一、转基因植物表达重组蛋白的研究进展（论文文献综述）
郭家秀[1]（2021）在《SikCDPK1基因响应非生物逆境的功能初步研究》文中研究说明钙依赖性蛋白激酶（calcium dependent protein kinase,CDPK）通过与Ca2+协同作用,参与调控植物生长发育并响应多种逆境胁迫,其C端调控区的EF-hand基序是使CDPK的激活依赖于Ca2+的关键结构。天山雪莲（Sasussured involucrata Kar.et Kir.）作为具有极强抗逆性的珍贵植物,对其抗逆基因功能及分子机制的研究具有重要意义。迄今,国内外对天山雪莲SikCDPK功能的研究非常有限,对SikCDPK1基因EF-hand基序及其响应非生物逆境的研究也较少。因此,本研究通过PCR定点突变技术对SikCDPK1中N、C端EF-hand基序分别进行定点突变(Ca2+结合位点),采用大肠杆菌表达系统进行体外诱导表达,使用镍柱亲和层析系统并结合超滤离心管分别对四种重组蛋白进行纯化、浓缩后,进行Ca2+结合能力及酶活性检测。另一方面,对两种不同生境植物SikCDPK1基因及GhCDPK1基因同时进行遗传转化,对比T1代转基因烟草在同一生长时期的生长发育表型差异,同时进行逆境胁迫处理,通过对表型差异及抗逆相关生理指标的对比观察,对SikCDPK1基因进行功能分析。主要研究结果如下:1、采用PCR定点突变技术,将SikCDPK1基因的第435位、471位、507位、540位氨基酸分别由E（谷氨酸）定点突变为Q（谷氨酰胺）,成功构建SikCDPK1基因不同位置EF-hand基序定点突变原核表达载体p ET32a-SikCDPK1-N-EF、p ET32a-SikCDPK1-C-EF、p ET32a-SikCDPK1-EFN+C、p ET32a-SikCDPK1,生物信息学分析发现,这些位点的突变会使得蛋白空间构象发生改变。转化表达菌株,四种重组菌株通过IPTG诱导均能够成功表达出目的重组蛋白,且重组蛋白可溶性表达较好的诱导培养条件是18℃1 mmol/L IPTG诱导16 h。通过镍柱亲和层析纯化及超滤离心管浓缩后,获得了纯度较好的四种重组蛋白,且电泳迁移率存在差异,表明获得的重组蛋白空间构象发生变化。2、对获得的重组蛋白进行Ca2+结合能力及酶活性检测,结果表明SikCDPK1与SikCDPK1-N-EF在Ca2+处理后,电泳迁移率变快,但SikCDPK1变化更明显,相比之下,SikCDPK1-C-EF与SikCDPK1-EFN+C在处理前后,电泳迁移率未表现出明显变化。说明SikCDPK1发生突变后,其Ca2+结合能力发生了改变。对激酶活性的检测发现,在EGTA存在的条件下,激酶活性均无明显变化,在Ca2+存在的条件下,SikCDPK1蛋白激酶活性被释放,随着时间的延长,其活性逐渐消失,突变蛋白SikCDPK1-N-EF及SikCDPK1-C-EF酶活性均出现不同程度的变化,突变蛋白SikCDPK1-EFN+C只在处理5min时出现较明显变化。以上结果说明不同位置的EF-hand基序对SikCDPK1空间构象及酶活性的影响不同,C端EF-hand可以结合Ca2+对空间构象产生影响,而N端EF-hand对激酶活性的影响较大。3、将SikCDPK1基因及GhCDPK1基因同时进行遗传转化,经表型对比观察发现,两种转基因烟草植株与野生型烟草植株相比均存在较明显的表型差异。转SikCDPK1基因烟草植株较高,叶片数量较多且叶片呈宽椭圆形,叶长较短,茎较细,而转GhCDPK1基因烟草植株与野生型烟草植株株高均明显低于转SikCDPK1基因烟草植株,转GhCDPK1基因烟草植株叶片数量较少但叶面积较大,呈长椭圆形,茎较粗。气孔观察发现,单位面积内两种转基因烟草植株叶片气孔数量均显着高于野生型烟草植株。4、通过对同一生长期的两种转基因烟草植株同时进行干旱及低温胁迫,发现转GhCDPK1基因烟草植株抗旱性强于转SikCDPK1基因烟草植株,而转SikCDPK1基因烟草植株抗寒性强于转GhCDPK1基因烟草植株,且在干旱胁迫复水后迅速恢复并出现开花迹象。虽然两种转基因烟草植株在抵御干旱与低温胁迫时存在一定差异,但其抗寒性及抗旱性均明显强于野生型烟草植株。相关抗逆生理指标的检测结果表明,转基因烟草植株能够在逆境胁迫下减轻细胞膜损伤,且渗透调节物质的大量增加被用于维持细胞内的渗透平衡,以进一步提高其抗逆性。
邢梦云[2]（2021）在《杨梅FLSs和F3’5’H调控杨梅素生物合成的机制研究》文中认为杨梅（Morella rubra Sieb.et Zucc.）是我国特色果树,具有重要的药用和经济价值。杨梅素是一种B环三羟基的黄酮醇,具有较高的生物活性,首次分离于杨梅树皮并因此得名。目前,黄酮醇生物合成研究多集中在山奈酚和槲皮素,有关杨梅素生物合成的信息较少,其生物合成机制尚不清楚。鉴别参与杨梅素生物合成的基因,解析杨梅素生物合成机制,对天然产物杨梅素的开发利用有重要指导意义,为黄酮醇生物合成信息的完善提供理论依据。本论文以富含杨梅素的杨梅为研究材料,通过转录组分析、实时荧光定量PCR、原核表达、真核表达和异源烟草转基因等技术手段,对杨梅素生物合成机制展开探索。主要结果如下:1.利用HPLC对‘荸荠’和‘东魁’两个品种杨梅不同组织黄酮醇和花色苷进行了代谢规律分析。杨梅中主要存在4种黄酮醇糖苷和1种花色素糖苷,其中杨梅素3-O-鼠李糖苷是杨梅中主要的黄酮醇,在‘荸荠’和‘东魁’叶、花中含量较高;槲皮素糖苷在‘荸荠’果实发育后期显着积累,‘东魁’果实发育后期未检测到槲皮素糖苷积累增加;矢车菊素3-O-葡萄糖苷在杨梅叶片和幼果中不积累,在果实成熟后期显着积累。2.基因表达与黄酮醇含量相关性分析发现,在‘荸荠’和‘东魁’两个品种杨梅不同组织中,MrFLS1和MrFLS2基因的表达水平均不与杨梅素糖苷含量相关,但在杨梅果实发育过程中,MrFLS1基因的表达水平与杨梅素糖苷含量正相关;MrF3’5’H基因的表达水平与杨梅素糖苷含量显着正相关,MrFLS2基因的表达水平与槲皮素糖苷含量显着正相关。3.氨基酸序列分析表明,MrFLS1和MrFLS2均属于双加氧酶家族,具有典型的2-氧代戊二酸和亚铁离子依赖型的保守结构域。体外重组蛋白活性分析发现,MrFLS1和MrFLS2均可催化二氢黄酮醇合成黄酮醇,且具有部分F3H功能,可催化黄烷酮羟基化成二氢黄酮醇;MrFLS1和MrFLS2对三种二氢黄酮醇的亲和性无显着性差异;MrFLS2对二氢槲皮素的转化效率显着较高。分子对接技术辅助分析了MrFLS1和MrFLS2对二氢黄酮醇的亲和力,结果表明,杨梅两个FLS蛋白对二氢杨梅素的作用力稍弱于二氢槲皮素和二氢山奈酚。MrF3H具有部分FLS功能,除催化黄烷酮羟基化成二氢黄酮醇外,还可催化二氢黄酮醇氧化成黄酮醇。不管是FLS蛋白还是F3H蛋白,均不能对自身催化产生的化合物进行进一步催化。与野生型烟草相比,过表达MrFLS1或MrFLS2的烟草叶和花中芦丁和山奈酚3-O-芸香糖苷含量显着增加,但未检测到杨梅素或其相关衍生物积累。4.MrF3’5’H属于CYP75A亚家族,具有典型的亚铁离子螯合区域（heme bing domain）、羟化位点和底物结合位点（substrate binding site）。酵母体内重组蛋白活性分析发现,MrF3’5’H可催化黄烷酮（柚皮素和圣草酚）、二氢黄酮醇（二氢山柰酚和二氢槲皮素）和黄酮醇（山柰酚和槲皮素）分别发生3’位点或5’位点羟化,且对柚皮素和山柰酚的催化活性显着高于其他四类化合物。与野生型烟草相比,过表达MrF3’5’H的烟草叶和花中杨梅素3-O-芸香糖苷含量显着增加,表明MrF3’5’H是杨梅素合成的关键因子。MrF3’H具有典型的F3’H功能,只能催化3’位点羟化,不能催化5’位点羟化,且催化活性较低。5.来源于葡萄、番茄、苹果和烟草的FLS蛋白功能与杨梅FLS相似,均可催化二氢黄酮醇发生氧化反应生成黄酮醇,且具有部分F3H功能。相比之下,杨梅FLS蛋白对二氢杨梅素的催化能力强于其他四种FLS蛋白,可能是杨梅积累杨梅素的因素之一。本论文涉及的植物P450蛋白功能有所差异,VvF3’5’H与MrF3’5’H在进化树上距离最近,蛋白功能也最相似;与MrF3’H不同,VvF3’H、Sl F3’H、Md F3’H和Nt F3’H均具有部分F3’5’H功能。相比来源于葡萄、茶、番茄、蓝莓、蔓长春花和陆地棉的F3’5’H蛋白,MrF3’5’H对山柰酚较高的催化活性及偏好生成杨梅素的催化特性,可能是杨梅富集杨梅素的又一重要因素。本论文研究结果表明,MrFLS和MrF3’5’H在杨梅素生物合成中都是必不可少的,其中,MrF3’5’H可通过羟基化山奈酚驱动代谢流走向三羟基化黄酮醇杨梅素,而不依赖特异催化二氢杨梅素的MrFLS。
朱熙[3]（2021）在《马铃薯中与胁迫相关StMAPKs基因的分离及功能研究》文中研究指明丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen activated protein kinase,MAPK）级联是真核生物中高度保守的信号转导模式,由MAPKKK、MAPKK和MAPK组成。该级联途径通过三种激酶依次逐级磷酸化将感知的外源信号放大并传递下去,从而产生应激反应介导细胞增殖、分化和死亡。马铃薯（Solanum tuberosum L.）为世界第四大粮食作物,日益突出的土地干旱和盐碱化问题造成其减产。目前,关于植物MAPK在干旱、盐及渗透胁迫条件下的基因功能研究十分有限。迄今为止,马铃薯StMAPKs基因响应非生物胁迫和植物激素诱导表达模式的系统研究仍未见报道,而且其在马铃薯不同组织和器官中的表达模式也不清楚。本研究主要解析StMAPKs是否介导多种与胁迫相关的信号转导途径,StMAPKs是否在干旱、盐和渗透胁迫下起作用以及其潜在机制。本研究对StMAPKs响应不同非生物胁迫和植物激素处理表达模式行了分析,同时还分析了其在不同组织和器官中的表达模式。从马铃薯“大西洋”中分离得到一个与盐和渗透胁迫相关的StMAPK3功能基因和一个与干旱胁迫相关的StMAPK11功能基因,并通过亚细胞定位、酵母双杂文库筛选、酵母双杂检测互作蛋白、双分子荧光互补、磷酸化蛋白组学,以及对过表达和RNA干扰表达转基因的植株在胁迫下生理指标和光合指标的检测做了研究。取得的主要研究结果如下:1.通过qRT-PCR技术分析了马铃薯15个StMAPKs基因在不同非生物胁迫和植物激素处理以及不同组织和器官中的表达模式。结果表明:马铃薯中15个StMAPKs基因不仅在非生物胁迫和植物激素处理时表达差异显着,而且在不同组织和器官中的特异性表达差异也显着。2.从马铃薯中克隆得到两个促分裂原活化蛋白激酶基因StMAPK3和StMAPK11,其中StMAPK3是与盐和渗透胁迫相关,而StMAPK11与干旱胁迫相关,构建了pCAM35s-GFP-StMAPK3和pCAM35s-GFP-StMAPK11亚细胞定位载体,并在烟草表皮细胞中进行了瞬时表达。结果表明,StMAPK3和StMAPK11均定位于细胞膜和细胞核。3.构建了原核重组表达载体pET28b-StMAPK11,并将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）后,IPTG诱导并纯化StMAPK11重组蛋白,制备兔抗StMAPK11多克隆抗体,Western blot结果显示制备好的抗体可以很好的与StMAPK11蛋白特异性结合。4.分别构建了酵母双杂和双分子荧光互补载体,通过酵母双杂交和双分子荧光互试验验证结果显示,StMAPK3可以与StDof1、StSR2、StACS5、StMEK2和StMAPKK1发生互作,其中StMAPK3与StSR2在细胞核内相互作用。StMAPK11可以与StbZIP2、StPTP1和StVQP9发生互作,其中StMAPK11与StbZIP2在细胞核内相互作用。5.与盐和渗透胁迫相关StMAPK3基因的功能分析。在盐和渗透胁迫条件下,与非转基因植株相比,过表达StMAPK3植株中过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）的酶活性和脯氨酸含量均增加,在RNA干扰表达植株中,结果相反,而在StMAPK3过表达植株中H2O2和丙二醛（MDA）含量减少,RNA干扰表达植株中H2O2和MDA含量增加。同时过表达StMAPK3提高了盐和渗透胁迫下植株的蒸腾速率、净光合速率、气孔导度和水分利用效率,在RNA干扰表达植株中,这些光合指标与非转基因植株相比都不同程度的降低。并且还发现在盐和渗透胁迫下转StMAPK3基因对马铃薯植株的气孔开合度、植株高度、茎粗、鲜重、根长和侧根数都有不同程度的影响。结果表明StMAPK3能明显提高马铃薯植株对盐和渗透胁迫的抗性。6.与干旱胁迫相关StMAPK11基因的功能分析。在干旱胁迫条件下,与非转基因植株相比,过表达StMAPK11植株（马铃薯、烟草和拟南芥）中CAT、POD、SOD酶活性和脯氨酸含量均增加,但在RNA干扰表达马铃薯植株中,结果相反,在StMAPK11过表达植株（马铃薯、烟草和拟南芥）中H2O2和MDA含量减少,但在RNA干扰表达马铃薯植株中H2O2和MDA含量增加。同时过表达StMAPK11提高了干旱胁迫下马铃薯植株的蒸腾速率、净光合速率、气孔导度和水分利用效率;在RNA干扰表达植株中,这些光合指标与非转基因相比都不同程度的降低。并且还发现转StMAPK11基因在干旱胁迫下对马铃薯植株的鲜重、干重、根鲜重和根干重都有不同程度的影响。表明StMAPK11能明显提高植株（马铃薯、烟草和拟南芥）对干旱胁迫的抗性。7.对StMAPK3过表达和RNA干扰表达马铃薯植株进行磷酸化蛋白质组学分析共鉴定得到2180种磷酸化蛋白。通过修饰位点定量分析在两组中共同鉴定到的修饰位点2922个,其中差异显着的修饰位点总数78个,显着上调的修饰位点总数49个,显着下调的修饰位点总数29个。通过磷酸化蛋白差异分析两组共鉴定蛋白2023个,其中上调表达蛋白15个,下调表达蛋白14个。利用GO、KEGG、COG数据库对鉴定的磷酸化蛋白质进行功能注释,结果表明这些蛋白质主要在植株生长发育过程,信号转导和代谢途径中发挥相应功能。
