一、PGPR生防作用的不稳定性及可能的改进策略（论文文献综述）
杨晓玫[1]（2020）在《珠芽蓼根际促生菌Bacillus mycoides Gnyt1比较基因组及其功能基因研究》文中研究表明微生物资源是国家的战略资源之一,是地球上最大的、尚未充分开发利用的生物资源,蕴藏着巨大的产业价值。以现代生物技术为核心的微生物资源研究与利用已经成为全球生物资源竞争的战略重点。植物根际促生菌（Plant Growth Promoting Rhizobacteria,PGPR）作为微生物资源的主要分支,在我国微生物资源利用中占有十分重要的地位,其充分合理的利用亦是当今世界各国关注的热点问题之一。近年来,国内外关于PGPR的研究多数主要集中在菌株分离筛选生物学性能方面,而在分子机理方面研究略少,因此深入研究PGPR菌株的促生机理、代谢调控及控制促生作用的基因,从分子生物学角度揭示PGPR的促生机理,深入挖掘内在促生基因,掌握促生的分子机制,促进PGPR的分子生物方法研究,有针对性更有效的利用PGPR菌株是亟待解决的新课题。本研究以课题组前期研究促生特性突出的一株优良植物根际菌株Bacillus mycoides Gnyt1为研究对象,在课题组全基因组测序的基础上,运用分子生物学技术,研究菌株Bacillus mycoides Gnyt1和同属菌株（参比菌株六株）比较基因组学的持家基因和差异基因,预测基因组中可能存在功能相似的功能基因,研究菌株固氮溶磷特性相关的基因,确定基因的相对表达量和主要代谢产物,为植物根际促生菌的利用和深入研究提供了理论依据和科技支撑,获得如下主要结果:（1）菌株Bacillus mycoides Gnyt1和同属参比菌株比较基因组学分析表明:Bacillus mycoides Gnyt1菌株基因组序列的总长度为5,597,907bp,GC含量为35.57%,开放阅读框ORF长度为792.17 bp,在进化关系方面菌株Bacillus mycoides Gnyt1与芽孢杆菌菌株AH621（CM000719.1）和AH603（CM000737.1）16Sr DNA同源性比对中有95%的同源性,菌株Bacillus mycoides Gnyt1和参比菌株之间的共线性较低,说明菌株Bacillus mycoides Gnyt1基因组相比同属之间发生重新排列,差异较大有继续研究的潜能。不同菌株的基因组成不同,均有基因特异性,其中固氮和溶磷相关的功能基因与基因蛋白酶的调节、色素、不同的分泌系统有关。（2）菌株Bacillus mycoides Gnyt1基于Mauve的菌株基因家族分析,共有3322个相同基因,菌株Bacillus mycoides Gnyt1中有515个特异性基因,系统发育树分析发现Bacillus mycoides AH621菌株与Bacillus mycoides Gnyt1菌株在基因功能与组成表达方面进化较近,可预测出表达性状一致的功能基因,可能有相同的调控机制、功能相同的持家基因。（3）根据已获得固氮的序列设计上下游引物,克隆出菌株Bacillus mycoides Gnyt1中的5个固氮基因（nif D,nif R,nif S,nif U和nif Ux）,分别双酶切连接表达载体p BI121,命名为p BI-nif D,p BI-nif R,p BI-nif S,p BI-nif U和p BI-nif Ux,生物信息学和系统发育树分析表明克隆出的固氮基因接近根瘤菌。菌株固氮酶活性测定验证了克隆出的固氮基因均能在大肠杆菌中成功表达,5个重组固氮菌株均具有固氮能力。（4）根据已获得溶磷的序列设计上下游引物,克隆出菌株Bacillus mycoides Gnyt1中的4个溶磷基因（pqq A,pqq B,pqq C和pqq E）,分别双酶切连接表达载体p BI121,命名为p BI-pqq A,p BI-pqq B,p BI-pqq C和p BI-pqq E,生物信息学和系统发育树分析表明克隆出的溶磷基因均接近溶磷家族蛋白组的聚类。菌株有机酸含量的测定验证了克隆出的溶磷基因均能在大肠杆菌中成功表达,4个重组溶磷菌株均具有溶磷能力。（5）菌株Bacillus mycoides Gnyt1全基因组信息和与铁载体相关的功能基因的研究结果表明:研究菌株Bacillus mycoides Gnyt1与铁载体分泌相关的基因GYT1和基因GYT2主要存在于Porphyrin metabolism（卟啉代谢）途径中,主要与细胞内铁的运输代谢有关,基因的产物均与铁的螯合、转运有关,具有进一步研究的意义。（6）菌株Bacillus mycoides Gnyt1固氮基因不同培养时间基因的相对表达量趋势不一致,固氮基因重组菌株p BI-nif D、p BI-nif R、p BI-nif U和p BI-nif Ux在培养时间4h时基因的表达量相对于其他培养时间呈明显的最高表达趋势,显着高于对照（P<0.05）,分别是对照的2.4倍、4.3倍、4.9倍和4.5倍,而固氮基因重组菌株p BI121-nif S在培养时间12h时基因的表达量相对于其他培养时间呈明显的最高表达趋势,显着高于对照（P<0.05）,是对照的2.4倍。固氮基因nif U为表达水平最高的基因。（7）菌株Bacillus mycoides Gnyt1溶磷基因不同培养时间基因的相对表达量逐渐减弱,溶磷基因重组菌株p BI-pqq A、p BI-pqq B、p BI-pqq C和p BI-pqq E在培养时间4h时基因的表达量相对于其他培养时间均呈明显的最高表达趋势,显着高于对照（P<0.05）,为基因表达的最高水平,分别是对照的4.25倍、1.78倍、1.7倍、4.2倍。其中菌株p BI-pqq A和p BI-pqq E溶磷基因表达的相对表达量最高,菌株p BI-pqq C溶磷基因表达的相对表达量最低。溶磷基因pqq A为表达水平最高的基因。（8）菌株Bacillus mycoides Gnyt1的固氮重组菌株和溶磷重组菌株基因的靶向代谢产物分析表明:重组固氮菌株p BI-nif U分泌的代谢物主要为柠檬酸、异柠檬酸、苹果酸、泛酸、琥珀酸和乳酸,重组溶磷菌株p BI-pqq A分泌的代谢物主要为泛酸、琥珀酸、苹果酸、柠檬酸和乳酸。
包华燕[2]（2020）在《基于乳清分离蛋白乳化/凝胶的营养活性成分共包埋研究》文中提出随着营养意识的提高,具有多种有益健康的功能食品的需求不断增加。多种营养活性成分共包埋不但有利于利用活性成分间增效作用,而且可能保持活性成分的长程稳定性,已引起越来越多的研究兴趣。目前,具有不同溶解性的活性成分共包埋是难点。基于蛋白质的多相体系正逐渐应用于不同溶解性的活性成分共包埋。乳清分离蛋白（Whey protein isolate,WPI）具有乳化和凝胶等功能特性,已被用作单一活性成分的包埋,利用其多种特性进行组装将可能实现活性成分的共包埋。本文基于WPI的乳化和凝胶特性,选取疏水性α-生育酚,亲水性L-抗坏血酸（能再生α-生育酚和协同抗氧化）和两亲性白藜芦醇（能再生α-生育酚）作为营养活性成分模型,旨在实现不同溶解性的活性成分共包埋,主要研究内容和结果如下:首先,基于本课题组前期研究构建的乳液填充凝胶,对α-生育酚和白藜芦醇进行共包埋研究。在变性WPI乳液中白藜芦醇总包埋率为59%-63%;而α-生育酚总包埋率约为98%。而在乳液填充凝胶中,α-生育酚和白藜芦醇可以被完全包埋。在模拟消化条件下,凝胶网络解体是影响活性成分释放的主要因素,提高体系Ca2+浓度和油含量能延缓活性成分的释放。释放的活性成分在模拟胃液中较稳定,在随后的模拟肠液中发生降解。通过与单一包埋冷凝胶体系比较,发现白藜芦醇在共包埋的乳液填充凝胶中通过自身损失保护α-生育酚。所有凝胶消化后,释放白藜芦醇的保留率均>50%,而释放α-生育酚的保留率则在25%左右。接着,本文从配方和制备两个角度设计和构建了内相凝胶化水包油包水（Water in oil in water,W/O/W）型乳状液,并利用其对L-抗坏血酸和α-生育酚进行共包埋研究。通过分析冰水浴下剪切、过膜挤出和不同预混膜乳化制备得到乳状液的粒径分布和显微图像,发现二次剪切配合过膜挤出后使用T-型通道和挤出模块实现的预混膜乳化能制备得到粒径可控的W/O/W型乳状液。利用WPI凝胶特性凝胶化乳状液内水相时,通过调节L-抗坏血酸量和Na+浓度得到了两种内水相凝胶配方,进一步共包埋α-生育酚,发现粒径和内水相凝胶是影响乳状液中L-抗坏血酸包埋率的主要因素,而乳状液中α-生育酚包埋率均>96%。此外,改变外水相未影响活性成分的包埋率和L-抗坏血酸稳定性,但使用WPI-果胶复配外水相稳定乳状液可明显提高α-生育酚稳定性。储藏温度是影响内相凝胶化W/O/W型乳状液中活性成分稳定性的关键因素,活性成分在4℃下较稳定,在25℃下储藏15天活性成分发生明显降解。通过本文为设计和开发基于乳清蛋白的多营养活性成分共包埋载体提供更多实验数据和参考。
陈丹梅[3]（2020）在《产酶溶杆菌新株Lysobacter enzymogenes LE16的促生防病作用及机理》文中提出我国化肥的平均用量是美国和欧盟的2.52.6倍,农药用量是全球平均水平的2.5倍,肥料和农药利用率远远低于世界均值。长期大量使用化肥农药,造成一系列生产、环境和安全问题,如土地生产力下降、重金属积累（主要源于化学磷肥）、水体富营养化、病原菌耐药性增强、药效降低（或失效）、生物多样性减少、食品农药残留超标等。在连作高产条件下,仅依靠传统技术减施化肥农药远远不够,亟待开创新思路、发展新技术、研制新产品。微生物生物技术是活化土壤养分、促进植物生长、增强作物抗逆性、提高肥效药效、减施化肥农药的重要手段之一。微生物制剂安全无毒、资源节约、环境友好,但种类较少、效果欠佳、成本偏高,急需增加种类、降低成本、提高肥效药效。本项研究以云南省长期轮作的土壤为对象,自主筛选获得兼具促生防病功能的产酶溶杆菌新株Lysobacter enzymogenes LE16,利用分子生物学、生物化学、土壤学、植物营养学和植物病理学等手段,研究了相关效应及机理,为减施化肥农药等提供了科学依据和潜在手段。主要研究结果如下:（1）产酶溶杆菌Lysobacter enzymogenes LE16（以下简称菌株LE16）能分泌磷酸酶、蛋白酶、溶菌酶、植物生长激素（IAA）和铁载体,可能具有活化土壤有机氮磷和拮抗作物病原菌等生物学功能;在液体培养条件下,菌株LE16会发生自溶,最终形成无菌发酵液。分子鉴定和全基因测序结果表明,菌株LE16不同于已知的产酶溶杆菌OH11、C3、3.1 T8等,为产酶溶杆菌新株。利用生物信息技术研究后发现,该菌株的核基因序列上存在指导合成分泌蛋白酶、磷酸酶、铁载体、IAA和多种抗菌物质的结构机构和调节基因,具有一定的植物促生防病潜力。（2）液培试验表明,菌株LE16能分泌酸性、中性和碱性蛋白酶,水解牛血清白蛋白产生NH4+;培养温度从12℃升高至28℃,菌株水解有机氮的能力逐渐增强;在pH4.010.0范围内,菌株水解牛血清白蛋白产NH4+能力无显着变化。此外,该菌株还能分泌酸性、中性和碱性磷酸酶,在1228℃和pH 4.010.0条件下均能水解卵磷脂;等量的硝态氮、铵态氮和尿素对该菌株水解有机磷的能力无显着影响,适量的外源氮和无机磷能显着提高该菌株水解有机磷的效率。（3）土培试验表明,菌株LE16能在供试紫色土中成功定殖,并分泌蛋白酶和磷酸酶活化土壤有机氮磷;培养30 d后,接菌土壤中的碱解氮、铵态氮、Olsen磷和水溶性磷含量均显着增加,比未接菌处理分别提高17.82%22.26%、46.54%47.86%、64.33%81.67%和48.82%55.88%。（4）盆栽试验表明,接种菌株LE16能提高生菜和辣椒根系活力,显着促进植株生长和养分吸收;与单施化肥处理相比,化肥配施LE16菌剂使生菜和辣椒分别增产6.43%11.30%和43.82%70.33%,品质改善。其主要机理可能是菌株LE16活化了土壤有机氮磷、增加了土壤有效养分含量。（5）在50 mL等体积培养条件下,培养温度从12℃升高至36℃,LE16菌体全部自溶所需时间由336 h缩短至96 h;在28℃等温培养条件下,培养体积由50 mL增加至400 mL,菌体全部自溶所需时间由120 h增加至216 h;但培养pH 5.0、7.0、9.0和接种量1%、2%、5%对该菌株的自溶过程无显着影响。因此,菌株LE16可能通过群体感应诱导菌体发生自溶,并通过细胞间的接触进行传播,最终形成无菌发酵液。（6）平板拮抗试验表明,菌株LE16能显着抑制金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、烟草野火病菌（Pseudomonas syringae pv.tabaci）、柑橘炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、意大利青霉（Penicillium italicum）、烟草赤星病菌（Alternaria alternate）、松立枯丝核病菌（Rhizoctonia solani）、瓜类蔓枯病菌（Didymella bryoniae）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、烟草疫霉（Phytophthora nicotiana）和辣椒疫霉（Phytophthora capsici）的生长。其发酵液经100℃高温处理30 min或在常温下储存1年后,仍能显着抑制植物病原真菌和卵菌的生长、导致菌丝畸形,其抑菌机理可能是分泌蛋白酶、磷酸酶、溶菌酶、铁载体和热稳定性抗菌物质等。（7）抗病试验表明,盆栽土壤施用菌株LE16发酵液能诱导植株产生获得性系统抗性,对烤烟黑胫病和辣椒疫病的防治效果分别为54.96%75.67%和86.20%93.10%;叶面喷施该发酵液能有效抑制瓜类蔓枯病菌侵染黄瓜,对黄瓜蔓枯病的预防和治疗效果分别为50.65%和53.67%,类似农药甲基托布津。该发酵液经100℃高温处理30 min或常温储存1年后,均能显着抑制白粉病孢子萌发并有效防治烤烟和黄瓜白粉病,温室防治效果分别为92.25%100%（烤烟）和91.30%96.78%（黄瓜）,优于常用农药三唑酮;此外,该发酵液对田间烤烟白粉病的治疗效果较好并具有持续作用。总之,产酶溶杆菌Lysobacter enzymogenes LE16能活化土壤有机氮磷,促进植物生长,拮抗多种病原微生物,预防和治疗植物病害,高效防治作物白粉病,表现出较好的应用前景。
