一、Akt and Bcl-x_L are independent regulators of the mitochondrial cell death pathways(论文文献综述)
赵丽[1](2021)在《降钙素基因相关肽对H9c2心肌细胞缺氧/复氧后自噬水平的影响及其作用机制》文中提出目的:1、研究探讨降钙素基因相关肽对H9c2心肌细胞缺氧/复氧后自噬和凋亡水平的影响。2、研究降钙素基因相关肽对缺氧/复氧H9c2心肌细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路中的相关蛋白的影响方法:在H9c2心肌细胞生长速度最快时,进行缺氧/复氧处理,模拟体内心脏细胞缺血/再灌注损伤。将六孔板中的H9c2心肌细胞随机分为4组,设置3个复孔。按照不同的处理因素分为:空白组;H/R组;CGRP组(向培养孔中加入1?10-8mol/L CGRP预处理20min,再H/R处理);CGRP8-37组(于H/R前30min加入1?10-7mol/L CGRP8-37作用10min,加入CGRP作用20min)。利用CCK-8检测细胞存活率;检测细胞上清液中LDH活性;利用TUNEL法检测细胞凋亡;采用JC-1检测线粒体膜电位水平;利用western blot法测定H9c2心肌细胞LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、Beclin-1、AKT、P-AKT、mTOR、P-mTOR的表达水平。结果:CCK-8检测:H9c2心肌细胞H/R处理后可降低正常培养细胞的存活率(P<0.01);而CGRP预处理后可提高H/R细胞存活率(P<0.01),该作用被CGRP8-37逆转(P<0.01)。ELISA法检测LDH活性:H9c2心肌细胞H/R后,培养液中LDH活性比空白组高(P<0.01),CGRP可降低H/R心肌细胞培养液中LDH活性(P<0.01),该作用被CGRP8-37拮抗(P<0.01)。TUNEL法检测:H/R处理后心肌细胞的凋亡率比正常培养细胞的凋亡率高(P<0.01),CGRP可降低H/R心肌细胞的凋亡率(P<0.01)该作用被CGRP8-37拮抗(P<0.01)。荧光探针JC-1检测:H/R可降低正常培养细胞的线粒体膜电位水平(均P<0.01)。CGRP处理后可提高H/R后H9c2心肌细胞的线粒体膜电位(均P<0.01);CGRP抑制剂CGRP8-37可逆转CGRP对H9c2心肌细胞的作用(P<0.01)。Western Blot检测:H/R可提高正常培养心肌细胞自噬相关蛋白Beclin-1表达以及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值(P<0.01),P-AKT/AKT比值、P-mTOR/mTOR值降低(P<0.01),与H/R组比较,CGRP组Beclin-1表达、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低(P<0.01),P-AKT/AKT比值、P-mTOR/mTOR值升高(P<0.01),CGRP8-37可逆转CGRP的作用(P<0.01)。结论:CGRP可能通过激活AKT/mTOR通路抑制过度自噬,提高细胞生存率,减轻细胞凋亡,保护H/R心肌细胞。
梅宇[2](2021)在《积雪草酸衍生物的合成及初步体外抗肿瘤活性的研究》文中指出积雪草酸(AA)是传统中药积雪草中的主要成分,在临床前研究中显示出降压、促智、抗微生物和抗肿瘤等多种生物活性。Bcl-xL蛋白是一种抗凋亡蛋白,在肿瘤细胞中广泛表达,并且对肿瘤的增殖、迁移和耐药性的产生具有促进作用,通过抑制Bcl-xL蛋白的活性可促进肿瘤细胞的凋亡,因此,Bcl-xL蛋白是肿瘤治疗的潜在靶标。本文在课题组前期总结的积雪草酸构效关系的基础上,运用计算机辅助设计及分子对接模拟,以Bcl-xL蛋白的三维晶体结构(PDB:3WIX)为靶点,设计了40个新型积雪草酸衍生物,最终筛选合成了两类共10个目标化合物。以AA为先导化合物,对其A环上的三个羟基进行氧化和缩合成环等反应,同时将其C-28位羧基酰化生成酰胺,得到6个2,3-并氢化吡嗪环-23-羰基-乌苏烷型-12-烯-28-酰胺类化合物和4个2α-烟酰氧基-3β,23-O-异亚丙基-乌苏烷型-12-烯-28-酰胺类化合物。其结构均经过1H-NMR确认,且均未见文献报道的新化合物。采用MTT方法,以SGC7901和A549细胞作为靶细胞,以Navitoclax(Bcl-xL抑制剂)为阳性对照药,测试了Ⅰ,Ⅱ类化合物的体外抗肿瘤活性。实验结果表明:所有目标化合物对肿瘤细胞A549和SGC7901的抑制作用均强于母体积雪草酸,其中化合物I2和Ⅱ3表现出较好的肿瘤抑制作用,与阳性对照药Navitoclax相比具有更强的抗肿瘤活性。化合物I2和Ⅱ3对人胃癌SGC7901细胞株的抑制率分别为72.39%、65.32%,IC50值分别为5.71μmol·L-1和5.43μmol·L-1。化合物I2和Ⅱ3对人肺癌A549细胞株的抑制率分别为73.62%和68.65%,IC50值分别为2.66μmol·L-1和4.79μmol·L-1。分子对接结果表明,化合物Ⅰ2和Ⅱ3与Bcl-xL蛋白结构中多个氨基酸残基形成氢键、π-π共轭和疏水键等相互作用,从而稳定结合。本文为进一步开展积雪草酸类化合物以及五环三萜类化合物的结构改造和抗肿瘤活性研究提供了一定参考。
何川[3](2021)在《FOXO3a在替莫唑胺诱导的保护性线粒体自噬中的作用和机制研究》文中研究说明背景:胶质瘤是最常见的中枢神经系统原发肿瘤,具有较高的侵袭性和复发性[2]。新诊断的恶性胶质瘤的治疗方案主要以手术切除肿瘤为主,结合放疗、化疗等综合治疗方法[3]。替莫唑胺是临床一线化疗药物,然而由于耐药机制的建立,替莫唑胺取得的效果仍然有限[4]。越来越多的证据表明自噬在降低胶质瘤细胞对替莫唑胺的敏感性方面起着重要的作用[9]。自噬是一种进化上高度保守的分解代谢过程。细胞通过将非必须的细胞组分或功能障碍的细胞器通过溶酶体降解来提供营养或能量,以维持细胞的稳态[6]。抑制自噬是提高胶质瘤细胞和胶质瘤干细胞对替莫唑胺敏感性的有效手段[9-12]。但是自噬导致胶质瘤细胞对替莫唑胺抗性的具体机制尚不清楚。通过自噬清除受损线粒体的过程被称为线粒体自噬[13]。细胞通过线粒体自噬的方式清除受损的线粒体,可以抑制细胞内ROS的积累,阻断线粒体中促凋亡蛋白如AIF、细胞色素C的释放[14]。尽管自噬赋予了胶质瘤细胞对替莫唑胺的抗性[9,12],但尚不清楚自噬的保护作用是否与清除受损线粒体相关。Bcl-2/腺病毒E1B 19-k Da相互作用蛋白3(Bcl-2/adenovirus E1B 19-k Da-ineracting protein 3,BNIP3)是一种自噬受体,负责介导受损线粒体通过自噬途径清除[13]。然而,替莫唑胺是否能引发线粒体自噬尚不明确。叉头盒转录因子3a(forkhead box transcription factor 3a,FOXO3a)是FOX蛋白家族成员。FOXO3a调控多种细胞功能如增殖、分化、侵袭转移和细胞死亡[15]。自噬的激活和BNIP3的上调均由FOXO3a调控[16-18],但是FOXO3a是否参与了BNIP3介导的线粒体自噬仍不清楚。因此,我们研究了FOXO3a在替莫唑胺引起胶质瘤细胞死亡中的作用,以及它与BNIP3介导的线粒体自噬之间的关系。目的:用人类及大鼠胶质瘤细胞系以及裸鼠移植瘤模型来研究FOXO3a和BNIP3在替莫唑胺诱导胶质瘤细胞死亡中的作用及机制。方法:1.MTT法检测胶质瘤细胞生存率。2.LDH释放法检测胶质瘤细胞死亡率。3.si RNA转染研究相关蛋白在替莫唑胺引起胶质瘤细胞死亡中的作用。4.免疫荧光技术检测相关蛋白在细胞内定位的变化。5.DCFH-DA荧光探针检测胶质瘤细胞内ROS水平变化。6.Mito SOX荧光探针检测胶质瘤细胞内线粒体超氧化物水平的变化。7.JC-1荧光探针检测胶质瘤细胞线粒体膜电位的变化。8.Mito Tracker荧光探针检测胶质瘤细胞线粒体形态和数量的变化。9.蛋白质印迹技术检测胶质瘤细胞和组织内蛋白表达的变化。、10.中性单细胞凝胶电泳检测胶质瘤细胞DNA双链断裂。11.构建Stub RFP-Sens GFP-LC3B慢病毒转染的U87细胞,研究替莫唑胺对胶质瘤细胞自噬的作用。12.C6裸鼠移植瘤模型研究替莫唑胺对体内胶质瘤细胞的作用。结果:1.替莫唑胺以浓度依赖的方式抑制胶质瘤细胞的体外增殖,并能抑制体内胶质瘤的生长。2.替莫唑胺引起胶质瘤细胞的DNA双链断裂,AIF核转位和线粒体膜电位降低。3.替莫唑胺引起胶质瘤细胞内ROS升高,通过GSH抑制ROS的升高能够抑制替莫唑胺引起的DNA双链断裂。替莫唑胺引起胶质瘤细胞线粒体超氧化物积累,通过Mn TBAP抑制线粒体超氧化物的积累可以抑制胶质瘤细胞内ROS升高,并抑制DNA双链断裂。4.替莫唑胺激活胶质瘤细胞自噬。通过3MA、bafilomycin A1或ATG5 si RNA抑制自噬能够增强替莫唑胺引起的AIF核转位、细胞内ROS升高,增强替莫唑胺的杀伤作用。5.替莫唑胺激活BNIP3介导的线粒体自噬。通过si RNA敲低BNIP3的表达能够增强替莫唑胺引起的AIF核转位、ROS升高,增强替莫唑胺对胶质瘤细胞的杀伤作用。6.通过si RNA敲低FOXO3a的表达,能够抑制BNIP3和LC3B的上调,从而抑制替莫唑胺引起的保护性线粒体自噬,增强替莫唑胺对胶质瘤细胞的杀伤作用。结论:1.替莫唑胺通过诱发氧化应激损伤线粒体,引起AIF释放和核转位、ROS升高,进而导致DNA双链断裂和胶质瘤细胞死亡。2.BNIP3介导的线粒体自噬通过清除受损的线粒体,抑制AIF的释放和ROS的升高,保护胶质瘤细胞免受替莫唑胺的杀伤。3.抑制FOXO3a调控的线粒体自噬,能够增强替莫唑胺对胶质瘤细胞的杀伤作用。
