一、反义c-myc寡核苷酸抑制大鼠气道平滑肌增殖与细胞凋亡无关（论文文献综述）
张玲[1]（2019）在《c-Myc靶向的长非编码RNA GATA2-AS1调控非小细胞肺癌生长的分子机制研究》文中研究表明背景肺癌是世界上最常见和最致命的恶性肿瘤之一,非小细胞肺癌（NSCLC）是最主要的组织病理学类型。研究发现,GATA2对RTK/RAS信号通路中KRAS或其他致癌基因突变的NSCLC细胞存活和生长至关重要;GATA2缺失降低了KRAS突变的NSCLC细胞生存能力,并显着抑制NSCLC发展。此外,GATA2还能通过调节蛋白酶体复合物、IL-1/NF-κB和Rho信号通路维持NSCLC细胞的存活。已知GATA2是GATA家族的一员,其作为转录因子能调控众多发育过程,并且GATA转录因子之间的相互作用在调控GATA家族基因的表达方面发挥重要作用。GATA2能与自身启动子区域结合并激活转录。然而,GATA1又与GATA2竞争性结合该启动子区域,通过破坏GATA2基因自身的转录来抑制GATA2的表达。因此,GATA1在GATA2的转录过程中发挥抑制作用。c-Myc在多种类型的癌细胞中都有组成性表达,它与启动子区域的E-boxes序列结合后,能激活众多参与细胞异常增殖的促癌基因转录,从而导致恶性肿瘤的形成。c-Myc基因的上调在胃癌、宫颈癌、结肠癌和NSCLC等恶性肿瘤中均有被发现。因此,c-Myc被认为是治疗癌症的一个潜在目标。近年人们发现长非编码RNA（lncRNA）在NSCLC等多种肿瘤的发生机制中发挥着重要的调控作用。lncRNA可以靶向转录激活因子或抑制因子调控下游基因的表达。目前研究报道了一种lncRNA的作用模式,即基因附近转录出来的lncRNA能通过招募转录因子或染色质修饰因子调控邻近基因的表达。例如,CCND1基因附近转录的lncRNA CCND1,它能结合TLS蛋白并使其转变为活性构象,从而结合到CCND1启动子上的CBP/p300复合物,最终抑制CCND1基因的转录。目的探讨lncRNA GATA2-AS1调控NSCLC生长及其受到c-Myc靶向调节的具体分子机制,为开拓NSCLC新的治疗靶点提供实验依据。材料与方法1.细胞培养和转染:在添加10%胎牛血清、1mM丙酮酸钠和100 mg/ml链霉素的DMEM培养基中培养A549细胞（KRAS突变）和HEK293T细胞。2.RNA干扰:HEK293T细胞转染对照组或实验组siRNA后,在Opti-MEM培养基培养12小时后换用10%胎牛血清的DMEM培养基,继续培养48小时。收集细胞,采用免疫印迹法和荧光定量PCR方法对敲除效率进行评估。3.实时荧光定量PCR（qRT-PCR）:用Trizol提取总RNA,然后逆转录成cDNA;采用SYBR和ROX对照染料进行实时荧光定量PCR分析。4.免疫印迹（WB）:收集细胞,加入缓冲液后95℃煮蛋白1015分钟,然后将蛋白按照大小分离。5.染色质免疫共沉淀（ChIP）:室温下将A549细胞用1%甲醛交联10分钟,甘氨酸终止反应。处理后的细胞用裂解缓冲液重悬。用GFP抗体或对照IgG偶联的蛋白与细胞裂解液孵育。洗脱后的产物经PCR扩增。6.RNA免疫共沉淀（RIP）:13×107个细胞用低渗缓冲液裂解和离心。细胞裂解液经蛋白A/G beads预处理后,在4℃条件下与偶联相应抗体的A/G beads孵育。经多次洗涤后,用洗脱缓冲液洗脱beads上结合的免疫复合物,然后用蛋白酶K分离提取出蛋白结合的RNA。纯化的RNA可用于RT-PCR分析。7.克隆形成实验:将转染了对照组、GATA2或GATA2-AS1 siRNA的A549细胞于6孔板中进行传代。一周后,用预冷的10%甲醇固定细胞5分钟,室温下用结晶紫染色30分钟。经过多次冲洗,拍照。8.细胞周期实验:收集细胞后洗涤,在4℃条件下用70%乙醇固定过夜;然后离心5分钟,PBS洗涤2次,室温下加入PBS孵育30分钟;最后用流式细胞仪检测细胞周期的分布。结果1.GATA2-AS1抑制NSCLC细胞的增殖lncRNA GATA2-AS1是位于人类基因组第3号染色体GATA2基因反义链上的非编码性抑癌基因。首先在A549细胞中通过siRNA敲低GATA2-AS1,发现GATA2转录的mRNA水平上调;在GATA2-AS1缺失的细胞中,GATA2蛋白水平也升高。然后通过对蛋白酶体复合物、IL-1/NF-κB和Rho信号这三种途径中GATA2靶基因表达情况进行检测,发现在GATA2-AS1敲低细胞中均表现出较高的表达水平。随后在A549细胞中利用siRNA敲低GATA2-AS1,发现一旦缺少GATA2-AS1就会加快A549细胞的增殖,而同时敲低GATA2-AS1和GATA2,GATA2-AS1就无法加快细胞的增殖。以上表明GATA2-AS1通过抑制GATA2的表达从而阻止NSCLC细胞的生长。2.GATA2-AS1结合GATA1通过在A549细胞中进行核质分离实验分析GATA2-AS1的亚细胞定位,发现它主要位于细胞核。随后进行RIP证明异位表达的GATA1能够与GATA2-AS1相互结合;反之内源性GATA2-AS1能够与GATA1共沉淀,说明GATA2-AS1与GATA1蛋白在细胞核内存在相互作用。然后采用两阶段RIP分析GATA家族共调节因子FOG1是否包含在GATA2-AS1和GATA1复合物中。第一阶段使用Flag抗体去沉淀Flag-GATA1,它可以捕获高水平的FOG1和GATA2-AS1;第二阶段使用FOG1抗体去沉淀FOG1,发现能够共沉淀Flag-GATA1和GATA2-AS1。结果表明,GATA1、FOG1和GATA2-AS1在GATA2启动子处形成一个三聚体,然后调控GATA2转录。3.GATA2-AS1增强GATA1的抑制功能进一步利用GATA1抗体进行ChIP实验,检测到在GATA2启动子上游约2.8kb处有一段GATA结合序列,该序列与GATA1的结合率会随着GATA2-AS1的减少而降低。这表明GATA2-AS1增加了GATA1与GATA2启动子的结合,从而增强GATA1对GATA2表达的抑制作用。随后在过表达GATA2-AS1的同时敲低GATA1,发现GATA2-AS1对GATA2表达的抑制作用可以通过GATA1沉默得到恢复,进一步证实GATA2-AS1通过GATA1调控GATA2。4.GATA2-AS1通过GATA2抑制NSCLC细胞的增殖首先检测到GATA2-AS1敲低的A549细胞中GATA2靶基因的表达上调,而在敲低GATA2-AS1时再去敲低GATA2,发现对GATA2靶基因的作用消失,表明GATA2介导了GATA2-AS1对NSCLC细胞生长的影响。然后通过克隆形成实验证明,A549细胞沉默GATA2-AS1的表型可以被GATA2 siRNA所恢复,通过细胞周期分析证实了GATA2敲低和GATA2-AS1及GATA2双敲低细胞之间的关系,说明GATA2-AS1通过GATA2调控NSCLC细胞生长的机制。5.c-Myc转录调控GATA2-AS1通过生物信息学分析,在GATA2-AS1启动子上游1964bp位点找到了c-Myc潜在的结合序列（CACGTG）。沉默c-Myc能诱导NSCLC细胞中GATA2-AS1表达上调,而在A549细胞中转染外源性c-Myc使其增加时,GATA2-AS1表达水平逐渐降低。随后使用c-Myc抗体进行ChIP实验,证实c-Myc与GATA2-AS1启动子上游1964bp位点结合。此外,通过siRNA沉默敲除MIZ-1的表达,发现缺失的MIZ-1能够恢复c-Myc过表达引起的GATA2-AS1下调,说明c-Myc通过与MIZ-1相互作用调控了对GATA2-AS1的转录抑制。6.GATA2-AS1在癌组织中表达较低对NSCLC标本中GATA2-AS1的表达情况进行检测发现,大多数癌组织表达的GATA2-AS1水平低于癌旁组织;同时这些癌组织也显示出相对较高的c-Myc和GATA2表达水平;但癌组织与癌旁组织组织的GATA1水平无明显变化。结果表明,GATA2-AS1通过抑制NSCLC细胞的增殖而发挥抑癌作用。结论1.lncRNA GATA2-AS1是一个非编码性抑癌基因,位于人类基因组第3号染色体GATA2基因的反义链上;其转录方向与GATA2相反,对NSCLC细胞的发生和发展具有抑制作用。2.lncRNA GATA2-AS1通过在GATA2启动子区域与GATA1蛋白相互结合,从而抑制GATA2基因的转录,阻止NSCLC细胞的增殖;此外,证实GATA2-AS1能通过调控蛋白酶体复合物、IL-1/NF-κB和Rho信号通路抑制NSCLC细胞的生长。3.lncRNA GATA2-AS1在NSCLC细胞中能被c-Myc转录抑制调控。4.本研究证明了c-Myc→GATA2-AS1→GATA1→GATA2信号通路在NSCLC发展中的作用,为NSCLC的治疗提供了潜在靶点。