李曦[4]（2019）在《解淀粉芽胞杆菌FZB42 sRNA生防功能的分子机制研究》文中进行了进一步梳理植物根际促生细菌（Plant growth promoting rhizobacteria,PGPR）在田间病害生物防治上具有重要的应用价值,在与植物的互作过程中,植物根际促生细菌通过在植物根际、体表或体内定殖,与植物周围的病原菌竞争养分,同时分泌抗菌物质,如脂肽化合物、抗菌蛋白等,从而对病原菌生长产生拮抗作用。与此同时,PGPR也会激活植物的免疫防卫反应,保护植物免受侵害。大量研究表明,PGPR发挥有效作用的前提是能够在植物根部进行有效定殖,制约定殖的主要因素包括生物膜的形成和群集运动（swarming）,特别是在定殖前期,生物膜的形成至关重要。芽胞杆菌属（Bacillus）细菌就是一类重要的植物根际促生细菌,在逆境环境下还会形成芽胞以抵御不良环境的侵害。细菌中的sRNA是一类重要的生理生化功能调控因子,在细菌中普遍存在且高度保守,发挥作用常常需要Hfq蛋白的协助,目前在革兰氏阴性菌中研究较多,而对革兰氏阳性菌的sRNA作用知之甚少。利用RNA-Seq测序技术在解淀粉芽胞杆菌FZB42中已鉴定到86个sRNA并通过Northern blot得到验证,其中73个sRNA的功能未被注释。因此,探究芽胞杆菌功能未知的sRNA的具体生物学作用对深入阐述其生防分子机制具有非常重要的科学意义,对研究高效稳定的微生物制剂也具有深远的指导意义。在本研究中我们构建了 17个sRNA突变体和Hfq突变体,并对这些突变体做了相关表型检测,结果发现,突变这些sRNA后菌株正常生长不受影响;△Bas03和△hfq突变体的生物膜形成及swarming显着减弱,△Bas32的产胞效率明显降低,其它突变与野生型相比没有明显差异。通过对sRNA突变体对外界环境胁迫抵抗能力的检测,我们发现△Bas03在10℃低温下生长减弱,其他sRNA突变体在低温环境下均可以正常生长;ΔBas12、△Bas15、△Bas23对盐胁迫能力减弱,其他突变体没有显着变化。我们还检测了 FZB42野生型及sRNA突变体对于酸性（pH 3.0）及过氧化物的耐受力,结果表明,酸性条件下突变体与野生型相比生长不受影响,而△Bas03、△Bas12、△Bas28、ΔBas32及△hfq对过氧化物抵御能力减弱。sRNA突变体对水稻种子促生结果显示:与野生型相比,△Bas13、△Bas20、△Bas23、ΔBas32、△Bas37、△Bas45菌株对水稻种子的促生作用明显减弱。为了研究sRNA Bas03和Hfq蛋白调控生物膜及群集运动的分子机制,我们首先检测了△hfq中Bas03的表达量,荧光定量PCR结果和Northern blot结果显示缺少Hfq蛋白的情况下,Bas03的表达水平显着降低,表明Bas03的表达依赖Hfq;通过TargetRNA软件预测和荧光定量PCR的检测验证,我们初步确认Bas03的作用靶标基因是surfactin的合成基因srfAC;随后我们采用HPLC检测方法对surfactin产量进行检测,发现ΔBas03中surfactin产量明显下降,证明Bas03的作用靶标是srfAC;通过lacZ报告基因标记和β-半乳糖苷酶活性检测,我们发现srfAC启动子没有活性,这一结果表明Bas03不是作用于靶标srfAC启动子区,也不是通过作用于surfactin合成的基因簇而增强srfAC mRNA活性。我们通过对srfAC mRNA半衰期的检测,初步证实Bas03可能会影响srfAC mRNA的稳定性;同时,EMSA结果显示Bas03与靶标基因srfAC只有在Hfq蛋白存在的条件下才可以结合。在前期研究中我们已经发现,Bas32的功能和产胞效率相关,我们将带有GFP标签的产胞报告基因sspB转入sRNA突变体,发现FZB42-sspB-GFPΔBas32检测出的荧光表达强度略弱于FZB42-sspB-GFP,表明Bas32可能与产胞相关;通过定量PCR检测比较野生型FZB42和Δhfq中Bas32的表达量,发现△hfq中Bas32的表达显着下调,说明Bas32的表达依赖于Hfq;随后我们检测了ΔBas32中的spo VAE1基因的表达情况,发现其与野生型相比没有明显差异,目前研究表明Bas32在产胞过程中仅起到微弱调控作用。本论文的研究取得了 一定的成果,探究了 17个前期在解淀粉芽胞杆菌FZB42中未被注释功能sRNA,对研究芽胞杆菌功能未知的sRNA的具体生物学作用具有非常重要的科学意义。
初少华[5]（2019）在《巨大芽孢杆菌对次生盐渍化土壤硝酸盐的转化途径及其机理研究》文中进行了进一步梳理设施栽培中土壤硝酸盐型次生盐渍化问题日益突出,不仅直接危害作物的正常生长,而且威胁农产品安全。利用微生物的同化作用降低土壤中的硝酸盐含量,不仅使氮素能被土壤固持且环境友好,在修复土壤次生盐渍化方面有巨大潜力。本研究以前期筛选到的一株巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）NCT-2为研究对象,解析该菌株的硝酸盐转化途径,深入研究其转化硝酸盐的机理,并考查该菌株在植物根际的定殖模式和对根际微生态的改良,研究成果可为硝酸盐型次生盐渍化土壤修复菌剂的开发和实际应用提供科学依据。主要研究结果如下:（1）巨大芽孢杆菌NCT-2可以在硝酸盐为唯一氮源的培养基中生长,好氧培养条件下菌株在对数生长期时,NO3--N被完全降解,并有少量NH4+-N生成,说明在好氧条件下可能存在硝酸盐异化还原成铵途径,但同化途径仍是菌株转化硝酸盐的主要途径。厌氧静止培养菌株,在排除同化作用干扰下,NO2--N含量下降,而NH4+-N含量上升,说明NCT-2菌株能利用NO2-生成NH4+,从而进一步推测了硝酸盐异化还原成铵途径的存在。在厌氧培养条件下,菌株未产生反硝化途径的中间产物N2O,说明NCT-2菌株不存在反硝化途径。（2）克隆了NCT-2菌株的同化型硝酸盐还原酶基因（nasBC）,并使其在大肠杆菌中过表达。该酶的电子还原亚基和催化亚基分别为87.3 kDa和80.5 kDa,最佳共表达条件为选用大肠杆菌BL21（DE3）细胞,在LB培养基中加入0.1 mM IPTG,在20°C和120 rpm条件下诱导10 h。该酶的纯化产物对温度和pH的耐受范围较广,最适温度和最适pH分别为35°C和6.2左右,该条件与设施栽培土壤条件类似。对该酶酶活促进作用和抑制作用最强的金属离子分别为Fe3+和Cu2+,最佳电子供体为MV+Na2S2O4+EDTA。该酶的酶促反应动力学参数Km为670μM,Vmax为58 U mg-1。（3）克隆了NCT-2菌株的同化型亚硝酸盐还原酶基因（nasDE）,并使其在大肠杆菌中过表达。该酶的大亚基和小亚基分别为88 kDa和11.7 kDa。最佳共表达条件为选用大肠杆菌BL21（DE3）细胞,在LB培养基中加入0.1 mM IPTG,在20°C和120rpm条件下诱导10 h。该酶的纯化产物对温度和pH的耐受范围较广,最适温度和最适pH分别为30°C和6.5左右,该条件与设施栽培土壤条件类似。对该酶酶活促进作用最强的金属离子为Fe3+,抑制作用最强的金属离子为Cu2+,最佳电子供体为MV+Na2S2O4。该酶的酶促反应动力学参数Km和Vmax分别为3.1 mM和5.2 U mg-1。（4）构建了绿色荧光蛋白标记重组菌株,该菌株能够成功定殖在玉米根系和根际土壤中。接种荧光标记重组菌菌剂能够显着促进土壤中硝酸盐的降解和植物生长。激光扫描共聚焦结果表明,NCT-2菌株是一株植物内生菌,能够定殖在根尖的分生区和伸长区以及根中段。土壤硝酸盐浓度对菌株的定殖分布无显着影响。在根系和根际土壤中的重组菌株群体数量先增加后下降,实验末期根际土壤中的定殖量稳定在每克土壤约5×104 CFU。但在不同的处理中,根系定殖量又再次增加到每克根约1-3×104CFU。菌株在根系的定殖量受硝酸盐浓度影响显着。土壤硝态氮浓度为72 mg kg-1时,菌株在玉米根系的定殖量最高。（5）高通量测序结果表明,玉米根际土壤中的优势菌群为变形菌门、酸杆菌门、放线菌门、泉古菌门和绿弯菌门。接种NCT-2菌剂对根际细菌群落的OTU数量和α多样性无显着影响。硝酸盐的添加对OTU数量影响不显着,但对群落α多样性影响显着。β多样性的结果表明,接种NCT-2菌剂显着影响了玉米根际细菌群落组成,且组分随硝酸盐浓度而变化。丰度位于前十名的门水平物种受NCT-2菌剂影响显着。接种NCT-2菌剂不仅增加了与氮转化和抗生作用相关的种群丰度,还降低了根际土壤中的电导率并且增加了硝酸盐还原酶酶活。变形菌门、绿弯菌门、拟杆菌门和浮霉菌门丰度与初始硝酸盐含量、电导率和硝酸盐还原酶密切相关。以上结果表明NCT-2菌剂对根际土壤理化性质和微生物多样性有显着的改善。
俞仪阳[6]（2018）在《水稻纹枯病生防菌株的筛选及两种生防芽胞杆菌生物膜形成相关机理研究》文中指出随着生活水平的日益提高,人们对农业生产的要求已逐渐从满足基本生存需求过度为提供健康、环保、高质量的农产品。生物防治以其取之于自然、用之于自然的独特病害防控模式成为新时代防治植物病害的最重要手段之一。然而,生物防治仍然存在防效不稳定、单一菌株防效不佳等问题。为解决这些生防过程中显现的重要问题,实验室前期通过筛选发现蜡质芽胞杆菌（Bacillus cereus）AR156、枯草芽胞杆菌（B.subtilis）SM21及沙雷氏菌（Serratia sp.）XY21的三菌合剂“宁盾”能够通过相互协作提高有益微生物的生物防治能力及稳定性。然而,对复配微生物通过何种方式促进整体生防能力的提升仍有待研究。芽胞杆菌属细菌以其优良的环境生存能力、独特的抵御逆境的芽胞产生机制以及较强的抗菌物质分泌系统等一系列优势在生防微生物中占据着重要的地位。生物膜是芽胞杆菌在自然界中的主要存在形态,研究显示其形成能力在芽胞杆菌生物防治的过程中起到重要的作用。本研究以蜡质芽胞杆菌（B.cereus）AR156、枯草芽胞杆菌（B.subtilis）SM21为生防菌株系统研究了两者单菌的生物膜形成机理以及两者通过互作对生物膜的形成产生的影响。1.稳定防治水稻纹枯病生防菌的筛选策略研究随着栽培、水肥条件的不断上升以及人们对水稻口感的日益追求,由立枯丝核菌引起的水稻纹枯病对中国水稻生产的威胁逐渐加剧。防治水稻纹枯病的一个重要难题是由立枯丝核菌多样性导致的防效不稳定。在本研究中,通过分析潜在生防菌对立枯丝核菌的抑菌能力、胞外水解酶、噬铁素产生能力对细菌潜在生防能力进行赋值。选取总共14株菌株:10株赋值高于6,4株赋值低于4,开展温室实验验证其对前期在中国11个省份筛选获得的多样性立枯丝核菌引起的水稻纹枯病的生物防治能力及稳定性。结果发现,单种生防菌对多样病源菌引起的水稻纹枯病的防治效果存在显着差异（-36.23%～88.24%）。其中,荧光假单胞4aYN11对多种水稻纹枯病具有较稳定的防治效果（32.26%-78.79%）,并对水稻生物量有18.43%的提升。蜡质芽胞杆菌AR156和枯草芽胞杆菌3ReF17分别对纹枯病有56.78%和24.81%的平均防效。通过分析发现,细菌潜在生防能力赋值与其生防效果具有0.717的相关性。本研究筛选获得对水稻纹枯病具有较稳定防治效果的4aYN11;并通过基于细菌潜在生防能力赋值,将病害防治的稳定性纳入考虑,改进了生防细菌的筛选方法,为未来生防菌的筛选提供了较为可靠的方法。2.枯草芽胞杆菌γ-聚谷氨酸的产生与其生物膜形成及定殖能力相关性研究土栖枯草芽胞杆菌分泌的多聚γ-谷氨酸（γ-PGA）是其主要的外泌多聚物之一。γ-聚谷氨酸的产生赋予枯草芽胞杆菌在琼脂培养基粘液状的菌落表型。γ-聚谷氨酸在枯草芽胞杆菌生理中的作用及其是否参与生物膜形成和细菌与宿主互作尚不清楚。本研究表明,环境中分离的枯草芽胞杆菌菌株具有不同的γ-聚谷氨酸产生能力,这种差异性表达可能是由于基因调控的差异性导致的。对大部分野生型菌株而言γ-聚谷氨酸对菌落生物膜的形态及强壮程度起着重要的作用。本研究展示了对γ-聚谷氨酸生物合成基因和生物膜基质产生基因的相反调控在基因水平的解释。结果显示Y-聚谷氨酸在细菌和植物生物防治番茄根定植起着显着的作用,表明γ-聚谷氨酸在枯草芽胞杆菌中植物的相互作用中的一个重要的功能。最后,综合γ-聚谷氨酸合成基因与生物膜形成相关基因的相反调控,提出了一个γ-聚谷氨酸与生物膜通过在不同定殖阶段的差异性表达,有利于生防菌在植物根系的附着、定殖以及形成多细胞群体。3.枯草芽胞杆菌通过识别蜡质芽胞杆菌胞外多糖激活生物膜形成的研究复合微生物菌剂的使用是实现对植物病害的高效、稳定生物防治的重要方式。在多种微生物共同存在的复合微生物制剂中,理解微生物之间的互作机制对复合微生物菌剂的制备及使用至关重要。在生物防治的田间应用中发现包含蜡质芽胞杆菌AR156与枯草芽胞杆菌SM21的复合微生物菌剂能够有效防治多种植物病害。在本研究中,对蜡质芽胞杆菌AR156与枯草芽胞杆菌SM21展开共培养并对共培养微生物的生物膜形成能力展开研究。发现在共培养中,蜡质芽胞杆菌AR156能够诱导枯草芽胞杆菌SM21生物膜相关基因epsA、tasA、sdpC的表达并增加微生物的生物量以及增强其生物膜的形成。枯草芽胞杆菌的kinC缺失突变体无法响应蜡质芽胞杆菌,表明KinC参与了蜡质芽胞杆菌对枯草芽胞杆菌生物膜形成的诱导。这种生物膜的诱导现象在供试的蜡质芽胞杆菌与枯草芽胞杆菌的共培养中普遍存在。经过进一步核酸酶及蛋白酶处理以及进一步的纯化,发现枯草芽胞杆菌能够利用蜡质芽胞杆菌的胞外多糖诱导自身生物膜的形成。4.蜡质芽胞杆菌外泌蛋白BC1280在生物膜及与枯草芽胞杆菌互作中作用研究蜡质芽胞杆菌被广泛认可为一种植物病害生物防治菌株。其形成生物膜的能力被认为是使蜡质芽胞杆菌在自然界中能够成功生存并产生防病效果的一个重要特征。近期研究鉴定的两个编码了与枯草芽胞杆菌中TasA蛋白和信号肽SipW同原蛋白的基因位点,sip W-tasA和calY,影响蜡质芽胞杆菌生物膜形成。在本研究中发现,在基因组上与此两基因簇临近的的之前的未知基因BC1280的表达也受到生物膜主效调控因子SinR的调控。SinR能够通过结合到三者的启动子直接抑制其表达。发现生物膜基质淀粉样蛋白的形成依赖于BC1280的存在,其表达能够回补枯草芽胞杆菌中tapA缺失突变体的生物膜表型。有趣的是,BC1280与TapA的氨基酸序列的相似度很低,BC1280在其C端具有独特的KE丰富的重复序列。重复序列的完全缺失会降低突变体的生物膜形成能力,但重复序列的减少并不影响其生物膜相关表型。另外,预测的β-折叠在BC1280起到一定生物学功能。据此,推测这些序列可能通过帮助BC1280和TasA蛋白的互作对生物膜的形成起到重要的作用。本研究一方面从病原菌多样性角度分析了生防菌防效不稳定的原因,构建了稳定筛选防治水稻纹枯病的有益细菌的体系,另一方面发现γ-聚谷氨酸在枯草芽胞杆菌生物膜形成过程中扮演着重要角色并且在调控上与其生物膜相关基因共同受到部分调控通路的控制;进一步的互作研究发现,在蜡质芽胞杆菌与枯草芽胞杆菌的共培养中,蜡质芽胞杆菌能够通过胞外多糖的产生诱导枯草芽胞杆菌生物膜的形成;而蜡质芽胞杆菌产生的假定蛋白BC1280在体内也能够有效拯救枯草芽胞杆菌因生物膜基质蛋白TapA的缺失导致的生物缺陷表型。这些关于复配生防菌的生物防治机理能够有效为生物防治的进一步研究提供思路与方向,为绿色、有机农业的生产实践提供物质及理论基础。
