一、RNA干涉在P~(53)基因功能研究及未来基因治疗中的应用（论文文献综述）
熊延路[1]（2018）在《去乙酰化酶SIRT3在非小细胞肺癌恶性进展中的作用及其机制的初步研究》文中认为背景:肺癌是世界范围内致死率首位的癌症,而非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）占肺癌总数的80-85%,其有效治疗对提升人类健康水平意义重大。传统的手术治疗和放化疗则由于适应性、耐药和毒副作用在治疗中捉襟见肘。近年来,基于驱动基因的靶向治疗在NSCLC中大放异彩,然而耐药和不敏感问题依然存在,因此NSCLC的恶性机制需要继续深入研究。蛋白的乙酰化和去乙酰化修饰在生命活动中广泛存在且作用关键。NAD依赖的去乙酰化酶沉默信息调节因子3（NAD-dependent deacetylase sirtuin-3,SIRT3）是机体内重要的去乙酰化酶,通过去乙酰化作用调控重要蛋白的功能,广泛调节细胞生命进程,影响多种疾病的发展转归。由于NSCLC的遗传异质性以及SIRT3底物广泛性等复杂影响因素,SIRT3在NSCLC中的作用存在争议,相应的分子机制有待阐明。因此,探索SIRT3对NSCLC的作用及相应分子机制将对理解NSCLC的恶性进展规律乃至治疗提供新的理论依据。目的:探索SIRT3对NSCLC恶性进展的作用以及相应分子机制。方法:（1）收集70对NSCLC肿瘤组织及相应正常组织标本和临床信息。采用免疫组化、蛋白印迹及实时定量PCR技术探索SIRT3在NSCLC临床组织和正常组织中mRNA水平和蛋白表达水平的差异;（2）采用免疫组化定量统计方法分析SIRT3和NSCLC临床病理特征的关系以及SIRT3和NSCLC增殖指标Ki-67表达、蛋白激酶B（protein kinase B,PKB/Akt）活化的关系;（3）采用RNA干涉技术和质粒过表达技术建立SIRT3低表达和过表达NSCLC细胞系（H520:SIRT3-;SW900:SIRT3-;H520:SIRT3+）,利用蛋白印迹技术检测SIRT3含量对Akt磷酸化水平的影响,采用激光共聚焦技术、蛋白免疫共沉淀技术探索SIRT3和Akt的相互作用关系;（4）采用免疫组化技术探索磷酸酶和张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog,PTEN）、SIRT3、p53在NSCLC组织中的相关性;采用蛋白印迹技术探索PTEN和SIRT3在NSCLC细胞系中蛋白表达状况,根据结果采用RNA干涉技术和质粒过表达技术建立不同PTEN表达背景下,SIRT3高低表达的细胞模型（H520:PTEN-/SIRT3-、PTEN+/SIRT3-;A549:PTEN-/SIRT3+、PTEN+/SIRT3+）;（5）在上述细胞模型中,采用蛋白印迹技术和蛋白免疫共沉淀技术探索不同PTEN表达背景下,SIRT3对p53含量的影响,以及借助泛素蛋白酶体途径相关抑制剂探索SIRT3对p53泛素化降解路径的调控作用;（6）利用激光共聚焦技术、蛋白免疫共沉淀技术探索SIRT3和p53的相互作用关系,并利用上述细胞模型,探索PTEN缺失背景下,SIRT3对p53的去乙酰化修饰作用。结果:（1）SIRT3在NSCLC临床组织中较正常组织显着高表达;（2）SIRT3和病人预后相关,高表达SIRT3病人生存期较短;SIRT3表达和NSCLC的病理分型有关,其中鳞癌表达较高;SIRT3和其余病理特征无明显关联;（3）在NSCLC组织中,SIRT3和恶性增殖指标Ki-67、p-Akt（磷酸化活化的Akt）呈现正相关;在NSCLC细胞系中,SIRT3可以与Akt共定位和共沉淀;在NSCLC细胞系中SIRT3可以促进Akt的磷酸化活化;（4）在NSCLC组织中,PTEN呈现低表达,在此背景下,呈现出SIRT3的高表达和p53的相应低表达。在PTEN缺失的NSCLC细胞系中,SIRT3可以促进泛素蛋白酶体介导的p53降解,而在PTEN存在的情况下,却失去这种作用;（5）在PTEN缺失的NSCLC细胞系中,SIRT3可以去乙酰化p53的赖氨酸320/382位点,这种翻译后修饰可能和p53的稳定相关。结论:（1）SIRT3在NSCLC组织中高表达,且和恶性增殖指标Ki-67正相关,同时SIRT3的高表达也预示着相对较差的预后,这些线索提示SIRT3可能在NSCLC扮演着癌基因的作用;SIRT3的表达量与NSCLC的病理分型相关,但是NSCLC分期分化等恶性程度特征没有明显关联,这可能归因于肿瘤的异质性和个体遗传背景的差异性以及SIRT3作用底物的广泛性。