王延蛟[4](2021)在《mRNA/piRNA/piwi在DEN诱导肝癌中的表达及紫草素对肝癌细胞生物学行为的影响》文中研究说明目的:全球肝癌发病率和死亡率居高不下,每年约有841,000新发病例和782,000死亡病例,其中约50%来自中国,严重威胁到人类的健康。寻找肝癌潜在发病机制及诱发因素,能早发现、早治疗的任务迫在眉睫。DEN(Diethylnitrosamine,二乙基亚硝胺)诱发癌变过程与人肝癌的过程非常相似,是最广泛应用的肝癌模型。而肝癌的发生和发展是一个复杂的多因素过程,涉及细胞和分子水平的异常变化,关于肝癌发病机制的研究主要集中在细胞信号转导、肿瘤相关基因表达调控等方面。基因芯片能对基因表达的组织特异性、病变特异性进行综合的分析和判断,并迅速将基因与疾病联系起来。mi RNA虽然与肝癌的发生密切相关,但其无明显的细胞特异性,而存在于生殖细胞piwi蛋白具有组织特异性,近年被发现也存在于癌细胞,与piwi蛋白结合的piRNA(Piwi-interacting RNA)在维持DNA完整、抑制转录、翻译等均有重要作用,但关于piRNA/piwi与肿瘤发生的相关研究还在初始阶段。肝癌化疗失败的主要原因是多重耐药性(multi-drug resistance,MDR),研究表明紫草素具有抗癌作用,不易产生耐药性且副作用小,但具体机制并不清楚。综上所述,本研究以DEN诱导建立的大鼠肝癌模型作为研究对象,测定血清肝癌标志物、免疫、内分泌及相关指标,寻找肝组织差异表达的mRNA和piRNA及相关蛋白,揭示以上因素与肝癌发生发展的关系;以肝癌细胞CBRH-7919为研究对象,检测紫草素对其增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响,为探索肝癌发生的分子机制及临床用药提供理论支持。方法:1)选取40只6周龄雄性健康Wistar大鼠,重量在150克左右,分为肝癌模型组(NC)和正常对照组(Md),其中,肝癌模型组自由饮用浓度为0.1 mg/m L DEN的无菌水,每24小时更换一次,20周后停药(9-12周断药用水代替),观察肝脏组织病理形态学的改变以及细胞超微结构的变化;ELISA法检测外周血AFP、ASMA、HSP、IL-1、IL-6、TNF-α、ACTH、CORT等指标的改变;利用芯片技术检测组间肝组织mRNA的差异表达并筛选候选基因,采用RT-q PCR、免疫组织化学、Western-blot检测肝癌组织中候选基因的mRNA和蛋白质的表达水平;2)利用二代测序法检测肝组织差异表达的piRNA;利用motif短序列模式比配算法辨认piRNA临近调控区域加工区域特征进行富集度解析和聚类,结合piRNA定位进行功能基因的分布总结,利用RT-q PCR对piRNA、mi RNA进行定量,通过免疫组化和Western-blot检测肝组织中piwil2、piwil4等基因蛋白质的表达水平,利用CRISPR/cas9基因编辑系统敲除CBRH-7919细胞中的piwil4基因,利用CCK-8、流式细胞术、划痕实验检测细胞的增殖、凋亡及迁移的变化;3)用MTT、流式细胞术、划痕实验以及transwell小室法观察紫草素作用于CBRH-7919细胞后的细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭等变化,通过Western Blot法检测紫草素作用CBRH-7919细胞后STAT3、Cyclin D1、piwil4、Bcl-xl蛋白。结果:1)利用改变饮水方式建立了DEN诱导大鼠肝癌模型,成癌率为75%,并避免了实验动物中途死亡,肝癌组肝脏表面粗糙度增加,假小叶、增生灶和大量癌结节形成。与正常对照组比较,肝癌模型组血清AFP明显升高,差异显着(P<0.01);组间血清ASMA无统计学差异,肝癌模型组与正常对照组血清HSP差异显着(P<0.01)。血清免疫学指标IL-1、IL-6水平降低而TNF-α水平升高(P<0.05),内分泌指标ACTH和CORT的水平降低。mRNA芯片结果显示,31042个mRNA中表达上调的有1639个,表达下调的有360个,应用RT-q PCR法检测结果发现,STAT3和Cyclin D1基因的mRNA表达水平显着升高(P<0.01);Igfals、G6PC基因的mRNA表达水平下调,有统计学差异(P<0.05);免疫组织化学结果显示,正常对照组中STAT3和Cyclin D1蛋白表达量少,肝癌模型组STAT3和Cyclin D1蛋白的高表达主要定位在细胞核。western-blot实验结果显示Igfals、G6PC以及Emp1蛋白表达水平下调,有统计学差异(P<0.05);2)总计发现符合piRNA序列特征的为27439个,mRNA芯片结果显示,与正常对照组相比发现,肝癌模型组中上调表达的piRNA有4个(P<0.05),分别是piR-64745(piR-rno-51044),piR-64265(piR-rno-50623),piR-79437(piR-rno-48177),piR-64744(piR-rno-51043),表达下调的有2个(P<0.01),分别是piR-64143(piR-rno-50518)和piR-64142(piR-rno-50517)。组间表达异常的piRNA靶基因涉及嘌呤嘧啶代谢、氨基酸降解、黏多糖合成、复制、DNA剪切与修复、RNA和蛋白质降解、MAPK信号通路、Ras信号通路众多途径,RT-q PCR显示,与正常对照组比较,肝癌模型肝组织的piR-79437表达增加(P<0.01)、piR-64143表达降低(P<0.01),肝癌模型组血清中mi R-133b升高(P<0.05);在肝癌模型肝脏中Piwil2、Piwil4的蛋白高表达(P<0.01),Piwil4基因敲除后,与肝癌正常对照组和空载组相比,KO组细胞的增殖活性降低(P<0.05),KO组细胞凋亡率明显增加(P<0.05),Piwil4-/-细胞中STAT3、Cyclin D1、Bcl-x L蛋白表达水平均下调,差异显着(P<0.05);3)紫草素的IC50是11.97μM,作用细胞的浓度确定为5、10、15μM,细胞的存活率随药物浓度的增加而发生梯度变化,具有统计学差异(P<0.05),FCM结果显示,紫草素浓度为0μM、5μM、10μM、15μM时候,凋亡细胞数量分别为5.50±0.28%、7.88±0.51%、16.05±1.23%、26.88±0.22%,细胞凋亡率逐步上升,呈现出浓度依赖性,具有统计学差异(P<0.05),划痕实验结果显示,依次用0μM、5μM、10μM、15μM的紫草素对应的迁移率分别为52.10±6.12%、47.01±9.01%、34.11±7.18%、13.98±4.52%,呈现出浓度依赖性,具有统计学差异(P<0.05);transwell实验显示,依次用0μM、5μM、10μM、15μM的紫草素对应穿过小室膜的细胞数分别为482.33±55.54%、423.00±35.51%、386.33±68.37%、288.67±50.74%,呈现出浓度依赖性,侵袭能力下降,具有统计学差异(P<0.05);用15μM紫草素处理CBRH-7919细胞48小时后,STAT3、Cyclin D1蛋白表达下调(P<0.05),piwil4和Bcl-x L与正常对照组无明显变化。结论:1)使用0.1mg/ml的DEN饮用水诱导大鼠肝癌模型20周(9-12周停药),成癌率为75%(15/20),效果良好,观察肝脏组织HE病理结果发现肝癌发生,且血清AFP、HSP均升高,是一种较理想的研究肝癌发生发展的大鼠模型。作者认为免疫相关IL-1、IL-6、TNF-α水平的升高,内分泌相关ACTH和CORT水平的降低,提示肝癌模型中免疫和内分泌功能至少在一定程度上发生紊乱;2)模型肝脏中,STAT3,Cyclin D1等癌基因的过表达和促凋亡基因EMP1低表达共同导致细胞的持续增殖,肝癌模型的G6PC表达的降低便于糖异生的中间产物用于肝癌细胞增殖所需能量的供应和物质的生物合成;3)本研究发现piR-79437、piR-64143的异常表达可能与HCC存在关联,在肝癌的发生和发展中起作用,血清mi R-133b可能是肝癌的潜在标志物,PIWIL2和PIWIL4在肝癌模型组的高表达,提示具有促癌作用,PIWIL4基因敲除细胞中STAT3,cyclin D1和Bcl-xl的表达水平低于对照组,表明PIWIL4基因可能通过作用于STAT3/cyclin D1促进肝癌细胞的增殖,通过STAT3/Bcl-x L抑制其凋亡;4)紫草素使STAT3和Cyclin D1蛋白表达下调,提示其对肝癌细胞生长有抑制作用,同时,紫草素可以促进肝癌细胞的凋亡,抑制其迁移及侵袭,呈现浓度依赖性的关系,但其作用细胞后的piwil4和Bcl-x L的表达水平没有变化,提示紫草素不通过Bcl-x L影响细胞凋亡,具体通过什么途径促进肝癌细胞的凋亡,还需进一步研究。
姚宏伟[5](2020)在《白藜芦醇对肾细胞癌的作用及相关机制研究》文中研究表明肾细胞癌作为肾癌最常见的亚型,对放疗、化疗均不敏感,早期局限性肾细胞癌以手术切除为主。30%的患者被确诊为肾细胞癌时已经发生转移,并且一部分患者术后仍会发生转移,转移性肾细胞癌患者预后极差。目前分子靶向药物治疗肾细胞癌取得了一定的进展,但疗效并不令人满意,因此发展新的药物具有重要的临床意义。自然化合物是新的药物发展的宝贵资源,白藜芦醇(Resveratrol,Res)作为一种天然类化合物,分布于多种植物中。已有的研究显示Res能够通过引起细胞周期阻滞,诱导凋亡,抑制侵袭、转移等多种机制,对多种类型的肿瘤细胞体外具有抑制作用,并且在体内同样具有抗肿瘤活性。目前Res在肾细胞癌中的相关研究较少,并且由于Res复杂的药理活性,其作用机制尚不清楚。本研究观察Res对肾细胞癌的作用,并探讨相关的作用机制,为发展新的药物治疗肾细胞癌提供理论基础。第一部分白藜芦醇对人肾细胞癌786-O细胞的作用背景:研究显示Res对多种类型的肿瘤具有抑制作用,但在肾细胞癌中的作用目前研究较少,需进一步阐释。目的:探讨Res对人肾细胞癌的作用。方法:给予Res处理人肾细胞癌786-O细胞,使用CCK8检测细胞活性;流式细胞技术分析细胞凋亡及细胞周期;细胞划痕及transwell实验分析迁移及侵袭能力;Western blot检测MMP2(基质金属蛋白酶2)及MMP9(基质金属蛋白酶9)蛋白的表达;建立786-O细胞裸鼠移植肿瘤模型,观察Res体内对肾细胞癌生长的作用。结果:Res呈浓度及时间关系减少786-O细胞的活性。给予48 h的处理,20μM及40μM浓度的Res诱导细胞凋亡,10μM的Res对凋亡无明显影响,但引起S期周期阻滞。Res抑制786-O细胞的迁移及侵袭能力,并且下调MMP2及MMP9蛋白的表达。Res在裸鼠体内抑制移植肿瘤的生长,减少肿瘤的体积及重量。结论:Res在体外及体内对人肾细胞癌均具有抗肿瘤作用。第二部分白藜芦醇通过ROS诱导人肾细胞癌786-O细胞凋亡背景:细胞凋亡是一个主动过程,涉及一系列信号因子的激活、表达以及调控。积累的证据证实Res能诱导肿瘤细胞的凋亡,但由于其复杂的药理活性,诱导凋亡的具体分子机制仍需进一步的阐释。目的:体外探讨Res诱导786-O细胞凋亡的分子机制。方法:流式细胞技术检测线粒体膜电位、凋亡、caspase3活性及ROS(活性氧)水平;免疫荧光检测ROS及细胞色素C;Western blot分析GAPDH、COXⅣ、细胞色素C、PARP、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38及p-p38蛋白的表达。结果:Res下调786-O细胞的线粒体膜电位水平,促进细胞色素C的胞浆释放,上调caspase3活性,引起PARP蛋白的裂解。Z-VAD-FMK,一个pan-caspase抑制剂,显着抑制Res诱导的凋亡。进一步的实验显示Res促进786-O细胞ROS的产生,抗氧化剂NAC(N-乙酰半胱氨酸)能够改善线粒体膜电位,下调caspase3活性,减少PARP蛋白的裂解,抑制Res诱导的凋亡。最后我们发现Res通过ROS抑制ERK(细胞外信号调节激酶),激活JNK(c-jun氨基末端激酶)及p38(p38丝裂原活化蛋白激酶),SP600125(JNK抑制剂)对凋亡无明显影响,SB203580(p38抑制剂)减少Res诱导的786-O细胞凋亡。结论:1、Res引起线粒体损伤,激活caspase3导致786-O细胞凋亡。2、Res上调786-O细胞的ROS水平,升高的ROS促进凋亡。3、Res通过ROS激活p38,激活的p38促进Res诱导的786-O细胞凋亡。