陈德强[7]（2018）在《香蕉穿孔线虫生防工程菌构建及其防控效果和发酵体系研究》文中研究说明香蕉穿孔线虫[Radopholus similis（Cobb,1893）Thorne,1949]是一种毁灭性的迁移内寄生植物病原线虫,广泛分布于热带、亚热带地区,严重危害粮食作物、果树和蔬菜等重要经济作物以及观赏植物等,是造成世界香蕉产量损失的主要原因之一。然而该线虫的防治仍然是一个世界性的难题,施用杀线剂是目前普遍采用和比较有效的防治方法,但杀线剂等化学药剂的大量使用对环境和人类造成极大的危害和其它负面影响,在许多国家和地区已被严格限制使用。因此研究和建立香蕉穿孔线虫防治的新途径和新方法已迫在眉睫,生物防治因其具有绿色环保、经济安全和可持续性等特点而受到重视和越来越多研究。胞外蛋白酶已被证实是食线虫微生物侵染线虫的重要毒力因子。本研究构建了香蕉穿孔线虫发生地香蕉根际土壤的微生物宏基因组Fosmid文库,从中筛选获得一个杀线虫活性较强的蛋白酶基因（编号pase4）,另外,从来自不同寄主的香蕉穿孔线虫10个种群中筛选得到一株优势可培养伴生细菌——荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）pf36菌株;在此基础上,通过载体转化和三亲本转导的方法将杀线虫蛋白酶基因pase4导入到pf36细胞中并使其正确表达,以期利用pf36与香蕉穿孔线虫的伴生关系,使杀线虫蛋白酶基因pase4通过pf36介导实现对香蕉穿孔线虫生长发育或侵染致病的抑制作用,从而达到有效防治香蕉穿孔线虫的目的;最后对遗传改造菌株的生物学特征、产蛋白酶活性、遗传稳定性、土壤定殖能力、体外杀线虫活性、盆栽生防效果及其对香蕉作物安全性进行了测定和评估。主要获得以下结果:1.对香蕉根际土壤细菌、古菌16S rDNA和真菌18S rDNA进行高通量测序和种类多样性分析,其丰富度和多样性由高至低依次为细菌>真菌>古菌,优势类群分别为酸杆菌GP1（Acidobacteria GP1）、Penidiella和Fervidicoccus,各类群中均存在一定比例的未能分类（unclassified）的序列。2.构建了香蕉根际土壤微生物宏基因组Fosmid文库,文库包含约35000个克隆,平均插入片段大小为30 kb左右,覆盖微生物基因组大小约1.05 Gb,通过功能驱动筛选方法获得6个具有蛋白酶水解活性的克隆子Pro1Pro6;分别构建Pro1Pro6的亚克隆筛选得到3个具有蛋白酶活性的亚克隆子Pro1’、Por4’和Pro6’,3个亚克隆子的发酵上清液均具有不同程度的杀线虫活性,其中Pro4’处理杀线虫活性最大。3.对亚克隆子Pro1’、Pro4’和Pro6’的插入序列分析表明各自包含一个完整的开放阅读框,分别编码3个相对应的蛋白酶（PASE1、PASE4和PASE6）;3种蛋白酶均为分泌型亲水蛋白。4.通过原核表达获得成熟的蛋白酶PASE4,大小约为32 kDa,并证实PASE4能有效降解香蕉穿孔线虫的体内组织,具有显着的杀线虫活性;建立了利用胡萝卜纯愈伤组织培养繁殖无菌香蕉穿孔线虫的方法。5.从来自不同寄主植物的香蕉穿孔线虫10个种群中共分离得到53株可培养伴生细菌,确定洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）和短小芽孢杆菌（Bacillus cereus）为供试线虫种群的优势伴生细菌;并以荧光假单胞菌pf36菌株作为遗传改造的目标菌株。6.通过载体转化和接合转导的方法将杀线虫蛋白酶基因pase4导入伴生细菌pf36获得了遗传改造菌p4MCS-pf36和p4Tn5-pf36;p4MCS-pf36的产蛋白酶能力和杀线虫活性均比p4Tn5-pf36高,但后者遗传稳定性、土壤定殖能力和盆栽防治效果均好于前者。7.确定了p4Tn5-pf36产蛋白酶的优化发酵体系:培养组分为甘油10 mL/L、酵母粉15 g/L、氯化钾1 g/L,培养条件为温度34.5℃、初始pH 7.66、接种量为8.0%、转速274 r/min;优化后发酵液中最高蛋白酶活力为109.928 U/mL,比优化前提高1.58倍。综上所述,本研究从构建的香蕉根际土壤微生物宏基因组中筛选获得一个具有较强杀线虫活性的蛋白酶基因pase4,并从不同的香蕉穿孔线虫种群中分离得到一株优势伴生细菌荧光假单胞菌pf36菌株;通过分子生物学方法成功将基因pase4导入到菌株pf36中并正确表达,并获得了遗传稳定良好且对香蕉穿孔线虫具一定防效改造菌株。初步实现了以伴生细菌为载体介导表达生防因子抑制香蕉穿孔线虫生长繁殖或侵染致病的的目的。研究结果将为香蕉穿孔线虫的防治提供安全、有效的新方法,同时也为研究建立高效、环保和可持续的植物线虫生物防治技术提供新策略和新途径。
王鑫[8]（2017）在《柑橘溃疡病菌拮抗菌的筛选及F9菌株抑菌物质的探究》文中研究表明柑橘溃疡病由黄单胞杆菌属地毯草黄单胞柑橘致病变种（Xanthomonas axonopodis pv.citri,Xac）引起的一种细菌性病害。柑橘溃疡病菌能侵染植株的叶片、枝条、皮刺和果实,引起叶片及果实溃疡斑,降低果实的品质和营养价值,严重时会导致落叶落果,树势减弱,已经被列为世界范围内的检疫性病害。目前,普遍采用铜制剂及农用抗生素进行防治。然而,传统化学农药施用易引起了环境污染、农药残留及病原菌耐药性等一系列问题,使得近年来发展安全、无毒、无污染的新型生物农药倍受重视。本文旨在筛选拮抗柑橘溃疡病菌的土壤细菌,并针对鉴定到的一株F9拮抗菌株,进行其抑菌物质的初步探索。1.本文从湖南省永州市江永县患病的柑橘果园根际土壤中取样,分离根际微生物。采用抑菌圈法筛选拮抗柑橘溃疡病菌的细菌,总共筛选到22株具有抑菌活性的细菌。采用细菌16SrDNA基因序列比对的方法,初步鉴定其中2株属于假单胞属,1株属于节杆菌属,19株属于芽孢杆菌属。对其中抑菌效果明显的菌株上清液进行抑菌活性实验,其中编号F4,F6,F9的三株细菌上清液具有抑菌活性。2.文中选取了抑菌活性最强的F9菌株进行了深入研究。采用扫描电镜形态学观察,16SrDNA序列分析、生理生化培养特征分析、以及芽孢杆菌β-甘露聚糖酶基因特异扩增分析,确定菌株F9为解淀粉芽孢防菌（Bacillus amyloliquefaciens）。盆栽接种防效实验表明,该F9菌株能有效的降低Xac引起的柑橘溃疡菌的发生和扩张。3.本文接下来对F9菌株上清液的抑菌活性成分进行分析。查阅前人对解淀粉芽孢杆菌的生防活性成分,发现解淀粉芽孢杆菌的抑菌物质主要是蛋白类、脂肽类物质。本文中采用硫酸盐沉淀上清液蛋白的方法,发现F9发酵上清液粗提蛋白耐高温、耐蛋白酶K,不太符合蛋白类物质的特性,从而推测F9菌株的抑菌物质可能是脂肽类物质;进一步用丙酮抽提F9菌株粗提蛋白成分,发现其抽提成分具有抑菌活性,推测F9菌株抑菌物质不是蛋白类物质,而可能是脂肽类物质;最后,采用酸沉淀丙酮抽提的方法提取F9发酵上清液中的抑菌物质,得到粗提脂肽类物质,经抑菌圈法测试,它具有抑菌活性,且化学性质稳定,可以耐80℃高温、耐蛋白酶K消化,因此推测抑菌活性物可能为脂肽类物质。4.F9菌株粗提脂肽采用HiTrap DEAE阴离子交换柱进一步分离,发现有两个峰,一个穿透峰,一个洗脱峰,活性物质主要集中在洗脱峰。收集洗脱峰不同时间段的成分,抑菌圈法活性测试发现,活性成分主要集中在峰的中部。收集有活性的组分用Sephadex G-25凝胶过滤柱进一步分离,分离结果显示有三个峰,活性成分在最后一个峰,分离纯化后的活性成分利用LC-MS对样品进行质谱分析,通过与肽质量指纹谱比对进行抑菌物质的鉴定,抑菌物质可能是多种成分的复合物,其中包含Bacillomycin L成分,其有效活性成分有待进一步的鉴定。
蒋春号[9]（2016）在《蜡质芽胞杆菌AR156诱导植物对丁香假单胞菌及南方根结线虫抗性机理研究》文中研究指明蜡质芽胞杆菌AR156（缩写为Bc AR156）是本实验室前期从森林树木根围土壤中分离的一株植物根围促生细菌（PGPR）,可广谱性防治茄劳尔氏菌引起的蔬菜青枯病、辣椒疫霉引起的疫病、尖孢镰刀菌引起的枯萎病和南方根结线虫引起的根结线虫病。目前该菌株已经获得相关专利,完成全基因组解析,获得防治番茄根结线虫病害的生物农药正式登记证。前期研究发现Bc AR156能够诱导拟南芥产生对丁香假单胞菌番茄致病变种（Pseudomonassyringae pv.tomato,以下简称Pst）DC3000系统抗性;机理研究表明,Bc AR156诱导拟南芥产生的系统抗性是通过同时激活水杨酸以及茉莉酸/乙烯两条信号通路,同时具有NPR1依赖性。为什么Bc AR156能同时激活拟南芥体内这两条信号通路,而其他生防因子如荧光假单胞菌、部分芽胞杆菌只能激活其中的某一条信号途径?Bc AR156如何被植物体识别,从而激活植物体的系统抗性?在Bc AR156诱导抗性过程中植物内源small RNA的调控作用是什么?除了上述广谱抗病机理外,既然根结线虫与其他病原物的致病机理完全不同,Bc AR156又是如何高效特异性地防治蔬菜根结线虫病害的?这些关于Bc AR156的生防机理问题的解决,将能更有效地推广使用生物农药活菌制剂,推动微生物农药产业的发展。本研究以Bc AR156为生防菌,以拟南芥、番茄为模式植物,以Pst DC3000、南方根结线虫为模式病原,进行三者互作研究,探究生防菌防病机理。本研究首先从转录因子角度出发,清楚地解析了 Bc AR156诱导抗病性机理,最终筛选发现Bc AR156分泌的胞外多糖（EPS）能够作为一种微生物相关分子模式（MAMPs）,被植物体表面模式识别受体识别,进而激活植物体自身防卫反应;同时发现植物内源miRNA:miR472和miR825/825*也参与调控Bc AR156诱导系统抗性过程。针对根结线虫的特异性生防机理研究发现,Bc AR156一方面能够改变番茄根系结构,促进番茄根系的快速成熟,从而降低根结线虫对番茄根系的侵染概率;另一方面Bc AR156还能抑制根结线虫某些效应因子编码基因的表达,降低其对番茄的致病力,最终达到高效防治番茄根结线虫的效果。1.转录因子WRKY70和WRKY11在调控蜡质芽胞杆菌AR156诱导系统抗性过程中的作用机理研究以拟南芥为模式植物探寻转录因子WRKY70和WRKY11在Bc AR156诱导系统抗性过程中所起作用。结果表明,Bc AR156处理拟南芥后,能够显着提升植物体内转录因子WRKY70的表达量,同时显着抑制WRKY11的表达。研究还发现转录因子WRKY70和WRKY11为Bc AR156诱导细胞防卫反应以及防卫相关基因的表达所必须。过量表达转录因子WRKY70和WRKY11能够影响Bc AR156诱导拟南芥产生对Pst DC3000的抗性。突变体验证结果显示:Bc AR156诱导抗性的能力在转录因子WRKY70和WRKY11单突变体拟南芥植株中能够保留,但抗性能力略微下降,然而在WRKY70和WRKY11双突变体植株中则完全丧失。以上结果表明,转录因子WRKY70和WRKY11是通过两条不同途径调控Bc AR156诱导系统抗性的,并且这两条途径之间具有协调作用。转录因子WRKY70和WRKY11靶标分析结果表明:WRKY70通过水杨酸信号通路,WRKY11通过茉莉酸信号通路来调控Bc AR156诱导的系统抗性,而且这两条调控通路之间具有NPR1的依赖性。综合上述结果,发现转录因子WRKY70和WRKY11在调控Bc AR156诱导系统抗性过程中起着重要的作用。本研究也是首次从转录因子角度出发,阐明根围有益微生物如何同时激活水杨酸、茉莉酸/乙烯两条信号通路,来诱导寄主植物对病原菌的抗性。2.蜡质芽胞杆菌AR156胞外多糖作为一类MAMPs激活植物系统免疫在诱导系统抗性过程中,植物体对Bc AR156的早期识别起着重要作用。本研究结果表明,Bc AR156分泌的胞外多糖能够诱导拟南芥产生对Pst DC3000的系统抗性;在此过程中,能够提升防卫相关基因PR1、PR2、PR5以及MAPK激酶MPK6的上调表达;另外,也能够激活植物体细胞防卫反应如活性氧爆发、胼胝质沉积以及防卫相关酶活性的提升。基因上位性分析结果显示,Bc AR156胞外多糖仍能够在信号通路突变体jar1、etr1中诱导对Pst DC3000的系统抗性,与野生型Col-0相比,其在突变体jar1、etr1中诱导抗性能力略有降低;在NahG转基因植物以及npr1突变体中,Bc AR156胞外多糖的诱导抗性能力丧失。以上结果表明,Bc AR156胞外多糖诱导的系统抗性依赖MAMPs信号识别和水杨酸信号通路转导,并且具有NPR1依赖性。综上所述,Bc AR156胞外多糖在Bc AR156诱导系统抗性过程中,作为一类MAMPs,发挥着重要的作用。3.Sma11 RNAs在生防菌诱导植物抗病中的调节作用为研究植物内源small RNA在调控植物诱导抗性的机理,本研究利用deep sequencing以及生物信息学技术,筛选获得一些参与调控植物诱导抗性的miRNA。Northern Blot验证试验结果显示,在Bc AR156诱导拟南芥产生对Pst DC3000的抗性过程中,miR472,miR825和miR825*三种miRNA在Bc AR156处理的拟南芥叶片内被显着下调。对上述miRNA靶标预测结果显示,miR472,miR825和miR825*的靶标主要参与植物基础免疫,其中miR825靶标主要一些泛素蛋白连接酶;miR472和miR825*的靶标主要是一些参与ETI途径的R基因。研究发现上述预测的靶基因的表达受到miRNA负向调控。另外,miRNA缺失突变体表现出对病原细菌Pst DC3000的抗性。与此相反,miRNA过表达转基因植株对病原菌更敏感。综上所述,BcAR156通过抑制miR472、miR825和miR825*三种miRNA的表达,引起其靶标基因的上调,从而激活植物体自身的防卫反应,诱使植物产生系统抗性。4.蜡质芽胞杆菌AR156调控植物根系发育防治根结线虫病害的机理研究本研究发现,Bc AR156处理番茄根系能够诱导其结构变化;加速根系的成熟化（如根毛增多,根毛区比例显着增加）,从而降低根结线虫进入植物体内的概率;减少植物根系内根结线虫的虫口数,从而获得防治根结线虫的效果。为探究Bc AR156防治根结线虫的机理,我们从植物根系结构发育角度出发,利用转录组学分析技术,探究Bc AR156改变植物根系结构防治根结线虫的分子机理。转录组结果显示,Bc AR156能够引起植物体内一系列与发育相关基因的表达,其中最为显着的是与脱落酸、乙烯、热激蛋白相关的基因,定量PCR验证结果与预测结果相同。综上所述,Bc AR156能够调控一些与脱落酸、乙烯、热激蛋白相关的基因,来调控植物根系的发育;加速根系的成熟化,进而诱导植物抵抗根结线虫的侵染。5.蜡质芽胞杆菌AR156调控根结线虫效应因子表达防治病害的机理研究研究发现利用Bc AR156预处理植物后接种根结线虫,能够显着降低线虫的侵染,为深入探究其生防机理,本研究利用转录组学分析技术进行研究。结果显示,Bc AR156处理能够抑制根结线虫效应因子编码基因的下调表达;Q-RT-PCR验证发现有11个效应因子的表达受到Bc AR156的抑制。本研究首次发现,生防菌能够通过抑制根结线虫效应因子的表达而降低根结线虫的致病力,以达到防治目的。
