一、巨噬细胞炎症蛋白-1α对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖反应的影响(论文文献综述)
林结桃[1](2021)在《3D打印血管翳类组织构建类风湿关节炎治疗药物筛选平台》文中进行了进一步梳理类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种侵蚀关节的慢性自身免疫疾病。血管翳是它的典型病理产物,该组织主要由增生肥大的滑膜组织,新生的血管以及纤维素组成。由于目前无法彻底治愈RA,大部分患者需长期依赖药物缓解症状,然而现阶段药物存在副作用大且无效率高的问题。因此,在RA治疗对中高效低毒药物的开发与探索仍然是研究热点,但目前RA模型(普通单层细胞培养和动物模型)已不满足药物高通量筛选的快速发展。近年来,类器官模型已逐步应用于药物筛选,这为构建RA治疗药物的筛选平台提供新的参考。因此,在本研究中我们提出通过3D生物打印技术体外构建RA血管翳病理类组织,探索该模型在药物筛选上发挥的作用。本文先以M1型巨噬细胞、滑膜成纤维细胞(MH7A)和血管内皮细胞(EA.hy 926)作为研究对象,探讨RA血管翳细胞间交流。首先我们对人外周血的单核细胞(THP-1)诱导并鉴定M1型巨噬细胞,通过RT-PCR检测趋化因子CCL2、白介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子(TNF-α)和趋化因子受体CCR7基因表达量,以及流式细胞术检测M1型巨噬细胞中CD80的表达,再利用ELISA检测M1巨噬细胞上清液IL-1β和IL-8分泌蛋白含量,本论文最终选用200 ng/ml浓度佛波酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)诱导的THP-1作为M1巨噬细胞模型。THP-1源M1巨噬细胞上清液用于模拟血管翳中炎症环境,与RPMI-1640完全培养基等比混合作用MH7A 24 h,经过RT-PCR检测,我们发现MH7A的IL-1β、IL-8、VEGF基因表达有明显的升高。此外,我们探索了THP-1源M1巨噬细胞无血清上清液对MH7A和EA.hy 926增殖作用的影响,结果显示MH7A细胞的增殖不受THP-1源M1巨噬细胞炎症环境影响,而EA.hy 926的增殖受到明显抑制,提示细胞间存在信息交流。以上实验结果为血管翳类组织的组建成分提供了参考。三维共培养模型比传统的二维平面培养模型更接近人体生理的细胞组成和行为,更能真实地反映体内药理作用,因此可作为体外药物筛选模型来评估药物的疗效和安全性。在本项研究中,我们构造了一个细胞共培养环境,生物墨水主要成分为MH7A,EA.hy 926细胞和明胶/藻酸盐水凝胶,通过生物打印技术搭建细胞生长所需的三维空间。在长达7天的培养过程中,我们观察到3D支架中的细胞活力和增殖率在稳定地增长。另外,我们在3D打印的支架中评估了细胞间的交流方式,发现随着时间的增加,细胞会产生聚集而且细胞球体尺寸会增大。在3D血管翳模型中,我们用肿瘤坏死因子TNF-α提前刺激MH7A和EA.hy 926,以模拟RA血管翳组织的病理状态。通过ELISA检测,我们发现血管翳模型中血管生成素(ANG)蛋白表达量随着时间的推移而升高。当用RA治疗首选药物甲氨蝶呤(MTX)在血管翳类组织中验证时,发现与血管生成相关的蛋白含量有所下降。综上所述,本文的研究结果证明血管翳中细胞存在信息交流,细胞共培养模式更好地模拟体内病理结构。我们进一步利用3D细胞生物打印技术为细胞共培养提供了一个三维环境,更真实地在体外模拟RA血管翳。这个具有生物病理特征的3D血管翳共培养模型有望成为RA治疗药物研究与发展中的有效平台。
武泽文[2](2021)在《FAPα对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞功能影响的研究》文中提出背景:类风湿关节炎(RA)是一种以滑膜成纤维细胞(Fibroblast-like synoviocytes,FLSs)的增殖、免疫细胞的浸润和血管翳的生成为主要病理表现的慢性系统性自身免疫性疾病。疾病进展会造成关节的滑膜组织损伤,最终致畸致残。但是到目前为止,RA的发病机制仍未完全诠释清楚。FLSs作为滑膜炎症中的重要参与者在疾病发生发展中的作用越来越受到人们的关注。成纤维细胞活化蛋白α(FAPα)主要表达于活化的成纤维细胞表面,研究表明FAPα于肿瘤、肺纤维化等多种疾病中表达升高,并与肿瘤细胞侵袭性相关。那么在RA-FLSs中FAPα扮演怎样的角色,有待进一步研究与讨论。目的:(1)通过对公共测序数据分析筛选RA患者与健康对照(health control,HC)滑膜组织中与FAPα表达相关的差异基因,预测FAPα可能通过哪些通路影响RA疾病的进程。(2)通过体外细胞实验探讨FAPα对RA-FLSs增殖、周期、凋亡、迁移和侵袭能力的影响,以及FAPα对细胞功能的影响是否与SHH信号通路相关,揭示FAPα在RA-FLSs中可能的生物学功能,为将来靶向FAPα+FLSs治疗RA的临床转化提供实验基础。方法:1.生物信息学分析:(1)RA和HC滑膜组织和平台信息数据下载于NCBI GEO数据库。对原始数据进行标准化处理后,使用R语言中“limma”软件包对RA与HC组中的差异基因进行筛选,设定阈值为|log FC|>1且P<0.05;根据基因测序数据中FAPα表达情况将数据分为高低表达两组,筛选差异基因,设定阈值为|log FC|>1且P<0.05。取两组差异基因交集作为下一步分析的关键基因。R语言中“ggplot2”软件包用于绘制RA与HC的火山图和聚类热图。(2)利用Bioconductor中的R package cluster Profiler(10)对关键基因进行GO分析和KEGG分析,P<0.05有统计学意义。(3)利用STRING数据库构建蛋白-蛋白相互作用网络,分析关键蛋白之间可能存在蛋白相互作用,找到FAPα可能的致病相关基因。2.FLSs的获取和鉴定:(1)RA-FLSs和骨关节炎(osteoarthritis,OA)的FLSs均在无菌条件中从关节置换术患者的滑膜组织分离获得,将组织剪碎并用胰蛋白酶消化处理,于含DMEM完全培养基中进行培养。FLSs为贴壁细胞,生长较为缓慢,平均3-4天后贴壁到达80%以上,进行传代培养。本课题所用的细胞均为3-6代细胞。(2)细胞鉴定主要从通过观察细胞形态以及使用FLSs的表面标志物(阳性)FAPα、PDPN和CDH11,以及巨噬细胞表面标志(阴性)CD68进行细胞鉴定。3.si RNA转染实验:设计合成FAPα的小干扰(small interfering RNA,si RNA),通过使用GP-transfect-Mate将si RNA转染至RA-FLSs中。设置空白对照(Blank组)、阴性对照(NC组)和FAPα干扰组(si RNA组)。使用Real-time PCR和Western blot法分别从m RNA和蛋白水平检测FAPα的抑制情况,筛选干扰率最高的si RNA进行后续实验。4.细胞增殖、周期、凋亡、迁移和侵袭能力的检测方法:(1)CCK8法检测实验组与对照组细胞增殖活性情况,利用流式细胞术对细胞的周期和凋亡进行检测,利用Transwell法比较各组FLSs细胞的迁移和侵袭能力改变;(2)Western blot法检测SHH信号通路SHH、PTCH1、GLI1蛋白的表达情况。结果:1.FAPα在RA滑膜中生物学作用的生物信息学分析:通过对RA和HC滑膜组织基因数据的分析,鉴定出与FAPα表达相关的关键基因,通过GO分析与KEGG分析进一步发现这些关键基因主要富集在类风湿关节炎,白细胞迁移、细胞与细胞间连接、细胞外基质胶原相关、受体配体和细胞因子活性、蛋白偶联受体结合、细胞因子受体结合、趋化因子和金属肽酶活性、CCR和CXCR趋化因子受体结合、纤维连接蛋白结合等几条重要信号通路。通过蛋白-蛋白相互作用网络筛选出FAPα表达相关的核心基因MMP1、MMP3、MMP13、CXCL9和CXCL13,经过Real-time PCR对RA-FLSs样本的验证发现MMP3、MMP13表达与FAPα表达差异相关。2.FAPα对FLSs细胞功能的影响:(1)对细胞增殖和周期的影响:细胞增殖检测表明,与NC组比较,转染24h和48h后si RNA组细胞生长率均受到了抑制,差异有统计学意义(P<0.05)。细胞周期检测表明与NC组相比,si RNA组中G0/G1期和S期所占的比例并没有明显的变化,但是G2/M期FLSs所占的比例降低(P<0.05);(2)对细胞凋亡的影响:细胞凋亡检测表明,转染后48h si RNA组与NC组的细胞凋亡情况并没有显着性变化,差异无统计学意义(P>0.05);(3)对细胞迁移和侵袭能力的影响:细胞迁移能力实验表明:与NC组比较,转染后24h si RNA组迁移能力无明显差异,差异无统计学意义(P>0.05),侵袭实验表明转染后24h si RNA组侵袭能力明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05);(4)对RA-FLSs中SHH信号通路的影响:Western blot法结果表明,与NC组相比,si RNA组中SHH和GLI1相对表达量均降低(P<0.05),但PTCH1表达无明显差异(P>0.05)。结论:1.基因测序数据分析结果表明FAPα可以通过影响细胞因子受体结合、趋化因子活性、金属肽酶活性等细胞功能和信号通路影响RA滑膜病理学改变,并且与MMP3、MMP13等核心基因相关;2.FAPα的表达可以促进RA-FLSs的增殖和侵袭能力,但对细胞凋亡、迁移能力无明显作用;3.FAPα对RA-FLSs的增殖和侵袭能力的影响可以与其激活SHH信号通路相关。
代二琴[3](2021)在《雷公藤红素作用RA-FLS的组学联合分析》文中认为类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性全身性的自身免疫性疾病,临床表现为滑膜细胞增生、血管翳形成以及关节软骨和骨破坏。RA患者的滑膜细胞在缺氧和低营养的封闭炎症环境中诱变为成纤维样滑膜细胞(Fibroblast-like synoviocytes,FLS),成纤维样滑膜细胞作为滑膜炎的主要组成细胞,它的侵袭和抗凋亡特性,调节免疫反应和慢性炎症的能力,最终使它成为类风湿关节炎的主要参与者。已有研究表明雷公藤红素(Celastrol,CEL)具有抗炎和抗癌的作用,其具体机制尚未完全清晰。本研究计划以RA患者FLS为研究对象,以CEL处理为实验组(High Dose,HD),以DMSO处理为对照组(Control,Ctrl),对HD组和Ctrl组分别进行RNA-Seq和Label-free,筛选出差异表达基因和差异表达蛋白,进一步筛选出显着差异表达基因和显着差异表达蛋白进行组学联合分析,对GO功能和Pathway途径富集分析,挑选6个候选基因,进行分子对接模拟、q RT-PCR和Western blot验证,探索CEL治疗RA的机制。本研究获得以下结果:1.对HD vs Ctrl的转录水平鉴定得到26565个表达基因,其中差异表达基因7803个,上调4479个,下调3324个;蛋白水平分析鉴定到3372个表达蛋白,差异表达蛋白共687个,357个上调,330个下调;其中一组样品中两次及以上不为空值,另一组所有数据均为空值的差异蛋白393个,169个上调,224个下调;其余部分的差异表达蛋白294个,其中106个上调,188个下调。2.当某一个蛋白被鉴定到且在转录组水平有表达信息时,则认为基因和蛋白被关联到。所有定量蛋白与关联的基因的相关性系数为0.2067,显着差异蛋白与关联的显着差异基因的相关性系数为0.2507,说明转录本与其关联的蛋白质表达一致性并不高。3.本研究采用转录组学和蛋白组学联合分析的方法来研究CEL治疗类风湿关节炎机制,共得到1897个关联上的差异表达基因,在蛋白质水平和转录组均无显着差异的基因有1254个,均有显着差异的基因有80个(转录水平和蛋白水平均上调的有36个;均下调的有15个;转录水平下调蛋白水平上调的27个;转录水平上调蛋白水平下调的2个);仅在蛋白质水平有显着差异的基因有103个;仅在转录组水平有显着差异的基因有460个。4.从关联上的80个显着差异基因的蛋白中筛选已有晶体结构的蛋白,挑选6个,与CEL进行分子对接模拟,验证分子层面CEL与候选蛋白可以相互作用,揭示CEL与候选蛋白的结合能、结合方式和最佳结合位置,用于后续CEL活性结构修饰。5.对候选基因进行q RT-PCR验证,仅ANXA6(p=0.0013)和THBS1(p=0.0077)显着差异表达,使得候选基因的目标范围进一步缩小。6.对候选基因ANXA6的蛋白进行Western blot验证,结果表明相对于Ctrl组,HD组ANXA6的蛋白表达量明显上调。本研究探索了CEL对RA-FLS凋亡作用的分子机制,为RA的靶向治疗提供了一定的理论依据。通过对转录组和蛋白组联合分析筛选出来的关键蛋白,验证后获得的靶蛋白Annexin A6,为Annexin A6在CEL治疗RA的机制奠定基础。