第三部分自噬抑制白藜芦醇诱导的人肾细胞癌786-O细胞凋亡背景:自噬作为进化过程中的保守机制,普遍存在于各种生物细胞中。当细胞受到各种压力,能够激活自噬,维持内环境的稳态,有利于细胞在压力环境下的存活;但在一些情况下,极度的自噬能导致损伤的进一步加重,促进细胞的死亡。研究报道Res能通过多种途径影响自噬,发挥促存活或促死亡的作用,但在肾细胞癌中的作用并不清楚。目的:体外探讨自噬对Res诱导786-O细胞凋亡的影响。方法:流式细胞技术及免疫荧光检测Cyto-ID荧光分析细胞自噬体形成;western blot检测GAPDH、LC3BII、P62、S6、p-S6、AMPK、p-AMPK、JNK、p-JNK、BCL2、p-BCL2、Becline1以及PARP蛋白的表达;流式细胞技术检测细胞凋亡;si RNA干扰技术敲低Beclin1蛋白的表达,探讨自噬对Res诱导786-O细胞凋亡的影响。结果:Res上调786-O细胞自噬水平;Res诱导的自噬需要ROS,抗氧化剂NAC减少Res上调的自噬;Res对p-AMPK及p-S6蛋白的表达没有影响,JNK阻滞剂SP600125下调自噬,相反p38阻滞剂SB203580进一步促进Res诱导的自噬;自噬阻滞剂CQ(氯喹)进一步促进Res诱导的凋亡,上调PARP蛋白的裂解,并且Beclin1si RNA上调Res引起的PARP蛋白的裂解。结论:1、Res在786-O细胞中激活自噬。2、Res通过ROS-JNK路径激活自噬。3、自噬抑制Res诱导的786-O细胞凋亡。第四部分白藜芦醇通过ROS诱导人肾细胞癌786-O细胞衰老背景:细胞衰老是指细胞从生长状态进入不可逆转的生长停滞状态。在一定条件下,如化疗药物、电离辐射以及氧化损伤等因素可以诱导肿瘤细胞进入衰老。研究证实Res在体外能够诱导肿瘤细胞进入衰老,抑制肿瘤细胞的生长增殖,但是否能够引起肾细胞癌细胞的衰老迄今未见相关报道。目的:体外探讨Res对肾细胞癌786-O细胞衰老的影响。方法:流式细胞技术检测细胞周期,凋亡及ROS水平;免疫荧光分析p-H2AX;EDU增殖实验检测细胞增殖;SA-β-Gal染色检测细胞衰老;western blot检测GAPDH、p-H2AX、p-ATM、p-ATR、p-CHK2、p-CHK1、p38、p-p38及p21蛋白的表达水平;荧光定量PCR检测IL-6、IL-8 mRNA的表达,ELISA分析IL-6、IL-8蛋白的分泌水平。结果:给予10μM的Res持续处理786-O细胞4 d,Res增加p-H2AX阳性的细胞,上调p-H2AX、p-ATM、p-ATR、p-CHK2、p-CHK1及p21蛋白的表达,引起持续的S期周期阻滞,减少EDU阳性的细胞,增加SA-β-Gal染色阳性的细胞,诱导786-O细胞衰老,未引起明显细胞凋亡。Res诱导786-O细胞衰老需要上调的ROS,NAC降低Res上调的p-H2AX、p-ATM、p-ATR、p-CHK2、p-CHK1及p21蛋白的表达,恢复细胞增殖,下调SA-β-Gal染色阳性的细胞。进一步来说,衰老的细胞上调IL-6、IL-8 mRNA以及蛋白分泌水平(衰老相关的分泌表型,SASP),上调的IL-6、IL-8mRNA及蛋白分泌需要ROS激活的p38活性,SB203580(p38阻滞剂)抑制IL-6、IL-8 mRNA及蛋白分泌水平。结论:1、Res在体外能够诱导786-O细胞衰老。2、Res上调的ROS促进786-O细胞衰老。3、Res通过ROS-p38路径促进SASP。
罗艺[6](2020)在《基于网络药理学研究隐丹参酮对肝癌细胞的作用机制》文中研究表明目的:肝癌是全球最常见的癌症之一,目前虽然肝癌的诊断和治疗取得了很大的进展,但复发率仍然很高,总体生存率较低。因此,迫切需要开发新的治疗肝癌的药物,降低肝癌的死亡率,改善预后。隐丹参酮(Cryptotanshinone,CPT)是从中药丹参中分离得到的一种天然脂溶性二萜类化合物,已被证明对多种癌症具有治疗作用。然而,隐丹参酮对肝癌细胞的干预作用及其机制仍不明确。因此,本研究旨在通过将网络药理学和实验验证相结合探讨隐丹参酮对肝癌细胞的干预作用及其机制。方法:在本研究中,首先我们采用网络药理学的方法,通过对药物-药物靶点网络、蛋白与蛋白互作网络、靶点-功能网络以及通路富集的分析,预测隐丹参酮对肝癌细胞的干预作用及其可能的相关分子机制。其次,在体外,采用MTT实验和平板克隆实验检测隐丹参酮对肝癌Huh7细胞的抗增殖作用和细胞毒性。采用流式细胞术实验观察隐丹参酮对肝癌Huh7细胞凋亡的影响。采用透射电镜和共聚焦显微镜观察隐丹参酮对肝癌Huh7细胞自噬的影响。通过使用自噬抑制剂氯喹和3-MA,采用流式细胞术实验、Western blot实验和MTT实验探讨隐丹参酮诱导的自噬和凋亡之间的关系。通过Western blot实验检测凋亡和自噬相关蛋白及PI3K/AKT/mTOR信号通路上的蛋白表达水平。最后,在体内通过构建裸鼠异位皮下移植瘤模型,探讨隐丹参酮对肝癌Huh7细胞裸鼠皮下移植瘤生长的影响,并通过Western blot实验检测凋亡和自噬相关蛋白及PI3K/AKT/mTOR信号通路上的蛋白表达水平,通过TUNEL实验检测细胞凋亡。结果:首先,通过利用PubChem、STITCH、HIT、TCMSP和PharmMapper数据库,我们总共获取隐丹参酮靶点296个。通过利用GeneCards、OMIM、Liverromme和OncoDB.HCC数据库,我们总共获取肝癌相关靶点10363个。通过对隐丹参酮-隐丹参酮靶点网络的分析,我们发现隐丹参酮可以通过多个靶点作治疗疾病,如AKT1、PIK3R1、CASP3、GSK3B、HSP90AA1、ESR1、TNF、IL12B。通过对蛋白与蛋白互作靶点网络的分析,我们发现 AKT1、ALB、MAPK1、TNF、EGFR、SRC、STAT3、HRAS、ESR1、HSP90AA1 这些靶点可能在隐丹参酮治疗肝癌中发挥关键作用。通过对隐丹参酮靶点-功能网络的分析,我们发现隐丹参酮可能通过血管生成、自噬、免疫、炎症、细胞增殖、细胞周期、凋亡过程、细胞迁移和侵袭和代谢过程这9个生物学功能模块发挥治疗肝癌的作用。通过对通路富集的分析,我们发现隐丹参酮可能通过FoxO信号通路、Prolactin信号通路、Thyroid hormone信号通路、PI3K-Akt信号通路、Ras信号通路、HIF-1信号通路、T cell receptor信号通路、ErbB信号通路和VEGF信号通路等信号通路发挥治疗肝癌的作用。其次,体外实验结果表明,隐丹参酮对肝癌Huh7细胞的增殖有明显的抑制作用,并且我们发现隐丹参酮能够诱导肝癌Huh7细胞凋亡和自噬。运用自噬抑制剂氯喹和3-MA,我们发现抑制隐丹参酮诱导的自噬能够促进隐丹参酮诱导的肝癌细胞凋亡,说明隐丹参酮诱导的自噬对肝癌Huh7细胞具有一定的保护作用。此外,通过使用PI3K激活剂IGF-I,我们发现隐丹参酮能够通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导细胞凋亡和自噬。最后,体内实验结果表明,隐丹参酮能够抑制肝癌细胞Huh7裸鼠皮下移植瘤的生长。结论:隐丹参酮能够诱导肝癌Huh7细胞发生凋亡和自噬,其机制可能是通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路实现的,这为今后隐丹参酮的进一步科学研究和运用于临床上治疗肝癌提供一定的参考价值。
杨龙[7](2020)在《HIF-1调控线粒体自噬恢复七氟醚后处理减轻糖尿病心肌缺血再灌注损伤的机制研究》文中研究说明目的:心血管疾病是目前全球突出性的社会医疗问题,患病率持续上升,已成为全球范围内造成死亡的最主要原因。糖尿病作为心血管疾病的重要危险因素,合并有糖尿病的缺血性心脏病患者诱发心肌缺血再灌注损伤的几率是非糖尿病缺血性心脏病患者的23倍。七氟醚后处理(Sevoflurane Postconditionning,SPostC)能有效减轻健康心肌缺血再灌注损伤,但糖尿病状态下,SpostC的心肌保护作用弱化。前期研究证实糖尿病状态下七氟醚后处理保护作用弱化的原因可能在于受损的HIF-1信号通路,应用去铁胺(DFO)能够激活糖尿病状态下受损的HIF-1α重现七氟醚后处理保护作用,但具体机制不清。新近研究发现线粒体自噬在七氟醚后处理心肌保护作用中起关键作用,但在糖尿病状态下,线粒体自噬被抑制。如何重现糖尿病状态下SpostC心肌保护作用是目前急需解决的重要临床问题,而阐明HIF-1α/BNIP3介导的线粒体自噬是否参与恢复糖尿病状态下七氟醚后处理保护作用尤为重要。本研究在前期研究基础上探讨HIF-1调控的线粒体自噬在SpostC对抗缺血性心肌损伤中的作用,期望通过调控HIF-1介导的线粒体自噬恢复糖尿病状态下七氟醚后处理保护作用。方法:在离体层面,建立H9C2心肌细胞缺氧/复氧模型,在复氧初接受2.4%七氟醚后处理。通过测定细胞活力、LDH活性及流式细胞仪测定细胞凋亡反映细胞损伤情况;透射电镜观察自噬小体反映自噬情况;western blot检测HIF-1α、BNIP3、Beclin-1蛋白表达;利用干扰RNA技术沉默BNIP3观察其在促进自噬方面作用。在体水平,通过结扎大鼠冠脉前降支40分钟后复灌120分钟建立I/R模型。在缺血前24h腹腔内注射DFO(200mg/kg),复灌初15分钟给与1MAC七氟醚后处理。复灌2h后测定心肌梗死面积、线粒体超微结构、自噬小体、ATP含量、膜电位、ROS产生率以及HIF-1α、BNIP3、LC3-II、Beclin-1、P62、LAMP2蛋白表达和心脏功能。结果:细胞实验缺氧复氧损伤后,与H/R组相比,SpostC能够上调HIF-1α、BNIP3蛋白表达(P<0.05,SPostC组vs H/R组),促进自噬小体清除,细胞活力明显增加,LDH降低,但是这种保护作用在给与2ME2或沉默BNIP3后完全消除。糖尿病状态下,与I/R组相比,SpostC组保护作用弱化,给与DFO处理后,SPostC能够上调HIF-1α及其下游靶基因BNIP3蛋白表达(P<0.05),同时降低自噬关键蛋白LC3-II、Beclin-1、P62的表达,增加LAMP2蛋白表达;自噬小体堆积明显减少,ROS产生率下降,ATP含量明显增加,膜电位提高,心肌梗死面积明显减小,心功能改善明显(P<0.05,SPostC组vs DFO+SpostC组)。结论:SPostC通过调控HIF-1α/BNIP3信号通路促进线粒体自噬减轻心肌细胞缺氧复氧损伤。主要机制在于SPostC能够上调HIF-1α的表达,进一步激化下游靶基因BNIP3,促进了BNIP3介导的线粒体自噬,通过清除自噬小体并增加细胞活力,降低LDH水平,抑制细胞凋亡,最终对抗细胞缺氧复氧损伤。糖尿病状态下,通过DFO预处理联合SPostC能够激活受损的HIF-1α并上调HIF-1α的蛋白表达,进一步促进HIF-1α/BNIP3介导的线粒体自噬,及时清除受损的线粒体,避免了线粒体来源的ROS对线粒体膜电位的攻击,使得线粒体功能得到稳定,心肌梗死面积明显减少,改善了心功能。