这些均提示SIRT3在NSCLC中的机制复杂多样;（2）p-Akt是促进肿瘤恶性进展的中心枢纽,Akt的去乙酰化可以显着影响其磷酸化活化,而SIRT3是细胞内重要的去乙酰化酶,这些线索提示SIRT3可能通过去乙酰化修饰促进Akt的磷酸化活化,进而促进NSCLC的恶性进程。本课题发现在NSCLC组织中SIRT3和p-Akt正相关,同时在NSCLC细胞系中,SIRT3能够促进Akt的磷酸化活化;并且SIRT3可以和Akt发生共沉淀和共定位,这些结果部分作证了SIRT3通过调节Akt影响NSCLC的科学假说;（3）p53的去乙酰化修饰抑制了其抑癌功能,而PTEN的去乙酰化修饰则促进其肿瘤抑制功能,这些提示在不同遗传背景的肿瘤中,去乙酰化修饰会发挥不同的作用。本课题中,在NSCLC组织中,PTEN呈现低表达,而SIRT3高表达,同时p53低表达,这提示在特定PTEN缺失背景下的NSCLC中,SIRT3可能通过抑制p53含量来发挥自身的癌基因作用;同时,我们在NSCLC模型中进一步揭示了在PTEN缺失的背景下,SIRT3可以促进泛素蛋白酶体介导的p53的降解;进一步研究发现,SIRT3可以去乙酰化p53的赖氨酸320/382位点,而相应位点的去乙酰化修饰则抑制了p53功能。因此这些结果提示了SIRT3在PTEN缺失背景下,通过对p53的调节影响NSCLC的恶性进展。
韦伊芳[2]（2017）在《NDRG2诱导线粒体Bad/p53复合物形成促进乳腺癌阿霉素治疗敏感性的机制探究》文中提出乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,近年来乳腺癌的发病率呈现逐年上升的趋势,而且发病年龄趋于年轻化。乳腺癌的死亡率占女性癌症15%,占居女性恶性肿瘤死亡率首位,严重威胁女性的生理和心理健康,甚至危及生命。近年来,随着科研和医疗水平的不断发展,乳腺癌治疗方式有很多种包括手术、化疗、放疗、内分泌治疗、分子生物靶向治疗和中医药治疗等,但综合治疗法已成为其基本原则及主流治疗模式。其中,化疗在乳腺癌的综合治疗过程中发挥重要作用,可以缩小乳腺癌的原发病灶,增加手术治疗的机会,并延长患者的长期生存率和提高生存质量。化疗药物耐药是制约化疗药物应用的重要原因,同时,它也是导致患者临床治疗失败、甚至患者最终死亡的重要原因之一。研究发现:乳腺癌的化疗耐药与DNA损伤修复,mi RNA,凋亡耐药,肿瘤微环境,抑癌分子p53,RB等多种因素有关,其中抑癌分子p53的研究较为广泛。人NDRG2基因（N-Myc downstream-regulated gene 2）是我们实验室首先发现的基因。1999年,邓燕春博士等在研究神经胶质瘤与正常脑组织的基因表达差异时,发现一个新基因,在肿瘤组织中呈现低表达,当时命名为SLYD（Gen Bank登录AF159092）。人NDRG2基因染色体定位于14q11.2,含有16个外显子,15个内含子。人NDRG2基因的m RNA全长为2121 bp,有一个ORF,编码的蛋白质含有357个氨基酸,分子量为40.7 KD。近年来,大量基因功能研究表明,NDRG2是一个抑癌候选分子。我们研究发现:化疗药物阿霉素引起的细胞DNA损伤可以明显促进NDRG2表达水平的提高,通过分析其启动子序列发现ATM和ATR等DNA损伤相关基因可能参与对NDRG2的调控。同时,我们还发现,NDRG2可以直接被抑癌基因p53转录激活,NDRG2在p53介导的细胞凋亡中发挥着重要作用,是可以增强肿瘤细胞化疗敏感性的新基因,但是具体的机制仍不明。【目的】1.分析并验证NDRG2与乳腺癌阿霉素耐药是否存在相关性;2.阐明NDRG2促进乳腺癌细胞阿霉素敏感性与p53活性的关系;3.明确NDRG2促进乳腺癌细胞凋亡的分子机制;4.揭示NDRG2促进乳腺癌细胞阿霉素耐药依赖于p53的分子机制。【方法和结果】1.NDRG2在乳腺癌耐阿霉素（adriamycin,ADR）细胞中的低表达状态分析我们首先用RT-q PCR和Western Blot检测NDRG2在亲本细胞MCF-7和阿霉素耐药细胞MCF-7/ADR中的表达,结果显示,NDRG2在MCF-7/ADR细胞中呈现低表达;我们进一步在MCF-7/ADR细胞中过表达NDRG2,MTT实验和流式细胞仪测细胞凋亡结果显示NDRG2过表达可以明显促进MCF-7/ADR细胞的凋亡和阿霉素的敏感性。这提示NDRG2可能促进乳腺癌对阿霉素的敏感性。