 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 人MSP58 基因真核干涉表达载体的构建和鉴定 |
| 3.2 稳定转染细胞系的建立 |
| 3.3 shRNA抑制MSP58 mRNA在U251-S细胞中的表达 |
| 3.4 shRNA抑制MSP58 蛋白在U251-S细胞中的表达 |
| 4 讨论 |
| 4.1 RNA干涉现象 |
| 4.2 shRNA对MSP58 基因表达的抑制作用 |
| 实验三 MSP58 基因RNAi对人脑胶质瘤细胞体外增殖及侵袭的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器和试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 化学合成小片段siRNA瞬转胶质瘤细胞系 |
| 2.3 倒置相差显微镜观察 |
| 2.4 四唑兰显色法（MTT法）绘制细胞生长曲线 |
| 2.5 平板克隆形成实验 |
| 2.6 软琼脂集落形成实验 |
| 2.7 流式细胞术（FCM）检测细胞周期 |
| 2.8 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.9 单层细胞划痕实验检测细胞的迁移能力 |
| 2.10 Transwell侵袭小室实验检测细胞的侵袭能力 |
| 2.11 美国SuperArray公司基因功能分类芯片实验 |
| 2.12 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 化学合成小片段siRNA瞬转胶质瘤细胞转染效率的确认 |
| 3.2 化学合成小片段siRNA瞬转胶质瘤细胞干涉效果的确认 |
| 3.3 倒置相差显微镜观察稳转细胞系U251-S形态的变化 |
| 3.4 MTT法测定细胞生长增殖曲线 |
| 3.5 平板克隆形成实验 |
| 3.6 软琼脂集落形成实验 |
| 3.7 流式细胞术测定细胞周期 |
| 3.8 流式细胞术检测细胞凋亡结果 |
| 3.9 单层细胞划痕实验检测细胞的迁移能力 |
| 3.10 Transwell侵袭小室实验检测细胞的侵袭能力 |
| 3.11 基因表功能分类芯片检测 MSP58RNAi后对细胞周期和肿瘤相关达的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 MSP58 RNAi对U251 细胞体外增殖、侵袭和迁移能力的影响 |
| 4.1.1 肿瘤发生发展的细胞周期机制 |
| 4.1.2 Cyclin的异常 |
| 4.1.3 CDK的增多 |
| 4.1.4 CKI表达不足和突变 |
| 4.2 基因芯片技术观察对肿瘤细胞周期和肿瘤相关基因的影响 |
| 实验四 MSP58 基因RNAi对胶质瘤裸鼠体内成瘤、增殖、侵袭的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞系和裸鼠 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 人脑胶质瘤裸鼠皮下移植瘤模型的建立及观测 |
| 2.2 HE染色 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 裸鼠皮下移植瘤生长的观察与测量 |
| 3.2 HE染色结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（8）基因（上皮膜蛋白1）在人脑胶质瘤中的表达研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文对照表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 在星形细胞瘤基因芯片数据的基础上筛选目的基因 |
| 一、基因芯片在脑胶质瘤中应用的回顾 |
| 二、关于前期已完成18 例星形细胞瘤基因芯片结果的分析 |
| 三、在芯片数据基础上分两步筛选目的基因 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 EMP1 mRNA在人脑胶质瘤中的含量 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分附图 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 蛋白EMP1 在人脑胶质瘤中的表达情况 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分附图 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 基因EMP1及相关分子在肿瘤研究中的回顾 |
| 在读期间以第一作者发表的文章 |
| 致谢 |
（9）病毒诱导牙鲆上调表达基因的筛选及牙鲆色素上皮衍生因子的特征分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 第一节 天然免疫与获得性免疫的关系 |
| 1.1.1 天然免疫和获得性免疫的识别机制 |
| 1.1.2 模式识别受体 |
| 1.1.3 Toll及TLRs |