王晓强[10]（2016）在《植物根际促生菌Lyc2和XW10的鉴定及抑菌机理研究》文中研究说明植物病害是影响农业高产稳产和优质的主要因素之一。生物防治作为一种绿色安全的防治措施,不仅可以有效降低病虫害对农作物造成的损失还可以促进植物生长,提高植物抗病性,增加作物产量。本研究以植物病原菌为指示菌筛选拮抗活性较高的植物根际促生菌（plant growth-promoting rhizobacteria,PGPR）,并进行种属鉴定;构建PGPR菌株突变体库,克隆生防相关基因,研究PGPR菌株的拮抗机制。主要研究结果如下:1、鉴定了菌株Lyc2的系统分类地位。通过生理生化特征、16S rRNA序列分析、多位点序列分型分析（multilocus sequence typing,MLST）以及全基因组测序等方法,证明菌株Lyc2为吡咯伯克霍尔德氏菌（Burkholderia pyrrocinia）。2、获得了菌株Lyc2的全基因组草图。为寻找潜在的次生代谢产物生物合成基因簇,对Lyc2基因组序列进行了生物信息学预测分析,共发现8类,15个次生代谢产物生物合成基因簇。主要包括,Arylpolyene类（2个）、Terpene类（5个）、Phosphonate类（1个）、Hserlactone类（1个）、Nrps类（2个）、Bacteriocin类（2个）、Nrps-Type I PKS类（1个）和其它类（1个）。3、探索Lyc2的抗菌机制。构建菌株Lyc2的随机突变体库,通过测序验证得到一个55.2kb负责抗真菌物质生物合成的基因簇ocfABCDEFGHIJKLMN,该基因簇编码一个由八个氨基酸残基组成的环状抗菌多肽化合物occidiofungin。对功能未知的ocfI基因的突变及基因互补实验表明,ocfI基因直接参与抗菌多肽occidiofungin的生物合成;另外,筛选得到一个失去细菌拮抗能力的突变体。序列分析表明,突变基因与菌株Burkholderia ambifaria AMMD的谷胱甘肽合成酶基因（glutathione synthase）具有较高同源性,核苷酸序列一致率为93.3%。对突变体的功能分析及互补实验结果表明,谷胱甘肽合成酶基因与菌株Lyc2对病原细菌的拮抗活性直接相关。4、明确了假单胞菌XW10的系统分类地位。分离自大豆根际的假单胞菌XW10对多种病原菌尤其是青枯劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum）具有显着拮抗活性。通过生理生化、16S rRNA和MLST分析发现菌株XW10与之前报道的假单胞属细菌具有显着差异,为假单胞菌属的一个新种,命名为Pseudomonas beanensis XW10。5、明确了菌株XW10对R.solanacearum的拮抗机制。构建了菌株XW10的随机突变体库,筛选得到一个失去R.solanacearum抗性的突变体。对突变体的分析表明,发生突变的基因为双精氨酸转运系统（Twin-arginine translocase secretion system,Tat）中的TatA基因。功能互补试验表明,互补TatA基因可以恢复突变体对病原菌的拮抗活性,说明Tat系统介导的转运途径对P.beanensis XW10拮抗R.solanacearum具有重要作用。
二、PGPR生防作用的不稳定性及可能的改进策略（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、PGPR生防作用的不稳定性及可能的改进策略（论文提纲范文）
（1）珠芽蓼根际促生菌Bacillus mycoides Gnyt1比较基因组及其功能基因研究（论文提纲范文）
| 项目来源 |
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 缩略词 |
| 前言 |
| 研究内容 |
| 研究技术路线 |
| 第一章 国内外研究进展 |
| 1.1 农业发展与植物根际的关系 |
| 1.2 植物根际微生物的定义及功能 |
| 1.2.1 植物根际微生物的定义 |
| 1.2.2 植物根际微生物的生态功能 |
| 1.3 植物根际促生菌 |
| 1.3.1 植物根际促生菌概念 |
| 1.3.2 植物根际促生菌的分类 |
| 1.3.3 植物根际促生菌的作用机理 |
| 1.4 微生物基因组学与分子生物技术运用的研究现状 |
| 1.4.1 基因组测序技术 |
| 1.4.2 生物信息技术 |
| 1.4.3 微生物比较基因组学研究现状 |
| 1.4.4 固氮基因的研究现状 |
| 1.4.5 溶磷基因的研究现状 |
| 1.4.6 与铁载体有关基因的研究现状 |
| 1.5 优良植物根际促生菌株Bacillus mysoides Gnyt1的研究进展 |
| 第二章 植物根际促生菌Bacillus mycoides Gnyt1生物学特性的研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 菌株生长曲线的测定 |
| 2.2.2 菌株对pH的适应能力的测定 |
| 2.2.3 菌株对温度耐受性的测定 |
| 2.2.4 菌株溶磷特性的测定 |
| 2.2.5 菌株分泌植物激素特性的测定 |
| 2.2.6 菌株固氮特性的测定 |
| 2.2.7 数据处理与分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 菌株生长曲线的测定 |
| 2.3.2 菌株最适pH的测定 |
| 2.3.3 菌株最适温度的测定 |
| 2.3.4 菌株的溶磷能力 |
| 2.3.5 菌株的分泌植物激素能力 |
| 2.3.6 菌株的固氮能力 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 植物根际促生菌Bacillus mycoides Gnyt1比较基因组学研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 Bacillus mysoides Gnyt1菌株基因组特征 |
| 3.2.2 Bacillus mysoides Gnyt1菌株基因组圈图 |
| 3.2.3 基于单拷贝基因的系统发育树构建 |
| 3.2.4 基于Mauve的共线性分析 |
| 3.2.5 基因家族分析 |
| 3.2.6 基于MUMmer的全基因组序列比对 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 Bacillus mycoides Gnyt1固氮基因的克隆及功能验证 |
| 4.1 试验材料与试剂耗材 |
| 4.1.1 培养基配方 |
| 4.1.2 主要试剂耗材 |
| 4.1.3 PCR引物与设计 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 序列分析和系统发育预测 |
| 4.2.2 Bacillus mysoides Gnyt1菌株基因组DNA的提取 |
| 4.2.3 RNA分离和cDNA合成 |
| 4.2.4 克隆基因nifDRSUUx |
| 4.2.5 目的基因连接克隆载体 |
| 4.2.6 构建pBI-nifDRSUUx不同长度目的基因表达载体 |
| 4.2.7 表达载体pBI121质粒双酶切 |
| 4.2.8 表达载体pBI121与目的片段连接 |
| 4.2.9 连接产物大肠杆菌的转化 |
| 4.2.10 蓝白斑筛选与重组质粒的双酶切鉴定 |
| 4.2.11 重组菌固氮酶活性的测定 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 克隆Bacillus mysoides Gnyt1菌株的5个nif基因 |
| 4.3.2 质粒的构建 |
| 4.3.3 回收双酶切质粒 |
| 4.3.4 连接表达载体 |
| 4.3.5 系统发育分析 |
| 4.3.6 大肠杆菌转化 |
| 4.3.7 固氮酶活性的鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 Bacillus mycoides Gnyt1溶磷基因的克隆及功能验证 |
| 5.1 试验材料与试剂耗材 |
| 5.1.1 培养基配方 |
| 5.1.2 主要试剂耗材 |
| 5.1.3 PCR引物与设计 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 序列分析和系统发育预测 |
| 5.2.2 Bacillus mycoide Gnyt1菌株基因组DNA的提取 |
| 5.2.3 克隆基因pqqABCE |
| 5.2.4 目的基因连接克隆载体 |
| 5.2.5 构建pBI-pqqABCE不同长度目的基因表达载体 |
| 5.2.6 表达载体pBI121质粒双酶切 |
| 5.2.7 表达载体pBI121与目的片段连接 |
| 5.2.8 连接产物大肠杆菌的转化 |
| 5.2.9 蓝白斑筛选与重组质粒的双酶切鉴定 |
| 5.2.10 重组菌溶磷菌能力的测定 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 克隆Bacillus mycoide Gnyt1的4个pqq基因 |
| 5.3.2 质粒构建 |
| 5.3.3 回收双酶切质粒 |
| 5.3.4 连接表达载体 |
| 5.3.5 系统发育树分析 |
| 5.3.6 大肠杆菌转化 |
| 5.3.7 溶磷特性分泌有机酸的鉴定 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 植物根际促生菌Bacillus mycoides Gnyt1铁载体分泌相关功能基因的挖掘 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 铁载体的检测 |
| 6.1.3 DNA的提取与检测 |
| 6.1.4 测序文库的构建 |
| 6.1.5 全基因组测序 |
| 6.1.6 序列处理 |
| 6.1.7 功能基因的注释 |
| 6.1.8 与铁载体相关基因的代谢途径 |
| 6.2 结果和分析 |
| 6.2.1 产铁载体测定 |
| 6.2.2 DNA的检测 |
| 6.2.3 序列信息统计 |
| 6.2.4 基因组圈图绘制 |
| 6.2.5 蛋白编码基因功能注释 |
| 6.2.6 菌株Gnyt1基因组的组成 |
| 6.2.7 与铁载体有关基因的注释 |
| 6.2.8 功能基因代谢途径 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 基于qRT-PCR分析植物根际促生菌Bacillus mycoides Gnyt1固氮基因和溶磷基因的表达 |
| 7.1 试验材料与试剂耗材 |
| 7.1.1 培养基配方 |
| 7.1.2 主要试剂耗材 |
| 7.2 实验方法 |
| 7.2.1 不同时期固氮基因的表达量分析 |
| 7.2.2 不同时期溶磷基因的表达量分析 |
| 7.2.3 重组菌株总RNA的提取和检测 |
| 7.2.4 表达量分析 |
| 7.2.5 数据处理 |
| 7.3 结果与分析 |
| 7.3.1 固氮基因RNA的检测结果 |
| 7.3.2 溶磷基因RNA的检测结果 |
| 7.3.3 固氮基因不同培养时间基因表达量差异 |
| 7.3.4 溶磷基因不同培养时间基因表达量差异 |
| 7.4 讨论 |
| 7.5 小结 |
| 第八章 重组固氮菌株和重组溶磷菌株的主要代谢产物研究 |
| 8.1 试验材料与试剂耗材 |
| 8.1.1 培养基配方 |
| 8.1.2 主要试剂耗材 |
| 8.2 实验方法 |
| 8.2.1 菌株培养 |
| 8.2.2 色谱条件 |
| 8.2.3 质谱条件 |
| 8.2.4 供试品样品制备方法 |
| 8.2.5 提取代谢物 |
| 8.2.6 数据处理 |
| 8.3 结果与分析 |
| 8.3.1 重组菌株靶向代谢组学的检测结果 |
| 8.3.2 重组固氮菌株液相色谱-质谱联用技术代谢产物定性定量分析 |
| 8.3.3 重组溶磷菌株液相色谱-质谱联用技术代谢产物定性定量分析 |
| 8.3.4 重组菌株靶向代谢组学固氮溶磷菌株热图 |
| 8.4 讨论 |
| 8.5 小结 |
| 第九章 结论与展望 |
| 9.1 主要结论 |
| 9.2 本研究的特色与创新点 |
| 9.2.1 研究特色 |
| 9.2.2 研究创新点 |
| 9.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 在读期间发表论文及研究成果等 |
| 导师简介 |
（2）基于乳清分离蛋白乳化/凝胶的营养活性成分共包埋研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩写符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 营养活性成分的共包埋研究 |
| 1.1.1 营养活性成分简介 |
| 1.1.2 共包埋营养活性成分研究进展 |
| 1.2 乳清分离蛋白 |
| 1.3 WPI乳状液 |
| 1.4 WPI水凝胶 |
| 1.5 乳液填充凝胶 |
| 1.6 多重乳状液设计:配方和乳化技术 |
| 1.6.1 配方选择 |