2.NDRG2促进p53野生型乳腺癌细胞对阿霉素的敏感性我们构建了三株NDRG2过表达的乳腺癌细胞,MTT实验和流式细胞仪检测细胞凋亡发现,只有在p53野生型的乳腺癌细胞MCF-7中,NDRG2可以明显促进细胞的凋亡和对阿霉素的敏感性;而在p53突变型乳腺癌细胞T47D和MDA-MB-231中,NDRG2过表达不发挥作用。在MCF-7细胞中干涉NDRG2的表达,细胞对阿霉素的敏感性明显降低;进一步在MCF-7/NDRG2细胞中干涉p53的表达可中和NDRG2对乳腺癌细胞阿霉素的敏感性。由此可见,NDRG2促进乳腺癌细胞对阿霉素的敏感性依赖于p53的活性。3.NDRG2促进p53野生型乳腺癌细胞的DNA损伤反应阿霉素刺激细胞通常造成DNA的损伤,进而诱导细胞对损伤DNA的修复。我们进一步检测NDRG2对乳腺癌细胞DNA损伤和修复的影响。Western Blot结果显示,在p53野生型乳腺癌细胞MCF-7中,NDRG2可明显促进γH2AX的表达,抑制RAD51的表达;而在T47D和MDA-MB-231细胞中却无此现象。激光共聚焦显微镜检测RAD51的表达结果与Western Blot一致。我们进一步用p DR-GFP,I-Sce I系统检测NDRG2对细胞DNA损伤同源重组修复的影响。结果显示,NDRG2可以明显抑制MCF-7细胞的同源重组修复;抑制p53的表达可以中和NDRG2对细胞同源重组修复的抑制作用。因此,NDRG2可以促进p53野生型乳腺癌细胞MCF-7的DNA损伤,并抑制其DNA损伤修复能力。4.NDRG2通过提高Bad的表达促进细胞的凋亡前几部分的研究表明NDRG2促进p53野生型乳腺癌细胞MCF-7的凋亡,我们用Western Blot检测凋亡相关分子Bcl-2家族成员的表达。发现NDRG2可促进MCF-7细胞中促凋亡分子Bad的表达;利用si RNA干涉Bad的表达可以显着抑制NDRG2的促凋亡能力。进一步的机制分析,发现NDRG2不改变Bad的m RNA水平,利用蛋白酶体抑制剂（MG132）抑制蛋白降解,放线菌酮（CHX）抑制蛋白合成,分析Bad的蛋白质降解过程,发现NDRG2可以抑制Bad的蛋白酶体-泛素化降解,促进其蛋白稳定性。5.NDRG2促进线粒体p53与Bad复合物的形成,抑制p53的核定位由于NDRG2促进乳腺癌细胞对阿霉素的敏感性均依赖于野生型p53,我们对其分子机制进行探究。RT-q PCR和Western Blot结果显示NDRG2对p53的Mrna以及蛋白表达没有明显改变;细胞核蛋白和细胞质蛋白分离检测发现,NDRG2明显抑制p53蛋白进入细胞核,增加其在细胞质中的含量;同时,对p53直接转录激活的下游靶基因m RNA水平的检测,证实p53进入细胞核减少;利用线粒体蛋白分离和激光共聚焦技术,我们进一步发现NDRG2可以促进p53在线粒体的定位;最后,Co-IP实验证实p53与Bad存在相互作用。因此,NDRG2通过促进p53定位于线粒体,诱导p53非转录依赖的细胞凋亡。同时,p53进入细胞核的蛋白量降低,抑制其DNA损伤修复过程,导致DNA损伤加剧。【结论】通过本课题的研究,我们发现NDRG2可以促进p53野生型乳腺癌对化疗药物阿霉素的敏感性,而且,NDRG2抑制Bad的泛素化降解维持蛋白稳定性,进而诱导细胞的凋亡;同时NDRG2可以促进p53与Bad的相互作用,且定位于线粒体。因此,我们的研究不仅明确了NDRG2在化疗药物阿霉素敏感性中的作用,更进一步揭示了NDRG2对p53的调控,为NDRG2在乳腺癌治疗中的应用提供了强有力的依据。
苏冬梅[3]（2010）在《BMP4在阿霉素诱导肺癌细胞过早性衰老的作用及机制研究》文中提出细胞衰老是细胞进入一种周期不可逆转的停滞而达到的相对稳定状态。细胞衰老包括复制性衰老和过早性衰老两种形式,其中过早性衰老这种方式可以更为快速并有效地抑制肿瘤细胞的增殖。化疗是目前治疗肿瘤的主要手段之一。化疗药物阿霉素在肿瘤的临床治疗上得到了广泛的应用,然而它抑制肿瘤的机制还不是完全清楚。我们实验结果显示化疗药物阿霉素抑制肺癌是通过促进肺癌细胞衰老来实现的,同时发现在阿霉素诱导肺癌细胞衰老过程中BMP4的表达水平显着升高。RNAi干涉实验表明,下调BMP4的表达可以明显抵制化疗药物阿霉素对衰老的诱导作用,说明BMP4很有可能是化疗药物阿霉素激活的下游靶基因,并在阿霉素对衰老的诱导过程中起着重要的调节作用。为了进一步深入研究BMP4参与阿霉素诱导肺癌细胞衰老的分子机制,我们构建了四环素调节BMP4表达的稳定转染细胞系。实验结果表明,作为上游信号分子的BMP4通过激活下游的Smad和p38信号通路来实现对衰老的调节作用。并且研究还显示,BMP4可以通过提高抑癌基因p16INK4a和p21WAF1/cip1的表达促进肺癌细胞衰老。Western blotting和染色质免疫沉淀实验结果表明,p16INK4a和p21WAF1/cip1表达水平的上升是通过BMP4提高转录因子Smad磷酸化水平,增强这些转录因子对下游靶基因p16INK4a和p21WAF1/cip1启动子的结合,并进而招募乙酰转移酶p300到p16INK4a和p21WAF1/cip1启动子上,促进它们启动子上组蛋白H3和H4乙酰化水平增加来实现的。总之,我们的实验表明,化疗药物阿霉素能够通过促进肺癌细胞的过早性衰老而抑制肿瘤的生长,而且BMP4在阿霉素诱导衰老过程中起着重要的调节作用。我们的研究为BMP4作为化疗药物新的靶点提供了重要的线索和实验证据。