战帅帅[4]（2021）在《小麦阿拉伯木聚糖阿魏酸酰基转移酶基因TaBAHD的克隆与功能鉴定》文中研究表明小麦是我国最重要的粮食作物之一。阿魏酰阿拉伯木聚糖（Feruloyl arabinoxylan,FAX）大分子构架中的阿魏酰基团与阿拉伯木聚糖（Arabinoxylan,AX）产生氧化交联最终形成凝胶,对面制品的加工品质及其营养品质均能产生重要影响。FAX在阿拉伯木聚糖阿魏酸酰基转移酶（Arabinoxylan feruloyl transferase,AFT）催化作用下合成,而FAX含量的高低则对小麦AX的分子结构和性质起到关键作用。因此,克隆FAX含量的关键酶（AFT）基因,开发功能标记并进行基因的表达机理分析是对小麦加工品质进行改良的有效途径。本研究利用253份来自黄淮冬麦区、北部冬麦区的国内外小麦品种（系）及124份新疆小麦品种（系）作为供试材料,同源克隆小麦3B、3D染色体上的TaBAHD基因,基于序列的差异性开发功能标记并验证,最后通过基因编辑对TaBAHD-A1和TaBAHD-B1及TaBAHD-D1基因进行分析鉴定,明晰小麦籽粒FAX含量相关的分子基础。主要结果如下:1.通过同源克隆的方法,以TaBAHD-A1基因序列为探针,分别克隆了位于3 BL和3 DL上的AFT基因TaBAHD-B1和TaBAHD-D1。TaBAHD-B1和TaBAHD-D1基因全长序列分别为1450 bp和1469 bp,各都包含一个1266 bp完整的开放阅读框（Open reading frame,ORF）,一个内含子及两个外显子,内含子的剪接位点结构则符合GT-AG经典类型。不同材料间的TaBAHD-B1基因在1425bp位置有1处SNP位点,2个等位变异序列之间相似度为98.08%,共编码氨基酸422个,预测其分子量是45.1k Da。不同材料的TaBAHD-D1基因等位变异序列之间相似度为99.73%,具有4个单核苷酸多态性位点,且具有20 bp的5′非翻译区（Untraslated region,UTR）和44 bp的3′UTR。TaBAHD-A1和TaBAHD-B1、TaBAHD-D1基因存在10个氨基酸非同义突变,相同结构域是乙酰转移酶催化机制重要组分。基于TaBAHD-B1基因的等位变异序列SNP位点开发了一对显性互补型标记AFT 97/AFT 85。AFT 97标记与高FAX含量相关,在具有TaBAHD-B1a类型的材料中能扩增出539 bp片段,在黄淮冬麦区材料间不同基因型的FAX含量差异达显着水平（P<0.05）。基于TaBAHD-D1基因19 bp SNP处开发了2个互补显性标记AFT 19和AFT 27。AFT 27可分辨出的等位变异TaBAHD-D1a材料中能扩增出908 bp片段,与高FAX含量相关。总体分析表明,具有不同基因型小麦品种的FAX含量差异达到显着水平（P<0.05）。TaBAHD-A1a/TaBAHD-B1a/TaBAHD-D1a基因型组合,在北部冬麦区、黄淮冬麦区及总体材料中,其FAX含量在不同麦区间差异达显着水平（P<0.05）,且TaBAHD-B1基因对FAX含量催化合成的功能作用相对较小。2.通过实时荧光定量PCR（Quanti-ficational,PCR）的方法,对12份基因型与表型值相符合的小麦材料,其开花后5个周期麦穗籽粒中的TaBAHD-A1、TaBAHD-B1、TaBAHD-D1基因表达量进行统计分析,结果表明TaBAHD-A1、TaBAHD-B1及TaBAHD-D1基因均在21 d时期表达量最高且稳定,且与其他7 d、14 d、28 d、35 d时期的相对表达量有显着差异（p<0.05）,与小麦籽粒处于面团期特征表现一致。TaBAHD-A1a的相对表达量约为TaBAHD-B1a等位变异相对表达量的1.3倍,TaBAHD-D1a等位变异相对表达量的2倍,TaBAHD-B1b等位变异相对表达量的5倍。12份材料分为两类,I类为高FAX含量品种,II类为低FAX含量品种。农大212（TaBAHD-A1a/TaBAHD-B1a/TaBAHD-D1a）、小偃54（TaBAHD-A1a/TaBAHD-B1a/TaBAHD-D1b）是优异等位变异组合类型的高FAX含量材料,与淮麦18（TaBAHD-A1b/TaBAHD-B1b/TaBAHD-D1b）、济麦21（TaBAHD-A1b/TaBAHD-B1b/TaBAHD-D1b）、陕354（TaBAHD-A1b/TaBAHD-B1b/TaBAHD-D1a）低FAX含量的材料在不同发育时期相对表达量差异显着（p<0.05）,且相对表达量与前期研究的FAX含量表型特征相符合,以上结果表明第3染色体组的TaBAHD-A1、TaBAHD-B1、TaBAHD-D1基因可能参与催化合成小麦籽粒发育过程中FAX含量的交联反应,且不同基因型参与调控作用的功能程度存在差异,在转录水平上分析了TaBAHD基因表达机理。3.通过双酶切法构建p ET-28a（+）-TaBAHD-A1,p ET-28a（+）-TaBAHD-B1,p ET-28a（+）-TaBAHD-D1原核表达载体;37℃,215 rpm条件下,加入IPTG至终浓度为1 m M,恒温培养2 h,全菌蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳,所得结果与前期预测结果一致,初步验证TaBAHD蛋白已被成功诱导。重组蛋白表达条件进一步优化表明,p ET-28a（+）-TaBAHD均在37℃表达最高,而p ET-28a（+）-TaBAHD-A1及p ET-28a（+）-TaBAHD-B1重组载体分别在1.0 m M、1.5 m M IPTG浓度条件下,p ET-28a（+）-TaBAHD-D1重组载体在诱导8 h时表达条件下最优。4.以中间载体pMETa U 6.1为模板成功构建双g RNA基因编辑载体。高通量测序结果表明37株基因编辑植株突变类型主要为Bi和He,主要在PAM识别序列为TaBAHD-222靶点上游3 bp、4 bp处以4 bp、5 bp的删除突变及下游2 bp处单碱基替换为主。主要在PAM识别序列为TaBAHD-322靶点下游4 bp处以2 bp的删除突变及单碱基插入为主,且主要为TaBAHD-A1及TaBAHD-B1发生基因编辑。3个染色体TaBAHD基因同时发生基因编辑的植株籽粒FAX含量为3.57×10-5mol/L,低于受体Fielder品种(4.07×10-5mol/L)。初步验证了TaBAHD基因可能与胚乳细胞壁FAX含量存在相关性。
陆小雨[5]（2021）在《基于联合组学技术的红花槭叶片呈色机理分析和ArMYB89的基因功能研究》文中进行了进一步梳理彩色树种在园林绿化中的作用日益凸显,红花槭以其挺拔的干型和艳丽的叶色,在绿化、园林设计中发挥着越来越重要的作用。红花槭全基因组序列的缺乏,制约着该物种的遗传基础研究,影响红花槭叶片变色的色素、基因调控机理尚不明确。前期研究表明,花青素的积累是红花槭叶片变红的主要原因。尽管部分MYB转录因子在花青素合成过程中的功能已得到证实,但对木本植物MYB转录因子的研究大多还停留在转录测序和模式表达分析阶段,深入研究其生物学功能的报道较少。本研究通过全基因组测序技术,绘制了相对完整的红花槭基因组草图,利用基因组学、转录组学和代谢组学联合分析技术,深度探索了红花槭叶片变色的分子机理,并结合功能研究明确ArMYB89与红花槭花青素积累的调控关系。主要结果如下:1.本研究通过全基因组测序技术获得了一个相对完整的红花槭基因组草图。利用Nanopore和Hi-C技术得到该物种的基因组大小为1.69Gb,其中N50为547.18Kb,99.61%的Contigs挂载到39条假染色体上;其基因组中的重复序列占69.85%,转座子的重复序列所占比例为67.14%;共预测得到基因64644个,平均基因长度为3801.1bp;共注释到红花槭中非编码RNA共7259个;能够注释到功能数据库的基因数目为62927个,占总基因数的97.34%;红花槭与其同属物种漾濞槭的亲缘关系较近,二者大约在6.34百万年前发生分化。2.红花槭叶色的形成与花青素、叶绿素和类胡萝卜素的合成与积累情况密切相关。将红花槭特殊叶色单株上不同分枝的绿叶、红叶和黄叶作为实验材料,在转录组测序中,红叶-绿叶比较组、黄叶-绿叶比较组和红叶-黄叶比较组中分别有14009个、20824个和13620个差异表达基因上调,14527个、22193个和13490个差异表达基因下调;在代谢组分析中,在正离子模式下,红叶-绿叶比较组、黄叶-绿叶比较组和红叶-黄叶比较组中分别有706个、537个和192个差异积累代谢物上调,671个、1256个和906个差异表达基因下调;在负离子模式下,红叶-绿叶比较组、黄叶-绿叶比较组和红叶-黄叶比较组中分别有355个、141个和70个差异积累代谢物上调,434个、558个和607个差异积累代谢物下调。综合转录组和代谢组的KEGG通路富集情况,花青素、叶绿素和类胡萝卜素的合成与积累影响着红花槭叶色的形成。3.红花槭叶片呈红色的主要原因是花青素的积累,其含量和比例均高于其他两种色素,绿叶的形成是由于叶绿素的积累,而黄叶产生的原因则是叶片中叶绿素降解,类胡萝卜素显现,花青素的积累,三种色素共同作用的结果。在红花槭花青素的合成代谢中,CHS基因正向调控花青素及其衍生物的生成,矢车菊素-3-（6’’-乙酰半乳糖苷）和矢车菊素-3-阿拉伯糖苷是红花槭叶片呈红色或者黄色的决定性因素。在红花槭叶绿素的合成代谢中,叶绿素a是发挥主要作用的色素,Ar POR正向调控叶绿素a的合成,而Ar NOL2逆向调控叶绿素a的生成。在红花槭类胡萝卜素的合成代谢中,衰老叶片的Ar LUT5-3和Ar LUT5-4的表达量降低,在它们对α-胡萝卜素的正调控下,类胡萝卜素的合成在叶片由绿变红或黄的过程中由α-分枝向β-分枝转变。4.对红花槭MYB基因家族进行了全基因组分析,克隆了一个调控红花槭中花青素合成的MYB转录因子,命名为ArMYB89,并对其进行功能研究。在红花槭基因组中共鉴定出393个MYB转录因子,这些Ar MYB成员在红花槭的34条染色体上分布不均。共线性分析表明,红花槭MYB家系中有16对串联重复基因对和247对片段重复基因对。q RT-PCR分析表明,红花槭中有5个第六亚组的R2R3-Ar MYB基因具有相同的表达模式,其中ArMYB89在红叶中的表达量显着高于绿叶。亚细胞定位实验表明,ArMYB89定位于细胞核。进一步的互作实验表明,ArMYB89蛋白在体内外都能与Ar SGT1相互作用。在烟草中过量表达ArMYB89可以提高转基因植株的花青素含量。综上所述,本研究在获得了红花槭全基因组序列的基础上,联合转录组和代谢组分析,明确了红花槭叶片的呈色机理,其叶片呈红色的主要原因在于花青素的大量积累。对调控红花槭中花青素合成的MYB基因家族进行了全基因组分析,进一步功能研究发现,定位于细胞核上的ArMYB89在红叶中表达量显着高于绿叶,过表达该基因可以提高转基因植物的花青素含量,ArMYB89蛋白在体内外都能与Ar SGT1发生互作。本研究对深入了解红花槭叶片变色和MYB转录因子的作用机理具有启示作用,在为研究槭属树种定向改良提供特异基因资源的同时,对创新槭属物种种质资源和丰富彩叶树种的资源具有重要的理论意义和应用价值。