| 1.6.2 乳化技术 |
| 1.7 立题依据及研究内容 |
| 1.7.1 立题依据 |
| 1.7.2 研究内容 |
| 第二章 乳液填充凝胶对白藜芦醇和α-生育酚的共包埋研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 乳液填充凝胶制备 |
| 2.3.2 白藜芦醇和α-生育酚定量 |
| 2.3.3 白藜芦醇和α-生育酚包埋率计算 |
| 2.3.4 体外模拟消化 |
| 2.3.5 数据处理与分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 成胶过程监测 |
| 2.4.2 白藜芦醇和α-生育酚包埋 |
| 2.4.3 体外模拟释放评价 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 W/O/W型乳状液制备及对L-抗坏血酸和α-生育酚的共包埋研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 溶液配制 |
| 3.3.2 W/O型乳状液制备 |
| 3.3.3 W/O/W型乳状液制备 |
| 3.3.4 配方相容性 |
| 3.3.5 乳状液表征 |
| 3.3.6 内水相包埋性能评估 |
| 3.3.7 L-抗坏血酸和α-生育酚共包埋 |
| 3.3.8 数据处理与分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 W/O型乳状液制备 |
| 3.4.2 W/O型乳状液表征 |
| 3.4.3 W/O/W型乳状液制备 |
| 3.4.4 W/O/W型乳状液表征 |
| 3.4.5 L-抗坏血酸和α-生育酚共包埋 |
| 3.5 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 Ⅰ:作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
| 附录 Ⅱ:附图 |
（3）产酶溶杆菌新株Lysobacter enzymogenes LE16的促生防病作用及机理（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 植物根际促生菌 |
| 1.1.1 植物根际及微生物 |
| 1.1.2 植物根际促生菌(PGPR) |
| 1.1.3 PGPR的作用及其机理 |
| 1.1.4 PGPR的研究方法 |
| 1.1.5 PGPR的利用现状及发展方向 |
| 1.2 产酶溶杆菌 |
| 1.2.1 溶杆菌简介及分类地位 |
| 1.2.2 产酶溶杆菌 |
| 1.2.3 产酶溶杆菌对植物病害的防治作用及其机理 |
| 1.2.4 产酶溶杆菌的研究展望 |
| 第2章 绪论 |
| 2.1 立题依据 |
| 2.2 研究目标 |
| 2.3 研究内容 |
| 2.4 技术路线 |
| 第3章 目标菌株的筛选、鉴定及生物学性质研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 试验地概述 |
| 3.2.2 试验材料 |
| 3.2.3 试验方法 |
| 3.2.4 数据分析与统计 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 目标菌株的筛选 |
| 3.3.2 目标菌株的基本生物学性质 |
| 3.3.3 目标菌株的分子鉴定 |
| 3.3.4 菌株LE16的全基因序列 |
| 3.3.5 菌株LE16促生功能相关基因 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 目标菌株的筛选及其基本生物学性质研究 |
| 3.4.2 目标菌株的种类鉴定及功能预测 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 菌株Lysobacter enzymogenes LE16 对土壤有机氮磷的活化作用 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 试验材料 |
| 4.2.2 试验方法 |
| 4.2.3 测定指标及方法 |
| 4.2.4 数据分析与统计 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 菌株LE16水解有机氮 |
| 4.3.2 菌株LE16水解有机磷 |
| 4.3.3 菌株LE16在土壤中的存活情况 |
| 4.3.4 菌株LE16活化土壤有机氮 |
| 4.3.5 菌株LE16活化土壤有机磷 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 菌株LE16对有机氮磷的水解作用 |
| 4.4.2 菌株LE16对土壤有机氮磷的活化作用 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 菌株Lysobacter enzymogenes LE16 对蔬菜(生菜、辣椒)生长的促进作用 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 试验材料 |
| 5.2.2 试验方法 |
| 5.2.3 测定指标及方法 |
| 5.2.4 数据分析与统计 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 菌株LE16对蔬菜生长的影响 |
| 5.3.2 菌株LE16对盆栽土壤养分含量的影响 |
| 5.3.3 菌株LE16对盆栽土壤微生物量及酶活性的影响 |
| 5.3.4 相关性分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第6章 菌株Lysobacter enzymogenes LE16 的抑菌作用及机理 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 试验材料 |
| 6.2.2 试验方法 |
| 6.2.3 测定指标及方法 |
| 6.2.4 数据分析与统计 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 菌株LE16对微生物的拮抗作用 |
| 6.3.2 菌株LE16发酵液的基本性质及其制备研究 |
| 6.3.3 菌株LE16发酵液的热稳定性及保质期研究 |
| 6.3.4 菌株LE16的抑菌机理 |
| 6.4 讨论 |
| 6.4.1 菌株LE16对微生物的拮抗作用及机理 |
| 6.4.2 菌株LE16发酵液的制备 |
| 6.5 小结 |
| 第7章 菌株Lysobacter enzymogenes LE16 对植物病害的防治作用 |
| 7.1 前言 |
| 7.2 材料与方法 |
| 7.2.1 试验材料 |
| 7.2.2 试验方法 |
| 7.2.3 测定指标及方法 |
| 7.2.4 数据分析与统计 |
| 7.3 结果与分析 |
| 7.3.1 菌株LE16发酵液对烤烟黑胫病的防治作用 |
| 7.3.2 菌株LE16发酵液对辣椒疫病的防治作用 |
| 7.3.3 菌株LE16发酵液对黄瓜蔓枯病的防治作用 |
| 7.3.4 菌株LE16发酵液对温室烤烟和黄瓜白粉病的防治作用 |
| 7.3.5 菌株LE16发酵液对田间烤烟白粉病的治疗作用 |
| 7.4 讨论 |
| 7.4.1 菌株LE16发酵液对作物病害的防治作用 |
| 7.4.2 菌株LE16发酵液对作物白粉病的防治作用 |
| 7.5 小结 |
| 第8章 结论与展望 |
| 8.1 主要结论 |
| 8.2 研究创新点 |
| 8.3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 论文、专利及课题成果 |
（4）解淀粉芽胞杆菌FZB42 sRNA生防功能的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 上篇 文献综述 |
| 第一章 植物根际促生细菌的定殖机制研究及芽胞形成研究 |
| 1 植物根际促生细菌 |
| 2 植物根际定殖 |
| 2.1 生物膜概述 |
| 2.2 群集运动概述 |
| 3 芽胞形成 |
| 3.1 芽胞的结构 |
| 3.2 芽胞形成的调控机制 |
| 第二章 细菌sRNA的研究进展 |
| 1 细菌sRNA和Hfq的概念 |
| 2 细菌sRNA的调控机理 |
| 3 细菌sRNA的功能 |
| 4 芽胞杆菌sRNA的研究进展 |
| 5 本研究的目的和意义 |
| 下篇 研究内容 |
| 第一章 解淀粉芽胞杆菌FZB42 sRNA突变体和Hfq突变体的构建及相关表型检测 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株和培养基 |
| 1.2 酶和试剂 |
| 1.3 植物材料 |
| 1.4 引物设计与合成 |
| 1.5 突变体的构建 |
| 1.6 生长曲线测定 |
| 1.7 生物膜表型检测 |
| 1.8 Swarming检测 |
| 1.9 产胞效率实验 |
| 1.10 耐低温特性检测 |
| 1.11 耐盐特性检测 |
| 1.12 耐酸特性检测 |
| 1.13 抗过氧化物能力检测 |
| 1.14 对水稻种子的促生能力检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 sRNA突变体及Hfq突变体的构建 |
| 2.2 sRNA突变体生长曲线 |
| 2.3 sRNA突变体生物膜表型 |
| 2.4 sRNA突变体swarming表型 |
| 2.5 sRNA突变体产胞效率 |
| 2.6 sRNA突变体耐低温能力 |
| 2.7 sRNA突变体耐盐能力 |
| 2.8 sRNA突变体耐酸能力 |
| 2.9 sRNA突变体抗过氧化物能力 |
| 2.10 sRNA突变体对水稻种子的促生作用 |
| 3 讨论 |
| 第二章 Bas03调控生物膜形成的机制研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 菌株和培养基 |
| 1.2 酶和试剂 |
| 1.3 荧光定量PCR |
| 1.4 HPLC检测surfactin表达情况 |
| 1.5 Lacz报告菌株的构建及β-半乳糖苷酶活性测定 |
| 1.6 srfAC mRNA半衰期测定 |
| 1.7 Northern印迹杂交实验方法 |
| 1.8 RNA EMSA实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 保守性分析 |
| 2.2 sRNA Bas03与Hfq蛋白的依赖性研究 |
| 2.3 sRNA Bas03靶标基因的预测 |
| 2.4 sRNA Bas03靶标基因的验证 |
| 2.5 sRNA Bas03调控srfAC的作用机理研究 |
| 2.6 sRNA、靶标基因srfAC及Hfq蛋白三者互作关系研究 |
| 3 讨论 |
| 第三章 Bas32调控芽胞形成的相关分子机制研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 菌株和培养基 |
| 1.2 酶和试剂 |
| 1.3 含荧光质粒菌株的构建 |
| 1.4 荧光定量PCR |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 保守性分析 |
| 2.2 产胞相关基因表达强度检测 |
| 2.3 sRNA Bas32和Hfq的依赖性研究 |
| 2.4 sRNA Bas32靶标基因的预测 |
| 2.5 荧光定量PCR检测野生型和△Bas32中spoVAE1的表达 |
| 3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 1 本研究所用引物序列 |
| 2 本研究所用培养基 |
| 2.1 LB液体培养基 |
| 2.2 LB固体培养基 |
| 2.3 Landy液体培养基 |
| 2.4 芽胞杆菌感受态制备所用培养基 |
| 2.5 Msgg培养基 |
| 2.6 SM液体培养基 |
| 基金项目 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
（5）巨大芽孢杆菌对次生盐渍化土壤硝酸盐的转化途径及其机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 设施栽培土壤硝酸盐型次生盐渍化的现状与改良措施 |
| 1.1.1 设施栽培土壤硝酸盐型次生盐渍化的现状 |
| 1.1.2 设施栽培土壤硝酸盐型次生盐渍化的成因 |
| 1.1.3 设施栽培土壤硝酸盐型次生盐渍化的改良措施 |
| 1.2 微生物转化硝酸盐的途径 |
| 1.2.1 硝酸盐同化途径 |
| 1.2.2 反硝化途径 |
| 1.2.3 硝酸盐异化还原成铵途径 |
| 1.3 硝酸盐还原途径中关键酶的研究进展 |
| 1.3.1 硝酸盐还原酶研究进展 |
| 1.3.2 亚硝酸盐还原酶研究进展 |
| 1.4 根际促生菌在农业中的应用前景 |
| 1.4.1 根际中植物与微生物的互作 |
| 1.4.2 根际微生物的作用机制 |
| 1.4.3 PGPR菌株的筛选和鉴定 |
| 1.4.4 PGPR的商业化 |
| 1.5 根际微生物多样性的重要性及其应用 |
| 1.5.1 链霉菌属多样性的重要性和应用 |
| 1.5.2 芽孢杆菌属多样性的重要性和应用 |
| 1.5.3 假单胞菌属多样性的重要性和应用 |
| 1.6 论文的研究意义、内容与技术路线 |
| 1.6.1 研究意义 |
| 1.6.2 研究内容 |
| 1.6.3 技术路线 |
| 第二章 巨大芽孢杆菌NCT-2 硝酸盐转化途径解析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 供试菌株与培养基 |
| 2.2.2 主要材料与试剂 |
| 2.2.3 仪器与设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 好氧、厌氧和静止培养条件的建立 |
| 2.3.2 NCT-2 菌株生长曲线的测定 |