刘超[4]（2010）在《沉默p53基因表达的稳定Vero细胞系的建立及初步应用》文中进行了进一步梳理p53基因广泛存在于各种动物细胞中,在进化程度不同种属的动物中,p53基因具有异常相似的基因结构。而由p53基因所编码的p53蛋白分子被称之为肿瘤抑制蛋白,具有参与细胞周期调控、诱导细胞凋亡、参与细胞分化与衰老、抗病毒等多种生物学功能。当细胞受到各种外来应激如射线辐射、缺氧、病原微生物感染时,细胞核内的p53蛋白分子就会被激活,继而激活下游基因的表达,从而产生一系列生物学效应,目的都是为保护细胞基因组免受外来损伤,因此它又被尊称为“基因组的守护着”。p53的生物学功能如此重要,因此倍受细胞生物学家和医学家的高度关注,为此进行了大量的研究。为研究p53及其介导的信号转导通路在动物病毒感染过程中的作用,本实验首先根据前期实验筛选的一条有效干扰p53基因的小RNA干扰片段,构建针对p53基因的RNA干扰慢病毒载体,将构建好的慢病毒载体与病毒包装辅助质粒共转染293T细胞进行慢病毒的包装,最后在293T细胞中测定病毒滴度。将前期包装好的慢病毒感染Vero细胞,嘌呤霉素筛选阳性细胞株,采用局部消化法获得单细胞克隆以筛选阳性细胞系,利用RT-PCR和Western blot检测p53的表达水平,利用虫荧光素酶报告系统,分析p53的转录激活功能。结果发现:慢病毒介导的shRNA有效地沉默了p53基因表达;与对照组细胞相比,干扰组细胞的p53的转录激活功能明显降低。因此成功获得了稳定沉默p53基因表达的Vero细胞系。以建立的稳定沉默p53基因表达的Vero细胞系为模型,将疱疹病毒家族典型代表伪狂犬病病毒（ PRV ）感染该细胞系,在病毒感染的不同时间点分别收集病毒样品和全细胞蛋白样品,采用TCID50方法测不同时间点的病毒滴度,绘制病毒的多步生长曲线;采用半定量RT-PCR方法测定指示病毒复制的基因的转录水平的变化;采用Western blot方法测定指示病毒复制的基因的翻译水平的变化;分别比较这三项指标在p53-knockdownVero细胞和阴性对照组细胞中的差异变化。结果发现:PRV在p53-knockdown Vero细胞中的复制情况与阴性对照组细胞相比,病毒滴度有所降低,指示病毒复制的基因的mRNA表达水平和蛋白表达水平也有所降低,尤其在病毒感染晚期,这种变化趋势尤为明显。因此可以初步说明:p53可能在PRV感染宿主细胞的晚期有助于病毒的复制,这为研究PRV与p53介导的信号转导通路之间的关系提供理论依据。总之,本研究首次采用慢病毒载体介导的RNA干扰技术建立了沉默p53基因表达的稳定Vero细胞系,并且初步应用于动物病毒复制机制中的研究,该细胞系将为研究p53的生物学功能提供有利的工具,阐明p53在某些动物病毒感染过程中的潜在作用机制,从而为研究新型抗动物病毒药物提供理论依据。
侯小强[5]（2010）在《促炎细胞因子及p53蛋白在哺乳动物禽流感致病中的作用研究》文中研究表明自2003年以来,高致病性禽流感（HPAI）在亚洲、欧洲与非洲的流行已导致492人感染,291人死亡。感染者发病死亡的主要原因是急性肺损伤导致的呼吸窘迫综合征,甲型H1N1流感病毒重症患者也表现出类似的现象。因此,H5N1禽流感病毒的致病机理成为研究的重点和热点。一些研究者发现,在宿主和病毒感染的相互作用中,病毒刺激宿主机体产生的强烈炎症反应及高滴度复制是H5N1禽流感病毒感染致病的关键。目前,已发现IL-1β、IL-6、TNFα、IP-10、RANTES和MIG等炎性细胞因子和趋化因子参与了致病,是否还有其它细胞因子也参与致病?宿主在抗病毒复制中是通过什么途径发挥功能?针对上述问题,我们进行了相关研究。我们的研究发现,促炎细胞因子MIF和HMGB1在哺乳动物源H5N1禽流感病毒感染的BALB/c小鼠肺脏中高水平表达。