王苑馨[6]（2021）在《喜旱莲子草DMNT合成途径关键TPS的鉴定和功能研究》文中研究说明入侵杂草喜旱莲子草Alternanthera philoxeroides,是原产南美洲的苋科（Amaranthaceae）莲子草属（Alternanthera）的宿根草本植物,目前广泛蔓延在北纬32度至南纬38度的湿润陆地上,造成严重经济及生态问题。莲草直胸跳甲Agasicles hygrophila（Coleoptera:Chrysomelidae）,以下简称“跳甲”,是自南美引入、专食喜旱莲子草的优良天敌。跳甲对喜旱莲子草具有高度寄主专一性,是研究专食性昆虫与寄主相互作用的优良模型。前期研究表明,寄主挥发物（E）-4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯（（E）-4,8-dimethyl-1,3,7-nonatriene,DMNT）能够显着吸引莲草直胸跳甲,且跳甲可利用该挥发物将寄主和非寄主植物区分开,是跳甲定向、定位和取食寄主喜旱莲子草的重要线索。萜类合酶（terpene synthase,TPS）作为DMNT合成中重要的关键酶,是了解专食性昆虫选择、适应寄主以及寄主植物防御的重要突破口。本研究利用喜旱莲子草各组织混合样本转录组数据,对喜旱莲子草DMNT合成关键萜类合酶基因ApTPSs进行了筛选和鉴定,并明确了其在专食性莲草直胸跳甲与寄主喜旱莲子草互作中的功能,从植物萜类挥发物代谢角度阐明了专食性莲草直胸跳甲与寄主喜旱莲子草相互作用机制。本文主要研究结果如下:1.首先,通过调查莲草直胸跳甲取食喜旱莲子草叶片的短期行为,对触摸和取食行为进行了时间划定,随后利用qPCR分析了候选7条ApTPSs片段在跳甲接触5 min、取食1 h和机械损伤下喜旱莲子草叶片中的相对表达量及损伤后随时间推移变化的表达情况,发现跳甲的短期接触即可诱导ApTPS10、ApTPS12、ApTPS16和ApTPS19的上调表达;取食强烈诱导7条候选ApTPSs的上调表达,而机械损伤状态下,候选7条ApTPSs表现出相对较弱的延迟上调表达。结合前期跳甲取食诱导和机械损伤诱导下DMNT的挥发量变化以及TPS基因诱导表达的特性,进一步筛选了DMNT合成相关ApTPSs。2.拼接并克隆了4条ApTPSs基因:ApTPS10、ApTPS15、ApTPS19和ApTPS35。对候选ApTPSs进行生物信息学分析,发现均为TPS-g家族成员,催化非环化萜类的形成,符合DMNT合成相关萜类合酶特征。采用原核表达的方式,对4条重组蛋白的最佳诱导条件进行了摸索,并利用SPME和GC-MS,体外确定了ApTPSs催化的产物成分,初步确定4个ApTPSs的催化功能。其中,ApTPS15为双功能酶,除催化DMNT前体橙花叔醇的形成外,还催化芳樟醇的形成。ApTPS10、ApTPS19和ApTPS35均催化芳樟醇的形成。3.利用qPCR对4个ApTPSs进行组织表达分析,发现ApTPS15在喜旱莲子草叶片中相对表达量最高,而ApTPS19在喜旱莲子草各组织的相对表达量差别不大。进一步构建ApTPSs-EGFP融合表达载体,采用烟草瞬时表达系统,对ApTPSs进行亚细胞定位分析发现,ApTPS10定位在质体中,ApTPS15、ApTPS19和ApTPS15均定位在胞质中。ApTPS15的亚细胞区位符合DMNT生物合成相关萜类合酶的亚细胞定位。4.为研究ApTPS15在莲草直胸跳甲和喜旱莲子草相互作用中的贡献,构建了ApTPSs的过表达载体,利用模式植物拟南芥遗传转化系统,获得了过表达ApTPS15拟南芥株系,并将过表达ApTPS19拟南芥株系作为对比。过表达ApTPS15拟南芥株系叶片蜷缩偏小,叶片中ApTPS15的表达量是野生型的2倍以上;而过表达ApTPS19拟南芥与野生型差别不大,ApTPS15的表达量中可达到野生型的8倍以上。莲草直胸跳甲的行为选择试验表明,相对于野生型拟南芥,雌性成虫对于过表达ApTPS15拟南芥株系表现出明显的偏好性,而对于过表达ApTPS19拟南芥株系无明显偏好。该结果表明,在拟南芥中ApTPS15的表达能够影响跳甲雌性成虫的行为选择。5.最后,我们构建了pGR107-ApTPS15RNAi载体,利用VIGS技术,诱导喜旱莲子草ApTPS15沉默。ApTPS15沉默植株表现出橙花叔醇丰度的降低,同时也在个别植株出现其他萜类挥发物丰度升高的现象。莲草直胸跳甲雌性成虫更倾向于选择对照植株,而非ApTPS15沉默植株。该结果进一步证明ApTPS15是调控喜旱莲子草DMNT前体橙花叔醇合成的萜类合酶。综上所述,ApTPS15为编码喜旱莲子草DMNT前体橙花叔醇合成的萜类合酶基因,其表达变化能够显着改变喜旱莲子草叶片中橙花叔醇的含量,进而影响莲草直胸跳甲雌性成虫的行为选择。该结果有助于增强对专食性昆虫与寄主植物关系的理解。
周春艳[7]（2021）在《转录组和代谢组联合分析低温胁迫对天麻生长影响及其SOD和GS基因克隆与功能鉴定》文中认为天麻（Gastrodia elata）是与真菌共生的异养多年生草本植物,也是一种名贵传统中药材。天麻素和4-羟基苯甲醇是天麻的主要药效成分,具有防治老年痴呆、阿尔兹海默症、抑郁症、中风以及改善记忆等功效。由于天麻营养丰富,是目前备受青睐的保健食品。近年来,随着生态环境不断破坏和人工采挖,野生天麻资源减少或濒临灭绝。目前天麻供不应求,人工栽培天麻将成为满足市场需求的唯一有效途径。气候条件影响天麻生长发育,温度是影响天麻生长的关键因子之一,影响到栽培天麻产量、品质和分布。长时间的低温胁迫会使天麻出现黑斑,严重时会腐烂坏死。然而,关于低温对天麻生长发育影响的生理分子机制尚未见报道。本研究以不同温度下生长的天麻为研究对象,利用转录组和代谢组联合分析研究不同温度条件下天麻基因表达水平和体内代谢物成分变化,从差异代谢物中寻找关键基因差异表达情况,推断不同温度对天麻生长发育规律的影响,并对差异表达基因超氧化物歧化酶（SOD）和谷氨酰胺合成酶（GS）基因进行克隆与功能鉴定。研究结果为提高天麻的产量和品质,培育抗寒天麻新品种提供理论依据。主要获得以下结果:1、本研究以13℃母麻（NS）、23℃母麻（TB）和23℃箭麻（SS）为实验材料,进行转录组和代谢组联合分析阐明温度对天麻生长发育的调控。转录组分析共获得126787个Unigene,注释到6大数据库的Unigene数有59501个,占总Unigene数的46.93%;基于显着差异表达的阈值|log2（变化倍数）|≥1且（P<0.05）,在NS-vs-SS、NS-vs-TB和SS-vs-TB中分别有17201、17162和10322个差异表达基因（DEGs）。KEGG通路富集分析表明差异表达基因主要参与代谢途径、次生代谢产物的生物合成和RNA转运等途径。代谢组分析共检测到437个代谢物,其中NS-vs-SS、NS-vs-TB和SS-vs-TB分别获得200、204和87个含量差异代谢物,其中分别有52、51和34个代谢产物含量上调,148、153和53个代谢物含量下调。这些差异物分布于糖醇类、氨基酸、有机酸、脂质类、核苷酸、酚酸类和维生素7类物质中。代谢组数据分析表明,在低温下,天麻母麻中大多数的糖醇类代谢物、氨基酸及其衍生物含量水平下调,为箭麻生长提供的营养物质少,仅能维持自生的生命活动,不利于天麻生长;而大多数为脂质、有机酸、核苷酸及其衍生物和酚酸类代谢物含量水平上调,为防止低温胁迫脂质抗氧化和酚酸次生代谢清除ROS而增加,有机酸和核苷酸新陈代谢减缓而积累。两组学联合分析发现代谢物的含量与合成酶基因表达水平呈正相关,而与分解酶基因表达水平呈负相关。4℃母麻（FS）、NS、TB和SS的MDA、H2O2、GSH和淀粉含量常规分析结果表明随温度的降低天麻中MDA、H2O2和GSH含量增加,而淀粉含量降低。2、基于转录组数据分析,筛选出显着差异表达的超氧化物歧化酶（SOD）基因,找出CDS序列,通过RACE-PCR技术扩增出SOD基因全长序列为720bp,编码239个氨基酸残基。构建天麻SOD基因的原核表达载体,原核表达分析表明SOD为可溶性蛋白,其分子量47.4 k Da。酶活分析表明SOD为金属酶,本研究中SOD最适温度为60℃,热稳定较好,最适p H为6.0,不同金属离子对SOD酶活影响不同,且高浓度的金属离子比低浓度对SOD的酶活影响大。构建了天麻SOD基因的真核过表达载体,通过农杆菌法转入拟南芥sod突变体中,验证基因功能。通过农杆菌法转染蜜环菌,获得转SOD基因的工程蜜环菌可以抵抗低温胁迫,提高转基因蜜环菌的抗氧化活性,为进一步培育抗寒天麻提供实验基础。3、基于转录组数据分析,筛选出显着差异表达的谷氨酰胺合成酶（GS）基因,找出CDS序列,通过RACE-PCR技术扩增出GS基因全长序列为1062 bp,编码342个氨基酸残基。构建天麻GS基因的原核表达载体,原核表达分析表明GS为可溶性蛋白,其分子量约为59.94 k Da。酶活分析表明本研究中GS最适温度为50℃,热稳定性较好,最适p H为4.0。不同金属离子对GS酶活影响不同,高浓度的金属离子比低浓度对GS的酶活影响大。构建天麻GS真核过表达载体,通过农杆菌转染蜜环菌获得转GS基因工程蜜环菌,可提高工程菌抗低温胁迫作用,推测含转GS基因蜜环菌可以促进氮同化,降低低温对天麻生长中的氧化损伤,提高天麻的产量,为培育抗寒新品种天麻提供理论依据。
郑仰辉[8]（2021）在《蜡梅冷适应基因Cpcor413pm1的原核蛋白表达及拟南芥超表达的特性研究》文中认为低温伤害对世界农业生产造成了巨大的损失,植物在抵抗低温的过程中体内会有多种具有保护功能的相关蛋白得到表达。其中COR（cold-regulation）类基因是植物冷调节基因,编码亲水性的多肽,通过形成α-螺旋的二级结构对产生脱水的细胞脂膜起到稳定作用从而使植物能够抵御一定的寒冷。已有研究表明Cpcor413pm1蛋白与植物的抗非生物胁迫能力有关。为了明确蜡梅Cpcor413pm1基因在蜡梅抗寒的过程中所形成的具体功能,本实验通过原核表达系统获得蜡梅Cpcor413pm1体外重组蛋白,并对超表达Cpcor413pm1基因的大肠杆菌进行抗逆性分析;同时,通过体外酶活实验验证Cpcor413pm1蛋白在低温和高温胁迫下对超氧化物歧化酶（SOD）的保护作用。另外,通过构建植物超表达载体转入拟南芥进行非生物胁迫功能分析。最终,希望通过对Cpcor413pm1基因功能的研究,加深对COR413基因家族功能的认识。研究结果如下:（1）在构建的蜡梅花c DNA文库的基础上,通过PCR技术扩增出具有完整开放阅读框ORF（Open Reading Frame）的蜡梅冷适应基因的c DNA全长序列,命名为Cpcor413pm1（GenBank accession number:DQ359747）。该基因c DNA包括一个含有606碱基对,编码201个氨基酸的开放阅读框,编码蛋白的预测分子量为22.69 kDa。含101个疏水氨基酸,占氨基酸总数的50.25%,41个极性氨基酸,19个碱性氨基酸,12个酸性氨基酸,理论分子质量为22.69 kDa,预测等电点为9.55,半衰期为30h,不稳定系数23.59,可以推测其为稳定的蛋白质。（2）将蜡梅Cpcor413pm1基因成功构建到原核表达载体pET32a（+）中,并转化到宿主大肠杆菌BL21（DE3）Chemically Cell中进行表达,用温度为37℃,诱导剂IPTG的诱导浓度为1.0mM,诱导时间为6 h的条件表达融合蛋白。其经过SDS-PAGE电泳检测证明该融合蛋白为可溶性蛋白,且蛋白分子量值为41 kDa,与预期值大小一致。（3）运用Ni2+亲和层析柱技术纯化Cpcor413pm1蛋白,经SDS-PAGE电泳检测,结果显示纯化的特异条带约在41 kDa处。（4）通过体外测定蜡梅Cpcor413pm1蛋白在低温和高温胁迫下对超氧化物歧化酶（SOD）的保护作用,证实了SOD酶在蜡梅Cpcor413pm1蛋白保护下能够在低温和高温胁迫下保持酶的活性。（5）对转入Cpcor413pm1基因的大肠杆菌进行点板实验和的生长曲线分析,其实验结果表明,Cpcor413pm1蛋白能够响应低温、高温、高盐、干旱胁迫,该蛋白的过表达能提高大肠杆菌在低温、高温、高盐、干旱等非生物胁迫条件下的耐受性。（6）构建pCAMBIA2301G-Cpcor413pm1植物超表达载体,通过农杆菌介导的花序侵染法转化拟南芥,获得转基因株系。通过qRT-PCR检测选出表达量高、中、低三个株系进行表型观察和非生物胁迫实验。各表型指标显示,Cpcor413pm1基因过表达并未显着影响拟南芥植株生长发育的过程。在逆境胁迫中,通过观察植株的生长状况及测量植株的叶绿素、丙二醛含量,证明了Cpcor413pm1转基因拟南芥的抗寒、抗干旱、抗高盐能力强于野生型拟南芥。综上所述,Cpcor413pm1基因能在植物的抗寒、抗旱、抗高盐等非生物胁迫方面起作用。