齐雪霏[2]（2019）在《长链非编码RNA在支气管哮喘和慢性阻塞性肺疾病中的表达和分析的研究》文中指出研究目的:本研究的目的是探索支气管哮喘患者和正常对照外周血CD4+T细胞中长链非编码RNA（lnc RNA）和信使RNA（m RNA）的表达情况,预测差异性表达的长链非编码RNA的可能生物学功能与信号通路,并结合临床资料,寻找与哮喘疾病发生发展有关的生物标志物并探索其临床意义。方法:以Arraystar Human Lnc RNA Microarray Version 3.0.检测支气管哮喘患者和正常对照组外周血CD4+T细胞lnc RNA和m RNA的表达谱,通过数据分析找到差异性表达的lnc RNA与m RNA。对差异性表达的m RNA进行基因本体分析和信号通路分析,富集出与之相关的生物学功能和信号通路,以此推测lnc RNA的功能。通过实时荧光定量聚合酶链式反应（q RT-PCR）对数据进行验证。用受试者工作特征曲线（ROC曲线）分析lnc RNA的诊断价值。与临床数据相结合,探索lnc RNA与疾病特征的相关性。通过共表达分析,寻找更多与之相关的基因。结果:与正常对照组相比,在哮喘组发现2725个差异性表达的lnc RNA,其中863个表达上调,1862个表达下调;发现2676个差异性表达的m RNA,其中1320个表达上调,1356个表达下调。通过q RT-PCR验证,发现4个具有统计学差异的差异性表达的lnc RNA,分别是ENST00000444682、ENST00000566098、ENST00000583179和ENST00000579468,其中ENST00000444682为表达上调,其他为表达下调。ROC曲线分析差异性表达lnc RNA的诊断价值,ENST00000444682、ENST00000566098、ENST00000583179和ENST00000579468的曲线下面积分别是0.7058、0.9026、0.8361和0.8316。生物信息学分析发现在“细胞因子与细胞因子受体相互结合”、“细胞因子活性”、“免疫应答反应”等项目中有显着富集。斯皮尔曼相关性分析发现,ENST00000579468与呼出气流速峰值具有相关性,ENST00000566098与CD4+T中白介素-13的表达量具有相关性。结论:与正常对照相比,哮喘患者外周血CD4+T细胞中lnc RNA和m RNA表达谱有显着改变,差异性表达的lnc RNA可能通过调节CD4+T细胞中细胞因子的表达参与Th2型免疫反应,有潜力成为诊断疾病及判断疾病状态的生物标志物。研究目的:本研究的目的是探究急性发作期COPD患者（AECOPD）、稳定期COPD患者（stable-COPD）外周血CD4+T细胞长链非编码RNA（lnc RNA）和信使RNA（m RNA）的表达情况,预测差异性表达的长链非编码RNA的可能生物学功能与靶基因,并结合临床资料,寻找与疾病发生发展有关的生物标志物。方法:以Arraystar Human Lnc RNA Microarray Version 3.0.检测急性发作期COPD患者、稳定期COPD患者和正常对照外周血CD4+T细胞lnc RNA和m RNA的表达谱,通过数据分析找到差异性表达的lnc RNA与m RNA。对差异性m RNA进行共表达分析和内源性竞争RNA分析,通过基因本体分析和信号通路分析,预测lnc RNA的生物学功能和信号通路,以此推测lnc RNA的靶基因。通过荧光实时定量聚合酶链式反应（q RT-PCR）对数据进行验证。用受试者工作特征曲线（ROC曲线）分析lnc RNA的诊断价值。与临床数据相结合,探究lnc RNA与疾病特征的相关性。结果:与正常对照组相比,AECOPD组有1517个lnc RNA和2289个m RNA发生表达水平变化;与stable-COPD组相比,AECOPD组有2284个lnc RNA和3364个m RNA表达水平发生变化;与正常对照组相比,COPD组有1517个lnc RNA和2158个m RNA发生表达变化。通过q RT-PCR验证,AECOPD组中ENST00000447867和NR-026690的表达量高于其他组,并具有统计学差异。通过ROC曲线分析验证过的差异性表达RNA的诊断价值,NR-026690有潜力成为区分AECOPD和stable-COPD的生物标志物,曲线下面积为0.8377。对与lnc RNA有共表达关系的差异性表达的m RNA进行生物信息学分析,发现在“调节Th17免疫反应”、“c AMP信号通路”方面出现富集,并推测ENST00000447867和NR-026690的靶基因是RAPGEF3。QRT-PCR发现ENST00000447867和NR-026690与CD4+T细胞中的RAPGEF3表达量具有相关性。Lnc RNA-mi RNA-m RNA网络图发现ENST00000447867和NR-026690与RAPGEF3之间有许多共同的mi RNA识别位点。结论:与正常对照相比,AECOPD患者、stable-COPD患者外周血CD4+T细胞中lnc RNA和m RNA表达谱都发生了改变。ENST00000447867和NR-026690可能成为诊断COPD并区别AECOPD和stable-COPD的生物标志物。ENST00000447867和NR-026690可能通过mi RNA海绵吸附作用调节RAPGEF3,进而影响COPD的发生与发展。
刘艳波[3]（2009）在《1. 减毒沙门氏菌携带GRIM-19及Survivin-特异shRNA共表达质粒对前列腺癌的治疗作用 2. 有机硒抑制激素非依赖性前列腺癌的发生》文中研究说明Survivin是前列腺癌高表达基因,GRIM-19基因（gene associated with retinoid-IFN-induced mortality 19）是一种由IFN-β联合维甲酸诱导表达的细胞死亡调节因子,其过度表达会导致细胞凋亡。应用RNAi技术沉默Survivin可达到抑制前列腺癌生长的作用,为提高其抗肿瘤效应,联合GRIM-19与之建立共表达载体以加强促细胞凋亡效应;体外实验已证明甲基硒酸（MSA）具有抗雄激素依赖性前列腺癌的作用。目的: （1）通过体内外实验探讨pGRIM-19-si-Survivin共表达质粒抗前列腺癌作用与机制;探讨减毒沙门氏菌作为该共表达质粒运载体进行体内实验的可行性。（2）在成功建立去势后复发型前列腺癌模型的基础上,探讨甲基硒代半胱氨酸（MSC）抑制激素非依赖性前列腺癌的发生并探讨相关机制。方法:（1）应用脂质体法将pGRIM-19-si-Survivin共表达质粒及对照质粒转染至人前列腺癌细胞DU145内,通过MTT法检测细胞增殖抑制情况,流式细胞术等观察细胞周期与凋亡,以RT-PCR、Western blot法检测目的基因与相关基因和蛋白的表达;复制裸鼠前列腺癌皮下移植瘤模型,腹腔注射携带pGRIM-19-si-Survivin共表达质粒等的减毒沙门氏菌,进行抗肿瘤作用与机制的研究。（2）复制裸鼠前列腺癌去势后复发模型,观察MSC对前列腺癌雄激素依赖性的影响。.结果:（1）通过体内外实验证明pGRIM-19-si-Survivin共表达质粒的抗前列腺癌作用优于单基因治疗组,显示出明显的协同效应:①增殖抑制实验结果显示,共表达质粒显着地抑制DU145细胞的增殖活性;②流式细胞术和Annexin V-FITC等检测分析发现:共表达质粒的促凋亡作用最为显着;③DU145细胞的免疫荧光染色显示Survivin的表达聚集在细胞核及其周围的胞浆中;④共表达质粒组Stat3、c-Myc、cyclinD1、BcL-xL和VEGF基因和蛋白表达明显抑制,而caspase3的基因与蛋白表达显着上调。体内实验证明,携带pGRIM-19-si-Survivin共表达质粒的减毒沙门氏菌治疗组的抗肿瘤作用最明显,主要是通过促凋亡作用实现的;（2）MSA体外可抑制人激素依赖性前列腺癌LNCaP细胞的增殖并降低雄激素受体表达;MSC可抑制去势诱导的激素非依赖性前列腺癌的发生。结论:减毒沙门氏菌携带pGRIM-19-si-Survivin共表达质粒,在抗前列腺癌作用中显示明显的协同作用;MSC可抑制去势诱导的激素非依赖性前列腺癌的发生。本研究所采用的技术路线及实验结果在国内外均未见报道。