| 1.1.4 天然免疫识别病原并启动获得性免疫 |
| 第二节 宿主细胞对病毒的防御机制 |
| 1.2.1 病毒的识别和抗病毒物质的产生 |
| 1.2.2 细胞凋亡 |
| 第三节 鱼类免疫系统 |
| 1.3.1 细胞因子 |
| 1.3.1.1 干扰素 |
| 1.3.1.2 肿瘤坏死因子α |
| 1.3.1.3 IL-1β |
| 1.3.2 趋化因子 |
| 1.3.3 补体系统 |
| 1.3.4 TLRs |
| 1.3.5 抗菌肽 |
| 第四节 本研究的目的和意义 |
| 第二章 紫外灭活GCHV诱导的牙鲆胚胎细胞差减cDNA文库的构建 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 细胞株与病毒株 |
| 2.1.2 细胞培养 |
| 2.1.3 病毒增殖、纯化与紫外线灭活 |
| 2.1.3.1 病毒增殖 |
| 2.1.3.2 病毒纯化 |
| 2.1.3.3 病毒灭活 |
| 2.1.4 牙鲆胚胎细胞(FEC)的诱导 |
| 2.1.5 诱导后牙鲆胚胎细胞抗病毒物质检测 |
| 2.1.6 差减cDNA文库的构建 |
| 2.1.6.1 病毒诱导牙鲆胚胎细胞的制备 |
| 2.1.6.2 病毒诱导和对照FEC总RNA的提取 |
| 2.1.6.3 病毒诱导和未经诱导的FEC mRNA的分离 |
| 2.1.6.4 差减cDNA文库的建立 |
| 2.1.6.5 Tester cDNA接头连接效率检测和差减文库差减效率检测 |
| 2.1.7 差减cDNA质粒文库的构建 |
| 2.1.7.1 E coli. DH5α感受态的制备 |
| 2.1.7.2 连接 |
| 2.1.7.3 转化 |
| 2.1.8 差减文库cDNA 片段大小检测 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 紫外灭活GCHV诱导的FEC抗病毒活性检测 |
| 2.2.2 Tester cDNA的接头连接效率的检测 |
| 2.2.3 cDNA文库差减效率检测 |
| 2.2.4 差减文库cDNA片段大小的鉴定 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 差减cDNA文库的筛选及ESTs分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试剂、酶及载体 |
| 3.1.2 PCR筛选 |
| 3.1.3 斑点杂交筛选 |
| 3.1.3.1 差减cDNA文库探针和对照cDNA文库探针的制备 |
| 3.1.3.2 斑点杂交 |
| 3.1.3.3 阳性克隆筛选 |
| 3.1.4 阳性克隆cDNA片段测序及序列分析 |
| 3.1.5 SMART cDNA的合成 |
| 3.1.6 PCR检测 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 差减cDNA片段的PCR筛选 |
| 3.2.2 差减cDNA片段的斑点杂交筛选 |
| 3.2.3 差减cDNA片段的序列测定和分析 |
| 3.2.4 部分差减cDNA片段的差异表达分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 色素上皮衍生因子基因的克隆、分析和鉴定 |
| 4.1 前言 |
| 4.1.1 丝氨酸蛋白酶抑制剂 |
| 4.1.2 色素上皮衍生因子 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 试剂、酶及载体 |
| 4.2.2 RACE-PCR克隆PEDF基因全长cDNA |
| 4.2.3 PCR产物回收 |
| 4.2.4 感受态细胞的制备、连接、转化及阳性克隆筛选 |
| 4.2.5 细胞及组织总RNA的提取 |
| 4.2.5.1 细胞及组织总RNA的TRIzol一步法提取 |
| 4.2.5.2 组织总RNA的SV Total法提取 |
| 4.2.6 RT-PCR |
| 4.2.7 Real-time PCR |
| 4.2.8 牙鲆基因组DNA的提取 |
| 4.2.9 PEDF基因组DNA的克隆 |
| 4.2.10 PEDF基因的生物信息学分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 紫外灭活GCHV诱导PEDF的上调表达 |
| 4.3.2 PEDF全长cDNA的克隆 |
| 4.3.3 PEDF cDNA序列分析 |
| 4.3.4 PEDF的氨基酸序列的比较分析 |
| 4.3.5 牙鲆PEDF基因组DNA结构 |
| 4.3.6 PEDF基因的染色体定位及PEDF基因的进化分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 PEDF蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 原核表达载体的构建 |
| 5.1.2.1 引物设计 |
| 5.1.2.2 表达片段的克隆 |
| 5.1.2.3 酶切 |
| 5.1.2.4 目的片段的回收 |
| 5.1.2.5 连接、转化及筛选 |
| 5.1.3 诱导表达筛选阳性克隆 |