李珊[9]（2021）在《岷江百合几丁质酶基因LrCHI2响应尖孢镰刀菌的机制研究》文中提出岷江百合（Lilium regale Wilson）是我国特有的野生品种,对引起百合根腐病的主要致病菌尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）具有极强的抗性,是培育百合抗病品种及研究百合抗病分子机理的重要种质资源。本研究前期对接种尖孢镰刀菌后的岷江百合进行了转录组测序,并筛选出一个由尖孢镰刀菌诱导表达的病程相关蛋白（pathogenesis-related protein,PR）基因,LrCHI2。本研究深入认识LrCHI2的功能。分析LrCHI2的表达特性以及亚细胞定位;表达并纯化获得LrCHI2的原核重组蛋白,分析其对几种病原真菌的抑制活性;在模式植物烟草中过表达LrCHI2以验证其在尖孢镰刀菌侵染过程中的作用。WRKY转录因子常作为PR基因的上游调控因子在植物的防御系统中发挥作用。于是进一步克隆了LrCHI2的启动子序列并研究了岷江百合LrWRKY2对LrCHI2的转录调控。本论文的研究工作及得到的主要结果如下:1、基于对尖孢镰刀菌侵染后百合的转录组测序分析结果获得一个岷江百合几丁质酶基因序列并命名为LrCHI2,通过PCR从岷江百合cDNA中克隆出LrCHI2。LrCHI2基因全长cDNA为1313bp,包含一个933 bp的开放读码框,编码含310个氨基酸的蛋白质。qRT-PCR结果表明,LrCHI2在根中高表达,在其它植物器官中低水平表达;LrCHI2的表达水平受四种信号分子乙烯利（ethephon,ETH）、水杨酸（salicylic acid,SA）、茉莉酸（jasmonic acid,JA）和过氧化氢（hydrogen peroxide,H2O2）处理的诱导;LrCHI2的表达水平还受尖孢镰刀菌侵染的诱导。2、构建pBIN m-gfp5-ER-LrCHI2亚细胞定位载体,转化洋葱表皮细胞,共培养后在激光共聚焦显微镜下观察到LrCHI2-GFP融合蛋白定位于细胞壁。构建p ET-32a-LrCHI2原核表达载体,在大肠杆菌BL21（DE3）中表达LrCHI2蛋白。抑菌实验结果表明,LrCHI2的原核重组蛋白明显抑制尖孢镰刀菌、胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporoides）、茄腐镰刀菌（F.solani）、人参链格孢（Alternaria panax）等病原真菌的生长。构建植物超表达载体p CAMBIA2300s-LrCHI2,转入到烟草中过表达,获得T2代转基因烟草,qRT-PCR结果表明LrCHI2在T2代转基因烟草株系中稳定表达,叶片接种实验表明LrCHI2转基因烟草对尖孢镰刀菌具有很强抗性。3、通过染色体步移克隆获得LrCHI2的启动子,通过顺式作用元件分析表明该启动子含有顺式作用元件W-box。凝胶阻滞实验（Electrophoretic mobility shift assay,EMSA）结果表明LrWRKY2重组蛋白能够在体外与包含W-box的LrCHI2启动子片段结合。进一步构建诱饵载体pAbAi-pLrCHI2和猎物载体pGADT7AD-LrWRKY2进行酵母单杂交实验,结果表明LrWRKY2对LrCHI2启动子具有反式激活作用。此外,构建LrCHI2启动子与葡萄糖苷酸酶（β-glucuronidase,GUS）报告基因融合表达载体,分别转入LrWRKY2转基因烟草以及野生型烟草中。GUS荧光定量分析结果表明,LrCHI2启动子响应几种非生物胁迫（盐胁迫、镉胁迫和伤胁迫）、生物胁迫（尖孢镰刀菌、茄腐镰刀菌和稻黑胞霉（Nigrospora oryzae）侵染）及植物激素MeJA的处理。此外,与单表达LrCHI2启动子的转基因烟草相比,共表达LrCHI2启动子与LrWRKY2的转基因烟草的GUS活性显着提高,表明LrWRKY2能够正调控LrCHI2启动子的活性。综上所述,LrCHI2响应植物信号分子处理和尖孢镰刀菌侵染。原核重组蛋白LrCHI2对包括尖孢镰刀菌在内的几种病原真菌具有明显的抑制活性。LrCHI2基因在烟草中过量表达赋予了烟草对尖孢镰刀菌的抗性。此外,MeJA处理、生物和非生物胁迫都能增强LrCHI2启动子的活性。LrWRKY2正调控LrCHI2的转录活性。以上结果表明LrCHI2受WRKY转录因子的调控在岷江百合对尖孢镰刀菌的防御中发挥着重要作用。
徐焕焕[10]（2021）在《番茄E3泛素连接酶SlSL1功能分析》文中指出植物的泛素化途径在其生长发育和对内外环境信号应答调控中发挥重要作用。泛素分子在多种酶的协作下结合于靶标蛋白,实现泛素化标记蛋白质的降解或修饰。其中决定靶标蛋白特异性的E3连接酶以复合物或单亚基形式发挥泛素连接功能,对番茄单亚基形式E3连接酶的研究相对较少。番茄SlSL1（Solanum lycopersicum SINA-like 1）基因具有RING型E3连接酶结构域,但对其泛素连接酶活性及生物学功能尚未分析。本文通过克隆番茄SlSL1基因、构建原核重组表达质粒,并利用诱导表达、亲和吸附纯化SlSL1重组蛋白,以此进行SlSL1的体外泛素化活性检测。SDS-PAGE电泳及蛋白印迹结果显示,由所构建番茄SlSL1原核表达质粒纯化获得了预期SlSL1重组蛋白;体外泛素化反应中SlSL1形成多聚化泛素条带,表明其可以进行自身泛素化,具有E3泛素连接酶功能。通过构建pBI121-SlSL1过表达遗传转化载体,利用农杆菌介导遗传转化将具有E3连接酶活性的SlSL1基因在番茄中过量表达。经定量PCR检测,获得了SlSL1过表达番茄株系。与野生型相比,转基因幼苗的生长发育未显示明显差异。但接种丁香假单胞菌番茄致病变种（Pseudomonas syringae pv.tomato）菌株Pst DC3000后,SlSL1过表达植株对病原菌的抗性显着高于野生型,叶片病斑减少,病原菌增殖数目明显降低,提示SlSL1通过泛素化途径参与番茄抗病防御反应。为进一步探讨SlSL1所调控靶标蛋白,利用番茄多种组织所构建酵母双杂交文库,对SlSL1互作蛋白进行筛选。初步获得6个候选靶标序列:polyubiquitin、ubiquitin-60S ribosomal protein L40、IQ-DOMAIN 14-like、glycine-rich protein 2-like、glycosyltransferase、hsp70-Hsp90 organizing protein 2,为探讨番茄SlSL1基因作用机制提供了线索。此外,SlSL1过表达对番茄植株生长、开花时间、果实重量、大小,以及果实和种子发育均未有明显不利影响,但可增强番茄对病原细菌的防御能力,具有遗传改良应用潜力。因此本工作为深入研究番茄E3泛素连接酶SlSL1的免疫应答调控功能及其作用机制奠定了重要基础,也为番茄抗病遗传改良提供了新的基因资源。
二、转基因植物表达重组蛋白的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、转基因植物表达重组蛋白的研究进展（论文提纲范文）
（1）SikCDPK1基因响应非生物逆境的功能初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文符号缩略词表 |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 钙依赖性蛋白激酶(CDPK)概述 |
| 1.2 EF-hand研究进展 |
| 1.2.1 EF-hand基序概述 |
| 1.2.2 EF-hand研究进展 |
| 1.2.3 体外定点突变技术 |
| 1.3 大肠杆菌表达系统对基因表达的影响 |
| 1.3.1 大肠杆菌表达系统 |
| 1.3.2 大肠杆菌表达系统对基因表达的影响 |
| 1.4 CDPKs参与调控植物的生长发育 |
| 1.5 CDPKs响应非生物逆境胁迫的研究进展 |
| 1.5.1 CDPKs响应干旱胁迫 |
| 1.5.2 CDPKs响应低温胁迫 |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 第二章 SikCDPK1 基因的定点突变、原核表达及纯化 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌种、载体与试剂 |
| 2.1.2 主要的仪器设备 |
| 2.1.3 本章所用到的引物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 SikCDPK1基因的序列比对及蛋白结构预测 |
| 2.2.2 SikCDPK1基因EF-hand的定点突变 |
| 2.2.3 原核表达载体的构建 |
| 2.2.4 重组质粒转化表达菌株 |
| 2.2.5 重组蛋白的诱导表达 |
| 2.2.6 重组蛋白的可溶性表达检测及纯化 |
| 2.2.7 重组蛋白Ca~(2+)结合能力及酶活性的检测 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 SikCDPK1基因的序列比对及蛋白结构预测 |
| 2.3.2 SikCDPK1基因EF-hand的定点突变 |
| 2.3.3 原核表达载体的构建及鉴定 |
| 2.3.4 重组蛋白的诱导表达及可溶性检测 |
| 2.3.5 重组蛋白的纯化、Ca~(2+)结合能力及酶活性检测 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 第三章 SikCDPK1基因响应非生物逆境的功能分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 菌种、载体与试剂 |
| 3.1.3 主要的仪器设备 |
| 3.1.4 本章所用到的引物 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 转基因烟草的遗传转化及分子鉴定 |
| 3.2.2 不同基因型烟草生长发育的表型观察及分析 |
| 3.2.3 干旱和低温胁迫处理 |
| 3.2.4 抗逆相关生理指标的测定 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 转基因烟草的遗传转化及分子鉴定 |
| 3.3.2 不同基因型烟草生长发育的表型观察及分析 |
| 3.3.3 转基因烟草的抗旱性分析 |
| 3.3.4 转基因烟草的抗寒性分析 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第四章 结论与展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 创新点 |
| 4.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表 |
（2）杨梅FLSs和F3’5’H调控杨梅素生物合成的机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略语表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 黄酮醇及其生物合成 |
| 1.1.1 黄酮醇结构组成 |
| 1.1.2 黄酮醇的功能 |
| 1.1.3 黄酮醇生物合成途径 |
| 1.2 参与黄酮醇合成的植物ODD蛋白研究进展 |
| 1.2.1 黄烷酮3-羟化酶(F3H) |
| 1.2.2 黄酮醇合成酶(FLS) |
| 1.3 参与黄酮醇合成的植物P450 蛋白研究进展 |
| 1.3.1 类黄酮3'-羟化酶(F3'H) |
| 1.3.2 类黄酮3'5'-羟化酶(F3'5'H) |
| 1.4 杨梅素在植物种的分布及生物合成研究进展 |
| 1.4.1 杨梅素的生物活性 |
| 1.4.2 杨梅素在植物中的分布 |
| 1.4.3 杨梅素生物合成研究进展 |
| 1.5 研究目标与内容 |
| 1.6 技术路线图 |
| 2 杨梅黄酮醇和花色苷的检测分析 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 杨梅材料 |
| 2.1.2 黄酮醇和花色苷标准品 |
| 2.1.3 杨梅组织提取物的制备 |
| 2.1.4 杨梅组织提取物总酚和总黄酮含量的测定 |
| 2.1.5 黄酮醇和花色苷HPLC分析 |
| 2.1.6 数据分析 |
| 2.2 结果分析 |
| 2.2.1 杨梅组织总酚总黄酮含量变化 |