朱丽娟[8](2020)在《基于代谢组学及自噬和凋亡调控途径研究蛇葡萄素抑制结直肠癌生长的作用机制》文中提出目的:结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是全球最常见的癌症之一,其在癌症中发病率和死亡率均位于前列,严重威胁着全人类的生命健康。目前对于结直肠癌的治疗以外科手术切除为主,辅助放、化疗等综合治疗措施,但随之产生的抗免疫、骨髓抑制、脏器受损、肿瘤细胞耐药等副作用,严重制约了放化疗的效果。天然药物具有复杂的成分、多重的作用靶点,对于肿瘤发展的多个环节会产生影响,同时其毒性较低,不容易产生肿瘤耐药,已成为结直肠癌辅助治疗方案重要的组成部分。蛇葡萄素(Ampelopsin,AMP)是从植物蛇葡萄根皮及叶中提取出的一种小分子黄酮类化合物,对多种肿瘤细胞具有细胞毒作用,而且能够诱导肿瘤细胞凋亡。近年研究发现自噬在肿瘤的治疗中也是非常重要的靶点,其与凋亡之间的关系对肿瘤的进程及治疗具有重要的影响,但是,蛇葡萄素对肿瘤细胞自噬和凋亡的调控尚不明确。因此,本研究以多种人结直肠癌细胞系作为研究对象,一方面基于色谱—质谱联用的代谢组学技术平台对蛇葡萄素干预人结直肠癌细胞移植瘤裸鼠肿瘤组织代谢谱进行分析,筛选出与其抑制结直肠癌生长相关的差异性代谢物,并对其代谢通路进行分析,有助于从代谢层面上阐述蛇葡萄素抑制结直肠癌生长的作用机理。另一方面从细胞水平、组织水平及分子水平,探讨蛇葡萄素对人结直肠癌细胞凋亡和自噬的调节以及相关的分子机制,为结直肠癌的治疗提供新的线索和途径,为蛇葡萄素抗肿瘤作用的进一步研究和开发利用提供理论参考。方法:(1)用不同浓度的AMP(6.25、12.5、25、50和100μg/ml)分别作用于人结直肠癌HCT-116、SW480、SW620、LOVO、Colo 205、LS174T细胞48、72及96 h,MTT法检测不同浓度的AMP对这些细胞增殖抑制率的影响。用50、100μg/ml的AMP作用于人结肠癌HCT-116、SW480细胞,克隆形成实验观察AMP对细胞克隆形成率的影响。用50μg/ml的AMP作用于人结肠癌HCT-116、SW480细胞24 h,细胞创伤愈合实验观察AMP对细胞迁移能力的影响。(2)利用人结肠癌HCT-116细胞裸鼠皮下移植瘤模型,观察AMP体内抗结直肠癌活性,组织切片HE染色观察AMP对动物主要脏器是否有毒性作用。(3)用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱联用(UPLC-TOFMS)非靶标代谢组学技术,研究人结肠癌HCT-116细胞皮下移植瘤模型小鼠和AMP处理组小鼠瘤块组织样本,初步筛选与AMP抑制结直肠癌生长有关的差异代谢物,并通过KEGG通路富集分析其相关代谢通路。(4)用50、100μg/ml的AMP作用于人结肠癌HCT-116、SW480细胞,流式细胞分析仪观察AMP对细胞周期和凋亡的影响,倒置显微镜下观察细胞形态。吖啶橙(Acridine orange,AO)染色后,荧光显微镜下观察AMP对细胞中发出红色荧光的酸性自噬囊泡的影响。并用电镜观察AMP对人结肠癌HCT-116细胞自噬的影响。免疫印迹法(Western-blotting)分析25、50、100μg/ml的AMP对细胞及移植瘤模型裸鼠瘤块组织中凋亡相关蛋白BCl-2、Bax、Cleaved-Caspase-3及自噬相关蛋白LC3、Beclin-1、Atg5表达的影响。(5)分别加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)和自噬促进剂雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)作用于人结肠癌HCT-116、SW480细胞,MTT法检测自噬抑制剂和促进剂与AMP合用后对细胞增殖抑制率的影响,流式细胞术观察细胞凋亡率的变化,荧光显微镜下观察自噬抑制剂和自噬促进剂与AMP合用后细胞中酸性自噬囊泡的红色荧光比例。Western-blotting分析细胞中抗凋亡蛋白BCl-2和促凋亡蛋白Bax的比率,以及Cleaved-Caspase-3的表达,同时分析细胞中自噬标志物LC3、自噬相关蛋白Beclin-1、Atg5表达的变化。(6)Western-blotting分析AMP对人结肠癌HCT-116、SW480细胞及移植瘤模型裸鼠瘤块组织中PI3K,p-mTOR、Total-mTOR,p-Akt,Total-Akt及p-P70S6K、Total-P70S6K蛋白表达的影响。结果:(1)体外抗肿瘤实验表明,AMP对受试的六种结直肠癌细胞均有显着的抑制作用,且具有浓度依赖性。在48、72、96 h作用点,AMP对人结肠癌HCT-116、SW480及Colo 205细胞增殖的抑制作用具有时间依赖性,对人结肠癌SW620、Lovo及LS174T细胞而言,作用72 h时,增殖抑制作用最强,此后,随时间延长抑制作用逐渐降低。克隆形成实验和细胞创伤愈合实验表明,AMP能够抑制人结肠癌HCT-116、SW480细胞的克隆形成能力,抑制细胞迁移。(2)体内抗肿瘤实验表明,200 mg/kg的AMP能够明显抑制人结肠癌HCT-116细胞裸鼠移植瘤的生长,具有良好的体内抗结直肠癌活性。对动物的肝脏、肾脏、心脏、脾脏、肺脏指数均无明显影响,组织切片HE染色结果显示,动物重要脏器组织无明显异常。(3)基于超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱联用(UPLC-TOFMS)非靶标代谢组学技术平台,对人结肠癌HCT-116细胞皮下移植瘤模型小鼠和AMP处理组小鼠瘤组织代谢谱进行了检测,筛选差异性代谢产物,涉及三羧酸循环、氨基酸代谢、核苷酸代谢、氨基酰tRNA的生物合成等通路。(4)流式细胞仪分析结果显示,AMP能够将人结肠癌HCT-116、SW480细胞阻滞于G1期,干扰细胞的有丝分裂,使细胞生长停滞。同时,细胞凋亡率明显增加。AO染色后,荧光显微镜下可见细胞内红色荧光比例明显增加,电镜下可见细胞胞浆中出现了双层或者单层膜包绕着线粒体等细胞器的自噬小体和自噬溶酶体。Western-blotting分析结果显示,AMP作用后,细胞和瘤块组织中BCl-2/Bax比率下调,Caspase-3剪切活性片段Cleaved-Caspase-3的表达上调,同时LC3-Ⅱ、Beclin-1及Atg5蛋白的表达均显着增加。(5)AMP与自噬抑制剂3-MA合用后,细胞增殖加快,与自噬促进剂RAPA合用后,细胞增殖减慢。细胞AO染色后荧光显微镜下可见,AMP与自噬抑制剂3-MA合用后,细胞内呈红色荧光的酸性自噬泡的比例减少,而与自噬诱导剂RAPA合用后,细胞内呈红色荧光的酸性自噬泡比例显着增加。Western-blotting分析显示,3-MA与AMP合用,可以使自噬相关蛋白LC3Ⅱ、Beclin-1及Atg5的表达降低,而RAPA与AMP合用后,这些蛋白的表达均明显增加。流式细胞术Annexin-PI双染结果显示,3-MA单独应用时,细胞凋亡率没有太大的变化,当其与AMP合用后,凋亡率明显低于AMP处理组。RAPA与AMP合用后,细胞凋亡率明显增加,高于AMP处理组。Western-blotting分析结果显示,3-MA与AMP合用后,凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax的比例没有显着变化,但Cleaved-Caspase-3的表达显着低于AMP处理组,RAPA与AMP合用后,细胞凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax的比例明显降低,Cleaved-Caspase-3的表达显着上调。(6)25、50、100μg/ml AMP作用于人结肠癌HCT-116、SW480细胞以及HCT-116细胞移植瘤裸鼠模型后,细胞及瘤块组织中的PI3K、p-Akt、p-mTOR和p-P70S6K的表达均呈降低的趋势。结论:(1)AMP具有显着的体外抗结直肠癌活性,能够抑制人结肠癌HCT-116、SW480细胞的克隆形成及迁移能力。(2)AMP具有显着的体内抗结直肠癌活性,且对动物的主要脏器无明显毒性。(3)AMP主要影响结直肠癌组织异常的能量代谢,特别是氨基酸代谢。(4)AMP能够形成结肠癌细胞G1期阻滞,诱导细胞凋亡和自噬。(5)自噬能够促进AMP诱导的细胞凋亡作用,与凋亡合作,共同促进细胞死亡。(6)AMP能够抑制PI3K/Akt/mTOR信号转导通路。
张文会[9](2019)在《基于p53通路新型黄酮螺环骨架衍生物的多靶点机制研究》文中进行了进一步梳理肿瘤已成为严重威胁人类健康的重大疾病之一,其形成与发展是一个多阶段、多因素、多基因和多细胞信号通路参与的复杂过程。由于肿瘤细胞的异质性及复杂性,相对于单靶点药物和药物联合使用,基于系统生物学的多靶点药物可能在肿瘤治疗上具有更好的优势。因此,合理设计出协同调节多病理靶点且安全有效的先导化合物已成为抗肿瘤新药研发的热点。p53是人体重要的抑癌基因,具有抑制细胞增殖,诱导细胞周期阻滞及诱导细胞凋亡等功能。5-Lox在多种恶性肿瘤中均过表达,其促进细胞增殖,抑制凋亡和分化的作用与PI3K/Akt和p53等信号通路密切相关。研究表明,Akt可以推迟p53介导的凋亡,并通过抑制MDM2自磷酸化来稳定p53表达水平,p53-MDM2信号通路和PI3K/Akt之间存在协同对话效应。肿瘤细胞中作用于p53通路的同时抑制Akt活性,可能增强p53激活剂的治疗效果。因此,本论文在以5-Lox及Akt等为抗肿瘤治疗靶点的黄酮骨架上,合理引入p53-MDM2结合抑制剂氧化吲哚,设计并合成一系列黄酮螺环骨架衍生物的新型分子。通过体外抗肿瘤活性筛选,得到活性最强的两个化合物3d和3e,并对其抗肿瘤作用途径及机制进行探究。在此基础上,通过建立Lewis肺癌移植瘤动物模型,对化合物3e的体内活性及作用机制进行研究。以期得到疗效更佳,毒副作用更低的抗肿瘤先导化合物,为多靶点抗肿瘤药物研发提供理论参考。本论文的主要工作如下:(一)靶标化合物的合成及体外抗肿瘤活性研究以p53信号通路为研究对象,采用药效团组合法,理性设计并合成26个新型黄酮螺环骨架衍生物,所有化合物结构经1H NMR、13C NMR、HR-ESI-MS及X-单晶映射技术确证。MTT法增殖研究结果表明,部分化合物显着抑制A549、K562、NCI-H1299及PC-3细胞的增殖,尤其是化合物3d(IC50=4.72±0.35μM)和3e(IC50=3.15±0.51μM)对表达野生型p53的A549细胞最为敏感,表现出优于阳性对照顺铂(IC50=17.58±1.12μM)和母核白杨素(IC50>50μM)的抑制活性,且对正常细胞的毒性较小,表明在正常细胞与肿瘤细胞之间具有良好的选择性。在此基础上,通过计算机模拟分子对接,初步探究化合物3e与受体Akt、5-Lox及MDM2的作用模式和结合能力,结果验证化合物3e的抗肿瘤作用靶点与设计理念中的Akt、5-Lox及MDM2靶点相关。通过生物试验显示,靶标化合物3d和3e以浓度或时间依赖性的方式显着激活A549细胞内p53蛋白和m RNA表达,证明靶标化合物确实能影响p53通路。(二)化合物3d和3e抑制A549细胞增殖作用研究以人肺癌A549细胞为研究对象,分别从细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期、细胞迁移和侵袭等方面研究化合物3d和3e抑制细胞增殖的作用。