胡军,王桂龙,向阳,刘义,陈一升,丁茹虎[4]（2007）在《反义c-myc寡核苷酸诱导骨肉瘤细胞MG-63凋亡的实验研究》文中提出目的:研究反义c-myc寡核苷酸诱导人骨肉瘤MG-63细胞凋亡的作用。方法:设计反义c-myc寡核苷酸片段,转染入人骨肉瘤MG-63细胞,通过MTT法、流式细胞仪、HE染色及透射电镜方法,观察和分析其对人骨肉瘤MG-63细胞作用的效果。结果:MTT法示反义c-myc寡核苷酸可抑制人骨肉瘤MG-63细胞的增殖,10.0μmol/L、作用48h效果最明显;流式细胞仪检测证实反义c-myc寡核苷酸（终浓度10.0μmol/L）诱导瘤细胞的凋亡率达37.92%,出现明显的凋亡峰,并可抑制c-myc基因蛋白的表达;细胞呈典型凋亡特征。结论:反义c-myc寡核苷酸能有效诱导人骨肉瘤MG-63细胞的凋亡。
白晶[5]（2007）在《ERK信号通路对慢性哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖与凋亡的调控作用》文中提出支气管哮喘是以气道高反应性、气道慢性炎症及气道重建为特征的慢性疾病。气道重建可导致不可逆的气道阻塞和持续性的气道高反应性[1-3],它包括上皮下胶原沉积,黏液细胞增生/化生,平滑肌的增生和肥厚等,是目前难治性哮喘的重要病理基础之一。已有研究证实气道平滑肌细胞（airway smooth muscle cell, ASMC）的增殖是气道重建（airway remodelig）的关键环节,ASMC作为气道重建的主要成分,通过自身的异常增殖参与整个过程[4-6]。因此,探讨支气管哮喘ASMC的异常增殖的调控机制是研究支气管哮喘气道重建发生机制的重要方向,抑制ASMC的异常增殖可成为治疗难治性哮喘的重要思路。但既往的研究多集中在探讨各种生物刺激（如生长因子、细胞因子等）对ASMC功能的影响及最终产生的生物学效应,有关生物信息在ASMC内传递机制的研究则相对较少。细胞外信号调节蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase, ERK）通道是一种重要的细胞内信号转导通道,联系着细胞外信号与细胞核反应间的信息转导,参与多种细胞异常增殖与分化的信号调控[7]。ERK是该通道中的关键酶,它有多种亚型,在平滑肌细胞中主要为ERK1、ERK2（ERK1/2）两种亚型分布。研究表明,在探讨血管重建机制的研究中发现,ERK1/2通道是介导血管平滑肌细胞（VSMC）异常增殖的重要信号通道[8]。它参与调控VSMC的表型变化、迁移、增殖、凋亡和分泌等活性[9,10]。那么,哮喘气道重建中是否也存在血管重建中的类似机制,即哮喘ASMC内ERK1/2的活性是否也介导了ASMC异常增殖生物信号转导?目前国内外尚少见研究报道。本实验拟通过建立大鼠慢性哮喘模型,体外培养ASMC,探讨哮喘ASMC增殖活性的变化及ERK1/2在该增殖变化中的作用,从细胞内信号转导的角度研究ERK通道在哮喘ASMC增殖调控中的意义,为进一步阐明哮喘气道重建的病理生理学机制提供理论依据,为寻求更为有针对性的治疗方法提供实验依据。研究内容:1.建立大鼠慢性哮喘模型,病理图像分析慢性哮喘大鼠气道重建,免疫组化法检测ERK和增殖细胞核抗原（PCNA）在肺内表达,激光共聚焦显微镜分析ERK1/2、磷酸化ERK1/2（p-ERK）和PCNA在气道平滑肌上共表达,免疫印迹检测气道平滑肌上ERK和PCNA蛋白的表达,原位杂交检测气道平滑肌中ERK和PCNA的mRNA表达,从而探讨ERK是否在慢性哮喘大鼠气道平滑肌上表达。2.建立大鼠慢性哮喘模型,体外培养哮喘ASMC,以ERK激动剂表皮生长因子（EGF）和抑制剂PD98059作为工具药物,采用流式细胞仪、四甲基偶氮唑盐（MTT）法、3H-TdR掺入法、PCNA免疫组织化学观察ASMC的增殖,免疫细胞化学法检测细胞周期蛋白（cyclin） D1和细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）2表达,逆转录-聚合酶链测定（RT-PCR）和Western免疫印迹检测ERK mRNA和ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的表达。从而探讨哮喘ASMC增殖活性的变化及ERK1/2在该增殖变化中的作用。3.体外培养哮喘ASMC,以ERK激动剂表皮生长因子（EGF）和抑制剂PD98059作为工具药物,用原位末端标记法和Annexin-V FITC PI双染色法观察ASMC凋亡,免疫细胞化学法检测凋亡相关基因bcl-2和bax的表达,用Western免疫印迹检测半胱天冬酶（caspase）-3蛋白的表达。从而探讨哮喘ASMC凋亡变化及ERK1/2在该凋亡变化中的作用。4.设计合成ERK反义寡核苷酸（ODN）,体外培养哮喘ASMC,利用脂质体将正义、反义及错配ERK1 ODNs导入ASMC,用流式细胞仪、MTT法、3H-TdR掺入法检测不同寡核苷酸对ASMC增殖的抑制作用,原位末端标记法和Annexin-V FITC PI双染色法检测细胞凋亡变化,RT-PCR和Western免疫印迹检测ERK mRNA和ERK1/2、p-ERK1/2、PCNA蛋白的表达。观察反义核酸对哮喘ASMC增殖和凋亡的干预。结果:1.病理图像分析显示慢性哮喘大鼠有气道平滑肌层增厚,出现结构重建。免疫组化法检测显示ERK和PCNA在肺内表达增强,激光共聚焦显微镜分析ERK1/2、p-ERK1/2和PCNA在气道平滑肌上共表达,免疫印迹和原位杂交检测显示在气道平滑肌上有ERK和PCNA蛋白与mRNA表达增加。2.与对照组ASMC比较,哮喘组ASMC的G0/G1期所占细胞的比例明显减少,S + G2/M期细胞所占比例增高,吸光度值( A490 )、细胞DNA合成量、PCNA阳性表达量、cyclin D1和CDK2蛋白表达量均明显增加。与对照组ASMC比较,哮喘组ASMC的ERK mRNA、ERK1/2蛋白、p-ERK1/2蛋白的表达量以及ERK活化率（%）均显着增高。经PD98059干预之后,哮喘组ASMC的S + G2/M期细胞所占比例、A490值、细胞DNA合成量、PCNA阳性表达量、cyclin D1和CDK2蛋白表达量明显降低,ERK mRNA、ERK1/2蛋白、p-ERK1/2蛋白的表达量以及ERK活化率（%）均显着下降。经EGF干预之后,哮喘组ASMC的S + G2/M期细胞所占比例、A490值、细胞DNA合成量、PCNA阳性表达量、cyclin D1和CDK2蛋白表达量进一步增高,而这一作用可以被PD98059所抑制。3.与对照组ASMC比较,哮喘组ASMC凋亡指数、早期凋亡细胞百分率明显下降,ERK mRNA、ERK1/2蛋白、p-ERK1/2蛋白的表达量以及ERK活化率（%）亦显着增高。经PD98059干预之后,哮喘组ASMC的凋亡指数与早期凋亡细胞百分率、bax蛋白表达量和caspase-3蛋白含量明显增高,ERK mRNA、ERK1/2蛋白、p-ERK1/2蛋白的表达量以及ERK活化率（%）亦显着降低。经EGF干预之后,哮喘组ASMC凋亡指数与早期凋亡细胞百分率进一步下降,而这一作用可以被PD98059所抑制。4.反义ODNs组的G0/G1期所占细胞的比例明显增高,S + G2/M期细胞所占比例明显减少,A490值、细胞DNA合成量、PCNA蛋白表达量、ERK mRNA、ERK1/2蛋白、p-ERK1/2蛋白的表达量以及ERK活化率（%）均明显减少,与哮喘组各值比较差异均有显着性（P<0.05）。反义ODNs组的凋亡指数和早期凋亡细胞百分率明显增高,与哮喘组各值比较差异均有显着性（P<0.05）。而正义和错配ERK1 ODNs没有上述作用。结论:1.慢性哮喘大鼠有气道平滑肌层增厚,出现结构重建。慢性哮喘大鼠气道重建模型复制成功;2.慢性哮喘大鼠中ERK和PCNA在肺内表达增强,同时在气道平滑肌上有ERK和PCNA蛋白与mRNA表达增加。提示ERK可能是介导慢性哮喘气道重建中平滑肌增殖的重要信号通路之一。3.慢性哮喘ASMC内源性增殖`活性增加,同时ERK1/2表达及活化率均显着增强。ERK1/2通过诱导cyclinD1和CDK2蛋白高表达,使细胞从G1期向S期发展,细胞增殖。ERK信号通道在哮喘气道重建的ASMC增殖调控中具有重要作用。4.慢性哮喘组大鼠ASMC内源性增殖活性增加的同时,伴有凋亡活性下降。ERK1/2参与慢性哮喘ASMC凋亡调控,其机制与bcl-2家族和caspace-3有关。5.反义ERK1 ODNs可通过抑制ERK mRNA表达和翻译来抑制慢性哮喘大鼠ASMC的增殖,促进其凋亡。由此可见,ERK1/2信号通道是介导哮喘ASMC异常增殖的重要信号通道,对哮喘ASMC增殖与凋亡起调控作用。ERK信号通道可能通过细胞周期、bcl-2家族以及caspace-3对哮喘ASMC增殖与凋亡起调控作用。这为研究哮喘气道重建的发病机理提供新的理论,也为将来治疗难治性哮喘提供一定的新思路。