| 2.2.2 杨梅组织黄酮醇含量变化 |
| 2.2.3 杨梅组织花色苷含量变化 |
| 2.3 讨论 |
| 3 杨梅素合成关键基因鉴定及表达分析 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 杨梅组织RNA提取 |
| 3.1.3 转录组测序 |
| 3.1.4 黄酮醇合成支路相关基因鉴定 |
| 3.1.5 杨梅素合成相关基因鉴定及表达模式分析 |
| 3.1.6 实时荧光定量PCR分析 |
| 3.2 结果分析 |
| 3.2.1 黄酮醇合成支路相关基因鉴别 |
| 3.2.2 黄酮醇合成支路相关基因表达分析 |
| 3.2.3 杨梅素合成关键基因的鉴别及表达量分析 |
| 3.3 讨论 |
| 4 杨梅FLS与F3H基因鉴别与功能研究 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 进化树构建和序列比对 |
| 4.1.3 基因全长序列克隆和表达载体构建 |
| 4.1.4 杨梅FLS与F3H蛋白重组及纯化 |
| 4.1.5 类黄酮标准品 |
| 4.1.6 体外酶活检测 |
| 4.1.7 杨梅FLS与F3H蛋白催化相对活力测定 |
| 4.1.8 杨梅FLS与F3H酶催化反应动力学研究 |
| 4.1.9 分子对接 |
| 4.1.10 杨梅FLS烟草异源转基因 |
| 4.1.11 转基因烟草黄酮醇和花色苷HPLC或LC-MS/MS分析 |
| 4.1.12 转基因烟草Q-PCR分析 |
| 4.1.13 数据分析及处理 |
| 4.2 结果分析 |
| 4.2.1 杨梅FLS与F3H家族进化树及蛋白结构分析 |
| 4.2.2 杨梅FLS底物催化活性及偏好性分析 |
| 4.2.3 杨梅F3H底物催化活性及偏好性分析 |
| 4.2.4 杨梅FLS烟草异源过表达 |
| 4.3 讨论 |
| 5 杨梅F3'5'H与F3'H基因鉴别与功能研究 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 植物材料 |
| 5.1.2 进化树构建和序列比对 |
| 5.1.3 基因全长序列克隆和载体构建 |
| 5.1.4 类黄酮标准品 |
| 5.1.5 杨梅MrF3'5'H与MrF3'H真核表达 |
| 5.1.6 杨梅MrF3'5'H与MrF3'H催化产物LC-MS分析 |
| 5.1.7 杨梅MrF3'5'H与MrF3'H相对催化活力测定 |
| 5.1.8 杨梅MrF3'5'H蛋白催化反应动力学研究 |
| 5.1.9 烟草异源转基因 |
| 5.1.10 转基因烟草黄酮醇和花色苷HPLC或LC-MS/MS分析 |
| 5.1.11 转基因烟草Q-PCR分析 |
| 5.1.12 数据分析及处理 |
| 5.2 结果分析 |
| 5.2.1 杨梅P450家族进化树及蛋白结构分析 |
| 5.2.2 杨梅P450蛋白底物催化活性分析 |
| 5.2.3 杨梅F3'5'H底物偏好性分析 |
| 5.2.4 杨梅F3'5'H烟草异源过表达 |
| 5.3 讨论 |
| 6 其他植物ODD和P450蛋白活性分析 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.1.1 植物材料 |
| 6.1.2 类黄酮标准品 |
| 6.1.3 基因全长序列克隆和载体构建 |
| 6.1.4 梅FLS与F3H原核表达 |
| 6.1.5 杨梅MrF3'5'H与MrF3'H真核表达 |
| 6.1.6 分子对接 |
| 6.1.7 数据分析 |
| 6.2 结果分析 |
| 6.2.1 FLS和F3H蛋白活性分析化 |
| 6.2.2 F3'5'H和F3'H蛋白活性分析 |
| 6.3 讨论 |
| 7 小结与展望 |
| 7.1 小结 |
| 7.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
（3）马铃薯中与胁迫相关StMAPKs基因的分离及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 缩略语表 Abbreviations |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物MAPK级联途径 |
| 1.1.1 植物MAPK级联途径组成 |
| 1.1.2 植物中的MAPKKK |
| 1.1.3 植物中的MAPKK |
| 1.1.4 植物中的MAPK |
| 1.2 植物MAPK级联途径参与植物激素信号转导 |
| 1.2.1 乙烯信号转导 |
| 1.2.2 脱落酸信号转导 |
| 1.2.3 茉莉酸信号转导 |
| 1.2.4 水杨酸信号转导 |
| 1.2.5 生长素信号转导 |
| 1.2.6 油菜素甾醇信号转导 |
| 1.2.7 赤霉素信号转导 |
| 1.3 MAPK级联参与调控植物非生物胁迫 |
| 1.3.1 盐胁迫 |
| 1.3.2 干旱胁迫 |
| 1.3.3 温度胁迫 |
| 1.3.4 氧化应激响应 |
| 1.3.5 臭氧胁迫 |
| 1.3.6 创伤响应 |
| 1.3.7 重金属胁迫 |
| 1.4 植物中磷酸化蛋白组学研究的应用 |
| 1.5 研究内容及目的意义 |
| 1.5.1 研究内容 |
| 1.5.2 研究目的意义 |
| 第二章 马铃薯StMAPKs的差异表达分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 生化试剂 |
| 2.1.2 培养基 |
| 2.1.3 引物 |
| 2.1.4 植物材料及处理 |
| 2.1.4.1 非生物胁迫和植物激素处理 |
| 2.1.4.2 马铃薯植株不同组织器官的取样 |
| 2.1.5 试验方法 |
| 2.1.5.1 植物总RNA的提取 |
| 2.1.5.2 反转录cDNA第一链的合成 |
| 2.1.5.3 实时荧光定量qRT-RCR分析StMAPKs表达谱 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 非生物胁迫及植物激素处理下的StMAPKs差异表达分析 |
| 2.2.1.1 脱落酸处理 |
| 2.2.1.2 干旱处理 |
| 2.2.1.3 乙烯处理 |
| 2.2.1.4 赤霉素处理 |
| 2.2.1.5 H_2O_2处理 |
| 2.2.1.6 高温处理 |
| 2.2.1.7 生长素处理 |
| 2.2.1.8 茉莉酸处理 |
| 2.2.1.9 低温处理 |
| 2.2.1.10 NaCl处理 |
| 2.2.1.11 PEG处理 |
| 2.2.1.12 水杨酸处理 |
| 2.2.2 不同组织器官中的StMAPKs差异表达分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 马铃薯StMAPK3 抗盐和渗透胁迫相关的功能研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 生化试剂 |
| 3.1.2 培养基 |
| 3.1.3 引物 |
| 3.1.4 植物材料及处理 |
| 3.1.5 试验方法 |
| 3.1.5.1 植物总RNA的提取 |
| 3.1.5.2 反转录cDNA第一链的合成 |
| 3.1.5.3 目的基因PCR扩增 |
| 3.1.5.4 PCR反应产物琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.1.5.5 回收目的片段 |
| 3.1.5.6 植物表达载体构建 |
| 3.1.5.7 马铃薯StMAPK3 的亚细胞定位 |
| 3.1.5.8 酵母双杂试验 |
| 3.1.5.9 双分子荧光互补试验 |
| 3.1.5.10 马铃薯遗传转化及鉴定 |
| 3.1.5.11 盐和渗透胁迫条件下生理指标分析 |
| 3.1.5.12 盐和渗透胁迫条件下生长指标和气孔的分析 |
| 3.1.5.13 盐和渗透胁迫条件下光合指标的分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 马铃薯中与渗透和盐胁迫相关的StMAPK3 基因的分离 |
| 3.2.2 载体的构建 |
| 3.2.2.1 过表达载体pCPB-StMAPK3 的构建 |
| 3.2.2.2 RNA干扰表达载体pCPB121-miRmapk3 的构建 |
| 3.2.2.3 亚细胞定位载体pCAM35s-GFP-StMAPK3 的构建 |
| 3.2.2.4 酵母双杂表达载体的构建 |
| 3.2.2.5 双分子荧光互补(BiFC)表达载体的构建 |
| 3.2.3 StMAPK3 的亚细胞定位 |
| 3.2.4 酵母双杂交筛选与StMAPK3 互作蛋白 |
| 3.2.4.1 诱饵载体pGBKT7-StMAPK3 毒性与自激活检测 |
| 3.2.4.2 StMAPK3 诱饵蛋白筛选马铃薯cDNA文库及分析 |
| 3.2.4.3 酵母双杂交验证蛋白互作 |
| 3.2.5 双分子荧光互补试验(BiFC)验证结果 |
| 3.2.6 转基因马铃薯的植株的获得与检测 |
| 3.2.7 NaCl、甘露醇和PEG处理下的生理指标分析 |
| 3.2.8 NaCl、甘露醇和PEG处理下的光合指标分析 |
| 3.2.9 NaCl、甘露醇和PEG处理下的生长指标及气孔分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 马铃薯StMAPK11 抗旱胁迫相关的功能研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 生化试剂 |
| 4.1.2 培养基 |
| 4.1.3 引物 |
| 4.1.4 植物材料及处理 |
| 4.1.4.1 马铃薯材料及处理 |
| 4.1.4.2 烟草材料及处理 |
| 4.1.4.3 拟南芥材料及处理 |
| 4.1.5 试验方法 |
| 4.1.5.1 植物总RNA的提取 |
| 4.1.5.2 反转录cDNA第一链的合成 |
| 4.1.5.3 目的基因PCR扩增 |
| 4.1.5.4 PCR反应产物琼脂糖凝胶电泳 |
| 4.1.5.5 回收目的片段 |
| 4.1.5.6 植物表达载体构建 |
| 4.1.5.7 马铃薯StMAPK11 的亚细胞定位 |
| 4.1.5.8 原核表达马铃薯StMAPK11 蛋白 |
| 4.1.5.9 原核表达马铃薯StMAPK11 重组蛋白抗体制备 |
| 4.1.5.10 Western blot |
| 4.1.5.11 酵母双杂试验 |
| 4.1.5.12 双分子荧光互补试验 |
| 4.1.5.13 马铃薯遗传转化及鉴定 |
| 4.1.5.14 烟草遗传转化及鉴定 |
| 4.1.5.15 拟南芥遗传转化及鉴定 |
| 4.1.5.16 干旱胁迫条件下马铃薯植株生理指标分析 |
| 4.1.5.17 干旱胁迫条件下烟草的生理指标分析 |
| 4.1.5.18 干旱胁迫条件下拟南芥的生理指标分析 |
| 4.1.5.19 干旱胁迫条件下马铃薯植株的生物量和生长指标分析 |
| 4.1.5.20 干旱胁迫条件下光合指标的分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 马铃薯中与渗透和盐胁迫相关的StMAPK11 基因的分离 |
| 4.2.2 载体的构建 |
| 4.2.2.1 过表达载体pCPB-StMAPK11 的构建 |
| 4.2.2.2 RNA干扰表达载体pCPB121-miRmapk11 的构建 |
| 4.2.2.3 拟南芥和烟草表达载体pART-CAM-StMAPK11 的构建 |
| 4.2.2.4 亚细胞定位载体pCAM35s-GFP-StMAPK11 的构建 |
| 4.2.2.5 原核重组表达载体pET28b-StMAPK11 的构建 |
| 4.2.2.6 酵母双杂表达载体pGBKT7-StMAPK11 的构建 |
| 4.2.2.7 双分子荧光互补(BiFC)试验表达载体的构建 |
| 4.2.3 原核表达StMAPK11 及抗体制备 |
| 4.2.3.1 原核重组StMAPK11 蛋白表达 |
| 4.2.3.2 间接ELISA法检测兔抗StMAPK11 抗血清效价 |
| 4.2.3.3 兔抗StMAPK11 抗血清的Western blot鉴定 |
| 4.2.4 StMAPK11 的亚细胞定位 |
| 4.2.5 酵母双杂交筛选与StMAPK11 互作蛋白 |