管印[4](2021)在《金银花复方治疗活动期RA湿热瘀阻证临床观察及单体GALU对FLS影响的研究》文中研究说明目的:观察金银花复方对类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)活动期湿热瘀阻证的临床疗效和安全性;探讨复方君药金银花有效成分木犀草苷(Galuteolin,Galu)对于TNF-α诱导的类风湿关节炎成纤维滑膜细胞(fibroblast-like synoviocyte,FLS)的影响,从分子角度分析金银花复方缓解活动期RA的部分潜在作用机制;更好地继承和发掘名老中医经验,为进一步探讨金银花复方的作用机制打下基础。方法:1.临床试验部分:收集60例活动期类风湿关节炎湿热瘀阻证患者,通过临床随机对照试验,采集患者基本资料、四诊信息、实验室检查等资料,观察金银花复方治疗活动期类风湿关节炎湿热瘀阻证的临床疗效,主要观察了中医证候积分、疾病活动度评分(DAS28评分)、类风湿因子(RF)、血沉(ESR)等指标,依据中医证候疗效标准及ACR20/50/70标准,评价疾病治疗的总体疗效。2.基础实验部分:用TNF-α刺激经不同浓度Galu预处理过的RA-FLS,观察不同浓度Galu对TNF-α刺激下的RA-FLS细胞增殖的影响,选取最佳Galu浓度进行后续实验;观察Galu对RA-FLS增殖、凋亡、炎症方面的影响,探索Galu发挥作用的可能途径。在研究中,用CCK-8比色法检测细胞增殖情况;TUNEL法检测细胞凋亡;Western blot检测IKKβ、p-p65、p65、p-IκB、I-κB、Cleaved-caspase-3,Caspase-3,Bcl-2和Bax的表达;qRT-PCR检测HO-1;ELISA法检测促炎症细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8和MMP1的含量。结果:1.临床部分:本临床试验共有57例患者完成了 12周的观察,其中女性患者41例,男性患者16例。对于两组治疗前的性别、年龄、病程、治疗前中医证候积分、治疗前DAS28的基线进行统计学比较均无统计学差异(P>0.05),具有可比性。1.1中医证候疗效方面,治疗组临床缓解的有10例,显效有15例,有效2例,无效2例;对照组临床缓解的有4例,显效有9例,有效9例,无效6例。因显效级别为等级变量,故采用秩和检验对两组疗效进行差异性分析可知,治疗组平均秩次为34.98,对照组为22.80,秩次越高表明疗效越好,Z=-2.918,P=0.004<0.05,即两组疗效存在差异,治疗组疗效更好。1.2 ACR20/50/70疗效方面,治疗组达到ACR20标准的患者有16例,达到ACR50标准的有7例,达到ACR70标准的有1例;对照组达到ACR20标准的患者有12例,达到ACR50标准的有9例,无达到ACR70标准的患者。因ACR疗效为等级变量,故采用秩和检验对两组ACR疗效进行差异性分析可知,治疗组平均秩次为29.41,对照组为28.57,Z=-0.208,P=0.835>0.05,即两组ACR疗效不存在差异。1.3中医证候积分方面,经12周的治疗后,治疗组及对照组均能明显降低患者的中医证候积分,且治疗组的疗效优于对照组。随后进一步比较了各症状的单项评分,发现治疗组及对照组均能明显降低患者的关节疼痛、关节肿胀、关节压痛及晨僵评分,治疗组还能显着降低屈伸不利、关节发热、疼痛夜甚及舌黯证候评分。在关节发热、疼痛夜甚、舌黯方面治疗组的疗效明显优于对照组,而在关节疼痛、关节肿胀、关节压痛、屈伸不利及晨僵五项积分中,两组疗效的差异尚未达到统计学意义。1.4治疗12周后,治疗组及对照组均能明显降低患者的DAS28评分,但两组之间比较无统计学差异,即在降低DAS28评分方面两组疗效相当。1.5在ESR/RF方面,治疗组及对照组均能明显降低患者的ESR、RF,在降低ESR水平方面治疗组的疗效优于对照组,在改善RF方面两组无统计学差异。2.实验部分2.1 Galu以剂量依赖性方式显着抑制RA-FLS细胞的增殖。2.2 Galu可上调HO-1、Cleaved-caspase-3和Bax的表达水平,降低Bcl-2的表达水平,显着促进RA-FLS细胞凋亡率;而且,HO-1可能参与了 Galu的促凋亡过程,并且是Galu诱导RA-FLS细胞凋亡中的下游靶标。2.3 Galu还能显着降低RA-FLS细胞中促炎因子IL-1β、IL-6、IL-8和MMP1的水平,对TNF-α诱导的RA-FLS细胞炎症具有良好的抑制作用;并且,HO-1可能是Galu在抑制RA-FLS细胞炎症中的下游靶标。2.4 Galu可显着抑制IKKβ、p-p65和p-IκB的水平,而沉默HO-1可上调上述蛋白在RA-FLS中的表达。结果表明,Galu可能通过激活HO-1抑制IKKβ/NF-κB途径,以抑制TNF-α诱导的RA-FLS细胞的增殖和炎症。结论:1.联合运用金银花复方可以更好地缓解活动期RA湿热瘀阻证患者的临床症状,降低相关炎症指标水平,提高中医证候缓解程度。2.金银花复方君药单体Galu可能通过激活HO-1的表达,抑制IKKβ/NF-κB信号通路,从而抑制RA中滑膜细胞增殖和炎症反应,促进滑膜细胞的凋亡。
敖丽梅[5](2020)在《蒙药三子汤为基础的系列方剂对CIA大鼠关节新生血管的影响》文中认为目的1.观察蒙药三子汤对胶原诱导性关节炎(Collagen-induced arthritis,CIA)模型大鼠关节炎症的影响,比较三子汤、森登4汤、忠伦5汤缓解炎症的作用差异。2.明确三子汤为基础的系列方剂对CIA模型大鼠关节新生血管形成的作用和潜在机制,分析森登4汤、忠伦5汤与三子汤相比是否具有增效作用或其他作用机制差异。3.观察三子汤为基础的系列方剂含药血清对人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(Fibroblast-like synoviocytes,FLS)和人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)增殖的影响以及对HUVEC管腔形成的影响。方法实验一:以CIA大鼠为研究对象,通过对其体重、关节肿胀度、关节炎评分、关节病理改变和炎性因子白介素(Interleukin,IL)-1β、干扰素(Interferon,IFN)-γ水平的评估,观察三子汤、森登4汤、忠伦5汤的不同剂量改善CIA滑膜炎症的作用,筛选出最佳剂量,比较三种复方的药效差异。对120只雄性SD大鼠随机分组:正常对照组(n=10)、造模组(n=110),对造模组构建CIA模型;模型建立完成后,对大鼠随机分组如下:模型对照组,雷公藤多苷片组(0.02g/kg/d),三子汤低、中、高剂量组(1.35g/kg/d,2.7g/kg/d,5.4g/kg/d),森登 4 汤低、中、高剂量组(1.35g/kg/d,2.7g/kg/d,5.4g/kg/d)和忠伦 5汤低、中、高剂量组(1.35g/kg/d,2.7g/kg/d,5.4g/kg/d),各组6只,对正常对照组和模型对照组灌胃蒸馏水;在初次接受免疫后的第21天,对大鼠口服灌胃给药,持续4周,每日一次;分别在致炎前、给药前、给药1周、2周、3周和4周后,观察记录各组大鼠的一般状态、体重、足爪厚度,对关节炎指数进行评分;灌胃给药前实施大鼠目内眦取血,酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay,Elisa)法检测抗二型胶原(Collagen typeⅡ,CⅡ)抗体含量;给药4周结束后取材,采用苏木精-伊红(Hematoxylin and Eosin,HE)染色对CIA大鼠踝关节的病理改变进行观察,采用免疫组化法对大鼠踝关节中的炎性因子IL-1β、IFN-γ的表达情况进行检测。实验二:明确三种复方改善CIA大鼠滑膜新生血管的作用和潜在的机制,筛选最佳剂量,比较三种复方的作用差异。延续实验一,取材结束后Elisa法检测CIA大鼠外周血清中血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、内皮型一氧化氮合酶(Endothelial nitric-oxide synthase,eNOS)、组织纤溶酶原激活物(Tissue plasminogen activator,tPA)含量;运用免疫组化法检测CIA大鼠踝关节中VEGFA、胎盘生长因子(Placental growth factor,PLGF)、缺氧诱导因子(Hypoxia inducible factor,HIF)-α的表达情况;蛋白质印迹法(Western blot,WB)检测大鼠踝关节中血管生成素(Angiopoietin,Ang)-1、Ang-2、酪氨酸激酶受体(Tyrosine kinase receptor,Tie)-2蛋白的表达。实验三:通过运用血清药理学方法观察三种复方不同浓度的含药血清在体外实验中对RA-FLS和HUVEC增殖的作用以及对HUVEC管腔形成的影响,筛选出最佳浓度,比较三种复方之间差异,并结合检测血管生成相关的细胞因子,初步探讨三种复方对RA-FLS和HUVEC增殖的作用机制。制备三种复方的含药血清,分别建立以IL-1 β诱导的RA-FLS损伤模型和以VEGF165诱导的HUVEC损伤模型,MTT法检测三种复方不同浓度(5%、10%、20%)的含药血清对两种体外细胞损伤模型的细胞活力;观察三种复方含药血清对HUVEC管腔形成的影响;Elisa法检测RA-FLS细胞上清中VEGF、PLGF、Ang-1、Ang-2的含量及HUVEC细胞上清中血管内皮生长因子受体(Vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)-1、VEGFR-2、Tie-2 的含量。结果实验一:与正常对照组相比,模型对照组大鼠血清抗CⅡ抗体含量显着增高(P<0.01),提示CIA模型建立成功。与模型对照组相比,三子汤和忠伦5汤高剂量可明显增加大鼠体重(P<0.05);森登4汤和忠伦5汤的高剂量能明显缓解CIA大鼠关节肿胀的程度(P<0.05);三子汤中、高剂量,森登4汤低、中、高剂量和忠伦5汤高剂量都能明显降低CIA大鼠关节炎症评分(P<0.05);三种复方的高剂量都可以明显缓解CIA大鼠踝关节炎症及减轻新生血管的生成(P<0.05);森登4汤和忠伦5汤的高剂量对降低大鼠踝关节中IL-1β、IFN-γ表达具有明显作用(P<0.05),而三子汤没有明显作用(P>0.05)。实验二:Elisa结果显示,与模型对照组相比,三子汤、森登4汤的高剂量和忠伦5汤中、高剂量可以明显降低大鼠血清中VEGF含量(P<0.05);各给药组大鼠外周血清中eNOS含量均明显降低(P<0.05),以三子汤、森登4汤的高剂量和忠伦5汤中剂量效果最佳;忠伦5汤中、高剂量组大鼠外周血清中tPA含量均明显降低(P<0.05)。免疫组化方法结果显示,与模型对照组相比,森登4汤、忠伦5汤的高剂量组大鼠踝关节中VEGFA的表达明显降低(P<0.01);雷公藤多苷片组,三子汤、森登4汤和忠伦5汤的中、高剂量组大鼠踝关节中PLGF表达均呈降低趋势,但没有统计学意义(P<0.05);森登4汤和忠伦5汤高剂量组大鼠踝关节中的HIF-α表达明显降低(P<0.05)。WB检测结果显示,与模型对照组相比,三子汤、忠伦5汤的高剂量和森登4汤的中、高剂量有下调大鼠踝关节中的Ang-1蛋白表达的趋势,但无统计学意义(P<0.05);三种复方的各给药剂量都能降低大鼠踝关节中Ang-2蛋白的表达(P<0.05);三子汤、森登4汤的中剂量能降低大鼠踝关节中Tie-2蛋白的表达(P<0.05)。实验三:MTT结果显示,与IL-1 β诱导组相比,三种复方含药血清在抑制RA-FLS增殖方面均有显着作用(P<0.05),最佳浓度都是20%;与VEGF165诱导组相比,三种复方含药血清均能抑制HUVEC的增殖(P<0.05),以20%浓度的三子汤、10%和20%的忠伦5汤含药血清的效果最显着;两种细胞得出各组含药血清疗效的最佳作用时间均为24小时。HUVEC管腔形成实验结果显示三种复方20%浓度组的含药血清都有减少VEGF165诱导的HUVEC的管腔形成的趋势,但无统计学意义(P>0.05)。Elisa检测结果显示,与IL-1β诱导组相比,10%、20%的三子汤、森登4汤和忠伦5汤含药血清组作用下的VEGF含量均明显降低(P<0.01);各浓度组的三子汤、森登4汤和忠伦5汤含药血清均能有效降低PLGF、Ang-1的含量(P<0.01);20%的三子汤、10%、20%的森登4汤和忠伦5汤含药血清均能明显降低Ang-2的含量(P<0.05)。与VEGF165诱导组相比,三种复方含药血清的各个浓度都能降低VEGFR-1的含量(P<0.01);10%、20%三子汤以及5%、10%、20%的森登4汤和忠伦5汤含药血清能降低VEGFR-2的含量(P<0.01);10%、20%的三种复方含药血清能降低Tie-2的含量(P<0.05);各细胞因子有效药物的最佳浓度均为20%。结论森登4汤和忠伦5汤与基础方三子汤相比,在缓解CIA大鼠关节炎症方面具有一定的增效作用,但两者之间没有显着差异。三种复方都能通过调控参与HIF-VEGF-Ang轴中的关键细胞因子来发挥缓解CIA关节新生血管的作用,但发挥药效作用机制各有偏重,三子汤主要通过降低血管生成刺激因子VEGF、eNOS的表达、抑制Ang-2/Tie-2途径发挥作用;森登4汤通过VEGF、HIF-α、eNOS的表达、抑制Ang-2/Tie-2途径发挥作用;忠伦5汤通过下调VEGF、HIF-α、eNOS和Ang-2的表达发挥作用;森登4汤的作用靶点更多,在抗血管新生方面可能更具优势。为三子汤为基础的系列方剂治疗类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)和进一步研究蒙药优化组方、新药研发提供了科学依据。