陈宏斌[6]（2007）在《吸烟对气道平滑肌细胞增殖和凋亡的影响及HSP70在凋亡中保护作用的研究》文中研究指明第一部分:吸烟对气道平滑肌细胞增殖中可能信号通路的影响的研究气道平滑肌细胞（airway smooth muscle cells,ASMCs）不仅在气道重建中起着决定性的作用,而且在气道慢性炎症的形成和调节方面也发挥重要的作用。吸烟可以导致小气道的炎症、纤维化、平滑肌增生,使气道壁增厚、气道狭窄。在气道平滑肌细胞增殖的过程中有许多的信号通路被涉及到。在气道平滑肌细胞有丝分裂的信号通路中,细胞外信号调节蛋白激酶（extracellular signal regulated kinase,ERK）和磷酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase, PI-3K）通路是气道平滑肌有丝分裂的主要的正向调节者。然而,细胞外信号调节蛋白激酶和磷酰肌醇3激酶通路是否参与了吸烟引起的气道平滑肌细胞增殖的过程中尚不清楚。因而,本课题部分主要探讨在体内外引起细胞增殖的可能的信号通路及其它们之间的联系。论文一:香烟提取物对气道平滑肌细胞增殖中ERKs及NF-κB的影响在吸烟的慢性阻塞性肺疾病患者以及熏香烟复制的大鼠慢性阻塞性肺疾病模型中,气道平滑肌都显着增生。而且香烟提取物（cigarette smoke extract,CSE）能刺激体外气道平滑肌细胞（airway smooth muscle cells,ASMCs）增殖。在影响细胞增殖的因素中,细胞外信号调节蛋白激酶（extracellular regulated protein,ERK）为丝裂原激活蛋白激酶（mitogen activated protein kinase,MAPK）家族重要成员,ERK1/2信号通路是多数生长因子、细胞因子调控细胞增殖的重要途径。研究显示ERK1/2通路是调节有丝分裂原诱导气道平滑肌增殖事件中的一个关键信号。另外,核因子-κB（nuclearfactor-kappaB,NF-κB）能被多种因素激活,激活后的NF-кB不仅参与机体的免疫应答和炎症反应,而且还可调控细胞增殖和凋亡相关基因,在熏香烟复制的大鼠COPD模型中肺泡巨噬细胞及气道上皮细胞中NF-кB表达增加,而且NF-кB在正常平滑肌细胞增殖中也发挥重要作用。本研究探讨香烟提取物对气道平滑肌细胞细胞增殖中ERKs及NF-κB的影响。方法:体外培养Wistar大鼠的气道平滑肌细胞,给予不同浓度的香烟提取物刺激24小时后,MTT法检测增殖情况,采用Western blot的方法检测细胞外信号调节蛋白激酶以及磷酸化的细胞外信号调节蛋白激酶和核因子-κB的表达。结果:1.在不同浓度香烟提取物对气道平滑肌细胞刺激后,气道平滑肌细胞的A值分别为0.247±0.027（对照组）、0.298±0.038（1/32CSE组）、0.353±0.017（1/16CSE组）和0.376±0.024（1/8CSE组）。随CSE浓度的增高细胞增殖程度逐渐增加,与对照组比较均有显着性增高（P<0.05,n=4）。2.在不同浓度香烟提取物对气道平滑肌细胞刺激后:ERK1的表达分别为0.586±0.032（对照组）、0.801±0.067（1/32CSE组）、0.842±0.067（1/16CSE组）及0.913±0.101（1/8CSE组）;ERK2的表达分别为0.589±0.061（对照组）、0.765±0.046（1/32CSECSE组）、0.836±0.054（1/16组）及0.919±0.086（1/8CSE组）;p-ERK的表达分别为0.579±0.058（对照组）、0.773±0.051（1/32CSE组）、0.848±0.075（1/16CSE组）及0.941±0.067（1/8CSE组）;NF-κB的表达分别为0.629±0.069（对照组）、0.879±0.058（1/32CSE组）、0.901±0.066（1/16CSE组）及0.936±0.087（1/8CSE组）。经过对数据统计分析后显示,ERKs、p-ERK、NF-κB的表达均随CSE浓度的增高而逐渐增高,且与对照组相比有显着性差异（P<0.05,n=4）。3.将对照组及不同浓度的CSE组中气道平滑肌细胞p-ERK和NF-κB免疫印迹的表达的A值与相应β- actin的A值比较后所得的数据进行相关分析,发现NF-κB的表达水平随p-ERK的表达的增加呈增加趋势,其r=0.858（P<0.05, n=4）。结论:一定浓度的CSE作用气道平滑肌细胞后可引起其增殖,而且随CSE浓度的增高细胞增殖程度逐渐增加;同时ERKs、p-ERK及NF-κB的表达增加,磷酸化激活后的ERKs可能通过NF-κB的活化参与气道平滑肌细胞的增殖。论文二: PI-3K在吸烟大鼠COPD模型气道平滑肌增生中的表达的作用吸烟是引起慢性阻塞性肺疾病（COPD）的最重要的环境危险因素。在吸烟的慢性阻塞性肺疾病患者以及熏香烟复制的大鼠慢性阻塞性肺疾病模型中,气道平滑肌都显着增生。而且香烟提取物（cigarette smoke extract,CSE）能刺激体外气道平滑肌细胞（airway smooth muscle cells , ASMCs）增殖。磷脂酰肌醇3激酶（ phosphoinositide3-kinases, PI-3K）是多磷脂酰肌醇通路中一个重要的效应器和涉及信号转导、细胞转化的关键酶。PI-3K产生的特异肌醇脂质3,4,5-三磷酸肌醇和3,4-二磷酸肌醇是调节Akt活性的重要作用分子,与多种细胞功能有关。研究发现PI-3K通过效应分子Akt能促进细胞增殖、抑制细胞凋亡,而且与癌症的发展有关。目前研究表明人的气道平滑肌细胞中,PI-3K能够诱导其DNA的合成,从而诱导气道平滑肌细胞的加速生长。本研究通过建立吸烟大鼠COPD模型来探讨PI -3K在COPD气道平滑肌增生中的作用机制。方法:制作大鼠吸入香烟烟雾后的COPD模型,测定大鼠气道阻力及呼吸系统总顺应性,对气道平滑肌进行HE染色及PCNA免疫组化观察,并且逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测气道平滑肌中PI-3KmRNA表达。结果:1.呼吸功能检测两组的呼吸功能检测显示:在气道阻力（cmH2O/L/s）方面CODP组和对照组分别为2.898±0.856和1.686±0.142,COPD组比对照组有显着性增高（P<0.05,n=8）;而在肺顺应性（L/cmH2O）方面COPD组和对照组分别为0.386±0.046和0.426±0.042,两者相比无统计学差异（P>0.05,n=8）。2.肺组织的HE染色在吸烟4月组,见大鼠支气管气道平滑肌增厚,部分肺泡壁变薄、断裂、肺泡融合、肺泡腔扩大以及炎症细胞侵润;而对照组的支气管及肺组织结构正常。3.气道平滑肌PCNA的表达平滑肌细胞核棕黄色为提示PCNA阳性。采用HPIAS - 100高清晰度彩色病理图文分析系统测定PCNA的表达。结果表明:COPD组和对照组大鼠气道平滑肌PCNA表达分别为0.773±0.076和0.573±0.062,两者相比有显着性差异（P<0.05,n=8）。4. COPD大鼠组和对照组PI-3KmRNA的表达将PI-3KmRNA的A值与β-actinA值比较后,结果发现:COPD后大鼠和对照组气道平滑肌PI-3KmRNA的表达分别为0.872±0.068和0.648±0.066,两者相比有显着性差异（P<0.05,n=8）。5.将对照组及COPD大鼠组中气道平滑肌中PI-3KmRNA表达的A值与相应β- actin的A值比较后所得的值和PCNA表达的值进行相关分析后发现,PI-3KmRNA的表达水平与PCNA的表达水平的呈明显正相关（r=0.816,P<0.05, n=8）。