对其功能阻断后发现,阻断治疗能延长病毒感染小鼠的生存时间,降低与致病密切相关的炎性细胞因子及趋化因子（IL-1β、IL-6、TNF-α、IP10、RANTES和MIG）的水平,减轻肺脏的病理损伤。实验结果表明,促炎细胞因子MIF和HMGB1在H5N1禽流感病毒感染致病中也发挥重要作用。我们在研究病毒复制与致病机理关系时发现,p53蛋白在哺乳动物源H5N1禽流感病毒感染的A549细胞及C57BL/6小鼠中高表达与病毒的复制有关,其功能不受p53基因的转录调控。更重要的是激活的p53蛋白能抑制H5N1禽流感病毒的复制,这种抑制病毒复制作用与干扰素通路有着密切的联系。实验结果表明,宿主的抗病毒天然免疫与H5N1禽流感病毒相互作用也影响致病。本研究证实了促炎细胞因子MIF和HMGB1在H5N1禽流感病毒感染中致病作用,发现激活的p53蛋白能抑制H5N1禽流感病毒的复制,为进一步阐明H5N1禽流感的致病机理提供了重要的理论依据,也为临床救治药物研究提供了新靶标。
唐兆前[6]（2010）在《卵巢癌耐药细胞与非耐药细胞差异表达基因的验证与结构和表型变化研究》文中认为卵巢上皮癌在妇科恶性肿瘤中致死率最高。手术后,以铂类为基础的联合化疗是其主要的治疗方法。但随着化疗的进行,患者最终获得难以治愈的多药耐药,因而其五年生存率一直徘徊在30-50%。为了更好地认识肿瘤抑制基因在卵巢癌多药耐药中的机制,我们对卵巢癌卡铂耐药基因差异表达谱芯片进行了肿瘤抑制基因的筛选及验证,对相关的肿瘤抑制基因启动子区进行了甲基化检测以及突变基因筛选研究。并在组织标本中进行了临床意义的探讨。第二章卵巢癌卡铂耐药细胞与非耐药细胞差异表达基因的验证目的:筛选卵巢癌卡铂耐药表达谱基因芯片中卡铂耐药细胞系（SKOV3-CB）较其亲本（SKOV3）细胞系差异表达下调的肿瘤抑制基因,并验证其差异表达。方法:应用分子生物信息学方法,分析卵巢癌卡铂耐药表达谱基因芯片中卵巢癌SKOV3-CB细胞系较SKOV3细胞系差异表达下调两倍以上的基因1554条,筛选肿瘤抑制基因。应用real-time PCR技术对基因芯片中差异表达基因检测验证。结果:从卵巢癌卡铂耐药表达谱基因芯片中筛选出RNASET2,VHL,DLG1,COPS2,NOL7,GGNBP2, RBL1, S100A2, PARG1,PERP,TCF3,DNAJA3,PCGF2,ING1,CYLD,RARRES3,RBBP8等17个肿瘤抑制基因,荧光定量PCR技术差异表达验证结果示:RNASET2,VHL, COPS2,NOL7, RBL1, S100A2, PARG1,PERP,TCF3,DNAJA3, ING1,CYLD,RARRES3,RBBP8等基因差异表达下调,下调倍数分别为24.47、65.24、10.81、21.30、72.94、5.95、27.13、1.57、1.32、12.93、46.8、7.57、14.9、14. 00、23.98。GGNBP2,PCGF2,DLG1等基因差异表达上调,上调倍数分别为5.76,2.19,17.1,基因芯片差异表达结果与real-time PCR所验证表达下降趋势的结果一致率为82.35%,下调两倍以上的基因一致率为64.70%。结论:利用基因芯片技术分析基因差异表达结合real-time PCR对其检测结果验证是一种有效的方法,多肿瘤抑制基因参与卵巢癌卡铂耐药的机制。第三章卵巢癌卡铂耐药细胞与非耐药细胞差异表达基因甲基化检测目的:探讨卵巢癌卡铂耐药相关肿瘤抑制基因启动子区甲基化状态与卵巢癌卡铂耐药表达下调的关系。方法:应用分子生物信息学方法,分析肿瘤抑制基因启动子区CPG岛并设计出引物,采用甲基化特异性PCR（MS-PCR）法或亚硫酸盐测序法（bisulphite sequencing）检测SKOV3-CB、SKOV3中的耐药相关肿瘤抑制基因启动子区甲基化状态。结果:表达下调的14个基因（VHL, COPS2, NOL7,RANSET2, RBL1, S100A2, PARG1, PERP, TCF3, DNAJA3, ING1, RARRES3, RBBP8,CYLD）中,有10个基因（VHL, COPS2, NOL7, RBL1, PARG1, PERP, DNAJA3, ING1, RNASET2,CYLD）启动子区能够设计出引物,其中CYLD未检出结果,后改用亚硫酸盐测序法检测。MS-PCR检测结果显示,SKOV3-CB、SKOV3的ING1、DNAJA3、VHL甲基化引物均能够扩增出产物,未甲基化引物均不能扩增出产物;COPS2、PERP甲基化引物均不能够扩增出产物,未甲基化引物均能够扩增出产物;RNASET2,PARG1、NOL7、RBL1甲基化引物与未甲基化引物均能够扩增出产物,CYLD重亚硫酸盐测序提示在SKOV3-CB及SKOV3细胞系均为未甲基化状态。