孔瑞娜[6](2020)在《艾拉莫德调控miR-146a介导的IRAK1/TRAF6/JNK1通路治疗类风湿关节炎的机制研究》文中研究指明类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是以对称性多关节炎为临床特征的慢性炎症性疾病。病理特征是关节滑膜的炎症和增生,伴骨、软骨的侵蚀。其发病机制尚不明确,表观遗传学可能是未来的研究方向。RA成纤维样滑膜细胞(Fibroblast-like synoviocytes,FLS)作为滑膜炎的主要组成细胞,它的侵袭和抗凋亡特性,以及调节免疫反应和慢性炎症的能力,最终使它成为关节炎的主要参与者。了解RA-FLS的表观遗传特性可能有助于我们识别RA新的诊断和预后标志物以及治疗靶点。近年来,micro RNA(mi RNA)在RA-FLS中的功能研究成为RA机制研究的热点。我们前期研究发现mi R-146a在RA患者的成纤维样滑膜细胞中表达下调,这引起了我们的兴趣。mi R-146a在RA中到底扮演一个什么角色呢?是促炎基因还是抑炎基因呢?生物信息学预测和双荧光素酶报告基因都证实白介素-1受体相关激酶1(Interleukin-1 receptor-associated kinase 1,IRAK1)、肿瘤坏死因子受体相关因子6(Tumor necrosis factor receptor-associated factor-6,TRAF6)是mi R-146a的靶基因。TRAF6是c-Jun氨基末端激酶(C-Jun N-terminal kinase,JNK)的上游分子,JNK信号通路与细胞增殖、凋亡、炎症反应关系密切。本研究拟以此为切入点,深入研究mi R-146a对RA-FLS生物学行为的影响,探索mi R-146a调控RA-FLS的分子机制。并在此基础上,从分子、细胞、动物模型水平来系统研究新型免疫调节剂艾拉莫德是否可以通过调节mi R-146a发挥抑制RA滑膜增殖、炎症反应的作用。第一部分Mi R-146a靶向IRAK1/TRAF6/JNK1信号通路对RA-FLS增殖、侵袭、迁移、凋亡和炎症反应的调控机制研究目的:明确mi R-146a在RA-FLS中的表达情况,研究mi R-146a对RA-FLS增殖、侵袭、迁移、凋亡及炎症反应的作用,探讨mi R-146a调控RA-FLS的分子机制。方法:(1)收集RA患者、创伤对照患者的滑膜,酶消化法提取人原代成纤维样滑膜细胞,并培养。(2)实时定量PCR(RT-q PCR)检测RA-FLS和Ctrl-FLS中mi R-146a的表达情况。(3)mi R-146a mimic质粒和inhibitor质粒及其相应的阴性对照转染RA-FLS。(4)RT-q PCR检测质粒转染后RA-FLS中mi R-146a的表达情况。(5)CCK-8法检测细胞活性,比较转染后RA-FLS增殖情况。(6)Transwell侵袭实验比较转染后RA-FLS的侵袭能力。(7)Wound healing细胞划痕实验比较转染后RA-FLS的迁移能力。(8)AV/PI流式细胞仪检测转染后RA-FLS细胞凋亡率。(9)收集FLS上清液,酶联免疫吸附法(ELISA)检测TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17的表达水平。(10)提取FLS总RNA及蛋白,分别用RT-q PCR和Western blot法检测靶基因及通路分子的m RNA和蛋白水平。结果:(1)RT-q PCR结果显示RA-FLS组mi R-146a水平明显低于Ctrl-FLS组。(2)与Mimic-NC组比较,过表达mi R-146a能明显抑制RA-FLS的增殖;与Inhibitor-NC组比较,抑制mi R-146a表达可促进RA-FLS的增殖。(3)Transwell侵袭实验结果显示,与Mimic-NC组比较,过表达mi R-146a能明显减少RA-FLS侵袭的细胞数;与Inhibitor-NC组比较,抑制mi R-146a表达能使RA-FLS侵袭的细胞数增多。(4)Wound healing细胞划痕实验显示,与Mimic-NC组比较,过表达mi R-146a能明显减低RA-FLS的迁移率;与Inhibitor-NC组比较,抑制mi R-146a表达可促进RA-FLS的迁移。(5)AV/PI流式细胞仪检测结果显示,与Mimic-NC组比较,过表达mi R-146a能明显增加RA-FLS细胞凋亡率;与Inhibitor-NC组比较,抑制mi R-146a表达能使RA-FLS细胞凋亡率下降。(6)ELISA法结果提示过表达mi R-146a可以抑制RA-FLS分泌TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17,而抑制mi R-146a表达会促进RA-FLS分泌TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17。(7)RT-q PCR、Western blot结果提示过表达mi R-146a能降低IRAK1、TRAF6 m RNA和IRAK1、TRAF6、p-JNK1蛋白水平。而抑制mi R-146a表达会升高IRAK1、TRAF6 m RNA和IRAK1、TRAF6、p-JNK1蛋白水平。结论:在RA-FLS中,mi R-146a表达下调,过表达mi R-146a能抑制RA-FLS的增殖、侵袭、迁移能力及炎症反应,促进RA-FLS凋亡。mi R-146a的这种作用机制可能与抑制IRAK1/TRAF6/JNK1信号通路有关。本研究揭示了mi R-146a对FLS细胞生物学行为的调控机制,为以后利用mi R-146a作为RA治疗靶点提供了坚实的理论基础。第二部分艾拉莫德(T-614)通过调控mi R-146a抑制RA-FLS功能的体外、体内研究目的:通过体外实验研究艾拉莫德(T-614)对RA-FLS中mi R-146a及其靶基因IRAK1、TRAF6的调控机制,阐明艾拉莫德对mi R-146a Inhibitor质粒转染后RA-FLS增殖、侵袭、迁移、凋亡和炎症反应的影响,验证艾拉莫德可以通过调节mi R-146a发挥抑制RA-FLS功能的作用。然后建立CIA大鼠模型,通过体内实验阐明艾拉莫德抑制RA滑膜增殖、炎症反应的作用与调控mi R-146a有关。方法:(1)CCK-8法检测艾拉莫德对RA-FLS活力的影响。(2)艾拉莫德干预RA-FLS后,RT-q PCR和Western blot法检测mi R-146a及靶基因通路的m RNA和蛋白水平。(3)艾拉莫德干预mi R-146a Inhibitor质粒转染后RA-FLS,RT-q PCR检测mi R-146a的表达。(4)CCK-8法检测细胞存活率,比较艾拉莫德干预质粒转染后RA-FLS的增殖情况。(5)Transwell侵袭实验比较艾拉莫德干预质粒转染后RA-FLS的侵袭能力。(6)艾拉莫德干预后,Wound healing细胞划痕实验比较质粒转染后RA-FLS的迁移能力。(7)AV/PI流式细胞仪检测艾拉莫德干预质粒转染后RA-FLS细胞凋亡率。(8)收集艾拉莫德干预质粒转染后FLS上清液,ELISA法检测TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17的表达水平。(10)提取FLS总RNA及蛋白,分别用RT-q PCR和Western blot法检测靶基因及通路分子的m RNA和蛋白水平。(9)建立CIA大鼠模型,进行艾拉莫德、mi R-146a inhibitor质粒干预,采用关节炎评分评估CIA大鼠关节炎严重程度。(10)HE染色观察大鼠滑膜组织病理改变。(11)TUNEL染色检测大鼠滑膜细胞的凋亡情况。(12)分别用RT-q PCR法和免疫组化(IHC)检测炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17的表达情况。(13)分别用RT-q PCR法和IHC法检测大鼠滑膜组织中mi R-146a及靶基因通路的表达情况。结果:(1)20μg/m L、40μg/m L、80μg/m L、160μg/m L T-614干预RA-FLS,可显着抑制RA-FLS的细胞活力,明显上调RA-FLS中的mi R-146a水平,降低IRAK1、TRAF6的水平。且随着T-614的浓度增大,RA-FLS细胞活力抑制越明显;mi R-146a水平随之升高,IRAK1、TRAF6的水平也随着下降。确定20μg/m L T-614用于后续实验。(2)20μg/m L T-614干预mi R-146a Inhibitor质粒转染后RA-FLS,RT-q PCR结果显示,Inhibitor-mi R-146a组RA-FLS中mi R-146a表达量较Inhibitor-NC组明显下调;T614&inhibitor-NC组RA-FLS中mi R-146a表达量明显高于Inhibitor-NC组和T614&inhibitor-mi R-146a组。(3)CCK-8检测结果显示,Inhibitor-mi R-146a组RA-FLS细胞增殖能力高于Inhibitor-NC组,并且在72h时具有显着差异;T614&inhibitor-NC组RA-FLS细胞增殖能力低于Inhibitor-NC组和T614&inhibitor-mi R-146a组,并且在72h具有显着差异。(4)Transwell侵袭实验结果显示,Inhibitor-mi R-146a组RA-FLS侵袭细胞数目高于Inhibitor-NC组;T614&inhibitor-NC组RA-FLS侵袭数目明显少于Inhibitor-NC组和T614&inhibitor-mi R-146a组。(5)Wound healing细胞划痕实验显示,与Inhibitor-NC组相比,Inhibitor-mi R-146a组RA-FLS愈合面积明显增大;T614&inhibitor-NC组RA-FLS愈合面积明显少于Inhibitor-NC组和T614&inhibitor-mi R-146a组。(6)AV/PI流式细胞仪检测结果显示,与Inhibitor-NC组相比Inhibitor-mi R-146a组RA-FLS凋亡比例明显降低;T614&inhibitor-NC组RA成纤维样滑膜细胞凋亡显着高于Inhibitor-NC组和T614&inhibitor-mi R-146a组。(7)Inhibitor-mi R-146a组RA-FLS上清液中TNF-a、IL-1β、IL-6和IL-17含量高于Inhibitor-NC组;T614&inhibitor-NC组促炎因子水平低于Inhibitor-NC组和T614&inhibitor-mi R-146a组。(8)RT-q PCR、Western blot结果显示,Inhibitor-mi R-146a组RA-FLS中IRAK1、TRAF6 m RNA和IRAK1、TRAF6、p-JNK1蛋白的表达水平高于Inhibitor-NC组;T614&inhibitor-NC组RA-FLS中IRAK1和TRAF6 m RNA和IRAK1、TRAF6、p-JNK1蛋白的表达水平低于Inhibitor-NC组和T614&inhibitor-mi R-146a。(9)Inhibitor-mi R-146a组CIA大鼠的关节炎评分高于Model组;T-614组CIA大鼠的关节炎评分低于Model组和T-614&inhibitor-mi R-146a组,而T-614&inhibitor-mi R-146a组的CIA大鼠关节炎评分低于inhibitor-mi R-146a组。(10)滑膜HE染色结果显示,Model组大鼠滑膜上皮增生,炎症细胞浸润明显。Inhibitor-mi R-146a组CIA大鼠滑膜增生、炎症细胞浸润程度高于Model组;T-614组CIA大鼠的滑膜增生和炎症细胞浸润程度低于Model组和T614&inhibitor-mi R-146a组,且T614&inhibitor-mi R-146a组CIA大鼠的滑膜增生和炎症细胞浸润程度低于Inhibitor-mi R-146a组。