结论:香烟烟雾可能通过PI-3K信号途径在COPD大鼠气道平滑肌增生中发挥作用。第二部分:吸烟对气道平滑肌细胞凋亡中p-JNK的影响及HSP70在凋亡中保护作用的研究吸烟是引起慢性阻塞性肺疾病发生的主要危险因素。较高浓度的香烟提取物（cigarette smoke extract ,CSE）刺激气道平滑肌细胞（airway smooth muscle cells,ASMCs）后可导致其凋亡。凋亡程序牵涉到几个主要的执行者,应激活化蛋白激酶（C-J unN-terminal kinase,JNKs）是其中之一。JNK是丝裂原激活蛋白激酶（mitogen activated protein kinase,MAPK）家族重要成员之一,它在气道平滑肌细胞中也有表达。JNK信号途径的活化可激活下游的细胞凋亡信号通路。较低浓度的香烟提取物刺激气道平滑肌细胞后,可以引起气道平滑肌细胞HSP70表达的增加,而增加表达的HSP70能对细胞起保护作用。施维舒（Geranylgeranylacetone,GGA）是一种树木香气和树汁中含有的萜类物质,具有组织修复作用,特别能强化抗溃疡作用。作为一种非毒性的诱导剂,无论是在体内还是在体外都能诱导胃肠道组织和细胞HSP70的表达。因而我们通过GGA增加气道平滑肌细胞中HSP70的表达,探讨HSP70表达的增高对较高浓度CSE所致气道平滑肌细胞凋亡中p-JNK的影响。论文一:施维舒对气道平滑肌细胞HSP70表达的影响施维舒（Geranylgeranylacetone,GGA）是一种树木香气和树汁中含有的萜类物质,具有组织修复作用,特别能强化抗溃疡作用。作为一种非毒性的诱导剂,无论是在体内还是在体外都能诱导胃肠道组织和细胞HSP70的表达。本研究探讨施维舒对气道平滑肌细胞（airway smooth muscle cells,ASMCs）中的热休克蛋白70（heat shock protein 70, HSP70）表达的影响。方法:将体外培养Wistar大鼠的气道平滑肌细胞进行分组:（1）A组,空白对照组:为未加任何处理的气道平滑肌细胞;（2）B组,含2μg/mlα-tocopherol的乙醇处理的气道平滑肌细胞组;（3）C组,10-6MGGA处理组;（4）D组,10-5MGGA处理组。用Western blot的方法检测气道平滑肌细胞中HSP70的表达情况。结果:各组气道平滑肌细胞HSP70的表达免疫印迹的表达:A组,0.252±0.018;B组,0.264±0.082;C组,0.601±0.092;D组,0.842±0.062。将所得数据进行统计学分析发现:与A组比较,C组和D组HSP70的表达均增加,而且随GGA浓度增高而增加（P<0.05,n=4）;A组与B组之间HSP70的表达无显着差异（P>0.05, n=4）。结论:一定浓度的GGA能诱导气道平滑肌细胞HSP70表达的增加,而且随GGA浓度增高而增加。论文二:香烟提取物对气道平滑肌细胞凋亡中p-JNK的影响吸烟是引起慢性阻塞性肺疾病发生的主要危险因素。较高浓度香烟提取物（cigarette smoke extract ,CSE）的刺激可导致气道平滑肌细胞的凋亡。凋亡程序牵涉到几个主要的执行者,应激活化蛋白激酶（C-J unN-terminal kinase,JNKs）是其中之一。JNK是丝裂原激活蛋白激酶（mitogen activated protein kinase,MAPK）家族重要成员之一,它在气道平滑肌细胞中也有表达。目前,JNK是否参与了香烟提取物引起的气道平滑肌细胞的凋亡过程尚不清楚。因此,我们通过给予不同浓度的香烟提取物刺激气道平滑肌细胞后,观察香烟提取物对气道平滑肌细胞凋亡中p-JNK的表达的影响。方法:将体外培养Wistar大鼠的气道平滑肌细胞分组:（1）对照组;（2）15%香烟提取物处理组;（3）30%香烟提取物处理组;（4）45%香烟提取物处理组。给予不同浓度的香烟提取物刺激3小时后,流式细胞仪检测凋亡细胞的发生率法;用Western blot的方法检测气道平滑肌细胞中p-JNK的表达。结果:1.给予不同浓度的香烟提取物刺激后,各组的平滑肌细胞凋亡情况如下:对照组为5.33±0.27;15%香烟提取物处理组为17.67±1.24; 30%香烟提取物处理组为26.38±3.08; 45%香烟提取物处理组30.42±4.28。将所得的数据经统计学分析后发现:与对照组相比,不同浓度的香烟提取物组的凋亡均显着的升高,而且随香烟提取物浓度的增加升高越明显（P<0.05,n=4）。2.加入不同浓度的香烟提取物处理的气道平滑肌细胞后p-JNK的表达结果:对照组为0.451±0.035;15%香烟提取物处理组为0.624±0.059; 30%香烟提取物处理组为0.736±0.075; 45%香烟提取物处理组0.886±0.079。所得数据经统计学分析后显示与对照组相比,不同浓度的香烟提取物处理组的p-JNK的表达均显着的升高,而且随香烟提取物浓度的增加升高越明显（P<0.05,n=4）。结论:通过我们的研究表明较高浓度的香烟提取物作用气道平滑肌细胞后引起气道平滑肌细胞的的凋亡增加,而且香烟提取物浓度越高气道平滑肌细胞的凋亡率越高;同时,气道平滑肌细胞中p-JNK表达的增加,而且其表达也随着香烟提取物浓度的增高而增加。较高浓度的香烟提取物作用气道平滑肌细胞后可能通过JNK的活化启动细胞凋亡程序导致细胞凋亡。论文三: HSP70对CSE引起的气道平滑肌细胞凋亡中p-JNK的影响较低浓度的香烟提取物（cigarette smoke extract ,CSE）刺激气道平滑肌细胞（airway smooth muscle cells,ASMCs）后,可以引起气道平滑肌细胞HSP70表达的增加,而增加表达的HSP70能对细胞起保护作用。较高浓度的香烟提取物刺激气道平滑肌细胞后可导致其凋亡。JNK是丝裂原激活蛋白激酶（mitogen activated protein kinase,MAPK）家族重要成员之一,它在气道平滑肌细胞中也有表达。JNK信号途径的活化可激活下游的细胞凋亡信号通路。因而我们通过GGA增加气道平滑肌细胞中HSP70的表达,探讨HSP70表达的增高对较高浓度CSE所致气道平滑肌细胞凋亡中p-JNK的影响。方法:将体外培养Wistar大鼠的气道平滑肌细胞分组:（1）A组,空白对照组;（2）B组,10-5MGGA处理组;（3）C组,30%CSE处理组,CSE的终浓度为30%;（4）D组,预处理10-5MGGA后加30%CSE处理组,CSE的终浓度为30%。给予不同刺激3小时后,流式细胞仪检测凋亡细胞的发生率法;用Western blot的方法检测气道平滑肌细胞中HSP70及p-JNK的表达。结果:1.各组中气道平滑肌细胞的凋亡情况气道平滑肌细胞的凋亡率:在A组中为5.33±0.27;在B组中为4.15±0.23;在C组中为26.38±3.08;在D中为14.49±1.48。将各组的数据做统计学分析后显示:与A组相比较,C组气道平滑肌细胞的凋亡率明显升高（P<0.05,n=4）;B组和D组中气道平滑肌细胞的凋亡率明显降低（P<0.05,n=4）;B组气道平滑肌细胞的凋亡率比D组中的低（P<0.05,n=4）。2.各组中气道平滑肌细胞HSP70的表达气道平滑肌细胞的HSP70的表达免疫印迹的表达,经与β- actin的A值比较后结果分别为:在A组中为0.601±0.092;在B组中为0.873±0.078;在C组中为0.434±0.082;在D组中为0.784±0.072。将各组的数据做统计学分析后显示:与A组相比较,C组气道平滑肌细胞的HSP70的表达明显降低（P<0.05,n=4）;B组和D组中气道平滑肌细胞的HSP70的表达明显增多（P<0.05,n=4）;B组中的气道平滑肌细胞HSP70的表达较D组中的高（P<0.05,n=4）。3.各组中气道平滑肌细胞p-JNK的表达气道平滑肌细胞的p-JNK的表达免疫印迹的表达,经与β- actin的A值比较后结果分别为:在A组中为0.216±0.026;在B组中为0.157±0.018;在C组中为0.736±0.075;在D组中为0.468±0.058。将各组的数据做统计学分析后显示:与A组相比较,C组气道平滑肌细胞p-JNK的表达明显增加（P<0.05,n=4）;B组和D组中气道平滑肌细胞p-JNK的表达明显降低（P<0.05,n=4）;B组中的气道平滑肌细胞p-JNK的表达较D组中的少（P<0.05,n=4）。