结论:卵巢癌卡铂耐药相关肿瘤抑制基因启动子区无超甲基化,甲基化机制不是引起卵巢癌卡铂耐药相关肿瘤抑制基因差异表达下调的原因。第四章卵巢癌卡铂耐药细胞与非耐药细胞差异表达基因突变检测目的:筛查可能的基因突变,探讨其与卵巢卡铂耐药以及相关肿瘤抑制基因表达下调的关系。方法:以亲本细胞系（SKOV3）为对照,在卵巢癌卡铂耐药细胞系（SKOV3-CB）,应用单链构象多态性分析（SSCP）检测RNASET2,VHL, COPS2, NOL7, PARG1, RBL1, PERP, DNAJA3, ING1, CYLD等10个基因RT-PCR扩增片段的突变。结果:以SKOV3细胞系为对照,在SKOV3-CB细胞系中,SSCP检测发现DNAJA3,PERP基因聚丙烯酰胺电泳带型存在差异;RNASET2,VHL,COPS2, NOL7, PARG1, RBL1,ING1, CYLD等基因未检测到差异带型。经测序发现PERP第三外显子1093,1160,1222位点上分别存在A→G突变;1083位点及1085,1086位点,分别存在T,C,C,碱基缺失。DNAJA3第八个外显子87位点处存在A→T突变。结论:DNAJA3,PERP的基因突变以及PERP基因的碱基缺失与卵巢癌卡铂耐药相关,可能是导致其表达下调的原因,宜进一步深入研究。第五章卵巢癌卡铂耐药相关肿瘤抑制基因表达与临床病理的关系的研究目的:探讨卵巢癌卡铂耐药相关肿瘤抑制基因表达的临床意义方法:Trizol一步法提取卵巢肿瘤患者卵巢组织总RNA,应用RT-PCR检测85例卵巢组织的RNASET2、VHL、PARG1、CYLD、COPS2、PERP、DNAJA3、ING1、NOL7、RBL1基因mRNA表达,其中卵巢癌49例,卵巢良性组织21例,卵巢正常组织15例。结果: RT-PCR结果显示RNASET2、ING1、PARG 1、RBL1、NOL7基因在正常卵巢组织、卵巢良性肿瘤组织、卵巢癌组织中均有一定程度表达;VHL、PERP、COPS2、CYLD基因在正常卵巢组织、良性肿瘤中、卵巢癌组织中均有一定程度表达,但在部分卵巢癌组织中表达沉默,分别为4（4/49）、3（3/49）、2（2/49）、32（32/49）例;采用Fisher确切概率法统计分析,提示RNASET2、ING1、PARG 1、RBL1、NOL7、VHL、PERP、COPS2基因在卵巢癌中的表达沉默阳性率与在卵巢正常组织及卵巢良性肿瘤中的表达沉默阳性率比较差异无意义。CYLD、DNAJA3基因在卵巢癌中的表达沉默阳性率与在卵巢良性肿瘤组织与正常卵巢组织中的表达沉默阳性率比较差异有显着意义（P分别为0.00、0.00;0.00,0.00）。VHL等10个基因表达与卵巢癌临床病理的关系Fisher确切概率法统计分析,提示CYLD在FIGO I-II与III-IV期存在差异有意义外（P<0.05）,其余基因差异均无意义（P均>0.05）。Log Rank分析发现卵巢癌组织VHL、PERP、CYLD基因表达阳性患者与阴性患者的生存时间比较,差异均无统计学意义（P分别为0.183、0.493、0.271）。COPS2基因表达阳性患者与阴性患者的生存时间比较,差异有统计学意义（P=0.005）。COX回归模型多因素生存分析提示FIGO分期、病理分级进入模型（P分别为0.045、0.028）;淋巴结转移及COPS2、PERP、CYLD、ING1基因表达沉默等参数均未进入模型（P分别为0.907、0.476、0.754、0.728、0.304）。结论:结论CYLD、DNAJA3基因表达沉默可作为卵巢癌与卵巢良性肿瘤及正常卵巢组织鉴别诊断的一个潜在的指标,COPS2、PERP、CYLD、ING1不能作为卵巢癌独立的预后因素。
施寒清[7]（2010）在《细胞周期检验点蛋白Nbs1的转录调控及功能》文中进行了进一步梳理Nbs1是细胞应答DNA损伤时起重要作用的蛋白,特别是在应答DNA双链断裂时。它在DSB监测、DNA损伤应答、细胞周期检验点、DNA损伤的修复和DNA复制中都起到重要作用,对维持基因组的保真性和细胞的存活有重要贡献。虽然有报道c-Myc可以调控Nbs1的表达,但是关于Nbs1的转录调控的具体机制未见报道。c-Myc是一个泛在性转录因子,在细胞中调控了大量的靶基因,影响许多细胞进程,包括了细胞增殖、生长、凋亡、能量代谢、分化等。c-Myc的表达失调与肿瘤发生和治疗密切相关,关于c-Myc对肿瘤细胞的药物敏感性的影响及其机制还有待阐明。