软琼脂集落形成及平板克隆实验显示,化合物3d和3e均显着抑制A549细胞克隆形成,再次证实靶标化合物对A549细胞的抗增殖作用;划痕及Transwell实验显示,化合物3d和3e显着抑制A549细胞的迁移和侵袭能力;通过形态学观察、PI及AO/EB荧光染色初步表明化合物3d和3e诱导A549细胞发生了凋亡,且凋亡程度随化合物浓度的增加而增强;随后的琼脂糖凝胶电泳显示,20μM的化合物3d和3e分别处理A549细胞24 h,能明显观察到DNA ladder的形成,表明其诱导A549细胞基因组DNA发生片段化;流式细胞术检测显示,A549细胞凋亡百分率随着化合物处理浓度的增加或时间的延长而逐渐提高,细胞倾向于晚期凋亡;且化合物3d和3e处理24 h引起A549细胞G1期阻滞。以上结果均表明化合物3d和3e具有显着抑制A549细胞增殖活性,且该作用与诱导细胞凋亡并使周期阻滞相关。(三)化合物3d和3e诱导A549细胞凋亡作用机制研究通过检测细胞内ROS水平研究发现,化合物3d和3e均浓度依赖性的提高A549细胞内ROS水平;Caspase活性检测结果表明,化合物3d和3e显着激活细胞内凋亡相关的Caspase-3、Caspase-8及Caspase-9酶活力。提示激活的p53调控增加细胞线粒体膜通透性,A549细胞凋亡可能与Caspase级联反应有关。为了进一步探究其作用机制,选择Bcl-2、Bax、Cyt c、p53、p21、MDM2、Akt、5-Lox等p53信号通路上相关蛋白及基因进行研究。Western blot和Real-time PCR研究结果表明,化合物3d和3e均显着上调A549细胞内Bax、Cyt c、p21及p53蛋白表达,下调Bcl-2、MDM2、Akt及5-Lox蛋白表达;此外,上调A549细胞内p53 m RNA水平,并下调Akt m RNA水平。根据以上结果,推测A549细胞凋亡的机制为:化合物3d和3e通过抑制MDM2活性,释放p53,激活p53信号通路;同时抑制Akt及5-Lox蛋白表达,协同增加p53通路抗肿瘤作用效果。激活的p53通过调控p21蛋白表达,诱导A549细胞G1期阻滞;与此同时,改变Bax/Bcl-2的比值,增加细胞内ROS水平,导致细胞内氧化还原失衡,DNA损伤,细胞线粒体膜通透性增加,释放促凋亡因子Cyt c,从而活化Caspase-9,启动内源性线粒体凋亡途径。此外,通过激活Caspase-8酶活力,启动外源性死亡受体凋亡途径。(四)化合物3d和3e急性毒性及体内抗肿瘤作用机制研究根据急性毒性分别标准,化合物3d和3e均属于低毒。在此基础上,通过构建C57BL/6小鼠Lewis肺癌移植瘤模型,对化合物3e的体内抗肿瘤作用机制进行研究。结果表明,化合物3e有效抑制Lewis肺癌小鼠体内移植瘤的生长,并具有良好的剂量依赖关系。其中,高剂量(400 mg/kg)具有最高的抑瘤率(56.87±1.47%)。通过Western blot研究,推测其体内抗肿瘤作用机制为:化合物3e通过抑制瘤细胞内MDM2、Akt及5-Lox蛋白表达,上调p53蛋白表达,激活并协同作用于p53信号通路。一方面,上调促凋亡蛋白Bax表达量,下调抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平,增加Bax/Bcl-2比值,并释放Cyt c,从而诱导瘤细胞凋亡;另一方面,下调血管生成因子VEGF、细胞粘附因子ICAM-1及基质金属蛋白酶MMP-2蛋白水平,阻滞瘤细胞血管再生并抑制Lewis肺癌小鼠体内肿瘤的转移。综上,本研究设计并合成26个新型黄酮螺环骨架衍生物,通过体外抗肿瘤活性筛选,并对高活性化合物3d和3e体外抗A549细胞增殖和化合物3e抑制Lewis肺癌小鼠体内移植瘤生长的作用机制进行研究,揭示了靶标化合物体内外抗肿瘤作用机制。为进一步多靶点黄酮类化合物抗肿瘤药物的研发提供理论基础和技术支撑,具有一定的理论价值及指导意义。
肇炜博[10](2019)在《Hippo信号通路在异丙肾上腺素所致心肌损伤中的调控作用研究》文中进行了进一步梳理研究背景交感神经系统-β肾上腺素能受体(β-adrenoceptor,β-AR)激活是心肌损伤和心力衰竭的重要病理生理机制之一。β-AR激活可通过提高心肌收缩功能和心率起到功能代偿作用;然而,病理情况下长期、过度的β-AR活化则可导致心肌细胞凋亡和心肌纤维化。目前对β-AR过度活化诱导心肌损伤机制的了解还十分有限。近几年研究者们开始关注Hippo信号通路在心肌损伤和心力衰竭中的作用,但具体机制目前仍不清楚。Hippo通路是调节细胞凋亡和增殖的重要信号途径之一,其主要成员包括哺乳动物不育系20-样激酶1/2(mammalian sterile 20-like kinase 1/2,Mst1/2)、大肿瘤抑制因子同源物1/2(large tumour suppressor homolog 1/2,Lats1/2)、转录共调节因子Yes-相关蛋白(yes-associated protein,YAP)以及YAP的平行同源因子TAZ(transcriptional co-activator with PDZ-binding motif,具有PDZ结合基序的转录共激活因子)。Hippo信号通路的激活可引起Mst1表达和磷酸化水平增加,通过促进YAP/TAZ磷酸化,抑制下游细胞增殖相关基因表达,同时促进细胞凋亡相关基因的表达。最近研究发现,心肌梗死时,抑制Hippo信号通路具有心脏保护作用。但目前尚不清楚心脏β-AR过度活化是否可通过激活Hippo信号通路导致心肌细胞凋亡和心肌纤维化。本人博士联合培养指导老师,澳大利亚Baker心脏和糖尿病研究所杜晓军教授课题组前期研究发现,在β-AR激动剂异丙肾上腺素(Isoprenaline,ISO)诱导的小鼠心肌损伤模型和心肌细胞特异性β2-AR过表达小鼠心肌组织中,促凋亡蛋白Bcl-2相互作用的细胞死亡介导因子(Bcl-2 interacting mediator of cell death,BIM)和促纤维化蛋白半乳糖凝集素-3(Galectin-3,Gal-3)的表达均升高。BIM是Bcl-2家族中仅含一个BH3结构域的小分子促凋亡蛋白。作为细胞凋亡的上游启动蛋白,BIM能够激活促凋亡的Bcl-2家族蛋白(如Bax,Bak)表达,同时下调抗凋亡的Bcl-2家族蛋白(如Bcl-2,Mcl-1)表达。Gal-3是一种与细胞内外糖蛋白有高亲和力的半乳糖凝集素,具有促进组织纤维化和炎症反应的作用。既往研究发现,敲除BIM基因能够抑制ISO诱导的心肌细胞凋亡、心肌肥大和心功能异常,但Gal-3是否介导了ISO诱导的心肌纤维化和心功能异常目前仍不清楚。此外,目前对于β-AR活化调控心肌细胞中BIM和Gal-3表达的信号转导机制仍不明确。既往研究发现,心肌细胞特异性Mst1过表达小鼠的心肌细胞中Gal-3的表达升高了约40-50倍,提示Mst1-Hippo信号通路可能参与了Gal-3的表达调控。因此,我们推测:β-AR过度活化可激活心肌细胞Hippo信号通路,进而上调BIM和Gal-3的表达,导致心肌细胞凋亡和心肌纤维化。研究方法1.以C57BL/6J小鼠和心肌细胞特异性β2受体转基因小鼠(β2-TG)作为研究对象,其中C57BL/6J小鼠给予不同剂量和不同时间的ISO治疗,采用Western-Blot检测心肌组织中Mst1,YAP,磷酸化YAP(p-YAP)和BIM的表达水平,ELISA检测Gal-3表达,并检测β-AR阻滞剂对YAP,p-YAP,BIM和Gal-3表达的影响。2.以Gal-3基因敲除(Gal-3 KO)小鼠作为研究对象,并给予ISO治疗,心脏超声检测小鼠心功能,羟脯氨酸浓度测定法检测小鼠心肌组织胶原含量,ELISA检测心肌组织中Gal-3水平,RT-q PCR检测心肌纤维化和炎症相关基因,以及心肌组织中YAP靶基因(CTGF、Ankrd1和Birc5)的表达水平。3.以心肌细胞特异性Mst1转基因小鼠(Mst1-TG)和Mst1显性失活突变体转基因小鼠(dn Mst1-TG)作为研究对象,并给予ISO治疗,Western-Blot检测心肌组织中YAP,p-YAP和BIM的表达,ELISA检测心肌组织中Gal-3水平;采用生物信息学方法分析Mst1-TG小鼠心肌组织中YAP靶基因的表达,并采用RT-q PCR检测Gal-3敲除对YAP靶基因的调控作用。4.体外培养H9c2细胞(大鼠心肌细胞株),并给予si RNA-YAP治疗,Western-Blot检测YAP、BIM和Gal-3的表达水平,明确YAP敲低对心肌细胞中BIM和Gal-3蛋白表达的影响;H9c2细胞分别给予ISO、PKA抑制剂H89或PKI 14-22、腺苷酸环化酶激活剂Forskolin治疗,研究c AMP/PKA信号转导对ISO诱导的YAP磷酸化以及BIM、Gal-3表达的影响。研究结果1.ISO通过上调心肌组织中BIM和Gal-3表达诱导心肌损伤1)ISO能够时间和剂量依赖性的上调C57BL/6J小鼠心肌组织中BIM和Gal-3表达;2)非选择性β-AR阻滞剂普萘洛尔或卡维地洛能够显着抑制ISO诱导的小鼠心肌组织中BIM和Gal-3表达;选择性β1-AR阻滞剂阿替洛尔(AT)和β2-AR阻滞剂ICI-118551(ICI)也可有效抑制ISO诱导的Gal-3表达,当联合使用AT和ICI时,Gal-3表达有进一步降低的趋势;3)β2-TG小鼠心肌组织中BIM和Gal-3水平均显着上调,其中Gal-3的表达呈年龄依赖性增加;4)正常野生型小鼠给予ISO治疗后,心肌组织中Gal-3水平显着增加,左室短轴缩短率降低40%,心肌胶原含量升高55%,纤维化和炎症相关因子m RNA水平均上调。敲除Gal-3基因后,左室短轴缩短率回升,心肌胶原含量降低,纤维化和炎症相关因子m RNA水平降低。2.ISO可激活小鼠Hippo信号通路,促进心肌组织中Mst1表达和YAP磷酸化1)ISO能够上调C57BL/6J小鼠心肌组织中Mst1,YAP和YAP Ser127位点的磷酸化水平;2)非选择性β-AR阻滞剂普萘洛尔和卡维地洛能够显着抑制ISO诱导的小鼠心肌组织中YAP的表达和磷酸化水平;3)ISO可同时上调心肌细胞核YAP(n YAP)与细胞浆YAP(c YAP)表达,其中细胞浆YAP蛋白(c YAP)的增加更明显,n YAP与c YAP的比值(n YAP/c YAP)显着降低;4)β2-TG小鼠心肌组织中Mst1表达和YAP磷酸化水平呈年龄依赖性增加。3.ISO通过激活Hippo信号通路促进BIM和Gal-3表达1)Mst1-TG小鼠心肌组织中YAP,p-YAP,BIM和Gal-3表达均显着增加,给予ISO治疗后,Gal-3表达进一步增加;2)Mst1失活突变(dn Mst1-TG)后,ISO诱导的心肌组织中YAP,p-YAP,BIM和Gal-3表达均显着抑制;3)生物信息学分析发现Mst1-TG小鼠心肌组织中存在8,619个差异表达基因,其中4,080个基因上调,4,539个基因下调。比对Cistrome DB中已发表的YAP Ch IP-seq数据,Mst1-TG小鼠心肌组织中共发现666个YAP靶基因,其中262个上调,179个下调。基因集富集分析结果表明Mst1-TG小鼠心肌组织中YAP靶基因集上调;4)降低H9c2细胞(大鼠心肌细胞株)中的YAP水平,可显着上调BIM和Gal-3表达;5)ISO治疗或心肌细胞特异性Mst1过表达(Mst1-TG)均可上调小鼠心肌组织中三种YAP靶基因(CTGF、Ankrd1和Birc5)的表达。Gal-3基因敲除可显着抑制ISO诱导的YAP靶基因表达;在Mst1-TG背景下敲除Gal-3后,Birc5表达无明显改变,而CTGF和Ankrd1却显着下调。4.ISO通过c AMP/PKA激活Hippo通路,促进BIM和Gal-3表达1)PKA抑制剂H89和PKI 14-22均可显着抑制ISO诱导的H9c2细胞中p-YAP,BIM和Gal-3的表达;2)腺苷酸环化酶激活剂Forskolin可显着上调H9c2细胞中Mst1,p-YAP,BIM和Gal-3的表达水平。研究结论心肌β肾上腺素能受体过度活化可通过c AMP/PKA信号转导激活Hippo通路,诱导Mst1表达和YAP磷酸化,通过上调BIM和Gal-3表达,促进心肌细胞凋亡和心肌纤维化。本研究首次揭示β-AR可与Hippo信号通路相偶联,并通过调节下游的促凋亡蛋白BIM和促纤维化蛋白Gal-3表达,最终导致心肌损伤和心功能异常。本研究提示β-AR/Hippo/BIM-Gal-3信号通路可能成为心肌损伤防治的新靶点。