(11)滑膜TUNEL染色结果显示,Model组凋亡细胞百分比低于Control组;Inhibitor-mi R-146a组凋亡细胞百分比低于Model组;T614组凋亡细胞百分比高于Model组和T614&inhibitor-mi R-146a组;且T614&inhibitor-mi R-146a组凋亡细胞百分比高于Inhibitor-mi R-146a组。(12)RT-q PCR检测和IHC结果都显示,Model组TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17表达高于Control组,低于Inhibitor-mi R-146a组;T-614组TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17表达低于Model组和T614&inhibitor-mi R-146组;且T614&inhibitor-mi R-146a组TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17表达低于Inhibitor-mi R-146a组。(13)RT-q PCR检测和IHC结果提示,Model组与Control组相比,mi R-146a表达量下降,而IRAK1、TRAF6和p-JNK1表达升高;Inhibitor-mi R-146a组与Model组相比,mi R-146a表达量下降,IRAK1、TRAF6和p-JNK1表达升高;与Model组和T614&inhibitor-mi R-146组相比,T-614组mi R-146a表达量升高,而IRAK1、TRAF6和p-JNK1表达下降;且与Inhibitor-mi R-146a组相比,T614&inhibitor-mi R-146a组mi R-146a表达量升高,而IRAK1、TRAF6和p-JNK1表达下降。结论:艾拉莫德能抑制RA-FLS细胞增殖、迁移、侵袭和炎症,促进其凋亡;同时上调RA-FLS中mi R-146a表达,降低IRAK1、TRAF6和p-JNK1的水平;抑制mi R-146a可以消弱艾拉莫德抑制RA-FLS细胞增殖、迁移、侵袭和炎症,促进其凋亡的作用。CIA大鼠中mi R-146a表达被抑制后,艾拉莫德对RA滑膜增殖和炎症的抑制作用减弱,同时IRAK1、TRAF6和p-JNK1表达升高。艾拉莫德在体外、体内都能够通过上调mi R-146a,下调其靶基因IRAK1、TRAF6,发挥抑制RA-FLS增殖及炎症反应,促进其凋亡的作用。艾拉莫德对RA的治疗作用,部分是通过上调mi R-146a,下调IRAK1/TRAF6/JNK1信号通路实现的。
邱明亮[7](2020)在《miR-150-5p/SOCS1在类风湿关节炎中的临床意义及其调控机制》文中指出背景:类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以滑膜炎为主要病理改变的系统性炎症性自身免疫病,全球发病率约为0.5-1.0%。我国大陆地区患病率约为0.42%,总患病人数约500万。目前,我国的RA治疗效果尚不理想,据估计有超过50%的中国RA患者,在诊断后没有经过规范治疗。作为一种常见的致残性疾病,本病的长期治疗及预后不佳,给患者家庭及社会带来沉重的经济负担。因此,迫切需要探求早期诊断、评估病情的生物标志物及有效的治疗靶点。细胞因子信号转导抑制因子(suppressor of cytokine signaling,SOCS)家族是特征性SOCS盒胞浆蛋白分子家族。SOCS是细胞因子信号传导的经典抑制剂,由SOCS1-7和CIS等8种成分组成。其中,SOCS1在免疫细胞的调节中发挥重要作用。SOCS1的SH2结构域可直接与激活的Janus激酶(JAKs)环结合,且通过其激酶抑制区域直接抑制JAK酪氨酸激酶活性。并且Janus激酶/信号传导和转录激活因子(Janus kinase-signal transducer and activator of transcription,JAK-STAT)通路是RA发病机制中公认的重要信号通路。因此,SOCS1可能参与了RA的发病过程,针对SOCS1参与的通路进行研究,可能为RA的治疗提供潜在的靶点。众所周知,编码基因的表达水平受到上游Micro RNA(miRNA)的调控,目前有文献证实miRNA的表达异常和RA的发生发展有着密切的联系,因此探索靶基因相关miRNA是研究靶基因的核心环节。miRNA是真核生物内源基因编码的18-25个核苷酸长单链非编码RNAs。在固有免疫及适应性免疫的信号转导过程中,miRNAs均起着重要的调节作用。目前报道的miRNAs,包括miR-146a、miR-155、miR-223等,可能参与了RA的发生发展过程。有报道显示,相对于骨性关节炎患者,RA外周血来源外周血单核细胞的miR-150-5p在RA患者中高表达。另有报道,注射间充质干细胞来源的miR-150-5p外泌体可降低胶原诱导关节炎小鼠的后脚掌厚度和临床关节炎评分。因而,miR-150-5p亦可能参与了RA的发病过程。既往研究显示,在系统性红斑狼疮中,miR-150-5p可通过作用于SOCS1,上调促纤维化蛋白,从而促进肾纤维化。说明miR-150-5p与SOCS1存在相互作用。两者的共同作用,是否参与了RA的发生发展,则需进一步明确。在RA患者关节中,RA滑膜成纤维细胞(rheumatoid arthritis synovial fibroblasts,RASFs)大量增加,导致滑膜增厚。同时RASFs可导致细胞外基质变性降解,进而侵蚀关节软骨和骨。因而在RA的发病过程中,RASFs是关键细胞之一。基于JAK-STAT通路,通过miR-150-5p靶向调控SOCS1的表达,影响RASFs的生物学功能,从而改善RA的预后,值得研究。如上所述miR-150-5p/SOCS1在RA中的作用,我们提出miR-150-5p和SOCS1可能作为诊断和评估RA的病情的生物标志物;miR-150-5p通过调控SOCS1的表达,进而影响JAK-STAT通路,从而改变RASFs的凋亡、增殖等生物学效应,最终影响RA的发生发展。为验证假设,本文进行了以下三方面的探索:第一部分,通过系统评价,探讨RA患者外周血SOCS1 m RNA的表达及其与RA的相关性。第二部分,通过病例对照研究,探索外周血白细胞(peripheral blood leukocyte,PBL)中SOCS1 m RNA、miR-150-5p在RA患者中的表达;二者对RA的诊断价值,及其与临床疾病活动度指标、实验室炎症指标的相关性。第三部分,通过细胞实验,在RASFs细胞系MH7A细胞中,探讨miR-150-5p对SOCS1及JAK-STAT通路的作用,以及对MH7A细胞的生物学效应。第一部分外周血SOCS1 m RNA与RA相关性的系统评价目的:系统评价RA患者外周血SOCS1 m RNA与RA的相关性方法:计算机检索英文数据库:Pub Med、Embase、Web of Science、the Cochrane Library,及中文数据库:中国期刊全文数据库、中文科技期刊数据库、万方数据库、中国生物医学文献数据库。检索时限从建库至2019年10月。手工检索相关杂志,搜集国内外有关外周血来源的SOCS1 m RNA与RA相关性的研究,同时追踪纳入文献的参考文献。按照Newcastle-Ottawa Scale评价纳入文献质量,提取有效数据,用Revman 5.3进行Meta分析。用STATA12.0进行敏感性分析及发表偏倚分析。结果:共纳入4个研究,其中3个病例对照研究,1个队列研究。共307例样本,其中239例RA样本,68例健康对照者样本。结果显示:(1)与健康对照组比较,RA患者外周血T细胞的SOCS1 m RNA明显升高[WMD=1.98,95%CI(1.14,2.83),P<0.05];RA患者外周血单核/巨噬细胞的SOCS1 m RNA明显升高(P<0.05);RA患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)的SOCS1 m RNA无明显升高[WMD=0.47,95%CI(-0.91,1.85),P>0.50]。(2)敏感性分析发现,Ortiz,A.M(2013)队列研究为异质性来源。剔除此项研究后,所有病例对照研究的亚组分析显示,与健康对照组比较,RA患者PBMC的SOCS1 m RNA明显升高[WMD=1.10,95%CI(0.51,1.68),P=0.0002]。(3)Begg漏斗图(P=0.089)或Egger回归检验(P=0.018)提示,可能存在发表偏倚。结论:SOCS1与RA可能存在一定的相关性。但结果估算的精确性,可能受样本量较小、发表偏倚等因素的影响。第二部分RA患者PBL中miR-150-5p、SOCS1 m RNA的表达及其临床意义目的:探讨RA患者PBL中miR-150-5p、SOCS1 m RNA的表达及其与RA临床疾病活动度指标、实验室炎症指标的相关性。对象和方法:纳入自2018年5月至2018年12月,就诊于江西中医药大学附属医院风湿病科,符合RA分类标准的患者57例,同期选择19例年龄、性别等相匹配的健康体检者作为健康对照组。(1)测定所有受试者的血常规、肝功能、肾功能、血沉(erythrocyte sedimentation rate,ESR)、C反应蛋白(C-reaction protein,CRP)等一般实验室资料。(2)采用聚合酶链式反应法(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)测定所有受试者外周血miR-150-5p、SOCS1 m RNA的表达水平。(3)采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定所有受试者的肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α,白细胞介素(interleukin,IL)-6,IL-21的相对表达水平。(4)评估RA患者的疾病活动度:疾病活动性评分(28-joint disease activity score,DAS 28)-ESR、DAS28-CRP、临床疾病活动指数(clinical disease activity index,CDAI)、简化疾病活动指数(simplified disease activity index,SDAI)。(5)统计分析RA组与健康对照组的miR-150-5p、SOCS1 m RNA的表达水平。并分析miR-150-5p、SOCS1 m RNA对RA的诊断价值,及其与疾病活动度、实验室指标的相关性。结果:(1)与健康对照组比较,RA组的miR-150-5p表达水平低,有统计学差异(4.61±0.17 vs 1.75±0.79,P<0.05);而SOCS1 m RNA表达水平升高,有统计学差异(9.18±0.38 vs 18.12±1.57,P<0.05);(2)与健康对照组比较,RA组的IL-6表达水平升高,有统计学差异(38.36±7.00 vs 57.91±32.64,P<0.05);而TNF-α、IL-21的表达水平无显着差异(P>0.05);(3)通过ROC曲线比较,根据Youden指数,RA患者PBL中miR-150-5p区分RA患者与健康人群的最佳界值为3.06(AUC=0.974,P<0.05);SOCS1m RNA无法区分RA患者(AUC=0.425,P>0.05);(4)miR-150-5p、SOCS1 m RNA的相对表达水平与ESR、CRP、TNF-α、IL-6、IL-21、DAS28-ESR、DAS28-CRP、CDAI、SDAI等指标无明显相关性(P>0.05)。结论:RA患者PBL中miR-150-5p低表达,SOCS1 m RNA高表达。miR-150-5p可能是区分RA与健康人群的潜在生物标志物。第三部分miR-150-5p对RASFs生长和SOCS1表达的影响目的:miR-150-5p参与了免疫疾病的调控和发病,其具体机制尚不明确。本部分着重探讨miR-150-5p对RASFs细胞的生长,及对SOCS1和JAK2-STAT3通路的影响。方法:(1)设计与合成靶向结合SOCS1基因的miR-150-5p mimics和negative control mimics;(2)培养MH7A细胞,实验随机分为3组:正常对照(Normal control)组、NC mimics组,miR-150-5p mimics组;基于上述分组,miR-150-5p模拟剂(miR-150-5p mimics)、阴性对照模拟剂(negative control mimics,NC mimics)分别转染MH7A细胞。(3)双荧光素酶法验证miR-150-5p、SOCS1的靶向结合关系;(4)CCK8检测细胞活性;流式细胞学方法检测细胞凋亡及细胞周期;RT-PCR测定miR-150-5p及SOCS1 m RNA的表达;Western Blot蛋白测定SOCS1、JAK2、p JAK2、STAT3、p STAT3等蛋白;ELISA测定细胞培养上清中TNF-α、IL-6的表达水平。