| 2.3.3 培养基中无机氮和全氮含量测定 |
| 2.3.4 菌体细胞干重和全氮含量测定 |
| 2.3.5 氧化亚氮气体浓度测定 |
| 2.3.6 统计学方法 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 好氧培养条件下NCT-2 菌株DNRA途径的分析 |
| 2.4.2 静止培养条件下菌株DNRA途径的分析 |
| 2.4.3 厌氧条件下菌株NCT-2 反硝化途径的分析 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 NCT-2 菌株硝酸盐还原酶的异源表达与酶学性质研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 供试菌株与质粒 |
| 3.2.2 主要试剂与培养基 |
| 3.2.3 仪器与设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 硝酸盐还原酶的序列比对分析 |
| 3.3.2 硝酸盐还原酶表达菌株的构建 |
| 3.3.3 重组硝酸盐还原酶的体外过表达与纯化 |
| 3.3.4 硝酸盐还原酶酶活检测方法 |
| 3.3.5 硝酸盐还原酶的酶学性质测定 |
| 3.3.6 统计学方法 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 硝酸盐还原酶的序列特征 |
| 3.4.2 重组硝酸盐还原酶的过表达与纯化 |
| 3.4.3 温度和pH对硝酸盐还原酶酶活的影响 |
| 3.4.4 不同金属离子对硝酸盐还原酶酶活的影响 |
| 3.4.5 不同电子供体对硝酸盐还原酶酶活的影响 |
| 3.4.6 硝酸盐还原酶酶活的动力学参数 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 NCT-2 菌株亚硝酸盐还原酶的异源表达与酶学性质研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 供试菌株与质粒 |
| 4.2.2 主要试剂与培养基 |
| 4.2.3 仪器与设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 亚硝酸盐还原酶的序列比对分析 |
| 4.3.2 亚硝酸盐还原酶表达菌株的构建 |
| 4.3.3 重组亚硝酸盐还原酶的体外过表达与纯化 |
| 4.3.4 亚硝酸盐还原酶酶活检测方法 |
| 4.3.5 亚硝酸盐还原酶的酶学性质测定 |
| 4.3.6 统计学方法 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 亚硝酸盐还原酶的序列特征 |
| 4.4.2 重组亚硝酸盐还原酶的过表达与纯化 |
| 4.4.3 温度和pH对亚硝酸盐还原酶酶活的影响 |
| 4.4.4 不同金属离子对亚硝酸盐还原酶酶活的影响 |
| 4.4.5 不同电子供体对亚硝酸盐还原酶酶活的影响 |
| 4.4.6 亚硝酸盐还原酶酶活的动力学参数 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 NCT-2 菌株的根际定殖模式与促生作用 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 供试菌株与培养基 |
| 5.2.2 主要材料与试剂 |
| 5.2.3 仪器与设备 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 绿色荧光蛋白重组质粒的构建 |
| 5.3.2 巨大芽孢杆菌原生质体的制备与转化 |
| 5.3.3 荧光标记重组菌的生长曲线测定 |
| 5.3.4 荧光标记重组菌的遗传稳定性测定 |
| 5.3.5 盆栽实验 |
| 5.3.6 荧光标记重组菌在玉米幼苗定殖部位和数量的观测 |
| 5.3.7 玉米生长指标测定 |
| 5.3.8 统计学方法 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 巨大芽孢杆菌NCT-2 中绿色荧光蛋白基因的表达 |
| 5.4.2 荧光标记重组菌株在玉米幼苗根际的定殖量对土壤硝酸盐含量的响应 |
| 5.4.3 荧光标记重组菌在玉米幼苗根系的定殖分布 |
| 5.4.4 荧光标记菌株对玉米根系的促生作用 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 NCT-2 菌株对根际细菌群落多样性的影响 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料 |
| 6.2.1 供试菌株与培养基 |
| 6.2.2 主要材料与试剂 |
| 6.2.3 仪器与设备 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 盆栽实验 |
| 6.3.2 土壤样本采集与DNA提取 |
| 6.3.3 PCR扩增与高通量测序 |
| 6.3.4 土壤硝酸盐含量、电导率和硝酸盐还原酶的测定 |
| 6.3.5 测序数据分析 |
| 6.3.6 统计学方法 |
| 6.4 结果与讨论 |
| 6.4.1 测序数据上传序列号 |
| 6.4.2 根际土壤细菌的测序数据统计 |
| 6.4.3 玉米根际土壤的微生物群落组成 |
| 6.4.4 玉米根际土壤微生物群落的α多样性和β多样性分析 |
| 6.4.5 不同处理间玉米根际土壤细菌群落的差异 |
| 6.4.6 土壤理化性质对丰度前十门水平物种的影响 |
| 6.4.7 玉米根际土壤细菌群落的互作网络分析 |
| 6.4.8 玉米根际细菌群落的功能预测 |
| 6.5 本章小结 |
| 第七章 结论与展望 |
| 7.1 研究结论 |
| 7.2 论文创新点 |
| 7.3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间的科研成果 |
（6）水稻纹枯病生防菌株的筛选及两种生防芽胞杆菌生物膜形成相关机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 上篇 文献综述 |
| 第一章 芽胞杆菌生物防治研究进展 |
| 1 芽胞杆菌农业应用现状 |
| 2 芽胞杆菌生物防治机理研究进展 |
| 2.1 拮抗作用 |
| 2.2 竞争作用 |
| 2.3 诱导植物抗性 |
| 3 芽胞杆菌生防应用面临的问题及应对方法的思考 |
| 3.1 防治效果不稳定 |
| 3.2 防治效果见效慢 |
| 3.3 生物防治面临问题的应对方法 |
| 第二章 芽胞杆菌生物膜形成机理研究进展 |
| 1 芽胞杆菌生物膜基质的组成 |
| 1.1 胞外多糖 |
| 1.2 胞外蛋白 |
| 1.3 胞外DNA |
| 1.4 聚谷氨酸 |
| 2 芽胞杆菌生物膜的调控 |
| 2.1 枯草芽胞杆菌生物膜调控 |
| 2.2 蜡质芽胞杆菌生物膜调控 |
| 3 芽胞杆菌生物膜与寄主植物的互作 |
| 3.1 芽胞杆菌生物膜对寄主植物的影响 |
| 3.2 寄主植物对芽胞杆菌生物膜形成影响 |
| 第三章 细菌互作机理研究进展 |
| 1 细菌间互作研究进展 |
| 1.1 细菌间竞争关系研究进展 |
| 1.2 细菌间合作关系研究进展 |
| 2 细菌互作信号物质研究进展 |
| 2.1 肽聚糖 |
| 2.2 抗生类物质 |
| 2.3 信号系统交互作用 |
| 3 细菌互作对实际应用价值 |
| 3.1 发现未知分子 |
| 3.2 生物膜的形成及生物防治 |
| 参考文献 |
| 下篇 研究内容 |
| 第一章 稳定防治水稻纹枯病生防菌的筛选策略研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细菌菌株鉴定及培养条件 |
| 1.2 颉颃细菌对R.solani拮抗活性测定 |
| 1.3 颉颃细菌产酶活性、产嗜铁素的测定 |
| 1.4 颉颃细菌防治水稻纹枯病效果温室实验 |
| 1.5 颉颃细菌对苗期水稻生长的检测 |
| 1.6 数据处理及分析 |
| 2 结果和分析 |
| 2.1 颉颃细菌对立枯丝核菌拮抗活性 |
| 2.2 颉颃细菌鉴定及生防潜力赋值 |
| 2.3 颉颃细菌对不同R.solani引起的水稻纹枯病的防治效果 |
| 2.4 颉颃细菌对苗期水稻生长的促进作用 |
| 2.5 颉颃细菌对株潜在生防效果的赋值及其与生防效果的相关性分析 |
| 3 讨论 |
| 第二章 枯草芽胞杆菌γ-聚谷氨酸的产生与其生物膜形成及定殖能力相关性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细菌菌株及培养条件 |
| 1.2 酶和引物合成 |
| 1.3 菌株构建 |
| 1.4 黏性菌落培养 |
| 1.5 生物膜培养 |
| 1.6 γ PGA粗提取与检测 |
| 1.7 β-半乳糖苷酶活性检测 |
| 1.8 生防菌定殖能力检测 |
| 2 结果和分析 |
| 2.1 不同土壤枯草芽胞杆菌γ-聚谷氨酸产量具有显着差异 |
| 2.2 枯草芽胞杆菌γ-聚谷氨酸合成基因表达量具有多样性 |
| 2.3 生物膜形成关键基因影响γ-聚谷氨酸产生 |
| 2.4 γ-PGA改变枯草芽胞杆菌生物膜形态 |
| 2.5 γ-PGA影响生防菌在植物根系的定殖 |
| 3 讨论 |
| 第三章 枯草芽胞杆菌通过识别蜡质芽胞杆菌胞外多糖激活生物膜形成的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细菌菌株及培养条件 |
| 1.2 菌株构建 |
| 1.3 生物膜培养及检测 |
| 1.4 β-半乳糖苷酶活性检测 |
| 1.5 胞外多糖提取及纯化 |
| 2 结果和分析 |
| 2.1 两株芽胞杆菌共培养促进枯草芽胞杆菌生物膜形成 |
| 2.2 生物膜促进的相互作用在种内保守 |
| 2.3 生物膜诱导与KinC相关 |
| 2.4 蜡质芽胞杆菌胞外多糖诱导生物膜 |
| 2.5 两株芽胞杆菌在根系的生物膜形成 |
| 3 讨论 |
| 第四章 蜡质芽胞杆菌外泌蛋白BC1280在生物膜及与枯草芽胞杆菌互作中作用研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细菌菌株及培养条件 |
| 1.2 酶和引物合成 |
| 1.3 菌株构建 |
| 1.4 生物膜培养 |
| 1.5 β-半乳糖苷酶活性检测 |
| 2 结果和分析 |
| 2.1 蜡质芽胞杆菌生物膜基质相关蛋白基因簇分析 |
| 2.2 BC1280表达受生物膜主效调节因子SinR调控 |
| 2.3 BC1280在生物膜形成过程中起重要作用 |
| 2.4 BC1280对生物膜的作用保守 |
| 2.5 重复序列在BC1280功能中作用的分析 |
| 2.6 β折叠在BC1280功能中作用的分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 本研究所使用的培养基配方 |
| 攻读学位期间发表学术论文及专利申请 |
| 致谢 |
（7）香蕉穿孔线虫生防工程菌构建及其防控效果和发酵体系研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 前言 |
| 1.1 香蕉穿孔线虫研究概况 |
| 1.1.1 香蕉穿孔线虫及其生物学特征 |
| 1.1.2 香蕉穿孔线虫寄主范围及致病性 |
| 1.1.3 香蕉穿孔线虫的经济重要性 |
| 1.1.4 香蕉穿孔线虫的防治现状 |
| 1.1.5 香蕉穿孔线虫的生物防治 |
| 1.2 宏基因组学的研究概况 |
| 1.2.1 宏基因组的定义 |
| 1.2.2 宏基因组文库构建 |
| 1.2.2.1 宏基因组DNA提取 |
| 1.2.2.2 宏基因组文库的载体 |
| 1.2.2.3 宏基因组文库的宿主 |
| 1.2.3 宏基因组文库分析途径 |
| 1.2.3.1 基于序列驱动筛选 |
| 1.2.3.2 基于功能驱动筛选 |
| 1.2.3.3 底物诱导基因表达筛选 |
| 1.2.4 宏基因组学在植物病害生物防治中的应用 |
| 1.3 微生物蛋白酶研究概况 |
| 1.3.1 微生物蛋白酶分类 |
| 1.3.2 丝氨酸蛋白酶概述 |
| 1.3.3 金属蛋白酶概述 |
| 1.3.4 杀线虫相关蛋白酶研究概况 |
| 1.4 研究内容及意义 |
| 第2章 香蕉穿孔线虫发生地根际土壤微生物多样性分析及宏基因组Fosmid文库构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.1.1 香蕉根际土壤采集 |
| 2.2.1.2 供试试剂 |
| 2.2.1.3 供试质粒载体和菌株 |
| 2.2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.2.2.1 香蕉根际土壤总DNA提取及纯化 |
| 2.2.2.2 香蕉根际土壤微生物多样性分析 |
| 2.2.2.3 香蕉根际土壤宏基因组Fosmid文库构建 |
| 2.2.2.4 Fosmid文库特征分析 |
| 2.2.2.5 Fosmid文库筛选蛋白酶活性克隆子 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 香蕉根际土壤总DNA提取 |
| 2.3.2 香蕉根际土壤微生物多样性分析 |
| 2.3.2.1 测序数据预处理 |
| 2.3.2.2 香蕉根际土壤细菌、真菌和古菌多样性指数 |
| 2.3.2.3 香蕉根际土壤细菌、真菌和古菌的群落结构 |
| 2.3.3 香蕉根际土壤微生物宏基因组Fosmid文库特征分析 |
| 2.3.3.1 Fosmid文库大小 |
| 2.3.3.2 Fosmid文库建库效率 |
| 2.3.3.3 Fosmid文库克隆稳定性 |
| 2.3.4 蛋白酶活性Fosmid克隆子筛选 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 亚克隆筛选蛋白酶基因及其杀线虫生物活性测定 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.1.1 供试线虫 |