二、Akt and Bcl-x_L are independent regulators of the mitochondrial cell death pathways(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Akt and Bcl-x_L are independent regulators of the mitochondrial cell death pathways(论文提纲范文)
(1)降钙素基因相关肽对H9c2心肌细胞缺氧/复氧后自噬水平的影响及其作用机制(论文提纲范文)
摘要 |
abstract |
常用缩写词中英文对照表 |
前言 |
1 材料与方法 |
1.1 实验材料和试剂 |
1.1.1 实验细胞株 |
1.1.2 主要实验仪器和设备 |
1.1.3 实验试剂及厂家 |
1.1.4 主要细胞所用培养试剂的配制 |
1.2 实验方法 |
1.2.1 H9c2心肌细胞的培养 |
1.2.2 建立H9c2心肌细胞缺氧/复氧模型 |
1.2.3 实验分组及处理 |
1.2.4 CCK-8检测细胞活力 |
1.2.5 LDH检测 |
1.2.6 一步法TUNEL检测H9c2心肌细胞凋亡 |
1.2.7 JC-I检测H9c2心肌细胞线粒体膜电变化 |
1.2.8 Western blotting法检测LC3、Beclin-1、AKT、P-AKT、mTOR、P-mTOR |
1.3 统计学方法 |
2 结果 |
2.1 CGRP对H/R后H9c2心肌细胞存活率的影响 |
2.2 CGRP对H/R后H9c2心肌细胞凋亡率的影响 |
2.3 不同的处理方法对H9c2心肌细胞乳酸脱氢酶(LDH)释放量的影响 |
2.4 不同处理方法对H9c2心肌细胞线粒体膜电位的影响 |
2.5 CGRP对H/R后H9c2心肌细胞自噬标志蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ以及AKT/mTOR通路蛋白 p-AKT,AKT,p-mTOR和mTOR表达量的影响 |
3 讨论 |
4 结论 |
参考文献 |
综述 自噬在心肌缺血/再灌注损伤中的分子机制 |
参考文献 |
致谢 |
个人简介 |
(2)积雪草酸衍生物的合成及初步体外抗肿瘤活性的研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
引言 |
第一章 文献综述 |
1.1 积雪草酸及其生物活性 |
1.1.1 积雪草酸简介 |
1.1.2 抗肿瘤作用 |
1.1.3 抗炎作用 |
1.1.4 抗纤维化作用 |
1.1.5 抗菌作用 |
1.1.6 护肤作用 |
1.1.7 保护心血管作用 |
1.1.8 护肝作用 |
1.1.9 抗阿兹海默症作用 |
1.2 积雪草酸衍生物及生理活性现状 |
1.3 其他五环三萜类化合物的研究进展 |
1.3.1 齐墩果酸 |
1.3.2 甘草次酸 |
1.3.3 熊果酸 |
1.3.4 桦木酸 |
1.4 抗肿瘤药物发展现状和天然抗肿瘤药物的研究进展 |
1.4.1 抗肿瘤药物发展现状 |
1.4.2 天然抗肿瘤药物的研究进展 |
1.5 Bcl-xL及其受体抑制剂的研究进展 |
1.6 五环三萜类化合物与Bcl-xl |
第二章 积雪草酸衍生物的结构设计 |
2.1 计算机辅助药物设计研究 |
2.2 基于Bcl-xL靶点的积雪草酸衍生物的设计 |
2.3 目标化合物的设计 |
2.3.1 2,3-并氢化吡嗪环-23-羰基-乌苏烷型-12-烯-28-酰胺类化合物的合成 |
2.3.2 2α-烟酰氧基-3β,23-O-异亚丙基-乌苏烷型-12-烯-28-酰胺类化合物的合成 |
第三章 积雪草酸衍生物的路线设计 |
3.1 2,3-并氢化吡嗪环-23-羰基-乌苏烷型-12-烯-28-酰胺类化合物的合成路线 |
3.2 2α-烟酰氧基-3β,23-O-异亚丙基-乌苏烷型-12-烯-28-酰胺类化合物的合成路线 |
第四章 实验部分 |
4.1 实验仪器与药品 |
4.1.1 实验材料 |
4.1.2 实验仪器 |
4.2 化学合成实验 |
4.2.1 2,3,23-三羰基-乌苏烷-12-烯-28羧酸(AA_1)的合成 |
4.2.2 2,3并氢化吡嗪环23羰基-乌苏烷-12-烯-28-羧酸(AA_2)的合成 |
4.2.3 N-[2,3-并氢化吡嗪环-23-羰基-乌苏烷-12-烯-28-酰]-对硝基苯胺(I_1)的合成 |
4.2.4 N-[2,3-并氢化吡嗪环-23-羰基-乌苏烷-12-烯-28-酰]-对氯苯胺(I_2)的合成 |
4.2.5 N-[2,3-并氢化吡嗪环-23-羰基-乌苏烷-12-烯-28-酰]-对氟苯胺(I_3)的合成 |
4.2.6 N-[2,3-并氢化吡嗪环-23-羰基-乌苏烷-12-烯-28-酰]-对甲氧基苯胺(I_4)的合成 |
4.2.7 N-[2,3-并氢化吡嗪环-23-羰基-乌苏烷-12-烯-28-酰]-对甲基苯胺(I_5)的合成 |
4.2.8 N-[2,3-并氢化吡嗪环-23-羰基-乌苏烷-12-烯-28-酰]-间甲基苯胺(I_6)的合成 |
4.2.9 2α-羟基-3β,23-O-异亚丙基-乌苏烷-12-烯-28-羧酸(AA_4)的合成 |
4.2.10 2α-烟酰氧基-3β,23-O-异亚丙基-乌苏烷-12-烯-28-羧酸(AA_5)的合成 |
4.2.11 N-[2α-烟酰氧基-3β,23-O-异亚丙基-乌苏烷-12-烯-28-酰]-对硝基苯胺(Ⅱ_1)的合成 |
4.2.12 N-[2α-烟酰氧基-3β,23-O-异亚丙基-乌苏烷-12-烯-28-酰]-对氯苯胺(Ⅱ_2)的合成 |
4.2.13 N-[2α-烟酰氧基-3β,23-O-异亚丙基-乌苏烷-12-烯-28-酰]-对氟苯胺的合成(Ⅱ_3) |
4.2.14 N-[2α-烟酰氧基-3β,23-O-异亚丙基-乌苏烷-12-烯-28-酰]-对甲氧基苯胺的合成(Ⅱ_4) |
4.3 生物活性测试 |
4.3.1 MTT比色法实验原理 |
4.3.2 实验仪器和药品 |
4.3.3 细胞培养 |
4.3.4 MTT法检测 |
4.3.5 数据处理 |
第五章 实验结果与讨论 |
5.1 实验结果 |
5.2 化学实验 |
5.2.1 基团的保护 |
5.2.2 氧化剂的选择 |
5.2.3 催化剂的选择 |
5.2.4 溶剂的选择 |
5.2.5 细胞活性实验方法的选择 |
5.3 谱图分析 |
5.3.1 化合物I_2的谱图分析 |
5.3.2 化合物Ⅱ_3的谱图分析 |
5.4 积雪草酸衍生物的抗肿瘤活性测试 |
第六章 结论 |
致谢 |
参考文献 |
附录 |
(3)FOXO3a在替莫唑胺诱导的保护性线粒体自噬中的作用和机制研究(论文提纲范文)
前言 |
中文摘要 |
Abstract |
中英文缩略词对照表 |
第1章 绪论 |
第2章 综述 |
2.1 胶质瘤的治疗概述 |
2.2 程序性细胞死亡 |
2.2.1 凋亡 |
2.2.2 自噬依赖性细胞死亡 |
2.2.3 程序性坏死 |
2.2.4 铁死亡 |
2.3 自噬 |
2.3.1 自噬的分类 |
2.3.2 自噬的机制 |
2.3.3 自噬的调控 |
2.3.4 自噬在胶质瘤及其治疗中的作用 |
2.3.5 替莫唑胺与自噬 |
2.4 线粒体的质量控制 |
2.4.1 线粒体的结构和功能 |
2.4.2 线粒体动力学 |
2.4.3 线粒体自噬 |
2.4.4 BNIP3与线粒体自噬 |
2.5 ROS与细胞抗氧化机制 |
2.5.1 ROS的产生和作用 |
2.5.2 ROS的调控 |
2.5.3 ROS与肿瘤 |
2.6 内质网应激和未折叠蛋白质反应 |
2.7 替莫唑胺的作用及耐药机制 |
2.7.1 替莫唑胺的作用机制 |
2.7.2 染色质溶解 |
2.7.3 MGMT |
2.8 替莫唑胺的其他相关耐药机制 |
2.8.1 ABC转运蛋白 |
2.8.2 NF-κB信号通路 |
2.8.3 JAK-STAT信号通路 |
2.9 总结 |
第3章 资料与方法 |
3.1 主要器材与试剂 |
3.1.1 主要实验器材 |
3.1.2 主要实验试剂 |
3.2 细胞系及细胞培养、裸鼠饲养 |
3.3 实验液体及配制方法 |
3.4 细胞复苏、传代及冻存 |
3.5 实验技术 |
3.5.1 MTT法检测细胞生存率 |
3.5.2 RNA干扰技术 |
3.5.3 乳酸脱氢酶释放法(LDH法)检测细胞的死亡率 |
3.5.4 中性单细胞凝胶电泳电泳检测DNA双链断裂 |
3.5.5 JC-1 探针检测细胞内线粒体膜电位的变化 |
3.5.6 Mito SOX检测线粒体内超氧化物的变化 |
3.5.7 DCFH-DA探针检测细胞内ROS的变化 |
3.5.8 构建荧光蛋白标记的LC3B的U87细胞系 |
3.5.9 线粒体荧光探针检测细胞内线粒体的形态和数量变化 |
3.5.10 裸鼠皮下移植胶质瘤模型 |
3.5.11 蛋白质印迹技术检测细胞胞浆、胞核、线粒体蛋白的变化 |
3.5.11.1 蛋白样品准备 |
3.5.11.2 蛋白质印迹 |
3.5.11.3 实验分组 |
3.5.12 免疫共沉淀法检测胶质瘤细胞及肿瘤组织中LC3BⅡ、BNIP与相关蛋白的相互作用 |
3.5.13 激光共聚焦扫描显微镜观察细胞内目标蛋白的表达和定位变化 |
3.5.14 裸鼠肿瘤组织内过氧化氢含量的测定 |
3.5.15 透射电镜观察线粒体自噬 |
3.5.16 统计学分析 |
第4章 实验结果 |
4.1 替莫唑胺在体外抑制胶质瘤细胞增殖 |
4.2 替莫唑胺引起胶质瘤细胞DNA双链断裂和线粒体损伤 |
4.2.1 替莫唑胺引起胶质瘤细胞DNA双链断裂 |
4.2.2 替莫唑胺引起胶质瘤细胞AIF核转位 |