结果:(1)与NC mimics组比较,miR-150-5p mimics组细胞凋亡率降低(28.877±1.241 vs 19.963±2.264,P<0.05)和S期细胞比例升高(13.780±6.878 vs 26.003±1.917,P<0.05);RASFs细胞增殖率升高(103.230±11.998 vs 130.751±22.702,P<0.05);(2)双荧光素酶报告基因分析结果显示,与NC mimis组比较,miR-150-5p mimics组的相对荧光强度明显下降,有统计学差异(25.462±1.006 vs 21.839±0.187,P<0.05);(3)与NC mimics组比较,miR-150-5p mimics组SOCS1 m RNA的相对表达水平显着降低,有统计学差异(1.2401±0.164 vs 0.190±0.050,P<0.05);(4)与NC mimics组相比,miR-150-5p mimics组SOCS1蛋白的表达水平显着降低,有统计学差异(0.629±0.052 vs 0.459±0.028,P<0.05);miR-150-5p mimics组JAK2、p JAK2、STAT3、p STAT3等蛋白的表达水平无显着差异(P>0.05);(5)与NC mimics组比较,miR-150-5p mimics组细胞培养基中的IL-6水平明显升高,有统计学差异(63.294±1.798 vs 132.570±5.886,P<0.05);对TNF-α的表达水平无明显影响(P>0.05)。结论:miR-150-5p可促进MH7A细胞的生长及IL-6的分泌,抑制SOCS1 m RNA的表达。提示miR-150-5p可能是RA治疗的新靶点。总之,本文将从荟萃分析研究、临床研究、细胞研究等多层面共同探讨miR-150-5p、SOCS1 m RNA在RA患者中的表达水平变化及其对RA的诊断价值和对疾病活动度、疾病严重程度的评估价值,并探索miR-150-5p靶向结合SOCS1对RASFs生物学功能的影响,以期为RA的诊治提供新的理论基础。
刘中兵[8](2020)在《川陈皮素抑制IL-21/IL-21R介导类风湿关节炎的炎症反应研究》文中认为第一部分:川陈皮素抑制IL-21/IL-21R介导类风湿关节炎的炎症反应体外研究目的:充分探讨川陈皮素靶向IL-21调控类风湿关节炎免疫应答过程,确定其与IL-21/IL-21R及JAK1/STAT3信号通路在调控过程中的介导关系,确定川陈皮素在类风湿关节炎发生、发展过程中的价值性,为后期临床治疗类风湿关节炎提供研究方向。材料与方法:我们使用的是RASFs细胞系,即MH7A细胞,它来自RA患者,被认为是RA的主要效应细胞。MH7A细胞系使用含10%胎牛血清的1640完全培养基于37℃、5%CO2、100%的恒温培养箱中培养,具体分组如下:Control组(不做处理);IL-21组(50 ng/ml IL-21处理MH7A细胞);IL-21+Nobiletin 25μM组(50ng/ml IL-21+25μmol/L Nobiletin处理MH7A细胞);IL-21+Nobiletin 50μM组(50ng/ml IL-21+50μmol/L Nobiletin处理MH7A细胞);MH7A细胞干预结束后,继续培养48小时后进行相关项目分析:细胞因子分析:ELISA检测各组细胞中IL-6、TNF-α、HMGB1、MMP-3、MMP-13表达浓度分析;各组MH7A细胞ROS(活性氧)检测;各组MH7A细胞4-HNE(4-羟基壬烯醛)检测;RT-PCR检测IL-21R、IL-6、TNF-α、MMP-3、MMP-13表达浓度分析;Western-blot检测IL-21R及JAK1/STAT3信号通路关键蛋白表达分析;统计数据,给出结论。结果:ELISA化学检测:IL-6、TNF-α:各组MH7A细胞中的表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;HMGB1蛋白:各组MH7A细胞中的表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;MMP-3、MMP-13:各组MH7A细胞中的表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;4-HNE检测:各组MH7A细胞中的表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;ROS检测:各组MH7A细胞中的ROS表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;RT-PCR检测:IL-21R:各组MH7A细胞m RNA表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;IL-6、TNF-α:各组MH7A细胞中的表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;MMP-3、MMP-13:各组MH7A细胞中的表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;Westwen-blot检测:IL-21R:各组MH7A细胞蛋白浓度表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义;JAK1/STAT3信号通路:各组MH7A细胞中JAK1、STAT3蛋白表达差异性较小,P>0.05,差异不具有统计学意义;在其磷酸的表达过程中,各组MH7A细胞中的表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin25μM<IL-21,各组数据比较,P<0.05,差异具有统计学意义。结论:(1)川陈皮素可以靶向IL-21受体对MH7A细胞做出免疫应答过程,明显降低MH7A滑膜细胞内白细胞介素以及基质金属蛋白酶等浓度变化,缓解MH7A滑膜细胞的炎性进展过程,促进其修复过程,且随着川陈皮素浓度增加,这种趋势更加明显。(2)川陈皮素可以靶向IL-21受体对细胞经典信号通路JAK1/STAT3进行调控应答,降低细胞信号通路关键蛋白JAK1及STAT3等蛋白的磷酸化水平,减缓炎症过程,与上文的结论具有一致性。由此可以得知,川陈皮素在类风湿关节炎的发生、发展过程中可能具有潜在的研究价值,为后期临床治疗类风湿关节炎提供靶向研究导向。第二部分:川陈皮素抑制IL-21/IL-21R介导类风湿关节炎的炎症反应体内研究目的:在体外研究的基础上,体内研究进一步探讨了川陈皮素靶向IL-21调控类风湿关节炎的免疫应答过程,从而明确了其与IL-21/IL-21R及JAK1/STAT3信号通路在调控过程中的介导关系,表明了川陈皮素在抗类风湿关节炎症作用方向的价值性,为后期临床治疗类风湿关节炎提供研究方向。材料与方法:选取48只Wistar大鼠适应性饲养1周后将其随机分成4组,除去对照组大鼠,其余建立CIA模型;具体分组如下:Control组(大鼠不做处理);IL-21组(CIA模型+50 ng/ml IL-21,腹腔注射);IL-21+Nobiletin 25μM组(CIA模型+50 ng/ml IL-21+25μmol/L Nobiletin,腹腔注射);IL-21+Nobiletin 50μM组(CIA模型+50 ng/ml IL-21+50μmol/L Nobiletin,腹腔注射);继续饲养6周后将大鼠处死,进行相关项目分析:各组大鼠模型成功率检测:大体观察、体重指数、关节炎、关节指数分析;形态学分析:各组大鼠HE染色分析;ELISA检测分析:IL-21R、TNF-α、IL-6、HMGB1、MMP-3及MMP-13蛋白;RT-PCR检测分析IL-21R、TNF-α、IL-6、MMP-3及MMP-13m RNA表达分析;Western-blot检测分析IL-21R、TNF-α、IL-6、MMP-3及MMP-13及JAK1/STAT3通路分析,分析数据,给出结论。结果:模型成功率检测:临床表现:对照组大鼠精神状态较好,体重体现出稳步增长的趋势,毛发光泽性较差;模型组大鼠意志沉迷,进食量逐渐减少,毛发光泽性,2周后处于无法负重的状态;体重变化:两周后各组大鼠的体重变化趋势为IL-21<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21+Nobiletin 50μM<Control,各组之间体重比较,差异具有统计学意义(P<0.05);关节炎发病率/关节指数:各组关节炎发病率比较趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,数据分析差异具有统计学意义(P<0.05).形态学分析:HE染色:对照组大鼠踝关节组织细胞排列密集,形态规则,轮裹明显;模型组大鼠踝关节组织细胞层变厚,白细胞和淋巴细胞大量充斥,连续性减弱;川陈皮素干预后,大鼠的踝关节组织细胞排列密集性加强,细胞形态趋于正常。ELISA化学检测:IL-6、TNF-α:表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义;HMGB1蛋白:表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义;MMP-3、MMP-13:表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义。RT-PCR检测:IL-21R:表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义;IL-6、TNF-α:表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义;MMP-3、MMP-13:表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义。Westwen-blot检测:IL-21R:表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义;IL-6、TNF-α:各组MH7A细胞中的表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义;MMP-3、MMP-13:表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义;JAK1/STAT3信号通路:各组MH7A细胞中JAK1、STAT3蛋白表达差异性较小,P>0.05,差异不具有统计学意义;在其磷酸的表达过程中,表达趋势为Control<IL-21+Nobiletin 50μM<IL-21+Nobiletin 25μM<IL-21,P<0.05,差异具有统计学意义。结论:(1)川陈皮素可以较好的改善模型组大鼠关节炎效应,明显改善大鼠的精神状态,降低大鼠的类风湿关节炎症的程度及关节指数,为后续的研究提供帮助。(2)与体外研究结果一致,川陈皮素改善大鼠类风湿关节炎症的作用主要是通过靶向机体IL-21R浓度变化进而调控JAK1/STAT3的活性状态,充分降低白细胞介素、肿瘤坏死因子-α、高迁移率蛋白表达,逐渐恢复关节软骨基质合成及分解的平衡状态,加速类风湿关节炎疾病的康复过程,达到对类风湿关节炎的治疗效果,给予临床一定启发。
梅晓峰[9](2020)在《基于RhoA/ROCK信号通路探讨麝香乌龙丸对血管屏障的保护机制》文中研究指明目的观察麝香乌龙丸对高浓度1-磷酸鞘胺醇(sphingosine-1-phosphate,S1P)诱导下人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVEC)血管内皮屏障的保护作用,探讨麝香乌龙丸(SXWLW)稳定血管屏障进而减少滑膜血管新生治疗类风湿关节炎(Rheumatiod arthritis,RA)的机制。方法将HUVEC分成4组:(1)对照组:1640+10%FBS培养基,培养24小时;(2)S1P组:1640+10%FBS培养基,培养24小时后更换为含10μmol/L S1P的1640培养基,刺激30min;(3)S1P+SXWLW组:浓度为320μg/mL SXWLW+1640+10%FBS培养基,培养24小时后,更换为含10μmol/L S1P的1640培养基,刺激30min;(4)S1P+S1PR2拮抗剂JTE013组:浓度为1μmol/L JTE013(S1PR2拮抗剂)+1640+10%FBS培养基,培养24小时后,更换为含10μmol/L S1P的1640培养基,刺激30min。采用免疫荧光检测HUVEC中细胞连接相关蛋白ROCK、ZO-1的变化,Western blot检测RhoA、ROCK、磷酸化RhoA激酶(p-ROCK)、ZO-1蛋白的表达水平。结果(1)闭锁小带蛋白1(Zonula occludens-1,ZO-1)免疫荧光的变化:对照组中,ZO-1蛋白主要集中表达在细胞膜上,显示出内皮细胞的形态。用浓度为10μmol/L S1P刺激后,与正常组相比,细胞膜上的ZO-1蛋白表达减少,部分分散于胞浆中。与S1P组相比,S1P+SXWLW组及S1P+S1PR2拮抗剂组,细胞膜上ZO-1蛋白表达均增多。磷酸化ROCK(p-ROCK)免疫荧光的变化:对照组中,p-ROCK蛋白表达较少,主要分布在胞浆以及胞核周围;用浓度为10μmol/L S1P刺激30min后,p-ROCK蛋白的表达显着上调,集中分布在胞浆以及胞核;S1P+SXWLW组及S1P+S1PR2拮抗剂JTE013组中p-ROCK蛋白的表达明显减少。(2)对HUVEC细胞中RhoA、ROCK、p-ROCK、ZO-1蛋白的表达的影响:与正常组比较,S1P组细胞ZO-1蛋白表达降低显着(P<0.05),RhoA蛋白表达明显升高(P<0.05),ROCK蛋白表达明显升高且其磷酸化水平明显升高(P<0.05)。与S1P组比较,麝香乌龙丸组和S1PR2拮抗剂JTE013组ZO-1蛋白表达均增加(P<0.05),RhoA蛋白表达下降(P<0.05),ROCK蛋白表达明显下降且其磷酸化水平明显下降(P<0.05)。结论麝香乌龙丸能够通过RhoA/ROCK通路,调控HUVEC细胞连接相关蛋白ROCK、p-ROCK及ZO-1的表达,稳定HUVEC的血管屏障,这可能是麝香乌龙丸治疗类风湿关节炎的机制之一。图5幅;表1个;参151篇。