本文探讨了Nbs1的表达调控的机制和意义以及c-Myc对肿瘤细胞的药物敏感性与Nbs1和DNA修复机制的关系。我们的研究证实了Nbs1是c-Myc的靶基因,存在于Nbs1启动子区的两个E-box序列对c-Myc结合是重要的。我们的实验结果也显示,组蛋白乙酰化酶p300参与Nbs1的表达调控,p300促进Nbs1的表达。染色质免疫沉淀表明c-Myc招募p300到Nbs1启动子,而且引起了Nbs1启动子区的组蛋白H4乙酰化。通过点突变和染色质免疫沉淀我们确定了Nbs1启动子区的两个E-box序列对c-Myc招募p300有重要作用。通过集落形成实验我们发现,过表达c-Myc和Nbs1都可以降低骨肉瘤细胞U2OS的阿霉素敏感性。通过小RNA干涉和补偿实验我们发现c-Myc对阿霉素作用的影响与其调控Nbs1有关,增强DNA损伤修复能力可能是c-Myc影响阿霉素的疗效的一个重要因素。用小RNA干涉进行的集落形成实验结果也显示,要提高c-Myc高表达细胞的阿霉素敏感性,干涉Nbs1可能比直接干涉c-Myc更有效。我们对Nbs1的表达调控的机制的研究阐明了c-Myc调控Nbs1的机制,从DNA损伤修复角度说明了c-Myc对骨肉瘤细胞药物抗性的影响机制,为肿瘤的治疗提供了依据。
汲坤[8]（2009）在《减毒沙门氏菌携带共表达siRNA-mdm2与p53质粒抗前列腺癌的实验研究》文中研究说明目的:探讨共表达siRNA-mdm2与p53质粒对前列腺癌细胞株PC-3的联合效应及用减毒沙门氏菌携带共表达siRNA-mdm2与p53质粒增强对裸鼠前列腺癌移植瘤的治疗作用,为前列腺癌的基因治疗提供新的实验依据。方法:免疫组化技术检测人正常前列腺组织和前列腺癌组织mdm2和p53的表达;基因重组技术构建共表达siRNA-mdm2与p53质粒;真核细胞转染技术将共表达质粒转入前列腺癌PC-3细胞;MTT法检测共表达质粒对PC-3细胞增殖活性的影响;流式细胞术检测共表达质粒对PC-3细胞凋亡的影响;半定量RT-PCR和Western blot检测共表达质粒对mdm2和p53及其相关基因的表达;应用减毒沙门氏菌（Ty21a）携带共表达siRNA-mdm2与p53质粒治疗裸鼠前列腺癌移植瘤,观察其对移植瘤生长的影响。结果:免疫组化检测到人前列腺癌组织中mdm2和mt-p53高表达,与正常前列腺组织表达有显着差异性,两者呈正相关;基因重组技术成功构建了共表达siRNA-mdm2与p53质粒;MTT检测到共表达质粒对PC-3细胞有抑制增殖作用;流式细胞术检测到共表达质粒对PC-3细胞有促进凋亡作用;透射电镜观察到共表达质粒治疗组肿瘤细胞核固缩等形态学变化;半定量RT-PCR和Western blot检测到共表达质粒促进了P21的表达,而CDK4,cyclin-D1, HIF-1α,pRb,E2F-1的表达被抑制;减毒沙门氏菌携带的共表达siRNA-mdm2与p53质粒明显增强抑制了裸鼠前列腺癌移植瘤的生长;减毒沙门氏菌作为siRNA-mdm2与p53共表达质粒的运载体,起到了靶向性治疗作用。结论:共表达siRNA-mdm2与p53质粒抑制了前列腺癌细胞PC-3的增殖;减毒沙门氏菌携带共表达siRNA-mdm2与p53质粒对裸鼠前列腺癌移植瘤具有显着的治疗作用。本研究首次构建了共表达siRNA-mdm2与p53质粒,并用减毒沙门氏菌人用疫苗株携带共表达质粒治疗裸鼠前列腺癌移植瘤,为临床肿瘤多基因联合治疗奠定实验基础。
吕佳音[9]（2009）在《MDM2-siRNA靶向阻断对骨肉瘤抑制作用的实验研究》文中指出目的观察靶向MDM2的小干扰RNA（siRNA）对骨肉瘤生长的影响。方法1、应用免疫组化方法检测MDM2在人骨肉瘤组织的表达;2、以MDM2已知序列为靶点,构建PGCsilencerTM-MDM2 siRNA重组质粒;3、通过体外、体内实验,研究重组质粒转染骨肉瘤U20细胞及裸鼠瘤内注射重组质粒后MDM2的表达情况及细胞凋亡情况。结果1、免疫组织化学研究结果提示MDM2的过度表达在骨肉瘤的发生、发展过程中起重要作用。2、成功地构建了PGCsilencerTM-MDM2 siRNA重组质粒,为进一步研究MDM2结构与功能及RNAi技术的应用提供了方便条件。3、成功地将重组质粒转染入骨肉瘤U20细胞,为后续的研究工作作好了铺垫。4、PGCsilencerTM-MDM2 siRNA重组质粒转染U20骨肉瘤细胞后MDM2的表达无论在蛋白水平还是在基因水平上都明显下调,体外研究结果证实,RNA干涉MDM2基因的效果具有特异性和高效性。5、成功地建立了骨肉瘤裸鼠动物模型:通过体内实验,证实瘤内注射PGCsilencerTM-MDM2 siRNA重组质粒且应用电穿孔技术可明显抑制裸鼠骨肉瘤的生长,降低肿瘤体积及重量。结果显示,MDM2的表达明显受抑,且促进了细胞的凋亡及肿瘤组织坏死。结论应用RNAi技术沉默MDM2基因可以降低骨肉瘤细胞中MDM2的表达,导致细胞凋亡进而抑制肿瘤的生长。