4.2.3 替莫唑胺引起胶质瘤细胞线粒体损伤 |
4.3 损伤的线粒体通过上调ROS增强替莫唑胺引起的DNA双链断裂 |
4.3.1 替莫唑胺通过升高胶质瘤细胞内ROS引发DNA双链断裂 |
4.3.2 替莫唑胺通过损伤线粒体引起细胞内ROS升高 |
4.4 自噬抑制替莫唑胺引起的氧化应激 |
4.4.1 替莫唑胺引起胶质瘤细胞自噬 |
4.4.2 自噬抑制替莫唑胺引起的胶质瘤细胞死亡 |
4.4.3 自噬抑制替莫唑胺引起的AIF核转位和ROS升高 |
4.5 替莫唑胺激活胶质瘤细胞线粒体自噬 |
4.6 BNIP3 介导替莫唑胺引起的线粒体自噬 |
4.6.1 替莫唑胺上调BNIP3的表达,并促进BNIP3向线粒体转位 |
4.6.2 BNIP3介导替莫唑胺引起的线粒体自噬 |
4.6.3 BNIP3介导保护性线粒体自噬 |
4.7 FOXO3a调控替莫唑胺引起的线粒体自噬 |
4.7.1 替莫唑胺引起FOXO3a表达升高和核转位 |
4.7.2 FOXO3a调控BNIP3介导的线粒体自噬 |
4.8 动物实验 |
第5章 讨论 |
第6章 结论 |
参考文献 |
附录 |
作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
致谢 |
(4)mRNA/piRNA/piwi在DEN诱导肝癌中的表达及紫草素对肝癌细胞生物学行为的影响(论文提纲范文)
中英文缩略词对照表 |
摘要 |
Abstract |
前言 |
第一部分 DEN诱导大鼠肝癌模型的建立及mRNA芯片分析 |
1 研究内容与方法 |
1.1 研究对象 |
1.2 研究内容与方法 |
1.3 统计学方法 |
2 结果 |
3 讨论 |
4 小结 |
第二部分 piRNA/piwi与肝癌的关系研究 |
1 研究内容与方法 |
1.1 实验对象 |
1.2 研究内容与方法 |
1.3 统计学方法 |
2 结果 |
3 讨论 |
4 小结 |
第三部分 紫草素对肝癌细胞CBRH-7919 的影响 |
1 研究内容与方法 |
1.1 实验对象 |
1.2 研究内容与方法 |
1.3 统计学方法 |
2 结果 |
3 讨论 |
4 小结 |
结论 |
致谢 |
参考文献 |
综述 piRNA/piwi 在癌症中的作用 |
参考文献 |
攻读博士学位期间获得的学术成果 |
个人简历 |
导师评阅表 |
(5)白藜芦醇对肾细胞癌的作用及相关机制研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
abstract |
引言 |
参考文献 |
第一部分 白藜芦醇对人肾细胞癌786-O细胞的作用 |
一、体外实验 |
材料和方法 |
结果 |
二、体内实验 |
材料和方法 |
结果 |
讨论 |
参考文献 |
第二部分 白藜芦醇通过ROS诱导人肾细胞癌786-O细胞凋亡 |
材料和方法 |
结果 |
讨论 |
参考文献 |
第三部分 自噬抑制白藜芦醇诱导的人肾细胞癌786-O细胞凋亡 |
材料和方法 |
结果 |
讨论 |
参考文献 |
第四部分 白藜芦醇通过ROS诱导人肾细胞癌786-O细胞衰老 |
材料和方法 |
结果 |
讨论 |
参考文献 |
结论 |
综述一 白藜芦醇抑癌作用及相关信号通路研究进展 |
参考文献 |
综述二 凋亡、自噬及衰老与肿瘤 |
参考文献 |
攻读学位期间的研究成果 |
致谢 |
(6)基于网络药理学研究隐丹参酮对肝癌细胞的作用机制(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
引言 |
第一章 文献研究 |
第一节 肝癌的研究进展 |
一、肝癌的概述 |
二、肝癌的危险因素 |
三、肝癌的诊断 |
四、肝癌的治疗现状 |
第二节 中医药与肝癌 |
一、肝癌的病因病机 |
二、隐丹参酮与肝癌 |
第三节 细胞自噬和细胞凋亡在肝癌中的作用 |
一、细胞自噬与肝癌 |
二、细胞凋亡与肝癌 |
三、细胞自噬与细胞凋亡在肝癌中的关系 |
第二章 隐丹参酮对肝癌细胞的干预作用及其机制的网络药理学研究 |
第一节 隐丹参酮靶点和肝癌相关靶点获取 |
一、实验材料 |
二、实验方法 |
三、实验结果 |
四、讨论 |
第二节 隐丹参酮-隐丹参酮靶点网络的分析 |
一、实验材料 |
二、实验方法 |
三、实验结果 |
四、讨论 |
第三节 蛋白与蛋白互作靶点网络分析 |
一、实验材料 |
二、实验方法 |
三、实验结果 |
四、讨论 |
第四节 隐丹参酮靶点-功能网络的分析 |
一、实验材料 |
二、实验方法 |
三、实验结果 |
四、讨论 |
第五节 通路富集分析 |
一、实验材料 |
二、实验方法 |
三、实验结果 |
四、讨论 |
第三章 隐丹参酮通过调控PI3K/AKT/mTOR通路诱导肝癌Huh7细胞自噬和凋亡 |
第一节 隐丹参酮对肝癌Huh7细胞增殖的影响 |
一、实验材料 |
二、实验方法 |
三、实验结果 |
四、讨论 |
第二节 隐丹参酮对肝癌Huh7细胞凋亡的影响 |
一、实验材料 |
二、实验方法 |
三、实验结果 |
四、讨论 |
第三节 隐丹参酮对肝癌Huh7细胞自噬的影响 |
一、实验材料 |
二、实验方法 |
三、实验结果 |
四、讨论 |
第四节 隐丹参酮诱导的肝癌Huh7细胞凋亡和自噬的关系 |
一、实验材料 |
二、实验方法 |
三、实验结果 |
四、讨论 |
第五节 隐丹参酮对肝癌Huh7细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响 |
一、实验材料 |
二、实验方法 |
三、实验结果 |
四、讨论 |
第六节 隐丹参酮对肝癌Huh7细胞裸鼠皮下移植瘤生长的影响 |
一、实验材料 |
二、实验方法 |
三、实验结果 |
四、讨论 |
结语 |
参考文献 |
附录 |
在校期间发表论文情况 |
致谢 |
统计学审核证明 |
(7)HIF-1调控线粒体自噬恢复七氟醚后处理减轻糖尿病心肌缺血再灌注损伤的机制研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
前言 |
第一部分 七氟醚后处理促进HIF-1/BNIP3 介导的线粒体自噬减轻H9C2 心肌细胞缺氧复氧损伤的机制研究 |
1 材料与方法 |
1.1 研究材料 |
1.2 研究方法 |
1.3 研究方案 |
1.4 观察指标 |
1.5 统计分析 |
2 结果 |
3 讨论 |
4 小结 |
第二部分 HIF-1/BNIP3 介导的线粒体自噬在七氟醚后处理减轻SD大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用机制研究 |
1 材料与方法 |
1.1 研究材料 |
1.2 研究方法 |
1.3 研究方案 |
1.4 观察指标 |
1.5 统计分析 |
2 结果 |
3 讨论 |
4 小结 |
第三部分 去铁胺预处理联合七氟醚后处理调控HIF-1/BNIP3 介导的线粒体自噬减轻糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的机制研究 |
1 材料与方法 |
1.1 研究材料 |
1.2 研究方法 |
1.3 研究方案 |
1.4 观察指标 |
1.5 统计分析 |
2 结果 |
3 讨论 |
4 小结 |
结论 |
致谢 |
参考文献 |
综述 |
参考文献 |
攻读博士学位期间获得的学术成果 |
个人简历 |
导师评阅表 |
(8)基于代谢组学及自噬和凋亡调控途径研究蛇葡萄素抑制结直肠癌生长的作用机制(论文提纲范文)
中文摘要 |
Abstract |
第一章 引言 |
1.1 结直肠癌的病因及治疗进展 |
1.2 天然药物治疗结直肠癌的研究进展 |
1.3 蛇葡萄素的研究进展 |
1.4 代谢组学在结直肠癌研究中的应用 |
1.5 凋亡和自噬在肿瘤发生发展中的作用 |
1.6 本研究的目的及意义 |
第二章 蛇葡萄素体外抗结直肠癌作用研究 |
2.1 材料 |
2.2 方法 |
2.2.1 细胞培养 |
2.2.2 药物及主要试剂配制 |
2.2.3 增殖抑制实验 |
2.2.4 细胞克隆实验 |
2.2.5 细胞创伤愈合实验 |
2.2.6 统计学方法 |
2.3 结果 |
2.3.1 MTT法检测不同浓度AMP对人结直肠癌细胞增殖的影响 |
2.3.2 AMP对人结肠癌HCT-116、SW480 细胞克隆的影响 |
2.3.3 AMP对人结肠癌HCT-116、SW480 细胞迁移的影响 |
2.4 讨论 |
2.5 小结 |
第三章 蛇葡萄素抗人结直肠癌HCT-116细胞裸鼠皮下移植瘤药效实验 |
3.1 材料 |
3.2 方法 |
3.2.1 人结肠癌HCT-116细胞裸鼠皮下移植瘤模型建立 |
3.2.2 分组及给药方法 |
3.2.3 检测指标 |
3.2.4 统计学方法 |
3.3 结果 |
3.3.1 AMP对 HCT-116 细胞裸鼠移植瘤模型动物体重的影响 |
3.3.2 AMP对 HCT-116 细胞裸鼠移植瘤模型动物瘤体积的影响 |
3.3.3 AMP对人结肠癌HCT-116细胞移植瘤动物瘤重及抑瘤率的影响 |
3.3.4 AMP对人结肠癌HCT-116细胞移植瘤动物脏器系数的影响 |
3.3.5 人结肠癌HCT-116细胞移植瘤模型动物主要脏器组织切片HE染色结果 |
3.4 讨论 |
3.5 小结 |
第四章 基于代谢组学研究蛇葡萄素抑制结直肠癌生长的作用机制 |
4.1 材料 |
4.2 方法 |
4.2.1 样品前处理 |
4.2.2 LC-MS/MS分析 |
4.2.3 数据统计分析 |
4.3 结果 |
4.3.1 样本代谢质谱TIC图 |
4.3.2 偏最小二乘判别分析结果 |
4.3.3 正交偏最小二乘判别分析结果 |
4.3.4 单变量统计分析结果 |
4.3.5 显着性差异代谢物 |
4.3.6 层次聚类分析结果 |
4.3.7 相关系数矩阵热图 |
4.3.8 KEGG通路富集分析结果 |
4.4 讨论 |
4.5 小结 |
第五章 蛇葡萄素对人结直肠癌细胞凋亡和自噬的影响 |
5.1 材料 |
5.2 方法 |
5.2.1 细胞培养 |
5.2.2 受试药配制 |
5.2.3 人结肠癌HCT-116细胞裸鼠皮下移植瘤模型建立 |
5.2.4 动物分组及给药方法 |
5.2.5 流式细胞仪分析细胞周期 |
5.2.6 流式细胞仪分析AMP对人结肠癌HCT-116、SW480细胞凋亡的影响 |
5.2.7 倒置显微镜观察细胞形态 |
5.2.8 AO染色观察AMP对人结肠癌HCT-116、SW480细胞自噬的影响 |
5.2.9 透射电镜观察HCT-116细胞自噬 |
5.2.10 Western-blotting观察AMP对人结肠癌HCT-116、SW480细胞及移植瘤裸鼠瘤块组织中凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax、Cleaved-Caspase-3及自噬相关蛋白LC3、Atg5、Beclin-1表达的影响 |
5.2.11 统计学方法 |
5.3 结果 |
5.3.1 AMP对人结肠癌细胞周期的影响 |
5.3.2 AMP对人结肠癌细胞凋亡的影响 |