| 5.1.4 PEDF的大量表达 |
| 5.1.5 pET32a-PEDF的包涵体制备 |
| 5.1.6 pET32a-PEDF的树脂纯化 |
| 5.1.7 pET156-PEDF蛋白的纯化 |
| 5.1.7.1 包涵体的制备 |
| 5.1.7.2 溶解包涵体和重折叠 |
| 5.1.7.3 透析 |
| 5.1.8 多克隆抗体的制备 |
| 5.1.9 细胞和组织蛋白的提取 |
| 5.1.9.1 TRIzol法细胞和组织蛋白的提取 |
| 5.1.9.2 一步法细胞和组织蛋白的提取 |
| 5.1.10 Western免疫印迹 |
| 5.1.11 免疫吸附 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 克隆片段的PCR扩增及克隆 |
| 5.2.2 表达载体的构建 |
| 5.2.3 原核表达与鉴定 |
| 5.2.4 多克隆抗体的制备与鉴定 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 牙鲆PEDF蛋白的亚细胞定位 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 牙鲆胚胎细胞总RNA的提取 |
| 6.1.3 逆转录 |
| 6.1.4 牙鲆PEDF 编码区cDNA的扩增 |
| 6.1.5 牙鲆PEDF 编码区cDNA的克隆 |
| 6.1.6 PEDF与EGFP融合蛋白表达载体的构建 |
| 6.1.7 pEGFP-PEDF质粒转染牙鲆胚胎细胞 |
| 6.1.8 细胞免疫组化 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 牙鲆编码区cDNA的扩增 |
| 6.2.2 pEGFP-PEDF融合基因真核表达载体的构建 |
| 6.2.3 细胞转染和免疫组化结果 |
| 6.3 讨论 |
| 第七章 PEDF的诱导表达特征分析 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 材料 |
| 7.1.2 ARTA诱导 |
| 7.1.3 低氧诱导 |
| 7.1.4 CoC12诱导 |
| 7.1.5 葡萄糖诱导 |
| 7.1.6 细胞老化过程中PEDF的表达 |
| 7.1.7 病毒及poly(I:C)诱导 |
| 7.1.8 PEDF细胞保护实验 |
| 7.1.9 牙鲆体内攻毒实验 |
| 7.1.10 细胞及组织总RNA的提取 |
| 7.1.11 Real-time PCR |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 ARTA诱导表达结果 |
| 7.2.2 低氧状态下PEDF的表达时序 |
| 7.2.3 PEDF表达量与细胞培养时间无关 |
| 7.2.4 葡萄糖诱导诱导表达结果 |
| 7.2.5 PEDF在病毒诱导的FEC细胞中上调表达 |
| 7.2.6 PEDF的保护实验 |
| 7.2.7 攻毒前后牙鲆组织PEDF的表达 |
| 7.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 总结 |
| 附录 |
| 致谢 |
（10）酵母双杂交文库构建与TMEFF2相互作用蛋白筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 引言 |
| 第2章 材料 |
| 第3章 方法 |
| 第4章 结果 |
| 第5章 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A 载体信息 |
| 附录B 测序结果 |
| 附录C 研究生期间的论文 |
| 个人简历 在读期间的学术论文与研究成果 |
四、人脑胶质细胞瘤分化相关基因GDR1全长cDNA的克隆和鉴定（论文参考文献）
- [1]MicroRNA-17对胶质瘤细胞生物学特性的影响及机制研究[D]. 孙广卫. 苏州大学, 2018(04)
- [2]重组人IL-24对胶质瘤干细胞增殖、分化的影响[D]. 王云. 苏州大学, 2013(11)
- [3]NOK基因在人脑胶质细胞瘤增殖和侵袭中的作用及其机制研究[D]. 王江. 第四军医大学, 2012(01)
- [4]BTBD10在人脑胶质瘤中的表达及其对U251细胞株增殖和凋亡的影响[D]. 刘瑜. 第二军医大学, 2010(10)
- [5]诱导MSP58基因高表达对人脑胶质瘤细胞系生物学特性的影响[D]. 王江. 第四军医大学, 2009(12)
- [6]牛8个繁殖性状相关基因cDNA克隆，SNPs及组织表达研究[D]. 淮亚红. 西北农林科技大学, 2008(12)
- [7]MSP58基因在人脑神经胶质瘤增殖和侵袭中的作用及其机制研究[D]. 林伟. 第四军医大学, 2008(02)
- [8]基因（上皮膜蛋白1）在人脑胶质瘤中的表达研究[D]. 张海涛. 第二军医大学, 2007(06)
- [9]病毒诱导牙鲆上调表达基因的筛选及牙鲆色素上皮衍生因子的特征分析[D]. 陈玉栋. 中国科学院研究生院（水生生物研究所）, 2006(10)
- [10]酵母双杂交文库构建与TMEFF2相互作用蛋白筛选[D]. 李静琪. 同济大学, 2006(09)