| 4.2.5.1 诱饵载体pGBKT7-StMAPK11 毒性与自激活检测 |
| 4.2.5.2 StMAPK11 诱饵蛋白筛选马铃薯cDNA文库及分析 |
| 4.2.5.3 酵母双杂交验证蛋白互作 |
| 4.2.6 双分子荧光互补试验(BiFC)验证结果 |
| 4.2.7 转基因马铃薯植株的获得与检测 |
| 4.2.8 转基因烟草植株的获得与检测 |
| 4.2.9 转基因拟南芥植株获得与检测 |
| 4.2.10 干旱胁迫下的生理指标分析 |
| 4.2.10.1 干旱胁迫下马铃薯植株的生理指标分析 |
| 4.2.10.2 干旱胁迫下烟草植株的生理指标分析 |
| 4.2.10.3 干旱胁迫下拟南芥植株的生理指标分析 |
| 4.2.11 干旱胁迫下的光合指标分析 |
| 4.2.12 干旱胁迫下的生长指标及生物量分析 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 马铃薯StMAPK3 磷酸化修饰定量蛋白组学分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 植物材料 |
| 5.1.2 试验方法 |
| 5.1.2.1 总蛋白提取 |
| 5.1.2.2 蛋白质检 |
| 5.1.2.3 蛋白酶解 |
| 5.1.2.4 磷酸化修饰多肽富集 |
| 5.1.2.5 液质检测 |
| 5.1.2.6 蛋白质的鉴定和定量 |
| 5.1.2.7 蛋白质和差异表达蛋白质的功能分析 |
| 5.1.2.8 基序分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 磷酸化蛋白质组学数据质控与鉴定 |
| 5.2.2 磷酸化蛋白功能注释 |
| 5.2.3 磷酸化修饰位点分析 |
| 5.2.4 磷酸化蛋白差异分析 |
| 5.2.5 差异磷酸化蛋白生物信息学分析 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 附录3 |
| 附录4 |
| 附录5 |
| 附录6 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 在读博士期间发表论文 |
| 导师简介 |
（4）小麦阿拉伯木聚糖阿魏酸酰基转移酶基因TaBAHD的克隆与功能鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 常用缩略语中英文对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 小麦品质重要性状及其影响因素 |
| 1.2 小麦籽粒阿魏酰阿拉伯木聚糖的结构及其功能特性 |
| 1.3 小麦籽粒阿魏酰阿拉伯木聚糖与BAHD基因密切相关 |
| 1.4 小麦籽粒TaBAHD基因的克隆及功能标记开发 |
| 1.5 表达分析、基因编辑技术在农业中的应用 |
| 1.6 研究意义及目的 |
| 1.7 技术路线 |
| 第2章 小麦TaBAHD-B1及TaBAHD-D1 基因的克隆及功能标记开发 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 小麦TaBAHD-A1、TaBAHD-B1及TaBAHD-D1基因表达模式分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 小麦TaBAHD-A1、TaBAHD-B1及TaBAHD-D1基因重组蛋白表达及条件优化 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 小麦TaBAHD-A1、TaBAHD-B1及TaBAHD-D1 基因编辑及突变体鉴定 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第6章 全文总结与展望 |
| 6.1 小麦TaBAHD-A1、TaBAHD-B1及TaBAHD-D1基因的克隆及功能标记开发 |
| 6.2 小麦TaBAHD-A1、TaBAHD-B1及TaBAHD-D1 基因表达模式分析 |
| 6.3 小麦TaBAHD-A1、TaBAHD-B1及TaBAHD-D1基因基因重组蛋白表达及表达条件优化 |
| 6.4 小麦TaBAHD-A1、TaBAHD-B1及TaBAHD-D1 基因编辑及突变体鉴定 |
| 6.5 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 2021年5月作者简历 |
（5）基于联合组学技术的红花槭叶片呈色机理分析和ArMYB89的基因功能研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 红花槭概述 |
| 1.1.1 红花槭简介 |
| 1.1.2 红花槭繁育及引种的研究进展 |
| 1.2 组学技术的简介 |
| 1.2.1 基因组学 |
| 1.2.2 转录组学 |
| 1.2.3 代谢组学 |
| 1.3 叶片中主要色素概述 |
| 1.3.1 叶绿素 |
| 1.3.2 类胡萝卜素 |
| 1.3.3 类黄酮类色素 |
| 1.4 花青素的代谢途径及转录调控 |
| 1.4.1 花青素的代谢途径 |
| 1.4.2 花青素转录调控的研究进展 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 1.6 技术路线图 |
| 第二章 红花槭的全基因组测序 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 植物材料 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 软件及其参数 |
| 2.2.4 红花槭DNA的提取和质量控制 |
| 2.2.5 Suvey预估红花槭基因组的大小 |
| 2.2.6 红花槭基因组测序 |
| 2.2.7 红花槭基因组的组装 |
| 2.2.8 红花槭基因组的注释分析 |
| 2.2.9 红花槭基因组的进化分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 红花槭基因组的Survey分析 |
| 2.3.2 红花槭基因组测序数据质控 |
| 2.3.3 红花槭基因组的组装结果 |
| 2.3.4 红花槭基因组的注释分析 |
| 2.3.5 红花槭基因组的进化分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 红花槭叶片的转录组与代谢组分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 红花槭叶片的转录组分析 |
| 3.2.2 红花槭叶片的代谢组分析 |
| 3.3 结果分析 |
| 3.3.1 红花槭叶片的转录组分析结果 |
| 3.3.2 红花槭叶片的代谢组分析结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 基于组学技术的红花槭叶片变色机理分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 植物材料 |
| 4.2.2 分析方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 红花槭中花青素的代谢机理分析 |
| 4.3.2 红花槭中叶绿素的代谢机理分析 |
| 4.3.3 红花槭中类胡萝卜素的代谢机理分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 ArMYB89基因的功能研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 ArMYB89基因的生物信息学分析 |
| 5.2.2 ArMYB89基因的克隆和功能分析 |
| 5.2.3 ArMYB89蛋白的相关实验 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 ArMYB89基因的生物信息学分析 |
| 5.3.2 ArMYB89基因的克隆和功能分析 |
| 5.3.3 ArMYB89蛋白的相关实验 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
（6）喜旱莲子草DMNT合成途径关键TPS的鉴定和功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 缩略词 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 昆虫与植物关系 |
| 1.1.1 植食性昆虫的食性特化 |
| 1.1.2 植食性昆虫物种多样性形成假说 |
| 1.2 昆虫与寄主植物互作机制 |
| 1.2.1 昆虫的寄主选择与寄主适应 |
| 1.2.2 植物虫害诱导信号转导与植物防御 |
| 1.3 专食性昆虫与寄主互作 |
| 1.3.1 鞘翅目专食性昆虫 |
| 1.3.2 莲草直胸跳甲与喜旱莲子草 |
| 1.4 植物萜类化合物 |
| 1.4.1 萜类化合物的合成 |
| 1.4.2 萜类化合物的多样性 |
| 1.4.3 萜类化合物的分类 |
| 1.4.4 低分子量萜类挥发物 |
| 1.4.5 C11、C16萜烯同系物 |
| 1.5 萜类合酶 |
| 1.5.1 萜类合酶基因家族 |
| 1.5.2 萜类合酶的催化机制 |
| 1.5.3 萜类合酶的基本结构 |
| 1.5.4 单萜合酶和倍半萜合酶 |
| 1.5.5 萜类合酶与动植物相互作用 |
| 1.6 病毒诱导的基因沉默技术 |
| 1.6.1 VIGS的发现和作用机制 |
| 1.6.2 VIGS的优势与不足 |
| 1.6.3 VIGS技术的开发与应用 |
| 1.7 本研究目的及内容 |
| 第二章 喜旱莲子草DMNT合成途径关键ApTPSs的筛选 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 被试植物 |
| 2.1.2 被试昆虫 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 莲草直胸跳甲短期取食行为调查 |
| 2.2.2 喜旱莲子草不同损伤处理 |
| 2.2.3 喜旱莲子草不同损伤处理下定量PCR内参基因的筛选 |
| 2.2.4 ApTPSs基因筛选及表达分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 候选ApTPSs基因 |
| 2.3.2 莲草直胸跳甲短期取食行为 |
| 2.3.3 昆虫接触、取食和机械损伤下叶片中内参基因的稳定性评估结果 |
| 2.3.4 健康状态下各候选ApTPSs基因的基础表达量 |
| 2.3.5 莲草直胸跳甲接触诱导候选ApTPSs表达 |
| 2.3.6 莲草直胸跳甲取食强烈诱导喜旱莲子草候选ApTPSs表达 |
| 2.3.7 机械损伤诱导候选ApTPSs低水平延迟表达 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 喜旱莲子草ApTPSs的克隆与功能验证 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 菌株 |
| 3.1.2 载体 |
| 3.1.3 试剂 |
| 3.1.4 植物材料 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 候选ApTPSs基因的克隆 |
| 3.2.2 候选ApTPSs基因的序列分析 |
| 3.2.3 候选ApTPSs基因的组织表达分析 |
| 3.2.4 候选ApTPSs基因的原核表达 |
| 3.2.5 原核表达蛋白ApTPSs酶学反应挥发物测定 |
| 3.2.6 莲草直胸跳甲对ApTPSs原核表达产物的选择 |
| 3.2.7 ApTPSs的亚细胞定位 |
| 3.2.8 拟南芥过表达ApTPSs基因 |
| 3.2.9 利用VIGS技术沉默ApTPS15 基因 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 ApTPSs的克隆 |
| 3.3.2 ApTPSs的序列分析 |
| 3.3.3 ApTPSs组织表达谱 |