5.3.3 倒置显微镜观察细胞形态 |
5.3.4 荧光显微镜和透射电镜观察细胞自噬情况 |
5.3.5 细胞及瘤块组织中凋亡相关蛋白的表达 |
5.3.6 细胞及瘤块组织中自噬相关蛋白的表达 |
5.4 讨论 |
5.5 小结 |
第六章 自噬在蛇葡萄素诱导人结肠癌细胞凋亡中的作用以及相关分子机制研究 |
6.1 材料 |
6.2 方法 |
6.2.1 细胞培养 |
6.2.2 药物及主要试剂配制 |
6.2.3 AMP联合自噬抑制剂和促进剂对结肠癌细胞增殖的影响 |
6.2.4 AMP联合自噬抑制剂和促进剂对结肠癌细胞凋亡的影响 |
6.2.5 AO染色观察AMP联合自噬抑制剂和促进剂对细胞自噬的影响 |
6.2.6 Western-blotting观察自噬抑制剂和促进剂对细胞凋亡和自噬蛋白表达的影响 |
6.2.7 统计学方法 |
6.3 结果 |
6.3.1 AMP联合自噬抑制剂和促进剂对细胞增殖的影响 |
6.3.2 AMP联合自噬抑制剂和促进剂对细胞凋亡的影响 |
6.3.3 AMP联合自噬抑制剂和促进剂对细胞凋亡相关蛋白表达的影响 |
6.3.4 AMP联合自噬抑制剂和促进剂对细胞自噬的影响 |
6.3.5 AMP联合自噬抑制剂和促进剂对细胞自噬相关蛋白表达的影响 |
6.3.6 AMP对 PI3K/Akt/mTOR信号转导途径的影响 |
6.4 讨论 |
6.5 小结 |
第七章 结论 |
7.1 主要结论 |
7.2 研究展望 |
参考文献 |
文献综述 |
参考文献 |
在学期间的研究成果 |
缩略词表 |
致谢 |
(9)基于p53通路新型黄酮螺环骨架衍生物的多靶点机制研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
第一章 绪论 |
1.1 研究背景 |
1.2 p53基因 |
1.2.1 p53基因的概述 |
1.2.2 p53与MDM2负反馈调节维持自身稳定 |
1.3 p53的肿瘤抑制功能 |
1.3.1 p53抑制肿瘤细胞的增殖 |
1.3.2 p53促进肿瘤细胞的凋亡 |
1.3.3 p53抑制肿瘤细胞的迁移 |
1.3.4 p53抑制肿瘤细胞的血管生成 |
1.4 小分子p53-MDM2结合抑制剂 |
1.4.1 Nutlin类抑制剂 |
1.4.2 螺环羟吲哚类抑制剂 |
1.4.3 RG7388类抑制剂 |
1.5 黄酮类化合物及其抗肿瘤作用 |
1.6 多靶点药物设计 |
1.6.1 多靶点抗肿瘤药物研究进展 |
1.6.2 多靶点药物分子的设计方法 |
1.7 立题依据及主要研究内容 |
1.7.1 立题依据 |
1.7.2 主要研究内容 |
第二章 靶标化合物的合成及体外抗肿瘤活性研究 |
2.1 引言 |
2.2 课题设计思路 |
2.3 实验材料与仪器设备 |
2.3.1 细胞株 |
2.3.2 实验试剂 |
2.3.3 仪器与设备 |
2.3.4 试剂的配置 |
2.4 实验方法 |
2.4.1 靶标化合物的合成 |
2.4.2 细胞培养 |
2.4.3 MTT法测定靶标化合物对肿瘤细胞增殖的抑制作用 |
2.4.4 正常细胞毒性测定 |
2.4.5 分子模拟对接 |
2.4.6 统计学分析 |
2.5 结果与讨论 |
2.5.1 靶标化合物的合成及结构表征 |
2.5.2 靶标化合物体外抗肿瘤活性筛选 |
2.5.3 化合物3d和3e抑制肿瘤细胞增殖活性研究 |
2.5.4 化合物3d和3e的毒性分析 |
2.5.5 化合物3e与受体Akt、5-Lox及 MDM2 的分子模拟 |
2.5.6 化合物3d和3e诱导p53的激活 |
2.6 本章小节 |
第三章 化合物3d和3e抑制A549细胞增殖作用研究 |
3.1 引言 |
3.2 实验材料与仪器设备 |
3.2.1 细胞株 |
3.2.2 实验试剂 |
3.2.3 仪器与设备 |
3.2.4 试剂的配制 |
3.3 实验方法 |
3.3.1 细胞培养 |
3.3.2 肿瘤细胞集落形成测定 |
3.3.3 肿瘤细胞伤口愈合测定 |
3.3.4 肿瘤细胞迁移及侵袭测定 |
3.3.5 肿瘤细胞凋亡检测 |
3.3.6 肿瘤细胞周期检测 |
3.3.7 统计学分析 |
3.4 结果与讨论 |
3.4.1 化合物3d和3e对A549细胞克隆形成的影响 |
3.4.2 化合物3d和3e对A549细胞软琼脂集落形成的影响 |
3.4.3 化合物3d和3e对A549细胞伤口愈合的影响 |
3.4.4 化合物3d和3e对 A549 细胞Transwell迁移的影响 |
3.4.5 化合物3d和3e对 A549 细胞Transwell侵袭的影响 |
3.4.6 化合物3d和3e对A549细胞凋亡形态学的影响 |
3.4.7 化合物3d和3e对A549细胞凋亡的影响(PI染色) |
3.4.8 化合物3d和3e对 A549 细胞凋亡的影响(AO/EB染色) |
3.4.9 化合物3d和3e对 A549 细胞DNA损伤的影响 |
3.4.10 化合物3d和3e对A549细胞凋亡水平的影响 |
3.4.11 化合物3d和3e对A549细胞周期的影响 |
3.5 本章小结 |
第四章 化合物3d和3e诱导A549细胞凋亡机制研究 |
4.1 引言 |
4.2 实验试剂与仪器设备 |
4.2.1 细胞株 |
4.2.2 实验试剂及耗材 |
4.2.3 仪器与设备 |
4.2.4 试剂的配制 |
4.3 实验方法 |
4.3.1 细胞培养 |
4.3.2 细胞内活性氧(ROS)测定 |
4.3.3 Caspase-3、Caspase-8及Caspase-9 酶活力测定 |
4.3.4 Western blot检测 |
4.3.5 Real-time PCR(RT-PCR)检测 |
4.3.6 统计学分析 |
4.4 结果与讨论 |
4.4.1 化合物3d和3e对 A549 细胞内ROS的影响 |
4.4.2 化合物3d和3e对 A549 细胞内Caspase酶释放水平的影响 |
4.4.3 化合物3d对 A549 细胞内Bcl-2 家族及Cyt c蛋白的影响 |
4.4.4 化合物3e对 A549 细胞内Bcl-2 家族及Cyt c蛋白的影响 |
4.4.5 化合物3d对A549细胞内p53信号通路上相关蛋白的影响 |
4.4.6 化合物3e对A549细胞内p53信号通路上相关蛋白的影响 |
4.4.7 化合物3d和3e对A549细胞内p53相关靶基因的影响 |
4.5 化合物3d和3e诱导A549细胞凋亡的分子机制 |
4.6 本章小结 |
第五章 化合物3d和3e急性毒性及体内抗肿瘤作用机制研究 |
5.1 引言 |
5.2 实验材料与仪器设备 |
5.2.1 细胞株 |
5.2.2 实验动物 |
5.2.3 实验试剂及耗材 |
5.2.4 仪器与设备 |
5.3 实验方法 |
5.3.1 细胞培养 |
5.3.2 急性毒性测定 |
5.3.3 建立小鼠Lewis肺癌移植瘤模型及分组 |
5.3.4 小鼠Lewis肺癌实体瘤抑制率的测定 |
5.3.5 小鼠Lewis肺癌细胞凋亡检测 |
5.3.6 小鼠Lewis肺癌移植瘤瘤体蛋白的提取 |
5.3.7 Western blot检测 |
5.3.8 统计学分析 |
5.4 结果与讨论 |
5.4.1 化合物3d和3e对 Balb/c小鼠急性毒性的影响 |
5.4.2 小鼠Lewis肺癌移植瘤病理检测 |
5.4.3 化合物3e对 Lewis肺癌小鼠体重变化的影响 |
5.4.4 化合物3e对 Lewis肺癌小鼠移植瘤体积变化的影响 |
5.4.5 化合物3e对 Lewis肺癌小鼠实体瘤生长的抑制作用 |
5.4.6 化合物3e对 Lewis肺癌小鼠实体瘤凋亡的影响 |
5.4.7 化合物3e对瘤细胞内Bcl-2 家族及Cyt c蛋白的影响 |
5.4.8 化合物3e对瘤细胞内p53信号通路上相关蛋白的影响 |
5.4.9 化合物3e对瘤细胞内VEGF、ICAM-1及MMP-2 蛋白的影响 |
5.5 化合物3e抑制Lewis肺癌小鼠体内移植瘤生长的作用机制 |
5.6 本章小结 |
第六章 结论与展望 |
6.1 结论 |
6.2 创新点 |
6.3 展望 |
参考文献 |
致谢 |
附录一 主要缩略词表 |
附录二 在读期间科研成果 |
附图一 化合物3d核磁图谱 |
附图二 化合物3e核磁图谱 |
附图三 化合物3e对移植瘤的抑制作用 |
附图四 化合物3e诱导瘤细胞凋亡 |
(10)Hippo信号通路在异丙肾上腺素所致心肌损伤中的调控作用研究(论文提纲范文)
缩略语表 |
英文摘要 |
中文摘要 |
第一章 前言 |
第二章 异丙肾上腺素通过上调BIM和 Gal-3 表达诱导心肌损伤的作用研究 |
2.1 材料和方法 |
2.2 实验结果 |
2.3 讨论 |
2.4 小结 |
第三章 异丙肾上腺素激活Hippo信号通路的作用研究 |
3.1 材料和方法 |
3.2 实验结果 |
3.3 讨论 |
3.4 小结 |
第四章 异丙肾上腺素通过Hippo信号通路促进BIM和 Gal-3 表达的机制研究 |
4.1 材料和方法 |
4.2 实验结果 |
4.3 讨论 |
4.4 小结 |
第五章 异丙肾上腺素通过cAMP/PKA激活Hippo通路的机制研究 |
5.1 材料和方法 |
5.2 实验结果 |
5.3 讨论 |
5.4 小结 |
全文总结 |
参考文献 |
文献综述 Mst1在心肌细胞凋亡中的作用 |
参考文献 |
在读期间发表文章 |
致谢 |
四、Akt and Bcl-x_L are independent regulators of the mitochondrial cell death pathways(论文参考文献)
- [1]降钙素基因相关肽对H9c2心肌细胞缺氧/复氧后自噬水平的影响及其作用机制[D]. 赵丽. 山西医科大学, 2021(01)
- [2]积雪草酸衍生物的合成及初步体外抗肿瘤活性的研究[D]. 梅宇. 沈阳化工大学, 2021(02)
- [3]FOXO3a在替莫唑胺诱导的保护性线粒体自噬中的作用和机制研究[D]. 何川. 吉林大学, 2021(01)
- [4]mRNA/piRNA/piwi在DEN诱导肝癌中的表达及紫草素对肝癌细胞生物学行为的影响[D]. 王延蛟. 新疆医科大学, 2021(08)
- [5]白藜芦醇对肾细胞癌的作用及相关机制研究[D]. 姚宏伟. 苏州大学, 2020(06)
- [6]基于网络药理学研究隐丹参酮对肝癌细胞的作用机制[D]. 罗艺. 广州中医药大学, 2020(06)
- [7]HIF-1调控线粒体自噬恢复七氟醚后处理减轻糖尿病心肌缺血再灌注损伤的机制研究[D]. 杨龙. 新疆医科大学, 2020(07)
- [8]基于代谢组学及自噬和凋亡调控途径研究蛇葡萄素抑制结直肠癌生长的作用机制[D]. 朱丽娟. 兰州大学, 2020(01)
- [9]基于p53通路新型黄酮螺环骨架衍生物的多靶点机制研究[D]. 张文会. 贵州大学, 2019(05)
- [10]Hippo信号通路在异丙肾上腺素所致心肌损伤中的调控作用研究[D]. 肇炜博. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)