| 3.2.1.2 主要试剂和耗材 |
| 3.2.1.3 供试质粒载体和菌株 |
| 3.2.1.4 主要仪器设备 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.2.2.1 构建Fosmid亚克隆文库 |
| 3.2.2.2 蛋白酶亚克隆的筛选 |
| 3.2.2.3 蛋白酶基因的序列分析 |
| 3.2.2.4 蛋白酶亚克隆杀线虫生物活性测定 |
| 3.2.2.5 蛋白酶pase4基因表达、纯化和荧光标记 |
| 3.2.2.6 蛋白酶PASE4对香蕉穿孔线虫的毒性分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 蛋白酶亚克隆的筛选 |
| 3.3.1.1 Fosmid质粒DNA的提取和检测 |
| 3.3.1.2 亚克隆构建和筛选 |
| 3.3.2 蛋白酶基因序列分析 |
| 3.3.2.1 蛋白酶亚克隆插入片段扩增 |
| 3.3.2.2 插入片段的开放阅读框分析 |
| 3.3.2.3 蛋白酶基因编码蛋白的生物信息学分析 |
| 3.3.3 蛋白酶亚克隆子杀线虫生物活性测定 |
| 3.3.4 蛋白酶PASE4的表达、纯化和检测 |
| 3.3.5 蛋白酶PASE4对香蕉穿孔线虫的毒性分析 |
| 3.3.5.1 无菌香蕉穿孔线虫的培养繁殖 |
| 3.3.5.2 蛋白酶PASE4对香蕉穿孔线虫的毒性 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 香蕉穿孔线虫优势可培养伴生细菌分离、鉴定及筛选 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.1.1 供试香蕉穿孔线虫种群 |
| 4.2.1.2 主要试剂耗材 |
| 4.2.1.3 供试质粒载体和菌株 |
| 4.2.1.4 主要仪器设备 |
| 4.2.2 方法 |
| 4.2.2.1 香蕉穿孔线虫培养繁殖 |
| 4.2.2.2 香蕉穿孔线虫可培养伴生细菌分离纯化 |
| 4.2.2.3 香蕉穿孔线虫可培养伴生细菌鉴定 |
| 4.2.2.4 香蕉穿孔线虫优势伴生细菌筛选 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 香蕉穿孔线虫可培养伴生细菌和胡萝卜愈伤组织内生细菌的分离纯化 |
| 4.3.2 香蕉穿孔线虫可培养伴生细菌和胡萝卜愈伤组织内生细菌的16S rDNA扩增 |
| 4.3.3 香蕉穿孔线虫可培养伴生细菌和胡萝卜愈伤组织内生细菌的16S rDNA鉴定 |
| 4.3.4 香蕉穿孔线虫优势可培养伴生细菌筛选 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 pase4基因导入伴生细菌pf36及其生物学特征测定 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 材料 |
| 5.2.1.1 供试试剂和耗材 |
| 5.2.1.2 供试质粒载体和菌株 |
| 5.2.2 方法 |
| 5.2.2.1 菌株pf36的抗生素敏感性分析 |
| 5.2.2.2 pase4基因转化pf36菌株 |
| 5.2.2.3 pase4基因转导pf36菌株 |
| 5.2.2.4 p4MCS-pf36和p4Tn5-pf36生长曲线测定 |
| 5.2.2.5 p4MCS-pf36和p4Tn5-pf36生理生化特征测定 |
| 5.2.2.6 p4MCS-pf36和p4Tn5-pf36蛋白酶表达活性测定 |
| 5.2.2.7 p4MCS-pf36和p4Tn5-pf36遗传稳定性测定 |
| 5.2.2.8 p4MCS-pf36和p4Tn5-pf36土壤定殖测定 |
| 5.2.2.9 数据分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 pf36菌株的抗生素敏感性分析 |
| 5.3.2 蛋白酶基因pase4导入伴生细菌pf36 |
| 5.3.2.1 pase4基因转化pf36菌株 |
| 5.3.2.2 pase4基因转导pf36菌株 |
| 5.3.2.3 遗传改造菌发酵上清液的SDS-PAGE和Western杂交检测 |
| 5.3.3 遗传改造菌p4MCS-pf36和p4Tn5-pf36的生物学特征测定 |
| 5.3.3.1 p4MCS-pf36和p4Tn5-pf36生长曲线测定 |
| 5.3.3.2 p4MCS-pf36和p4Tn5-pf36蛋白酶表达活性测定 |
| 5.3.3.3 p4MCS-pf36和p4Tn5-pf36生理生化测定 |
| 5.3.4 菌株p4MCS-pf36和p4Tn5-pf36的遗传稳定性测定 |
| 5.3.5 p4MCS-pf36和p4Tn5-pf36土壤定殖测定 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 遗传改造菌的生防效果及其产蛋白酶发酵体系的优化 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 材料 |
| 6.2.1.1 供试线虫 |
| 6.2.1.2 供试香蕉苗和种植基质 |
| 6.2.1.3 供试试剂 |
| 6.2.1.4 主要仪器设备 |
| 6.2.2 方法 |
| 6.2.2.1 p4MCS-pf36和p4Tn5-pf36发酵上清液杀线虫生物活性测定 |
| 6.2.2.2 p4MCS-pf36和p4Tn5-pf36对香蕉穿孔线虫防治效果测定 |
| 6.2.2.3 p4Tn5-pf36产蛋白酶发酵体系的优化 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 p4MCS-pf36和p4Tn5-pf36发酵上清液杀线虫生物活性测定 |
| 6.3.2 p4MCS-pf36和p4Tn5-pf36对香蕉穿孔线虫防治效果及其对作物安全性测定 |
| 6.3.3 p4Tn5-pf36产蛋白酶发酵体系的优化 |
| 6.3.3.1 单因素试验优化 |
| 6.3.3.2 Plackett-Burman试验筛选显着因素 |
| 6.3.3.3 响应面Box-Behnken试验设计优化 |
| 6.3.3.4 最优发酵体系组合验证 |
| 6.4 小结 |
| 第7章 全文讨论与结论 |
| 7.1 香蕉根际土壤微生物种类的多样性 |
| 7.2 香蕉根际土壤微生物宏基因组文库构建及杀线虫蛋白酶基因筛选 |
| 7.3 香蕉穿孔线虫优势可培养伴生细菌筛选 |
| 7.4 遗传改造菌的构建及其生防效果测定 |
| 7.5 遗传改造菌p4Tn5-pf36产蛋白酶发酵体系优化 |
| 7.6 本研究创新性 |
| 7.7 研究展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A 香蕉根际土壤细菌、真菌和古菌的群落结构 |
| 附录B 筛选获得的蛋白酶基因的开放阅读框序列信息 |
（8）柑橘溃疡病菌拮抗菌的筛选及F9菌株抑菌物质的探究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩写词和英汉对照表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 柑橘溃疡病及柑橘溃疡病菌简介 |
| 1.2 柑橘溃疡病菌的生理形态特征 |
| 1.3 柑橘溃疡病菌的侵染循环 |
| 1.4 柑橘溃疡病的防治 |
| 1.4.1 物理防治 |
| 1.4.2 化学防治 |
| 1.4.3 生物防治 |
| 1.5 芽孢杆类拮抗菌的研究现状 |
| 1.5.1 芽孢杆菌的生防机制 |
| 1.5.2 生防芽孢的种类 |
| 1.6 解淀粉芽孢杆菌抑菌物质 |
| 1.6.1 抗菌蛋白 |
| 1.6.2 脂肽类物质 |
| 1.6.3 聚酮类物质 |
| 1.7 研究目的和意义 |
| 1.8 技术路线图 |
| 第二章 柑橘溃疡病菌拮抗菌的筛选鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 供试材料 |
| 2.2.1.1 菌株 |
| 2.2.1.2 主要仪器 |
| 2.2.2 柑橘溃疡病拮抗细菌的筛选 |
| 2.2.2.1 柑橘根际土壤样品采集 |
| 2.2.2.2 柑橘溃疡病菌拮抗菌的分离筛选 |
| 2.2.2.3 拮抗细菌的复筛 |
| 2.2.2.4 拮抗菌发酵上清液活性测试 |
| 2.2.3 拮抗菌的种类鉴定 |
| 2.2.3.1 拮抗细菌 16SrDNA序列PCR测定与分析 |
| 2.2.3.2 芽孢杆菌 16-23S之间ITS序列扩增 |
| 2.2.3.3 拮抗芽孢杆菌种间的系统发育树构建 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 拮抗菌筛选 |
| 2.3.1.1 拮抗菌初筛 |
| 2.3.1.2 拮抗菌的复筛 |
| 2.3.2 拮抗菌株鉴定 |
| 2.3.3 ITS基因序列扩增鉴定 |
| 2.3.4 拮抗菌发酵上清液活性测试 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 拮抗菌株F9的鉴定及其抑菌物质的探究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 供试材料 |
| 3.2.1.1 供试菌株 |
| 3.2.1.2 培养基及配方 |
| 3.2.1.3 主要仪器 |
| 3.2.2 拮抗菌株F9的鉴定 |
| 3.2.2.1 拮抗菌株F9的菌落形态 |
| 3.2.2.2 拮抗菌株F9生理生化特性检测 |
| 3.2.2.3 拮抗菌株F9的 16SrDNA PCR鉴定 |
| 3.2.2.4 拮抗菌株F9的ITS PCR鉴定 |
| 2.2.3.5 解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌 β-甘露聚糖酶基因序列特异性扩增 |
| 3.2.3 拮抗芽孢杆菌F9抑菌效果测试 |
| 3.2.3.1 F9菌体抑菌效果测试 |
| 3.2.3.2 F9发酵上清液的抑菌效果测试 |
| 3.2.3.3 F9产抑菌物质培养基的选择 |
| 3.2.4 F9抑菌物质的探究 |
| 3.2.4.1 抑菌蛋白的提取 |
| 3.2.4.2 抑菌蛋白稳定性的研究 |
| 3.2.4.3 脂肽的提取 |
| 3.2.4.4 脂肽稳定性的研究 |
| 3.2.5 粗提脂肽对Xac jx-6 生长曲线的影响 |
| 3.2.5.1 脂肽粗提的浓度检测 |
| 3.2.5.2 Xac jx-6 生长曲线的测量 |
| 3.2.6 拮抗菌F9菌体盆栽接种防治试验 |
| 3.2.6.1 微生物的培养 |
| 3.2.6.2 柑橘盆栽接种试验 |
| 3.2.7 粗提脂肽活体接种防治效果 |
| 3.2.7.1 微生物的培养 |
| 3.2.7.2 柑橘盆栽接种试验 |
| 3.2.8 粗提脂肽的抑菌谱试验 |
| 3.2.9 粗提脂肽的分离纯化 |
| 3.2.10 抑菌物质LC-MS分析 |
| 3.2.11 初纯抑菌物质的最小抑菌浓度(MIC)测定 |
| 3.3 结果和分析 |
| 3.3.1 F9菌落形态 |
| 3.3.2 F9生理生化鉴定 |
| 3.3.3 F9 β-甘露聚糖酶基因序列特异性扩增 |
| 3.3.4 F9系统发育树 |
| 3.3.5 F9透射电镜图 |
| 3.3.6 拮抗菌株F9抑菌测试 |
| 3.3.6.1 F9菌体的抑菌效果 |
| 3.3.6.2 F9发酵上清液抑菌效果 |
| 3.3.7 培养基的筛选 |
| 3.3.8 F9菌株上清液抑菌物质的提取和验证 |
| 3.3.8.1 抑菌蛋白的提取 |
| 3.3.8.2 抑菌蛋白稳定性 |
| 3.3.9 F9上清液脂肽的提取和验证 |
| 3.3.9.1 粗提脂肽的抑菌活性 |
| 3.3.9.2 粗提脂肽稳定性试验 |
| 3.3.10 粗提脂肽对Xac jx-6 生长曲线的影响 |
| 3.3.10.1 粗提脂肽的浓度测量 |
| 3.3.10.2 粗提脂肽对Xac jx-6 生长曲线的影响 |
| 3.3.11 F9菌体盆栽防治试验 |
| 3.3.12 粗提脂肽盆栽防治试验 |
| 3.3.13 粗提脂肽的抑菌谱 |
| 3.3.14 初步纯化后抑菌物质的最小抑菌浓度(MIC)的测定 |
| 3.3.15 粗提脂肽的分离纯化 |
| 3.3.15.1 抑菌活性组分的初步分离 |
| 3.3.15.2 初步纯化后活性物质的HPLC分析 |
| 3.3.15.3 Sephadex G-25 凝胶柱过滤纯化 |
| 3.3.15.4 抑菌物质LC-MS分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 抑菌物质的提取 |
| 3.4.2 抑菌物质的盆栽接种防治试验 |
| 3.4.3 抑菌物质的分离纯化 |
| 3.4.4 抑菌物质的鉴定 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（9）蜡质芽胞杆菌AR156诱导植物对丁香假单胞菌及南方根结线虫抗性机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 上篇 文献综述 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 微生物防治植物病害的机理研究进展 |
| 第一节 |
| 1 国内外芽胞杆菌的研究及其应用现状 |
| 1.1 国内芽胞杆菌的生防研究概况 |
| 1.2 国外芽胞杆菌的生防研究进展 |
| 2 芽胞杆菌生防机理研究 |
| 2.1 抗菌作用 |
| 2.2 溶菌作用 |
| 2.3 竞争作用 |
| 2.4 诱导系统抗病性 |
| 3 芽胞杆菌在农业生产应用中面临的问题及解决途径 |
| 3.1 芽胞杆菌生物农药面临的问题 |
| 3.2 针对芽胞杆菌生物农药问题的解决方法 |
| 3.3 芽胞杆菌生物农药未来发展展望 |
| 第二节 蜡质芽胞杆菌生防机理研究进展 |
| 1 国内外芽胞杆菌的研究及应用现状 |
| 2 蜡质芽胞杆菌生防机理研究 |
| 2.1 竞争作用 |
| 2.2 拮抗作用 |
| 2.3 诱导系统抗病性 |