熊勇[10](2020)在《电针抑制IL-33调节的肥大细胞炎症减缓大鼠胶原诱导性关节炎》文中研究说明背景类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以滑膜炎症、骨和软骨破坏及滑膜组织增生为特征的自身免疫性疾病,其发病机制至今尚未完全明确。近年来,肥大细胞及其合成、分泌的相关细胞因子在RA发病机制中的作用成为研究热点之一。肥大细胞(mast cells,MCs)约占正常关节滑膜细胞总数的3%,其作用可能是参与修复组织损伤或清除病原体;而在RA患者的滑膜组织中,MCs的数量可能是健康人的625倍。现有实验研究证实,针刺“足三里”穴具有抗炎、镇痛、免疫调节等作用,在抗RA方面具有良好的应用前景,但其发挥抗炎、免疫调节的分子机制尚未明了,其抗RA的机制是否与调节肥大细胞功能有关有待进一步研究探索。为此,我们针对这一问题进行了一系列实验研究,建立胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)大鼠模型,探讨电针“足三里”穴对CIA大鼠的治疗效果及其作用的潜在机制。目的以牛Ⅱ型胶原诱导的关节炎大鼠为模型,从CIA大鼠的足跖肿胀度、关节指数、病理组织形态学改变、炎症因子等方面考察电针“足三里”穴的抗炎及免疫调节作用。通过体内实验观察电针对CIA大鼠治疗作用及对滑膜肥大细胞数目及功能的影响,体外实验评估电针对IL-33诱导的肥大细胞激活的影响,结合mi R-155 mimic转染后的肥大细胞对IL-33刺激的反应性,阐明电针发挥抗胶原诱导性关节炎作用的部分分子机制。方法1.选取清洁级雌性SD大鼠,按数字随机法分为四组,即空白对照组、CIA模型组、CIA模型+电针治疗组、CIA模型+假针刺组,每组30只。常规饲养7天后,除空白对照组外,其余各组大鼠采用牛Ⅱ型胶原与弗氏不完全佐剂的混合乳化液于尾根部皮下注射进行造模,即制作胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)大鼠模型。造模结束后采用关节炎指数对大鼠关节损伤程度进行评分,每两天一次,直至取材前。2.造模结束后,空白对照组、CIA模型组不给予任何干扰,CIA模型+电针治疗组选取“足三里”穴给予电针刺激;其具体参数为:2Hz,1m A,5min;2Hz,1.5m A,5min;2Hz,2m A,20min,以此为一次完整的循环。每天一次,从造模第一天开始持续到取材前一天,一共34天。CI A模型+假电针组大鼠予以针灸针浅刺“足三里”穴但不予通电刺激,其余操作同CIA模型+电针治疗组。每次治疗前均测量各组大鼠体重及足趾肿胀程度,直至取材前一天。末次电针治疗结束后24h,用5%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠,后将其置于大鼠板上固定,经腹主动脉取血后离心采集各组大鼠血清。一部分大鼠取其左侧膝关节组织,另一部分大鼠取其左侧滑膜组织,各组织经固定、脱钙、包埋,制成切片;提取大鼠脾脏及分离脾脏单个核细胞;收集无菌腹腔液。实验一1.利用关节炎指数对大鼠关节损伤程度进行评价;称重法测定大鼠体重,足容积法测定大鼠足跖肿胀度;2.HE染色观察膝关节滑膜的组织病理学改变;3.ELISA检测各组大鼠血清中II型胶原抗体(total anti-CII Ig G,anti-CI I Ig G1,anti-CII Ig G2a)及炎性因子(TNF-α,IL-1β,IL-6,IL-17)的含量;4.流式细胞学检测脾脏淋巴细胞RORγt及IL-17的表达。实验二1.免疫组织化学法检测滑膜组织IL-33的释放;2.ELISA法检测血清中IL-33的含量及滑膜组织中IL-33、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17的含量;3.实时定量PCR技术检测滑膜组织IL-33m RNA的表达;4.甲苯胺蓝染色显示滑膜组织肥大细胞数目及脱颗粒情况。实验三1.大鼠腹腔肥大细胞的分离及甲苯胺蓝染色鉴定;2.ELISA法检测IL-33刺激肥大细胞炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、MC P-1、IL-6、IL-13的分泌及组胺的释放;3.分光光度法测定肥大细胞体外β-己糖胺酶的释放;4.实时定量PCR技术检测IL-33刺激肥大细胞对其ST2及mi R-155表达的影响;5.蛋白质印迹法评价IL-33诱导的肥大细胞NF-κB p65转录及P38 MA PK信号激活情况。实验四1.RT-PCR检测mi R-155 mimic肥大细胞转染后mi R-155表达;2.ELISA法检测IL-33刺激经mi R-155 mimic转染的肥大细胞炎症因子释放;3.蛋白免疫印迹法评价IL-33刺激经mi R-155 mimic转染的肥大细胞NF-κB p65及P38激活情况。结果1.电针足三里减缓大鼠胶原诱导性关节炎(CIA)。CIA模型组大鼠的足趾在造模后逐渐肿胀,肿胀程度于第21天达到峰值,以后逐渐消退;局部皮肤充血、红肿,关节炎评分在第24天达到峰值;体重逐渐减轻。CIA模型+假针刺组大鼠与CIA模型组大鼠的状况表现基本相同。CIA模型+电针治疗组在未治疗前和CIA模型组大鼠状况表现基本相同,经电针治疗后,CIA大鼠足跖肿胀程度减轻(P<0.05)、关节炎评分减小(P<0.05)、体重下降减缓(P<0.05)。HE染色结果显示,与CIA模型组相比,CIA模型+电针治疗组大鼠膝关节滑膜组织增生减轻、炎细胞浸润明显减少(P<0.05)、组织病理学评分明显降低(P<0.05)。ELISA检测结果显示,电针能够不同程度地下调血清中Ⅱ型胶原抗体(总抗CII Ig G抗体浓度、抗CII Ig G1抗体浓度、抗CII Ig G2a抗体)的含量(P<0.01、P<0.05、P<0.01),抑制CIA大鼠血清炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17)的释放(P<0.01、P<0.01、P<0.01、P<0.05)。流式细胞学检测结果表明,电针能够明显下调CIA大鼠CD3+CD4+T细胞中CD4+RORγt+细胞比例及CD4+IL-17+细胞比例(P<0.01、P<0.05)。2.电针抑制CIA大鼠IL-33产生及滑膜肥大细胞浸润。免疫组织化学检测结果显示,与空白对照组相比,CIA模型组与CI A模型+电针治疗组滑膜组织中IL-33的含量明显升高;而与CIA模型组相比,CIA模型+电针治疗组IL-33的含量显着下降(P<0.01)。ELISA检测大鼠血清及滑膜组织中IL-33的含量,其结果趋势与免疫组织化学结果一致(P<0.01),且血清中IL-33的含量和滑膜组织中IL-33的含量呈现正相关(r=0.9196,p=0.0012)。进一步RT-PCR检测结果显示,与CI A模型组相比,电针能明显降低血清中IL-33m RNA表达水平(P<0.01)。甲苯胺蓝染色结果显示,与CIA模型组相比,电针能明显减轻CIA大鼠滑膜组织肥大细胞浸润,减少肥大细胞脱颗粒(P<0.05、P<0.01)。ELI SA检测结果显示,与CIA模型组相比,电针能明显减少滑膜组织中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17的释放(P<0.01、P<0.01、P<0.05、P<0.05),且经分析发现,滑膜肥大细胞的数量与滑膜组织中炎症因子的释放呈现正相关。3.电针抑制IL-33诱导的肥大细胞炎症。分离各组大鼠腹腔肥大细胞,与IL-33共培养,使用甲苯胺蓝染色鉴定分离的肥大细胞,使用ELISA检测肥大细胞炎症因子的释放。结果显示,与CIA模型组相比,CIA+电针治疗组中肥大细胞TNF-α、IL-5、IL-1β、IL-6、MCP-1和IL-13的分泌及组胺的释放均明显减少(P<0.05、P<0.01、P<0.01、P<0.01、P<0.05、P<0.01、P<0.05)。分光光度法检测结果显示,与CIA模型组相比,电针能明显抑制肥大细胞体外β-氨基己糖苷酶的释放(P<0.05)。ELISA检测体外培养的肥大细胞上清中相关抗体的含量,结果显示,上清中IL-5及IL-13的含量均分别与抗CⅡIg G1和抗CⅡIg G2a含量呈正相关。流式细胞学检测结果显示,IL-1β和IL-6的含量均与CD3+CD4+T细胞中CD4+IL-17+细胞比例成正相关。RT-PCR检测结果显示,电针能明显下调肥大细胞mi R-155的表达但是对IL-33受体ST2没有影响(P<0.01)。免疫蛋白印迹检测结果显示,电针可明显下调肥大细胞胞浆蛋白p-IKKα/β的表达水平(P<0.001)及胞核蛋白NF-κB p65的表达水平(P<0.005)和减小胞浆中p-P38/p38比值(P<0.005),以及提高胞浆蛋白IκBα的表达水平(P<0.01)。4.电针经由mi R-155抑制IL-33调节的肥大细胞炎症减缓大鼠CIA。分离大鼠腹腔肥大细胞,对CIA+电针治疗组肥大细胞进行mi R-155mimic转染使其mi R-155过表达(P<0.005)。ELISA检测结果显示,与CIA+电针治疗组相比,在IL-33刺激下,经mi R-155 mimic转染后的肥大细胞炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1、IL-5和IL-13的释放量明显上升(P<0.01、P<0.01、P<0.01、P<0.05、P<0.05、P<0.05)。蛋白免疫印迹分析结果显示,与CIA+电针治疗组相比,在IL-33刺激下,经mi R-155 mimic转染后的肥大细胞胞浆蛋白中p-P38/P38的值及p-IKKα/β蛋白表达水平显着上调(P<0.005、P<0.005),而IκBα蛋白表达水平显着下降(P<0.01);胞核蛋白NF-κB p65的表达水平显着上升(P<0.005)。结论1.电针“足三里”穴对胶原诱导的关节炎症具有明显的改善作用。电针“足三里”穴减轻CIA大鼠滑膜组织炎性细胞浸润,抑制其体内Ⅱ型胶原抗体的含量及炎性细胞因子TNF-α,IL-1β,IL-6,IL-17的分泌,抑制C IA大鼠脾脏Th17细胞激活,是其发挥调节CIA大鼠亢进的免疫功能效应的关键。2.电针通过减少CIA大鼠滑膜组织肥大细胞的浸润,减少局部滑膜组织及全身血液中IL-33的生成,抑制IL-33诱导的肥大细胞炎症反应,从而发挥其治疗作用。3.mi R-155参与了电针抑制CIA大鼠中IL-33诱导的肥大细胞炎症反应。综上,我们推测电针可能经由mi R-155抑制IL-33调节的肥大细胞炎症,从而减缓胶原诱导性关节炎。
二、巨噬细胞炎症蛋白-1α对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖反应的影响(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、巨噬细胞炎症蛋白-1α对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖反应的影响(论文提纲范文)
(1)3D打印血管翳类组织构建类风湿关节炎治疗药物筛选平台(论文提纲范文)
摘要 |
abstract |
中英文缩略词表 1 |
第1章 引言 |
1.1 类风湿关节炎 |
1.1.1 类风湿关节炎血管翳病理微环境 |
1.1.2 血管翳中滑膜细胞与内皮细胞的作用 |
1.2 RA治疗药物的研究模型 |
1.2.1 单层细胞培养模型 |