结论:我们的研究表明,在气道平滑肌细胞中HSP70表达增加时,一方面可以降低较高浓度的CSE诱导的凋亡,另一方面可下调气道平滑肌细胞中p-JNK的表达。我们推测增加表达的HSP70可能通过下调细胞中p-JNK的表达而降低细胞的凋亡。附属部分:吸烟对肺功能及外周血T淋巴细胞IL-2mRNA的影响吸烟是慢性阻塞性肺疾病（COPD）发生的危险因素[1]。大量的研究表明,在COPD患者的气道、肺实质和肺血管中均存在着慢性炎症,并且影响肺功能。T淋巴细胞及其分泌的细胞因子等参与吸烟引起的炎症过程。白介素-2（IL-2）是一种有效的T淋巴因子,IL-2在淋巴细胞发育、淋巴细胞激活和维持免疫反应中都发挥着重要的作用。目前,吸烟对肺功能及外周血T淋巴细胞中IL-2mRNA表达的影响尚不清楚。本研究通过检测吸烟者外周血T淋巴细胞IL-2mRNA表达的变化,以及吸烟对肺功能的影响,探讨吸烟在COPD发病中的作用。方法:随机选择健康吸烟者和非吸烟者各24名,检测肺功能指标、检测外周血T淋巴细胞中IL-2mRNA表达。结果:吸烟组中FEV1、FEV1/ FVC %、MMEF75/25较对照组有明显下降（P<0.05,n=24）;吸烟组中IL-2mRNA较对照组有显着性增高（P<0.05,n=24）。肺功能中FEV1随IL-2mRNA的表达水平增加呈降低趋势,其r=-0.758（P<0.05,n=24）。结论:吸烟者在尚无临床症状时,肺功能已经受损。吸烟可能通过增加T淋巴细胞IL-2mRNA的表达促进炎症反应导致肺功能损害。
王桂龙,向阳,胡军,尹培荣,吴承龙,张骏,李鹏[7]（2007）在《反义c-myc寡核苷酸对骨肉瘤MG-63细胞增殖和凋亡的影响》文中研究说明目的研究反义c-myc寡核苷酸（c-mycASODN）对人骨肉瘤MG-63细胞增殖和凋亡的影响。方法设计c-mycASODN片段,转染入人骨肉瘤MG-63细胞,通过MTT检测、HE染色光镜观察、透射电镜超微结构及流式细胞仪（FCM）分析,观察和分析其对瘤细胞体外增殖、凋亡、细胞周期及c-myc基因蛋白的影响。结果MTT示c-mycASODN可抑制人骨肉瘤MG-63细胞的体外增殖,10.0μmol/L、作用48h效果最明显;形态学观察到典型瘤细胞凋亡特征;流式细胞仪分析证实反义c-myc寡核苷酸主要阻止瘤细胞进入S期,出现明显的凋亡峰,凋亡率达36.82%,并可抑制c-myc基因蛋白的表达。结论反义c-myc寡核苷酸可诱导人骨肉瘤MG-63细胞的凋亡,对瘤细胞的增殖有抑制作用。
蒋建伟,张洹[8]（2006）在《受体介导的c-myc反义核酸抑制肝癌Bel-7402细胞增殖的机制》文中研究说明目的探讨半乳糖受体介导的c-myc反义寡核苷酸（antisenseoligodeoxynucleotide,ASODN）抑制肝癌Bel-7402细胞增殖的机制。方法c-mycASODN与半乳糖（galactose,Gal）-聚乙烯亚胺（poly-ethyleneimine,PEI）相作用形成Gal-PEI-ASODN复合物,作用于人肝癌Bel-7402细胞,通过流式细胞仪检测细胞周期、AnnexinV-FITC和碘化丙啶（PropidiumIodide,PI）双染色、DNA电泳实验观察Gal-PEI-ASODN对Bel-7402细胞的作用。结果采用流式细胞仪检测细胞周期,细胞对照组、Gal-PEI对照组、ASODN对照组,细胞增殖指数分别为35.04%、33.95%、32.90%,Gal-PEI-ASODN组细胞增殖指数为23.65%,与细胞对照组相比,sub-G1期+G0/G1期细胞总数从64.03%增加到76.74%,S期+G2/M期的细胞从35.04%减少为23.65%,Gal-PEI-ASODN组细胞增殖指数下降11.39%,差异显着（P<0.01）。采用细胞凋亡检测试剂AnnexinV-FITC/PI双染检测细胞坏死情况,细胞对照组细胞凋亡率2.77%,坏死率3.06%,正常细胞率94.13%;ASODN对照组、Gal-PEI对照组细胞凋亡率均在4%以下,坏死率均在6.8%以下;Gal-PEI-ASODN组细胞凋亡率6.5%,坏死率15.9%,正常细胞率下降为76%。DNA电泳实验中,Gal-PEI-ASODN组未发现细胞凋亡的DNA梯形条带,相反出现了弥散条带。结论半乳糖受体介导的c-myc反义核酸通过阻止细胞从G0/G1期细胞向S期的转变,诱导细胞坏死,达到抑制细胞Bel-7402增殖的作用。
匡新建[9]（2006）在《c-myc反义寡核苷酸对增生性瘢痕成纤维细胞增殖及P27表达影响的实验研究》文中研究说明研究背景：增生性瘢痕（Hypertrophic scar，HS）是人类皮肤受损、创面愈合后瘢痕持续增生的一种病理现象，它的病理本质是以成纤维细胞（Fibroblast，Fb）为主的细胞成分的过度增殖和以胶原为主的细胞外基质（Extracel lular matrix，ECM）的过度沉积，目前其发病机制还不清楚。瘢痕增生过度挛缩，常常导致各种畸形功能障碍，给患者带来身心痛苦。多年来，瘢痕增生一直无确切的治疗方法。基因治疗是分子生物学的主要应用领域之一，理论上可以从根本上阻止许多疾病的发生与进展，并有望达到治愈的目的，但如何选择靶基因及靶细胞成为其关键。 c-myc是细胞原癌基因，其编码的62KD核蛋白通过与核蛋白Max形成二聚体结合特异的DNA序列（CACTGT）激活许多靶基因的转录，其中很多基因产物与细胞周期调控密切相关。c-myc属于永生性癌基因，在细胞的生长、繁殖、凋亡及分化中具有非常重要的地位。c-myc的过度表达是人类肿瘤细胞最常见的变化之一。近年来国外研究表明c-myc与增生性瘢痕关系密切。国外学者以c-myc反义寡核苷酸（Antisense oligonucleotide，ASODN）转染肿瘤细胞后，分别采用流式细胞术和Western blotting检测的结果均显示，肿瘤细胞c-Myc蛋白水平显着降低。增生性瘢痕形成的早期阶段，通过基因进行干预，是防止瘢痕增生和挛缩的较佳时机。但目前国内外文献尚未见到c-myc ASODN对增生性瘢痕成纤维细胞c-myc mRNA表达影响的报道。国内尚未见到c-myc ASODN处理增生性瘢痕成纤维细胞的类似报道。越来越多的实验证实细胞周期调节蛋白p27对许多肿瘤有抑制作用，因此p27又被称为抑癌基因，是肿瘤抑制性治疗的重要候选者，但其在瘢痕增生过程中的作用尚不清楚。p27蛋白的表达在增生性瘢痕中比正常皮肤组织低，提示p27可能与瘢痕形成有关。研究发现，成纤维细胞高表达c-myc可直接引起p27下调，
邓波[10]（2006）在《人肺腺癌细胞TGF-β1对细胞凋亡调控的实验研究》文中进行了进一步梳理转化生长因子β1（TGF-β1）属于生长因子超家族,其生物学效应非常广泛,主要包括调节细胞增殖和分化、参与胚胎发育调节、促进细胞外基质（ECM）形成和抑制免疫反应等。TGF-β1在包括肺癌在内的多种恶性肿瘤细胞中常呈高表达,并可由癌旁基质细胞产生。目前认为,在肿瘤早期TGF-β1抑制原癌基因c-myc等,阻止细胞生长周期从G1期进入S期;而在肿瘤的中晚期（肿瘤浸润血管逐渐开始形成）,TGF-β1可通过促进血管生成、肿瘤细胞迁移、免疫抑制等途径为肿瘤的生长、浸润及转移提供适宜的微环境,使肿瘤细胞表现恶性特征。对非肿瘤细胞的观察发现,TGF-β1对细胞中Fas/FasL蛋白表达具有调控作用。Fas/FasL为重要的细胞凋亡途径,在非肿瘤细胞中TGF-β1通过上调Fas表达,从而激活Fas/FasL凋亡信息链中的凋亡蛋白酶caspase家族诱导细胞发生凋亡。另外,TGF-β1与细胞内TGF-β1受体结合后,亦能通过下游信号smad蛋白激活caspase家族引起细胞凋亡。因此,TGF-β1可看作是一个诱导细胞凋亡的细胞因子,在机体内发挥清除异常细胞的重要作用。但TGF-β1与肿瘤细胞凋亡的关系尚不明确,目前国内外鲜有肿瘤细胞中TGF-β1与Fas/FasL凋亡信号通路之间关系的研究报道。为探讨TGF-β1与肿瘤细胞凋亡的关系,本实验按如下三个部份进行研究。第一部分通过siRNA靶点序列设计软件结合Angela siRNA设计原则,设计、合成TGF-β1特异性siRNA靶点序列;再将靶点序列插入PAVU6+27质粒构建siRNA质粒;通过免疫荧光、免疫印记等方法检测转染siRNA质粒后人A549肺癌细胞株中TGF-β1的表达水平。第二部分将TGF-β1特异性小干扰RNA质粒pOligo1216和无关对照质粒pOligo Control转染肺腺癌A549细胞,检测TGF-β1 siRNA质粒转染后（即TGF-β1被静默后）,上述A549细胞中Fas/FasL分子表达与凋亡酶caspase-3、caspase-8的活性;然后通过蛋白转染剂,将TGF-β1蛋白导入A549细胞,检测细胞内TGF-β1蛋白上调后细胞中Fas/FasL分子表达与凋亡酶caspase-3、caspase-8的活性,以了解TGF-β1对人肺腺癌细胞Fas/FasL凋亡通路的影响。第三部分参照Saitoh、Crowley等学者所报告的方法,首先检测人肺腺癌A549细胞与Calu-6细胞的HLA-ABDR等位基因,再构建稳定表达HLA-A2的人肺腺癌细胞系,通过混合淋巴细胞肿瘤细胞培养（MLTC）的方法,对诱导刺激健康人PBL产生肺癌特异性CTL作了初步的研究与探索。