| 3 问题与展望 |
| 第二章 植物防卫系统与诱导抗性 |
| 第一节 植物防卫系统与诱导抗性概述 |
| 1 根围免疫信号 |
| 2 植物系统获得性抗性(SAR) |
| 3 诱导系统抗病性(ISR) |
| 4 关键调控因子 |
| 4.1 NPR1调节因子 |
| 4.2 WRKY转录因子 |
| 4.3 植物诱导抗病过程中的Priming |
| 第二节 微生物胞外多糖的功能研究概述 |
| 1 多糖的种类 |
| 1.1 按照多糖的来源 |
| 1.2 按照微生物分泌的多糖部位 |
| 2 微生物胞外多糖的生物活性 |
| 2.1 保护作用 |
| 2.2 识别作用 |
| 2.3 储存能量 |
| 2.4 粘合作用 |
| 2.5 提升机体免疫力 |
| 2.6 抑制肿瘤细胞生长 |
| 3 微生物胞外多糖的应用 |
| 3.1 微生物胞外多糖在农业领域内的应用 |
| 4 总结 |
| 第三节 Small RNAs在植物内源免疫中的调控作用 |
| 1. 参与small RNAs合成的基本成分及作用 |
| 1.1 Dicer酶 |
| 1.2 AGO蛋白 |
| 1.3 RNA依赖性RNA聚合酶 |
| 2 Small RNAs的种类及生物合成 |
| 2.1 microRNAs的生物合成 |
| 2.2 siRNAs的生物合成 |
| 3. Small RNAs的作用机制 |
| 4. Small RNAs在植物内源免疫中的抗病作用 |
| 5. 总结 |
| 第三章 蔬菜根结线虫病害综合防治研究进展 |
| 1 根结线虫的分类学地位 |
| 2 根结线虫的发生规律 |
| 3 根结线虫的寄主范围和传播途径 |
| 4 根结线虫的为害特点及症状 |
| 5 根结线虫病害的防治策略 |
| 5.1 农业防治措施 |
| 5.2 物理防治措施 |
| 5.3 化学防治措施 |
| 5.4 生物防治措施 |
| 6 目前根结线虫防治中存在的问题及发展前景 |
| 第四章 根结线虫病害的生防机理研究进展 |
| 1 根结线虫病害的生防机理 |
| 1.1 寄生作用 |
| 1.2 捕食作用 |
| 1.3 毒杀作用 |
| 1.4 诱导植物产生系统抗病性 |
| 2 问题和展望 |
| 第五章 植物线虫效应因子在调控病害防治过程中的作用研究 |
| 1 线虫效应因子注入寄主植物细胞的调控 |
| 2 线虫效应因子作为植物细胞生物学的探针 |
| 2.1 细胞周期与骨架 |
| 2.2 细胞壁结构 |
| 2.3 新陈代谢 |
| 3 效应因子的功能性研究 |
| 3.1 基因沉默 |
| 3.2 寄主靶标识别 |
| 4 线虫效应因子分类 |
| 5. 线虫效应因子的识别研究 |
| 6 线虫效应因子在全球范围内的研究进展 |
| 参考文献 |
| 下篇 研究内容 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 转录因子WRKY70和WRKY11在调控蜡质芽胞杆菌AR156诱导系统抗性过程中的作用机理研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试植物 |
| 1.2 供试菌株 |
| 1.3 培养基 |
| 1.4 转录因子WRKY11与WRKY70基因克隆及过表达载体构建过程 |
| 1.5 转录因子WRKY11与WRKY70基因过表达拟南芥以及转录因子WRKY11,WRKY70双突变体植株的构建 |
| 1.6 植物内源水杨酸、茉莉酸含量检测 |
| 1.7 引物信息 |
| 1.8 转录因子WRKY11与WRKY70亚细胞定位 |
| 1.9 Bc AR156对拟南芥促生作用表型测定 |
| 1.10 Bc AR156诱导拟南芥对Pst DC3000抗病性表型测定 |
| 1.11 Bc AR156诱导拟南芥对Pst DC3000抗病性的分子水平检测 |
| 1.12 Bc AR156诱导拟南芥对Pst DC3000抗病性的细胞水平检测 |
| 1.13 Western blot |
| 1.14 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 转录因子WRKY11和WRKY70参与调控Bc AR156诱导系统抗性 |
| 2.2 转录因子WRKY11和WRKY70都定位于细胞核 |
| 2.3 转录因子WRKY11和WRKY70参与调控Bc AR156诱导拟南芥产生的系统抗性 |
| 2.4 转录因子WRKY11和WRKY70参与调控Bc AR156诱导拟南芥内细胞防卫反应 |
| 2.5 转录因子WRKY11和WRKY70是Bc AR156诱导拟南芥内防卫相关基因的上调表达所必需的 |
| 2.6 转录因子WRKY11和WRKY70靶标基因在Bc AR156诱导拟南芥产生的系统抗性过程中的表达情况 |
| 2.7 水杨酸、茉莉酸/乙烯信号通路,以及NPR1参与转录因子WRKY11和WRKY70调控Bc AR156诱导的系统抗性 |
| 2.8 Bc AR156诱导拟南芥产生的系统抗性并非通过影响植物内源激素的合成 |
| 3 讨论 |
| 第二章 蜡质芽胞杆菌AR156胞外多糖作为一类MAMPS激活植物系统免疫 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试植物 |
| 1.2 供试菌株 |
| 1.3 培养基 |
| 1.4 Bc AR156胞外多糖的提取与纯化 |
| 1.5 过敏性反应（HR)分析 |
| 1.6 Bc AR156各组分对Pst DC3000的平板拮抗试验 |
| 1.7 蜡质芽胞杆菌胞外多糖诱导抗性表型验证试验 |
| 1.8 Pst DC3000在拟南芥上的定殖量测定 |
| 1.9 Bc AR156胞外多糖诱导拟南芥对Pst DC3000抗病性的细胞水平的检测 |
| 1.10 拟南芥总RNA提取与Q-RT-PCR分析 |
| 1.11 拟南芥叶片总蛋白的提取与Western blotting分析 |
| 1.12 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Bc AR156胞外多糖能够诱导植物产生过敏性反应 |
| 2.2 Bc AR156胞外多糖诱导拟南芥产生对Pst DC3000的系统抗性 |
| 2.3 Bc AR156胞外多糖诱导拟南芥防卫相关基因的表达 |
| 2.4 Bc AR156胞外多糖激活植物体免疫诱导活性氧的积累、胼胝质的沉积以及防卫相关酶活性增加 |
| 2.5 AR156胞外多糖在拟南芥中诱导的系统抗性通过SA信号途径,并依赖NPR1 |
| 2.6 Bc AR156胞外多糖在拟南芥中诱使的系统抗性通过MAPK信号途径。 |
| 2.7 Bc AR156胞外多糖的化学分析及结构鉴定 |
| 3 讨论 |
| 第三章 SMALL RNAS在生防菌诱导植物抗病中的调节作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试植物 |
| 1.2 供试菌株 |
| 1.3 培养基 |
| 1.4 转基因植物的构建 |
| 1.5 Bc AR156诱导拟南芥对Pst DC3000抗病性表型测定 |
| 1.6 miRNA靶基因的预测 |
| 1.7 拟南芥总RNA提取与Q-RT-PCR分析 |
| 1.8 Northern Blot |
| 1.9 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 miRNA参与调控Bc AR156诱导拟南芥产生对Pst DC3000系统抗性 |
| 2.2 miR472,miR825/825*参与调控Bc AR156激活的ISR |
| 2.3 miR472、miR825/825*过表达或者缺失能够影响植物基础免疫 |
| 2.4 miR472、miR825/825* target植物内源R基因,调控植物基础免疫 |
| 3 讨论 |
| 第四章 蜡质芽胞杆菌AR156调控植物根系发育防治根结线虫病害的机理研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试植物 |
| 1.2 供试菌株 |
| 1.3 培养基 |
| 1.4 根结线虫二龄幼虫(J2)悬浮液的制备 |
| 1.5 蜡质芽胞杆菌引起番茄根系变化观察 |
| 1.6 线虫对番茄根系侵染率检测 |
| 1.7 温室防效实验 |
| 1.8 转录组测序与分析 |
| 1.9 番茄根组织总RNA提取与Q-RT-PCR分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Bc AR156高效防治番茄根结线虫病 |
| 2.2 Bc AR156诱导番茄根系结构变化,加速番茄根系得成熟化 |
| 2.3 Bc AR156诱导番茄根系结构变化,降低根结线虫侵染 |
| 2.4 Bc AR156调控番茄根系相关基因的表达 |
| 2.5 转录组学预测相关调控基因Q-RT-PCR验证 |
| 3 讨论 |
| 第五章 蜡质芽胞杆菌AR156调控根结线虫效应因子表达防治病害的机理研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试植物 |
| 1.2 供试菌株 |
| 1.3 培养基 |
| 1.4 根结线虫二龄幼虫(J2)悬浮液的制备 |
| 1.5 转录组测序与分析 |
| 1.6 效应因子分析和预测 |
| 1.7 番茄根组织总RNA提取与Q-RT-PCR分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 转录组测序结果分析 |
| 2.2 Q-RT-PCR结果验证 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结及展望 |
| 攻读学位期间发表的学术论文与专利 |
| 致谢 |
（10）植物根际促生菌Lyc2和XW10的鉴定及抑菌机理研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 植物根际促生菌 |
| 1.2 PGPR菌株的开发与应用 |
| 1.3 PGPR菌株的作用机制 |
| 1.3.1 PGPR菌株的促生作用 |
| 1.3.2 PGPR菌株的生防机制 |
| 1.4 假单胞菌研究进展 |
| 1.5 伯克霍尔德氏菌研究进展 |
| 1.6 生物防治中存在的问题及展望 |
| 1.7 本研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 土壤样品 |
| 2.1.2 试验菌株 |
| 2.1.3 培养基组分及配方 |
| 2.1.4 生化及分子生物学试剂 |
| 2.1.5 主要实验设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 PGPR菌株的分离保存 |
| 2.2.2 PGPR菌株抑菌活性测定 |
| 2.2.3 PGPR菌株抑菌谱测定 |
| 2.2.4 PGPR菌株的鉴定 |
| 2.2.5 菌株Lyc2全基因组测序及序列分析 |
| 2.2.6 菌株Lyc2次生代谢产物功能域预测 |
| 2.2.7 电转感受态细胞的制备及转化 |
| 2.2.8 菌株突变体筛选鉴定 |
| 2.2.9 突变体突变基因功能互补 |
| 2.2.10 菌株Lyc2抗菌物质分离纯化鉴定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 菌株Lyc2的分类地位和抑菌机制 |
| 3.1.1 菌株Lyc2抑菌谱测定 |
| 3.1.2 菌株Lyc2生理生化特性 |
| 3.1.3 菌株Lyc216S rRNA序列分析 |
| 3.1.4 菌株Lyc2多位点序列分型分析 |
| 3.1.5 菌株Lyc2安全性检测 |
| 3.1.6 菌株Lyc2全基因组测序及序列分析 |
| 3.1.7 菌株Lyc2基因组次生代谢产物功能域预测 |
| 3.1.8 菌株Lyc2抗真菌功能丧失突变体鉴定分析 |
| 3.1.9 菌株Lyc2抗真菌功能丧失突变体互补 |
| 3.1.10 菌株Lyc2抗真菌物质鉴定分析 |
| 3.1.11 菌株Lyc2抗细菌功能丧失突变体鉴定分析 |
| 3.1.12 菌株Lyc2抗细菌功能丧失突变体互补 |
| 3.2 菌株XW10的分类地位和抑菌机制 |
| 3.2.1 菌株XW10的分离筛选 |
| 3.2.2 菌株XW10生理生化特性 |
| 3.2.3 菌株XW1016S rRNA序列分析 |
| 3.2.4 菌株XW10多位点序列分型分析 |
| 3.2.5 菌株XW10抗细菌功能丧失突变体鉴定分析 |
| 3.2.6 菌株XW10抗细菌功能丧失突变体互补 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文及奖励情况 |
四、PGPR生防作用的不稳定性及可能的改进策略（论文参考文献）
- [1]珠芽蓼根际促生菌Bacillus mycoides Gnyt1比较基因组及其功能基因研究[D]. 杨晓玫. 甘肃农业大学, 2020(01)
- [2]基于乳清分离蛋白乳化/凝胶的营养活性成分共包埋研究[D]. 包华燕. 江南大学, 2020(01)
- [3]产酶溶杆菌新株Lysobacter enzymogenes LE16的促生防病作用及机理[D]. 陈丹梅. 西南大学, 2020(01)
- [4]解淀粉芽胞杆菌FZB42 sRNA生防功能的分子机制研究[D]. 李曦. 南京农业大学, 2019
- [5]巨大芽孢杆菌对次生盐渍化土壤硝酸盐的转化途径及其机理研究[D]. 初少华. 上海交通大学, 2019(06)
- [6]水稻纹枯病生防菌株的筛选及两种生防芽胞杆菌生物膜形成相关机理研究[D]. 俞仪阳. 南京农业大学, 2018
- [7]香蕉穿孔线虫生防工程菌构建及其防控效果和发酵体系研究[D]. 陈德强. 华南农业大学, 2018(08)
- [8]柑橘溃疡病菌拮抗菌的筛选及F9菌株抑菌物质的探究[D]. 王鑫. 华南农业大学, 2017(08)
- [9]蜡质芽胞杆菌AR156诱导植物对丁香假单胞菌及南方根结线虫抗性机理研究[D]. 蒋春号. 南京农业大学, 2016(05)
- [10]植物根际促生菌Lyc2和XW10的鉴定及抑菌机理研究[D]. 王晓强. 山东农业大学, 2016(08)