1.2.2 细胞共培养模型 |
1.2.3 动物模型 |
1.3 3D类器官研究现状 |
1.3.1 生物墨水 |
1.3.2 3D打印技术 |
1.3.3 类器官在在药物筛选上的应用 |
1.4 本论文的研究意义 |
1.4.1 本论文研究目的 |
1.4.2 本论文研究内容 |
第2章 THP-1源M1巨噬细胞对MH7A及EA.hy926基因表达及增殖的影响 |
2.1 引言 |
2.2 实验材料及设备 |
2.2.1 实验细胞株 |
2.2.2 实验试剂与耗材 |
2.2.3 实验设备 |
2.2.4 试剂配制 |
2.3 实验方法 |
2.3.1 THP-1、MH7A和EA.hy926细胞复苏 |
2.3.2 THP-1 悬浮细胞传代 |
2.3.3 MH7A和EA.hy926贴壁细胞传代 |
2.3.4 THP-1、MH7A和EA.hy926细胞冻存 |
2.3.5 THP-1 细胞诱导成M1型巨噬细胞 |
2.3.6 THP-1 源巨噬细胞RNA提取 |
2.3.7 THP-1 源巨噬细胞RNA逆转录 |
2.3.8 RT-PCR鉴定THP-1源M1巨噬细胞 |
2.3.9 流式细胞术鉴定THP-1 源M1巨噬细胞 |
2.3.10 ELISA检测THP-1源M1巨噬细胞上清IL-1β炎症因子含量 |
2.3.11 ELISA检测THP-1源M1巨噬细胞上清IL-8 炎症因子含量 |
2.3.12 THP-1源M1型巨噬细胞无血清上清液处理MH7A细胞 |
2.3.13 MH7A细胞RNA提取 |
2.3.14 MH7A细胞RNA逆转录 |
2.3.15 RT-PCR检测THP-1源M1巨噬细胞无血清上清液对MH7A炎症因子和促血管生成因子m RNA表达的影响 |
2.3.16 CCK-8 检测THP-1源M1巨噬细胞上清对MH7A、EA.hy926 的增殖影响 |
2.3.17 数据处理 |
2.4 实验结果 |
2.4.1 THP-1 细胞在不同诱导阶段的形态变化 |
2.4.2 RT-PCR鉴定THP-1源M1型巨噬细胞 |
2.4.3 THP-1源M1巨噬细胞进行PE抗人CD80 抗体流式鉴定 |
2.4.4 ELISA比较不同浓度 PMA诱导的THP-1源Mφ和M1型巨噬细胞上清液中IL-1β和IL-8 蛋白浓度 |
2.4.5 200ng/mlPMA诱导的THP-1源M1巨噬细胞上清液对MH7A细胞IL-1β、IL-6、IL-8和VEGF基因的表达影响 |
2.4.6 200ng/mlPMA诱导的THP-1源M1巨噬细胞上清对MH7A细胞、EA.hy926 细胞的增殖影响 |
2.5 讨论 |
2.6 小结 |
第3章 3D生物打印构建类风湿关节炎血管翳类组织 |
3.1 引言 |
3.2 实验材料与设备 |
3.2.1 实验细胞株 |
3.2.2 实验试剂与耗材 |
3.2.3 实验设备 |
3.2.4 试剂配制 |
3.3 实验方法 |
3.3.1 细胞处理 |
3.3.2 生物墨水的配置 |
3.3.3 三维打印条件设置 |
3.3.4 三维结构打印后培养条件及结构外观形态的观察 |
3.3.5 Calcein/PI染色检测细胞死活情况 |
3.3.6 CCK-8 检测细胞在三维结构中的增殖状况 |
3.3.7 CCK-8 检测钙离子溶液对二维培养中MH7A、EA.hy926 细胞的活性影响 |
3.3.8 MH7A、EA.hy926 在二维和三维中细胞分布及形态的观察 |
3.3.9 ELISA检测3D支架分泌的VEGF蛋白浓度 |
3.3.10 ELISA检测三维支架上清液中ANG的蛋白表达量 |
3.3.11 数据处理 |
3.4 实验结果 |
3.4.1 3D支架在打印后第1、3、5、7 天的形态观察 |
3.4.2 细胞共培养模型在7 天时间内的细胞存活率变化 |
3.4.3 细胞共培养模型中的细胞增殖速率变化 |
3.4.4 钙离子溶液对二维平面中EA.hy926、MH7A和1:1 细胞共培养的细胞毒性 |
3.4.5 MH7A和EA.hy926细胞在单层培养与3D支架上细胞形态差异 |
3.4.6 三维支架上清VEGF及 ANG分泌蛋白含量 |
3.5 讨论 |
3.6 本章小结 |
第4章 结论与展望 |
参考文献 |
致谢 |
作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
(2)FAPα对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞功能影响的研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
常用缩略词中英文对照表 |
前言 |
第一部分:通过生物信息学分析FAPα在RA滑膜中的作用 |
1 对象与方法 |
1.1 数据的获取和标准化处理 |
1.2 差异基因分析 |
1.3 GO和KEGG分析 |
1.4 蛋白-蛋白相互作用网络的构建 |
2 结果 |
2.1 数据标准化处理结果 |
2.2 FAPα相关差异基因的表达 |
2.3 GO分析与KEGG分析 |
2.4 蛋白与蛋白互作网络分析 |
3 讨论 |
4 结论 |
第二部分:FAPα对RA-FLSs功能的影响 |
1 实验材料 |
1.1 实验试剂与设备 |
1.2 主要工作液配制 |
2 实验方法 |
2.1 细胞培养与鉴定 |
2.2 细胞转染及验证 |
2.3 细胞增殖 |
2.4 细胞周期 |
2.5 细胞凋亡 |
2.6 细胞迁移和侵袭能力 |
2.7 SHH信号通路蛋白表达的检测 |
2.8 数据处理 |
3 实验结果 |
3.1 原代FLSs的培养与鉴定 |
3.2 细胞转染效率的验证 |
3.3 FAPα对FLSs增殖的影响 |
3.4 FAPα对FLSs周期的影响 |
3.5 FAPα对FLSs凋亡的影响 |
3.6 FAPα对FLSs迁移及侵袭能力的影响 |
3.7 FAPα对SHH通路影响的蛋白水平的验证 |
4 讨论 |
5 结论 |
附录 |
参考文献 |
文献综述 FAPα在类风湿关节炎中的研究进展 |
参考文献 |
致谢 |
个人简介 |
(3)雷公藤红素作用RA-FLS的组学联合分析(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
主要符号表 |
第1章 文献综述 |
1.1 类风湿关节炎研究进展 |
1.1.1 类风湿关节炎的基本概述 |
1.1.2 类风湿关节炎的病因 |
1.1.3 类风湿关节炎发病机制 |
1.1.4 类风湿关节炎的治疗 |
1.2 CEL的研究进展 |
1.2.1 CEL的基本概述 |
1.2.2 CEL治疗RA的研究进展 |
1.3 转录组学 |
1.3.1 转录组学概述 |
1.3.2 转录组学在RA治疗中的研究进展 |
1.4 蛋白组学 |
1.4.1 蛋白组学概述 |
1.4.2 蛋白组学在RA治疗中的研究进展 |
1.5 本课题的研究内容和意义 |
1.6 技术路线 |
第2章 转录组学分析 |
2.1 材料和方法 |
2.1.1 主要材料、试剂、仪器 |
2.1.2 细胞培养及活性鉴定 |
2.1.3 RNA提取与纯化 |
2.1.4 文库构建 |
2.1.5 文库质控 |
2.1.6 上机测序 |
2.2 实验结果 |
2.2.1 细胞培养及活性鉴定 |
2.2.2 RNA浓度和纯度测定 |
2.2.3 转录组测序数据质控 |
2.2.4 与参考基因组比对分析 |
2.2.5 样品间相关性评估 |
2.2.6 主成分分析和基因表达聚类分析 |
2.2.7 差异表达基因筛选 |
2.2.8 差异基因GO功能富集分析 |
2.2.9 差异基因Pathway富集分析 |
第3章 蛋白组学分析 |
3.1 实验分析流程 |
3.2 材料和方法 |
3.2.1 主要试剂、配置的溶液和仪器 |
3.2.2 蛋白质提取和肽段酶解 |
3.2.3 LC-MS/MS数据采集 |
3.2.4 蛋白质鉴定和定量分析 |
3.2.5 GO功能注释 |
3.2.6 KEGG通路注释 |
3.2.7 GO注释和KEGG注释的富集分析 |
3.2.8 蛋白质聚类分析 |
3.3 实验结果 |
3.3.1 肽段离子质量控制 |
3.3.2 蛋白质和肽段特性鉴定 |
3.3.3 蛋白鉴定结果 |
3.3.4 差异表达蛋白质筛选和聚类分析 |
3.3.5 差异蛋白GO功能富集分析 |
3.3.6 差异蛋白Pathway富集分析 |
3.3.7 与转录组数据的表达关联分析 |
第4章 候选基因验证 |
4.1 分子对接模拟 |
4.1.1 材料和方法 |
4.1.2 分子对接结果 |
4.2 qRT-PCR检测基因 |
4.2.1 试验主要仪器与试剂 |
4.2.2 实验步骤 |
4.2.3 实验结果 |
4.3 Western blot检测候选蛋白 |
4.3.1 试验主要仪器 |
4.3.2 试验主要试剂 |
4.3.3 实验步骤 |
4.3.4 实验结果 |
第5章 讨论 |
第6章 结论 |
参考文献 |
攻读学位期间获得与学文论文相关的科研成果目录 |
致谢 |
(4)金银花复方治疗活动期RA湿热瘀阻证临床观察及单体GALU对FLS影响的研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
前言 |
第一章 理论研究 |
一、类风湿关节炎的发病 |
1. 滑膜炎是类风湿关节炎发生的重要标志 |
2. 细胞因子网络促使滑膜炎持续存在 |
3. 成纤维滑膜细胞具有独特侵袭性,是RA滑膜炎关键效应细胞 |
二、RA炎症效应机制信号通路 |
1. 肿瘤坏死因子通路与NF-κB信号通路在RA疾病发展中的意义 |
2. IKKβ是激活NF-κB经典途径的关键激酶 |
三、对于RA活动期湿热瘀阻证的中医药治疗研究 |
1. 湿热瘀阻证是活动性RA的主要证型 |
2. 中医药治疗可有效抑制RA滑膜炎症、促进滑膜细胞凋亡 |
3. 汪悦教授运用金银花复方治疗活动性RA的经验 |
四、中药金银花单体Galu治疗RA的潜在分子机制 |
1. 金银花单体Galu对于炎症及细胞增殖的调控作用 |
2. HO-1可能是Galu对于炎症调节的潜在作用靶点 |
第二章 临床研究 |
一、试验目的 |
二、试验设计类型: 随机非盲对照 |
三、病例选择 |
1. 诊断标准 |
2. 纳入标准 |
3. 排除标准 |
4. 病例的脱落 |
5. 病例的剔除 |
四、治疗方案 |
1. 试验用药 |
2. 服药方法 |
五、观察项目 |
1. 一般记录项目 |
2. 观察指标 |
3. 观测时点 |
六、统计分析 |
七、研究结果 |
1. 一般资料 |
2. 总体疗效指标 |
3. 各临床及实验室观察疗效指标 |
4. 安全性评价 |
第三章 实验研究 |
一、实验材料 |
1. 实验主要材料 |
2. 实验主要仪器 |
二、实验方法及步骤 |
1. 细胞培养及处理 |
2. 细胞转染 |
3. CCK 8 |
4. TUNEL |
5. qRT-PCR |
6. ELISA |
7. Western blot |
8. 统计分析 |
三、实验结果 |
1. Galu抑制RA-FLS细胞的增殖并诱导细胞凋亡 |
2. Galu抑制RA-FLS细胞的炎症 |
3. 沉默HO-1减弱了Galu对RA-FLS细胞增殖和凋亡的影响 |
4. 沉默HO-1减弱了Galu对RA-FLS细胞炎症反应的影响 |
5. Galu通过激活RA-FLS细胞中HO-1的表达来抑制IKKβ/NF-κB信号通路 |
第四章 讨论 |
一、从“湿、热、瘀”论治活动期类风湿关节炎 |
1. 湿热瘀是RA疾病进展的病机关键 |
2. “清热解毒,化瘀除湿”为活动期RA的治疗大法 |
二、金银花复方方解 |
三、成纤维滑膜细胞对类风湿关节炎疾病进展具有特殊意义 |
1. 维持RA细胞因子网络 |
2. 主导RA软骨破坏 |
3. 促进T、B细胞持续存活 |
四、NFkB与滑膜细胞浸润以及凋亡的关系 |
五、H0-1是RA潜在治疗靶点 |
六、研究结果分析 |
1. 临床试验结果分析 |
2. 单体Galu对成纤维滑膜细胞影响的实验结果分析 |
第五章 结论 |
特色及创新点 |
不足与展望 |
参考文献 |
附录 |
附录1: 28个关节肿痛计数 |
附录2: 中医证候积分 |
附录3: 患者对当前疾病造成的疼痛和不适的主观评价(VAS评分) |
附录4: 患者生活能力的自我评价量表(HAQ) |
附录5: 英文缩略词说明表 |
硕士期间学术成果 |
致谢 |
(5)蒙药三子汤为基础的系列方剂对CIA大鼠关节新生血管的影响(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
符号说明 |
第一部分 文献综述 |
综述一 类风湿关节炎血管新生病理介质的研究概况 |
1 概述 |
2 巨噬细胞和滑膜成纤维细胞与RA血管新生 |
3 参与血管生成病理介质的研究概况 |
4 总结与展望 |
参考文献 |
综述二 中蒙药对RA抗血管生成作用的实验研究进展 |