| 3.3.4 ApTPSs基因的原核表达 |
| 3.3.5 ApTPSs产物测定 |
| 3.3.6 莲草直胸跳甲对ApTPSs原核表达产物的选择 |
| 3.3.7 ApTPSs的亚细胞定位 |
| 3.3.8 拟南芥过表达ApTPSs基因 |
| 3.3.9 利用VIGS技术沉默ApTPS15 基因 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 结论与展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 创新点 |
| 4.3 展望 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 附录 |
| 博士在读期间研究成果 |
| 致谢 |
（7）转录组和代谢组联合分析低温胁迫对天麻生长影响及其SOD和GS基因克隆与功能鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 天麻的研究进展 |
| 1.1.1 天麻的生活史 |
| 1.1.2 天麻的生长特性 |
| 1.1.3 天麻的栽培技术 |
| 1.1.4 天麻的药食价值 |
| 1.2 蜜环菌的研究进展 |
| 1.2.1 蜜环菌的培养技术 |
| 1.2.2 共生真菌与天麻的共生关系研究 |
| 1.3 低温胁迫对植物生长发育影响研究进展 |
| 1.3.1 植物低温胁迫与生长 |
| 1.3.2 植物低温胁迫与植物成分含量 |
| 1.3.2.1 低温胁迫对植物糖类含量的影响 |
| 1.3.2.2 低温胁迫对植物氨基酸含量的影响 |
| 1.3.2.3 低温胁迫对植物脂质含量的影响 |
| 1.3.2.4 低温胁迫对植物酚酸类含量的影响 |
| 1.3.3 植物低温胁迫与相关基因 |
| 1.3.4 植物低温胁迫与MDA、H_2O_2和GSH含量 |
| 1.4 转录组测序技术 |
| 1.4.1 转录组概况及方法 |
| 1.4.2 植物转录组RNA-seq技术研究进展 |
| 1.5 代谢组学分析技术 |
| 1.5.1 代谢组学的分析技术 |
| 1.5.2 植物低温下的代谢组学 |
| 1.5.3 植物逆境中的转录组和代谢组联合分析 |
| 1.6 超氧化物歧化酶的研究进展 |
| 1.6.1 超氧化物歧化酶的功能 |
| 1.6.2 超氧化物歧化酶歧化酶在植物逆境中的研究进展 |
| 1.7 谷氨酰胺合成酶的研究进展 |
| 1.7.1 谷氨酰胺合成酶的功能 |
| 1.7.2 谷氨酰胺合成酶在植物逆境中的研究进展 |
| 1.8 研究的目的及意义 |
| 第二章 转录组和代谢组联合分析低温胁迫对天麻生长发育的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 天麻的栽培 |
| 2.1.1.1 蜜环菌菌种与天麻种的获得 |
| 2.1.1.2 蜜环菌菌种活化与培养 |
| 2.1.1.3 蜜环菌菌材的制备 |
| 2.1.1.4 天麻的室内栽培 |
| 2.1.2 天麻样品的采集 |
| 2.1.3 天麻样品转录组测序 |
| 2.1.4 荧光定量PCR引物设计及分析 |
| 2.1.5 天麻样品代谢组检测 |
| 2.1.6 MDA(丙二醛)的测定 |
| 2.1.7 H_2O_2 的测定 |
| 2.1.8 GSH(谷胱甘肽)的测定 |
| 2.1.9 淀粉的测定 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 天麻样品观察与采集 |
| 2.2.2 转录组数据分析 |
| 2.2.2.1 转录组测序数据过滤与组装 |
| 2.2.2.2 转录组测序数据基因功能注释 |
| 2.2.2.3 转录组基因差异筛选分析 |
| 2.2.2.4 差异表达基因的GO分类和KEGG分析 |
| 2.2.2.5 关键差异基因筛选及相对表达水平荧光定量PCR分析 |
| 2.2.3 代谢组数据分析 |
| 2.2.3.1 代谢物检测与分类 |
| 2.2.3.2 代谢物相对含量差异筛选分析 |
| 2.2.4 转录组和代谢组联合分析 |
| 2.2.5 MDA(丙二醛)的测定 |
| 2.2.6 H_2O_2 的测定 |
| 2.2.7 GSH的测定 |
| 2.2.8 淀粉的测定 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 天麻超氧化物歧化酶(SOD)的克隆及分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料与仪器 |
| 3.1.2 引物设计 |
| 3.1.3 天麻总RNA 的提取及cDNA 的合成 |
| 3.1.4 巢式PCR扩增天麻SOD基因的未知片段 |
| 3.1.5 SOD未知片段的胶回收与克隆 |
| 3.1.6 SOD未知片段转化大肠杆菌并拼接 |
| 3.1.7 SOD基因全长克隆 |
| 3.1.8 SOD基因原核表达载体构建 |
| 3.1.9 SOD原核表达重组蛋白的纯化 |
| 3.1.10 SOD酶活及酶学性质的检测分析 |
| 3.1.11 SOD蛋白序列分析 |
| 3.1.12 SOD基因真核表达载体的构建 |
| 3.1.13 sod拟南芥纯化突变体的筛选 |
| 3.1.14 过表达SOD真核载体的拟南芥sod突变体转化 |
| 3.1.15 过表达SOD真核载体的蜜环菌转化 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 天麻SOD基因全长的获得 |
| 3.2.1.1 SOD未知片段的扩增与检测 |
| 3.2.1.2 SOD全长序列的拼接与扩增 |
| 3.2.2 天麻SOD基因的原核表达载体构建及重组蛋白纯化 |
| 3.2.2.1 SOD基因原核表达载体的构建及检测 |
| 3.2.2.2 SOD原核表达转化BL21 感受态诱导蛋白表达分析 |
| 3.2.2.3 SOD原核表达重组蛋白的纯化 |
| 3.2.3 天麻SOD酶活及酶学性质分析 |
| 3.2.3.1 SOD蛋白最适酶促反应温度 |
| 3.2.3.2 SOD蛋白促酶最适pH值 |
| 3.2.3.3 SOD蛋白的耐热性分析 |
| 3.2.3.4 金属离子对SOD蛋白活性的影响 |
| 3.2.4 天麻SOD基因的生物信息学分析 |
| 3.2.4.1 SOD基因编码的氨基酸序列 |
| 3.2.4.2 SOD蛋白氨基酸组成及理化性质分析 |
| 3.2.4.3 SOD蛋白的疏/亲水性分析 |
| 3.2.4.4 SOD蛋白的磷酸化位点分析 |
| 3.2.4.5 SOD蛋白亚细胞定位预测 |
| 3.2.4.6 SOD蛋白的二级结构分析 |
| 3.2.4.7 SOD蛋白的三级结构分析 |
| 3.2.5 天麻SOD基因真核表达载体的构建及转化农杆菌 |
| 3.2.5.1 入门载体pENTR2B-SOD的构建 |
| 3.2.5.2 过表达载体pH2GW7.0-35S-SOD的构建及转化农杆菌 |
| 3.2.6 超氧化物歧化酶突变体拟南芥的筛选及转化 |
| 3.2.6.1 超氧化物歧化酶突变体拟南芥的筛选 |
| 3.2.6.2 SOD过表达载体转化拟南芥花序及鉴定 |
| 3.2.7 SOD过表达载体转化蜜环菌及鉴定 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 天麻谷氨酰胺合成酶(GS)的克隆及分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料与载体 |
| 4.1.2 天麻总RNA 的提取及cDNA 的合成 |
| 4.1.3 GS基因巢式引物及全长扩增的设计 |
| 4.1.4 巢式PCR扩增天麻GS基因的未知片段 |
| 4.1.5 GS未知片段的胶回收与克隆 |
| 4.1.6 GS未知片段转化大肠杆菌并拼接 |
| 4.1.7 GS基因全长克隆 |
| 4.1.8 GS基因原核表达载体构建 |
| 4.1.9 GS原核表达重组蛋白的纯化 |
| 4.1.10 GS酶活及酶学性质的检测分析 |
| 4.1.11 GS蛋白序列分析 |
| 4.1.12 GS基因真核表达载体的构建 |
| 4.1.13 过表达GS真核载体转化蜜环菌及筛选转基因蜜环菌筛选 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 天麻GS基因全长的获得 |
| 4.2.1.1 GS未知片段的扩增与检测 |
| 4.2.1.2 GS长的拼接与扩增 |
| 4.2.2 天麻GS基因的原核表达载体构建及重组蛋白纯化 |
| 4.2.2.1 GS基因原核表达载体的构建及检测 |
| 4.2.2.2 GS原核表达转化BL21 感受态诱导蛋白表达分析 |
| 4.2.2.3 GS原核表达重组蛋白的纯化 |
| 4.2.3 天麻GS酶活及酶学性质分析 |
| 4.2.3.1 GS最适酶促反应温度 |
| 4.2.3.2 GS促酶最适pH值 |
| 4.2.3.3 GS耐热性分析 |
| 4.2.3.4 金属离子对GS活性的影响 |
| 4.2.4 天麻GS基因的生物信息学分析 |
| 4.2.4.1 GS基因编码的氨基酸序列 |
| 4.2.4.2 GS蛋白氨基酸组成及理化性质分析 |
| 4.2.4.3 GS蛋白的疏/亲水性分析 |
| 4.2.4.4 GS蛋白的磷酸化位点分析 |
| 4.2.4.5 GS蛋白亚细胞定位预测 |
| 4.2.4.6 GS蛋白的二级结构分析 |
| 4.2.4.7 GS蛋白的三级结构分析 |
| 4.2.5 天麻GS基因真核表达载体的构建及转化农杆菌 |
| 4.2.5.1 入门载体pENTR2B-GS的构建 |
| 4.2.5.2 过表达载体pH2GW7.0-35S-GS的构建及转化农杆菌 |
| 4.2.6 GS过表达载体转化蜜环菌及转基因蜜环菌的筛选鉴定 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 总结与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附件 |
| 附表A |
| 附录B |
（8）蜡梅冷适应基因Cpcor413pm1的原核蛋白表达及拟南芥超表达的特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 植物COR蛋白概述 |
| 1.1.1 .COR蛋白的功能 |
| 1.1.2 植物COR413蛋白的研究进展 |
| 1.1.3 COR413蛋白的结构特征 |
| 1.2 原核表达系统概述 |
| 1.2.1 pET表达系统简介 |
| 1.2.2 pET表达载体 |
| 1.2.3 原核表达宿主菌株 |
| 1.2.4 COR蛋白家族的原核表达 |
| 1.3 蜡梅研究进展 |
| 1.3.1 蜡梅形态与分布 |
| 1.3.2 蜡梅品种分类 |
| 1.3.3 蜡梅开发与应用 |
| 1.3.4 蜡梅分子生物学研究进展 |
| 第2章 引言 |
| 2.1 研究目的和意义 |
| 2.2 技术路线 |
| 第3章 蜡梅CPCOR413PM1基因的克隆和原核表达分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 蜡梅植物材料 |
| 3.1.2 菌株与载体 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.1.5 主要自配试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 Cpcor413pm1基因的克隆 |
| 3.2.2 Cpcor413pm1基因原核表达载体的构建与鉴定 |
| 3.2.3 Cpcor413pm1重组蛋白的诱导表达 |
| 3.2.4 Cpcor413pm1重组蛋白诱导表达条件的优化 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 Cpcor413pm1基因的克隆 |
| 3.3.2 Cpcor413pm1基因原核表达载体的构建与鉴定 |
| 3.3.3 Cpcor413pm1重组蛋白的诱导表达 |
| 3.3.4 Cpcor413pm1重组蛋白诱导表达条件的优化 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 低温和高温胁迫下蜡梅CPCOR413PM1蛋白对超氧化物歧化酶(SOD)的保护作用分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 主要仪器设备与试剂 |