二、反义c-myc寡核苷酸抑制大鼠气道平滑肌增殖与细胞凋亡无关（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、反义c-myc寡核苷酸抑制大鼠气道平滑肌增殖与细胞凋亡无关（论文提纲范文）
（1）c-Myc靶向的长非编码RNA GATA2-AS1调控非小细胞肺癌生长的分子机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 肺癌的研究背景 |
| 1.2 lncRNA的研究背景 |
| 1.3 原癌基因c-Myc的研究背景 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验细胞 |
| 2.2 试剂和抗体 |
| 2.3 细胞培养和转染 |
| 2.4 RNA干扰 |
| 2.5 实时荧光定量PCR(q RT-PCR) |
| 2.6 免疫印迹(WB)分析 |
| 2.7 染色质免疫共沉淀(ChIP)分析 |
| 2.8 RNA免疫共沉淀(RIP)分析 |
| 2.9 克隆形成实验 |
| 2.10 细胞周期分析 |
| 2.11 癌组织标本分析 |
| 2.12 实验再现性 |
| 2.13 数据管理与统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 GATA2-AS1 抑制NSCLC细胞的增殖 |
| 3.2 GATA2-AS1 通过结合GATA1 发挥作用 |
| 3.3 GATA2-AS1 增强GATA1 的转录抑制功能 |
| 3.4 GATA2-AS1 通过GATA2 抑制NSCLC细胞的增殖 |
| 3.5 c-Myc转录调控GATA2-AS1 |
| 3.6 GATA2-AS1 在癌组织中表达较低 |
| 3.7 NSCLC中c-Myc→GATA2-AS1→GATA1→GATA2 信号通路 |
| 4 讨论 |
| 4.1 GATA2-AS1 调控邻近基因GATA2 的转录 |
| 4.2 GATA2-AS1 通过转录抑制GATA2 发挥抑癌作用 |
| 4.3 GATA2-AS1 的表达受到c-Myc的转录调控 |
| 4.4 GATA2-AS1 在癌组织标本中的表达分析 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简历 |
| 在学期间研究成果 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（2）长链非编码RNA在支气管哮喘和慢性阻塞性肺疾病中的表达和分析的研究（论文提纲范文）
| 华中科技大学博士学位论文创新点概述 |
| 前言 |
| 第一部分 长链非编码RNA在支气管哮喘患者外周血CD4+T细胞中的表达和分析的研究 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 研究背景 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 长链非编码RNA在慢性阻塞性肺疾病患者外周血CD4+T细胞中的表达与分析的研究 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 研究背景 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 长链非编码RNA在肺部疾病中的表达及作用机制的研究进展 |
| 1.LncRNA的生物学特点和功能 |
| 2.LncRNA与肺部疾病 |
| 参考文献 |
| 附录1 英文缩略词表 |
| 附录2 攻读学位期间撰写与发表的研究论文 |
| 致谢 |
（3）1. 减毒沙门氏菌携带GRIM-19及Survivin-特异shRNA共表达质粒对前列腺癌的治疗作用 2. 有机硒抑制激素非依赖性前列腺癌的发生（论文提纲范文）
| 提要 |
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一篇 减毒沙门氏菌携带GRIM-19 及SURVIVIN-特异SHRNA 共表达质粒对前列腺癌的治疗作用 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 凋亡抑制蛋白Survivin 的研究进展 |
| 1.2 细胞死亡调节因子GRIM-19 的研究进展 |
| 1.3 肿瘤基因导入的载体系统 |
| 第2章 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 Survivin 与GRIM-19 在正常前列腺、前列腺增生、前列腺癌组织及DU145 细胞的表达 |
| 3.2 共表达siRNA-Survivin 和GRIM-19 基因真核重组质粒的构建及鉴定 |
| 3.3 共表达siRNA-Survivin 及GRIM-19 基因真核重组质粒抑制人前列腺癌DU145 细胞生长的体外研究 |
| 3.4 siRNA-Survivin 与pGRIM-19 共表达质粒对人前列腺癌作用的体内研究 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 前列腺癌Survivin 和GRIM-19 的表达研究 |
| 4.2 共表达siRNA-Survivin 和GRIM-19 基因真核重组质粒的构建及鉴定 |
| 4.3 siRNA Survivin 和GRIM-19 共表达质粒对前列腺癌DU145 细胞生长抑制的体内外研究 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 第二篇 有机硒抑制激素非依赖性前列腺癌的发生 |
| 前言 |
| 第1章 文献回顾 |
| 1.1 前列腺癌去势治疗的现状 |
| 1.2 雄激素非依赖性前列腺癌发生机制的研究进展 |
| 1.3 硒与肿瘤关系的研究进展 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 MSC 抑制去势裸鼠前列腺癌移植瘤生长的体内研究 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 MSA 对LNCaP 细胞生长的抑制作用 |
| 3.2 MSC 对去势裸鼠移植瘤的影响 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表文章 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
（4）反义c-myc寡核苷酸诱导骨肉瘤细胞MG-63凋亡的实验研究（论文提纲范文）
| 材 料 和 方 法 |
| 1 材料 |
| 1.1 反义寡核苷酸的制备 |
| 1.2 主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 细胞与细胞培养 |
| 2.2 细胞转染 |
| 2.3 MTT法测定 |
| 2.4 流式细胞仪测定瘤细胞凋亡情况 |
| 2.5 流式细胞仪测定c-myc基因蛋白的表达 |
| 2.6 形态学观察 |
| 3 统计学处理 |
| 结 果 |
| 1 MTT法测定不同浓度的c-myc ASODN对人骨肉瘤MG-63细胞增殖的抑制作用 |
| 2 MTT法测定不同作用时间c-myc ASODN对人骨肉瘤MG-63细胞增殖的抑制作用 |
| 3 流式细胞仪测定c-myc ASODN对人骨肉瘤MG-63凋亡的影响 |