1 概述 |
2 RA与血管新生 |
3 中药抗RA血管新生作用的实验研究进展 |
4 蒙药抗RA血管新生作用的研究进展 |
5 总结与展望 |
参考文献 |
前言 |
第二部分 实验研究 |
实验一 三子汤为基础的系列方剂对CIA大鼠关节炎症的影响 |
1 实验材料 |
2 实验方法 |
3 实验结果 |
4 讨论 |
实验二 三子汤为基础的系列方剂对CIA大鼠血管新生的影响及机制研究 |
1 实验材料 |
2 实验方法 |
3 实验结果 |
4 讨论 |
实验三 三子汤为基础的系列方剂含药血清对体外RA-FLS、HUVEC细胞增殖和血管新生相关细胞因子的影响 |
1 实验材料 |
2 实验方法 |
3 实验结果 |
4 讨论 |
结语 |
参考文献 |
致谢 |
在学期间主要研究成果 |
(6)艾拉莫德调控miR-146a介导的IRAK1/TRAF6/JNK1通路治疗类风湿关节炎的机制研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
缩略词表 |
第一部分 Mi R-146a靶向IRAK1/TRAF6/JNK1 信号通路对RA-FLS增殖、侵袭、迁移、凋亡和炎症反应的调控机制研究 |
一、引言 |
二、实验材料 |
三、实验方法 |
四、结果 |
五、讨论 |
第二部分 艾拉莫德通过调控mi R-146a抑制RA-FLS功能的体外、体内研究 |
一、前言 |
二、实验材料 |
三、实验方法 |
四、结果 |
五、讨论 |
全文总结 |
参考文献 |
综述一 成纤维样滑膜细胞调控免疫反应在类风湿关节炎发病中的作用 |
参考文献 |
综述二 Micro RNAs 在类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中的作用及研究进展 |
参考文献 |
在读期间发表论文和参加科研工作情况 |
致谢 |
(7)miR-150-5p/SOCS1在类风湿关节炎中的临床意义及其调控机制(论文提纲范文)
摘要 |
abstract |
中英文缩略词表 |
第1章 引言 |
第2章 外周血SOCS1 mRNA与 RA相关性的系统评价 |
2.1 前言 |
2.2 资料 |
2.2.1 文献检索 |
2.2.2 纳入标准与排除标准 |
2.2.3 结局指标 |
2.3 方法 |
2.3.1 文献筛选 |
2.3.2 质量评价 |
2.3.3 资料提取 |
2.3.4 数据分析 |
2.4 结果 |
2.4.1 文献检索 |
2.4.2 纳入文献的一般特征及文献评价 |
2.4.3 Meta分析结果 |
2.5 讨论 |
2.6 结论 |
第3章 RA患者PBL中miR-150-5p、SOCS1 mRNA的表达及其临床意义 |
3.1 前言 |
3.2 实验试剂与仪器 |
3.2.1 实验试剂 |
3.2.2 实验仪器 |
3.3 研究对象和实验方法 |
3.3.1 纳入受试者 |
3.3.2 收集患者及健康对照者一般资料 |
3.3.3 RT-PCR法测定miR-150-5p的表达水平 |
3.3.4 RT-PCR法测定SOCS1mRNA的表达水平 |
3.3.5 ELISA法测定RA患者血清炎症细胞因子水平 |
3.3.6 统计学处理 |
3.4 结果 |
3.4.1 一般临床资料及实验室指标 |
3.4.2 RA患者PBL中 miR-150-5p表达水平的变化 |
3.4.3 RA患者PBL中 SOCS1 mRNA表达水平的变化 |
3.4.4 RA患者外周血TNF-α、IL-6及IL-21 表达水平的变化 |
3.4.5 miR-150-5p、SOCS1 mRNA对 RA诊断的预测分析 |
3.4.6 miR-150-5p与实验室指标及临床指标的相关性分析 |
3.4.7 SOCS1 mRNA与实验室指标及临床指标的相关性分析 |
3.5 讨论 |
3.6 结论 |
第4章 miR-150-5p对 RASFs细胞生长和SOCS1 表达的影响 |
4.1 前言 |
4.2 材料 |
4.2.1 细胞株 |
4.2.2 购置试剂 |
4.2.3 主要仪器设备及耗材 |
4.3 方法 |
4.3.1 细胞培养 |
4.3.2 miR-150-5p mimic及miR-150-5p NC的设计及合成 |
4.3.3 克隆载体的构建 |
4.3.4 双荧光素酶试验 |
4.3.5 流式细胞学方法检测细胞凋亡及细胞周期 |
4.3.6 CCK8 法测定细胞增殖水平 |
4.3.7 RT-PCR测定miR-150-5p的表达水平 |
4.3.8 RT-PCR测定SOCS1 m RNA的表达 |
4.3.9 Western Blot蛋白测定 |
4.3.10 ELISA测定TNF-α、IL-6 的表达水平 |
4.3.11 统计学处理 |
4.4 结果 |
4.4.1 miR-150-5p促进MH7A细胞生长 |
4.4.2 miR-150-5p靶向结合于SOCS1 基因 |
4.4.3 miR-150-5p抑制SOCS1m RNA的表达 |
4.4.4 miR-150-5p对SOCS1 蛋白及JAK2/ STAT3 蛋白的影响 |
4.4.5 miR-150-5p对MH7A细胞IL-6 及TNF-α 的影响 |
4.5 讨论 |
4.6 结论 |
第5章 全文总结与展望 |
致谢 |
参考文献 |
攻读学位期间的研究成果 |
综述 |
参考文献 |
(8)川陈皮素抑制IL-21/IL-21R介导类风湿关节炎的炎症反应研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
abstract |
前言 |
1.类风湿关节炎 |
1.1 疾病介绍 |
1.2 滑膜成纤维细胞代谢与类风湿关节炎 |
1.3 细胞因子与类风湿关节炎 |
2.IL-21/IL-21R信号转导途径 |
2.1 IL-21/IL-21R产生及来源 |
2.2 IL-21/IL-21R对疾病的调节 |
2.3 IL-21/IL-21R与类风湿关节炎 |
3.JAK/STAT信号通路与类风湿关节炎 |
3.1 JAK/STAT信号通路 |
3.2 基本过程及调节 |
3.3 JAK/STAT与类风湿关节炎 |
4.川陈皮素药理性作用 |
4.1 名称介绍 |
4.2 药代动力学 |
4.3 药理作用 |
5.本研究的目的和内容 |
第一部分 :川陈皮素抑制IL-21/IL-21R介导类风湿关节炎炎症反应体外研究 |
材料与方法 |
1.1 研究对象 |
1.2 实验试剂及设备 |
1.3 实验过程 |
1.4 实验分析 |
1.5 统计学分析 |
结果 |
2.1 川陈皮素对MH7A细胞活力的影响 |
2.2 川陈皮素能够抑制IL-21受体的表达 |
2.3 川陈皮素抑制IL-21诱导的氧化应激反应 |
2.4 川成皮素抑制促炎细胞因子的表达 |
2.5 川陈皮素抑制IL-21 诱导的基质金属蛋白酶(MMPs)表达 |
2.6 川陈皮素的作用通过JAK1/STAT3 信号通路介导 |
讨论 |
研究结论 |
第二部分 :川陈皮素抑制IL-21/IL-21R介导类风湿关节炎炎症反应体内研究 |
材料与方法 |
1.1 研究对象 |
1.2 实验试剂及设备 |
1.3 实验试剂配置 |
1.4 实验过程 |
1.5 统计学分析 |
结果 |
2.1 模型成功率检测 |
2.2 形态学分析表明川陈皮素对类风湿关节炎的改善作用 |
2.3 ELISA检测IL-21R、TNF-α、IL-6、HMGB1、MMP-3及MMP-13 提示川陈皮素对类风湿关节炎炎症的的抑制效应 |
2.4 RT-PCR检测IL-21R、TNF-α、IL-6、MMP-3、MMP-13从m RNA水平进一步表明川陈皮素抑制类风湿关节炎炎症的水平 |
2.5 Western-blot检测IL-21R、TNF-α、IL-6、MMP-3、MMP-13、JAK1/STAT3从蛋白水平进一步充分表明川陈皮素的类风湿关节炎炎症抑制作用 |
讨论 |
研究结论 |
参考文献 |
综述 白细胞介素21在类风湿关节炎中的作用研究进展 |
参考文献 |
中英文缩略词 |
攻读学位期间公开发表的论文 |
致谢 |
(9)基于RhoA/ROCK信号通路探讨麝香乌龙丸对血管屏障的保护机制(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
英文缩略表 |
引言 |
第1章 实验研究 |
1.1 材料与方法 |
1.1.1 实验细胞 |
1.1.2 实验药品 |
1.1.3 主要试剂及相关试剂配备 |
1.1.4 实验仪器 |
1.2 实验方法 |
1.2.1 不同时间点的高浓度S1P对HUVEC细胞中RhoA、ROCK、p-ROCK、ZO-1蛋白的表达的影响 |
1.2.2 细胞培养 |
1.2.3 CCK8检测细胞毒性 |
1.2.4 免疫荧光染色 |
1.2.5 Westen Blot 测目的蛋白 |
1.2.6 实验分组 |
1.2.7 统计学处理 |
1.3 结果 |
1.3.1 不同时间点的高浓度S1P对HUVEC细胞中RhoA、ROCK、p-ROCK、ZO-1蛋白的表达的影响 |
1.3.2 CCK8检测细胞毒性 |
1.3.3 ZO-1蛋白免疫荧光的变化 |
1.3.4 磷酸化ROCK(p-ROCK)免疫荧光的变化 |
1.3.5 HUVEC细胞中RhoA、ROCK、p-ROCK、ZO-1蛋白的表达的影响 |
1.4 讨论 |
1.4.1 麝香乌龙丸在治疗RA中的应用以及药物提取 |
1.4.2 高浓度S1P对血管内皮屏障的损伤 |
1.4.3 高浓度S1P对血管内皮屏障的损伤 |
1.5 小结 |
参考文献 |
结论 |
第2章 综述 中医药在类风湿关节炎相关信号通路中的作用及研究进展 |
2.1 Wnt 信号通路 |
2.2 JAK-STAT 信号通路 |
2.3 MAPKs 信号通路 |
2.4 PI3K-Akt 信号通路 |
2.5 NF-κB 信号通路 |
2.6 RANKL/RANK/OPG 通路 |
2.7 TLRs信号通路 |
2.8 结语 |
参考文献 |
附录 A 技术路线图 |
致谢 |
在学期间研究成果 |
(10)电针抑制IL-33调节的肥大细胞炎症减缓大鼠胶原诱导性关节炎(论文提纲范文)
中文摘要 |
ABSTRACT |
中英文缩略词 |
前言 |
实验一 电针抑制胶原诱导的大鼠关节炎(CIA) |
1 材料 |
2 实验方法 |
3 结果 |
4 讨论与小结 |
实验二 电针抑制CIA大鼠IL-33 产生及滑膜肥大细胞浸润 |
1 材料 |
2 实验方法 |
3 结果 |
4 讨论与小结 |
实验三 电针抑制IL-33 诱导的肥大细胞炎症 |
1 材料 |
2 实验方法 |
3 结果 |
4 讨论与小结 |
实验四 电针经由MIR-155 抑制IL-33 调节的肥大细胞炎症减缓大鼠CIA |
1 材料 |
2 实验方法 |
3 结果 |
4 讨论与小结 |
讨论 |
结语 |
参考文献 |
附录一 文献综述(一) |
参考文献 |
附录二 文献综述(二) |
参考文献 |
附录三 博士期间科研成果和科研经历 |
致谢 |
四、巨噬细胞炎症蛋白-1α对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖反应的影响(论文参考文献)
- [1]3D打印血管翳类组织构建类风湿关节炎治疗药物筛选平台[D]. 林结桃. 中国科学院大学(中国科学院深圳先进技术研究院), 2021(08)
- [2]FAPα对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞功能影响的研究[D]. 武泽文. 山西医科大学, 2021(01)
- [3]雷公藤红素作用RA-FLS的组学联合分析[D]. 代二琴. 信阳师范学院, 2021(09)
- [4]金银花复方治疗活动期RA湿热瘀阻证临床观察及单体GALU对FLS影响的研究[D]. 管印. 南京中医药大学, 2021(01)
- [5]蒙药三子汤为基础的系列方剂对CIA大鼠关节新生血管的影响[D]. 敖丽梅. 北京中医药大学, 2020(04)
- [6]艾拉莫德调控miR-146a介导的IRAK1/TRAF6/JNK1通路治疗类风湿关节炎的机制研究[D]. 孔瑞娜. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(02)
- [7]miR-150-5p/SOCS1在类风湿关节炎中的临床意义及其调控机制[D]. 邱明亮. 南昌大学, 2020(08)
- [8]川陈皮素抑制IL-21/IL-21R介导类风湿关节炎的炎症反应研究[D]. 刘中兵. 苏州大学, 2020(06)
- [9]基于RhoA/ROCK信号通路探讨麝香乌龙丸对血管屏障的保护机制[D]. 梅晓峰. 华北理工大学, 2020(02)
- [10]电针抑制IL-33调节的肥大细胞炎症减缓大鼠胶原诱导性关节炎[D]. 熊勇. 湖北中医药大学, 2020(08)