| 4.1.2 主要自配试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 Cpcor413pm1融合蛋白的纯化 |
| 4.2.2 Cpcor413pm1蛋白在低温和高温胁迫下对超氧化物歧化酶(SOD)的作用 |
| 4.3 实验结果与分析 |
| 4.3.1 Cpcor413pm1重组蛋白的纯化 |
| 4.3.2 Cpcor413pm1蛋白在低温和高温胁迫下对超氧化物岐化酶(SOD)的保护作用分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 超表达蜡梅CPCOR413PM1基因大肠杆菌的抗逆性分析 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 蜡梅Cpcor413pm1蛋白在低温和高温胁迫下对大肠杆菌的作用 |
| 5.2.2 蜡梅Cpcor413pm1蛋白在高盐、干旱、高渗透胁迫下对大肠杆菌的作用 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 点板试验鉴定超表达Cpcor413pm1基因大肠杆菌的抗低温、高温、干旱、高盐、高渗透能力 |
| 5.3.2 生长曲线法分析超表达Cpcor413pm1基因大肠杆菌的抗低温、高温、高盐、干旱、高渗透能力 |
| 5.4 讨论 |
| 第6章 CPCOR413PM1基因植物超表达载体的构建及拟南芥遗传转化研究 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 植物材料 |
| 6.1.2 载体及菌株 |
| 6.1.3 主要试剂及试剂盒 |
| 6.1.4 主要仪器设备 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 蜡梅Cpcor413pm1植物超表达载体的构建 |
| 6.2.2 转化拟南芥 |
| 6.2.3 转基因拟南芥的检测 |
| 6.2.4 转基因拟南芥的功能分析 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 植物表达载体的构建 |
| 6.3.2 转基因拟南芥的筛选 |
| 6.3.3 转基因拟南芥的表型观察 |
| 6.3.4 转Cpcor413pm1拟南芥对非生物胁迫的抗性分析 |
| 6.4 讨论 |
| 第7章 结论与展望 |
| 7.1 主要结论 |
| 7.1.1 蜡梅Cpcor413pm1基因的原核表达 |
| 7.1.2 Cpcor413pm1基因植物表达载体的构建及拟南芥遗传转化研究 |
| 7.2 下一步试验计划 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（9）岷江百合几丁质酶基因LrCHI2响应尖孢镰刀菌的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 百合 |
| 1.1.1 百合根腐病 |
| 1.1.2 岷江百合 |
| 1.2 病程相关蛋白 |
| 1.2.1 病程相关蛋白的分类 |
| 1.2.2 病程相关蛋白响应病原菌的侵染 |
| 1.2.3 病程相关蛋白抗真菌活性与机制 |
| 1.3 WRKY转录因子 |
| 1.3.1 WRKY转录因子的结构域及识别特点 |
| 1.3.2 WRKY转录因子对PRs的调控 |
| 1.4 岷江百合对尖孢镰刀菌抗性的基础研究 |
| 1.5 本课题的研究意义及目的 |
| 第二章 病程相关蛋白基因LrCHI2的克隆及功能分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与试剂 |
| 2.2.1 植物及真菌材料 |
| 2.2.2 菌株与载体 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 缓冲液及培养基的配置 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 病原真菌的活化 |
| 2.3.2 植物材料的处理及接种 |
| 2.3.3 全长cDNA的克隆及生物信息学分析 |
| 2.3.4 qRT-PCR |
| 2.3.5 LrCHI2的亚细胞定位 |
| 2.3.6 LrCHI2的原核表达、重组蛋白的抑菌活性分析 |
| 2.3.7 LrCHI2转基因烟草的获得及分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 LrCHI2基因的序列分析 |
| 2.4.2 LrCHI2的聚类分析和多重序列比对 |
| 2.4.3 LrCHI2基因的表达谱分析 |
| 2.4.4 LrCHI2定位于细胞壁 |
| 2.4.5 LrCHI2原核重组蛋白的诱导纯化及活性分析 |
| 2.4.6 LrCHI2转基因烟草的产生、筛选及分析 |
| 2.4.7 LrCHI2过表达转基因烟草对尖孢镰刀菌的抗性明显增强 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 岷江百合WRKY转录因子对LrCHI2的转录调控作用研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料和试剂 |
| 3.2.1 植物及真菌材料 |
| 3.2.2 菌株与载体 |
| 3.2.3 主要试剂 |
| 3.2.4 缓冲液及培养基的配置 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 LrCHI2启动子的克隆与顺式作用元件分析 |
| 3.3.2 EMSA验证LrWRKY2的专一性结合位点 |
| 3.3.3 LrWRKY2的转录激活特性分析 |
| 3.3.4 LrCHI2启动子转基因烟草的获得及分析 |
| 3.3.5 LrWRKY2与pLrCHI2共表达转基因烟草的获得及分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 LrCHI2启动子的克隆及序列分析 |
| 3.4.2 含有W-box的LrCHI2启动子片段能够在体外与LrWRKY2结合 |
| 3.4.3 LrWRKY2对LrCHI2启动子具有反式激活作用 |
| 3.4.4 LrCHI2启动子转基因烟草的产生及筛选 |
| 3.4.5 LrCHI2启动子转基因烟草的GUS活性荧光检测 |
| 3.4.6 LrWRKY2与pLrCHI2共表达转基因烟草的产生及筛选 |
| 3.4.7 LrWRKY2与pLrCHI2共表达转基因烟草的GUS活性荧光检测 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 结论与展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A 载体图谱 |
| 附录B 攻读硕士学位期间发表论文 |
（10）番茄E3泛素连接酶SlSL1功能分析（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 蛋白质泛素化机制概述 |
| 1.1.1 泛素 |
| 1.1.2 泛素化修饰 |
| 1.1.3 E3 泛素连接酶 |
| 1.1.4 植物体内E3 泛素连接酶的功能 |
| 1.2 E3 连接酶活性的体外检测 |
| 1.3 酵母双杂交 |
| 1.4 农杆菌介导的植物遗传转化 |
| 1.5 番茄细菌性斑点病及防御系统 |
| 1.6 本研究的目的及意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 质粒与菌株 |
| 2.2 主要仪器设备 |
| 2.3 主要试剂、耗材 |
| 2.4 常用培养基、缓冲液及试剂配制 |
| 2.4.1 SOC培养基 |
| 2.4.2 LB培养基 |
| 2.4.3 TAE电泳缓冲液 |
| 2.4.4 植物基因组DNA提取液 |
| 2.4.5 蛋白实验相关试剂 |
| 2.4.6 番茄遗传转化相关试剂、培养基 |
| 2.4.7 酵母相关培养基 |
| 2.4.8 酵母转化试剂 |
| 2.5 本实验所用引物 |
| 2.6 SlSL1 基因原核表达载体的构建 |
| 2.6.1 SlSL1 基因克隆 |
| 2.6.2 PCR产物纯化 |
| 2.6.3 载体、PCR纯化产物的酶切 |
| 2.6.4 酶切产物胶回收 |
| 2.6.5 连接与转化 |
| 2.6.6 阳性菌落鉴定 |
| 2.6.7 质粒提取 |
| 2.6.8 酶切及测序验证 |
| 2.7 SlSL1 重组蛋白诱导表达、纯化 |
| 2.8 体外泛素化及蛋白免疫印迹分析 |
| 2.9 SlSL1 基因遗传转化载体构建 |
| 2.10 番茄遗传转化 |
| 2.10.1 无菌番茄幼苗的获得 |
| 2.10.2 愈伤组织预培养 |
| 2.10.3 农杆菌侵染 |
| 2.10.4 卡那霉素梯度筛选与生根培养 |
| 2.11 遗传转化植株鉴定 |
| 2.11.1 番茄基因组DNA提取 |
| 2.11.2 SlSL1 转基因植株DNA水平鉴定 |
| 2.11.3 番茄植株总RNA提取 |
| 2.11.4 反转录 |
| 2.11.5 定量PCR |
| 2.12 病原菌接种 |
| 2.13 叶片菌落计数 |
| 2.14 酵母文库筛选 |
| 2.14.1 酵母菌转化 |
| 2.14.2 酵母文库筛选 |
| 2.14.3 酵母质粒提取 |
| 第三章 实验结果与分析 |
| 3.1 SlSL1 基因原核表达载体的构建 |
| 3.2 SlSL1 重组蛋白诱导表达、纯化 |
| 3.3 体外泛素化反应及蛋白免疫印迹分析 |
| 3.4 SlSL1 基因遗传转化载体的构建 |
| 3.5 SlSL1 基因过表达遗传转化 |
| 3.5.1 番茄愈伤组织预培养与农杆菌侵染 |
| 3.5.2 卡那霉素梯度筛选与生根培养 |
| 3.6 SlSL1 遗传转化植株鉴定 |
| 3.6.1 转化植株DNA鉴定 |
| 3.6.2 定量PCR分析 |
| 3.7 SlSL1 过表达番茄表型分析 |
| 3.7.1 SlSL1 过表达植株抗病性 |
| 3.7.2 SlSL1 转化植株果实性状 |
| 3.8 酵母双杂交文库筛选SlSL1 互作蛋白 |
| 第四章 结论与讨论 |
| 4.1 结论 |
| 4.1.1 番茄SlSL1 具有E3 泛素连接酶活性 |
| 4.1.2 SlSL1 上调有助于增强番茄对丁香假单胞菌的抗病性 |
| 4.1.3 过表达SlSL1 对番茄生长发育无明显不利影响 |
| 4.1.4 与SlSL1 互作的番茄蛋白 |
| 4.2 讨论与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间的学术活动及成果情况 |
四、转基因植物表达重组蛋白的研究进展（论文参考文献）
- [1]SikCDPK1基因响应非生物逆境的功能初步研究[D]. 郭家秀. 石河子大学, 2021(02)
- [2]杨梅FLSs和F3’5’H调控杨梅素生物合成的机制研究[D]. 邢梦云. 浙江大学, 2021(01)
- [3]马铃薯中与胁迫相关StMAPKs基因的分离及功能研究[D]. 朱熙. 甘肃农业大学, 2021(01)
- [4]小麦阿拉伯木聚糖阿魏酸酰基转移酶基因TaBAHD的克隆与功能鉴定[D]. 战帅帅. 新疆农业大学, 2021
- [5]基于联合组学技术的红花槭叶片呈色机理分析和ArMYB89的基因功能研究[D]. 陆小雨. 安徽农业大学, 2021
- [6]喜旱莲子草DMNT合成途径关键TPS的鉴定和功能研究[D]. 王苑馨. 山西农业大学, 2021
- [7]转录组和代谢组联合分析低温胁迫对天麻生长影响及其SOD和GS基因克隆与功能鉴定[D]. 周春艳. 昆明理工大学, 2021(02)
- [8]蜡梅冷适应基因Cpcor413pm1的原核蛋白表达及拟南芥超表达的特性研究[D]. 郑仰辉. 西南大学, 2021(01)
- [9]岷江百合几丁质酶基因LrCHI2响应尖孢镰刀菌的机制研究[D]. 李珊. 昆明理工大学, 2021
- [10]番茄E3泛素连接酶SlSL1功能分析[D]. 徐焕焕. 合肥工业大学, 2021(02)