| 4 流式细胞仪测定c-myc ASODN对人骨肉瘤MG-63细胞中c-myc基因蛋白表达的影响 |
| 5 形态学观察结果 |
| 讨 论 |
（5）ERK信号通路对慢性哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖与凋亡的调控作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 ERK 在慢性哮喘大鼠气道平滑肌增殖中的作用 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 慢性支气管哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖中ERK 活化的作用 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 ERK 对慢性支气管哮喘大鼠ASMC 凋亡的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 ERK 反义寡核苷酸对慢性哮喘大鼠ASMC 增殖和凋亡的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 小结与展望 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（6）吸烟对气道平滑肌细胞增殖和凋亡的影响及HSP70在凋亡中保护作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分：吸烟对气道平滑肌细胞增殖中可能信号通路的影响的研究 |
| 论文一: 香烟提取物对气道平滑肌细胞增殖中ERKS 及NF-ΚB 的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 论文二: PI-3K 在吸烟大鼠COPD 模型气道平滑肌增生中的表达的作用 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分：吸烟对气道平滑肌细胞凋亡中P-JNK 的影响及HSP70 在凋亡中保护作用的研究 |
| 论文一: 施维舒对气道平滑肌细胞HSP70 表达的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 论文二: 香烟提取物对气道平滑肌细胞凋亡中P-JNK 的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 论文三：HSP70 对CSE 引起的气道平滑肌细胞凋亡中P-JNK 的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 附属部分：吸烟对肺功能及外周血T 淋巴细胞IL-2MRNA 的影响 |
| 对象和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表（录用）论文情况 |
| 致谢 |
（7）反义c-myc寡核苷酸对骨肉瘤MG-63细胞增殖和凋亡的影响（论文提纲范文）
| 材料与方法 |
| 一、主要材料 |
| 二、方法 |
| 结果 |
| 一、不同浓度c-myc ASODN对人骨肉瘤MG-63细胞增殖的抑制作用 |
| 二、不同作用时间c-myc ASODN对人骨肉瘤MG-63细胞增殖的抑制作用 |
| 三、c-myc ASODN对人骨肉瘤MG-63细胞周期的影响 |
| 四、c-myc ASODN对人骨肉瘤MG-63细胞凋亡的影响和c-myc基因蛋白表达情况 |
| 五、形态学改变 |
| 讨论 |
（9）c-myc反义寡核苷酸对增生性瘢痕成纤维细胞增殖及P27表达影响的实验研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 论文正文 c-myc反义寡核苷酸对增生性瘢痕成纤维细胞增殖及其P27表达影响的实验研究 |
| 前言 |
| 第一部分：c-myc ASODN对原代培养人增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分：c-myc ASODN对增生性瘢痕成纤维细胞胶原合成的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分：反义寡核苷酸对成纤维细胞c-myc mRNA表达及其蛋白水平的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第四部分：c-myc ASODN对抑癌基因P27 mRNA及蛋白表达的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 文献综述 |
| 攻读博士学位期间发表论文 |
（10）人肺腺癌细胞TGF-β1对细胞凋亡调控的实验研究（论文提纲范文）
| 缩写词表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 人肺腺癌细胞TGF-β1对细胞凋亡调控的实验研究 |
| 前言 |
| 第一部分 载体介导RNAi抑制TGF-β1在肺癌细胞株中表达 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 TGF-β1对肺癌细胞Fas/FasL凋亡通路的影响 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 构建稳定表达HLA-A2 的人肺癌细胞系诱生肺癌特异性T 淋巴细胞的初步研究与探讨 |
| 分题一 肺腺癌细胞系A549、Calu-6 的HLA-ABDR 等位基因检测 |
| 实验方法 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 分题二 HLA-A*0201 cDNA在肺腺癌细胞A549中的瞬时与稳定表达 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 分题三 肿瘤特异性T 淋巴细胞杀伤肺腺癌A549 细胞的初步研究与探讨 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 图片 |
| 参考文献 |
| 文献综述 转化生长因子β信号通路对肿瘤影响的研究进展 |
| 参考文献 |
| 研究生期间发表主要论文 |
四、反义c-myc寡核苷酸抑制大鼠气道平滑肌增殖与细胞凋亡无关（论文参考文献）
- [1]c-Myc靶向的长非编码RNA GATA2-AS1调控非小细胞肺癌生长的分子机制研究[D]. 张玲. 安徽医科大学, 2019(08)
- [2]长链非编码RNA在支气管哮喘和慢性阻塞性肺疾病中的表达和分析的研究[D]. 齐雪霏. 华中科技大学, 2019(03)
- [3]1. 减毒沙门氏菌携带GRIM-19及Survivin-特异shRNA共表达质粒对前列腺癌的治疗作用 2. 有机硒抑制激素非依赖性前列腺癌的发生[D]. 刘艳波. 吉林大学, 2009(08)
- [4]反义c-myc寡核苷酸诱导骨肉瘤细胞MG-63凋亡的实验研究[J]. 胡军,王桂龙,向阳,刘义,陈一升,丁茹虎. 中国病理生理杂志, 2007(07)
- [5]ERK信号通路对慢性哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖与凋亡的调控作用[D]. 白晶. 华中科技大学, 2007(05)
- [6]吸烟对气道平滑肌细胞增殖和凋亡的影响及HSP70在凋亡中保护作用的研究[D]. 陈宏斌. 华中科技大学, 2007(05)
- [7]反义c-myc寡核苷酸对骨肉瘤MG-63细胞增殖和凋亡的影响[J]. 王桂龙,向阳,胡军,尹培荣,吴承龙,张骏,李鹏. 中国骨肿瘤骨病, 2007(01)
- [8]受体介导的c-myc反义核酸抑制肝癌Bel-7402细胞增殖的机制[J]. 蒋建伟,张洹. 肿瘤防治研究, 2006(10)
- [9]c-myc反义寡核苷酸对增生性瘢痕成纤维细胞增殖及P27表达影响的实验研究[D]. 匡新建. 南昌大学, 2006(02)
- [10]人肺腺癌细胞TGF-β1对细胞凋亡调控的实验研究[D]. 邓波. 第三军医大学, 2006(11)