李绍青[10]（2009）在《BZAP45基因与黏液表皮样癌关系的研究》文中指出人涎腺黏液表皮样癌（Mucoepidermoid Carcinoma,MEC）是涎腺最常见的恶性肿瘤,约占涎腺恶性肿瘤的30%,尽管有时表现像良性病变,生长比较慢,但是该肿瘤有时是高度恶性而且预后很差。低分化的涎腺黏液表皮样癌侵袭和转移能力强,5年的存活率不超过43%。对于BZAP45（或BZW1）基因的相关研究的文献不多。至今仅知BZAP45是一种调节因子。而对于BZAP45基因是否有其他功能并没有文献报道,也未见有BZAP45基因与肿瘤相关的报道。RNA干扰（RNA interference, RNAi）作用机制为应用小的双链RNA引发序列特异性的基因表达的“沉默”或“敲除”。在哺乳动物细胞中这种双链RNA可以是短发夹结构RNA （Small hairpin RNA,shRNA）;也可以是3’-端带有游离碱基的简单的二聚体（Small interference RNA, siRNA）。转染合成的siRNA所得到的靶基因抑制效果往往时间比较短,而且局限于容易转染的细胞系。应用于RNA干扰的载体有很多种,而利用慢病毒构建载体应用于基因沉默,是研究基因功能很好的方法。在本课题的前期研究中,我们初步发现在黏液表皮样癌组织和细胞中,BZAP45均高表达。在此基础上,本课题构建了BZAP45慢病毒干涉载体,将Mc3细胞中的BZAP45基因沉默,观察其体外和体内生物学特性的改变,并对其影响Mc3细胞生物学行为的机制进行初步探索。本课题主要的研究内容包括以下几个方面:1.进一步确认BZAP45基因在黏黏液表皮样癌中高表达为验证基因芯片结果正确与否并且明确BZAP45基因是否为黏液表皮样癌特异性的差异表达基因,我们设计了BZAP45基因实时定量PCR的引物,进行实时定量PCR检测;并预制了BZAP45基因的多克隆抗体,对4例肿瘤组织（制备成15个样本）和4例正常组织进行了免疫组化染色。结果显示,BZAP45基因在黏液表皮样癌细胞和组织中表达均比正常细胞和组织高。2. BZAP 45基因RNA干扰慢病毒载载体的制备及黏黏液液表皮样癌细细胞胞感染针对靶基因序列,利用公用网站按照RNA干扰序列设计原则,设计4个针对BZAP45基因的RNA干扰靶点序列;合成含干扰序列的双链DNA oligo,其两端含酶切位点粘端,直接连入酶切后的载体上,将连接好的产物转入制备好的感受态细胞,对长出的阳性克隆先进行PCR鉴定,再进行测序比对后,鉴定阳性的克隆即为构建成功的BZAP45基因RNA干扰慢病毒载体。选择干涉效果最好的序列,经过病毒的小量包装、大量包装、滴度检测及浓缩后获得足够滴度的慢病毒溶液,利用慢病毒载体感染Mc3细胞,利用有限稀释法挑选阳性单克隆,并利用时定量PCR对获得的细胞进行鉴定,从而获得了稳定感染的细胞株。3. BZAP 45基因干涉后Mc3细胞体体体外外及及体体内内生生物物学学行为的改变为了研究BZAP45基因在Mc3细胞中可能的作用,我们将BZAP45基因干涉,使其沉默后,利用MTT法、细胞计数法、平板克隆形成实验观、细胞划痕实验、transwell实验、HE染色、透射电镜等方法察Mc3细胞体外的生物学行为的变化情况,利用裸鼠移植瘤方法观察了Mc3细胞干涉前后在裸鼠体内的生长情况。结果显示,BZAP45基因沉默后,Mc3细胞体外增殖变缓,细胞的群体倍增时间由原来的约23 h增为约48 h;克隆形成能力下降,克隆形成率由原来的78%下降为20%;体外迁移能力下降,Mc3、Mc3-NC和Mc3-RNAi三种细胞迁移的距离分别为65.833±4.940μm、64.733±2.684μm和45.667±3.066μm;体外侵袭能力下降,Mc3、Mc3-NC和Mc3-RNAi三种细胞到达小室底面的细胞数分别为85±6.1、82.0±7.8和24.0±3.7个;细胞超微结构改变,干涉后细胞核染色质浓缩、碎裂、边集于核膜,呈境界清楚的块状或半月状;体内成瘤速度变缓,抑瘤率约为57.95%。4. BZAP 45影响MMCC 3细细细胞胞胞生生生物物物学学行行为为的的机机制初探为研究BZAP45影响MC3细胞生物学行为的机制,我们利用流式细胞仪检测了干涉前后细胞周期分布的改变,并利用免疫荧光检测了细胞周期相关因子、凋亡相关因子以及细胞增殖相关因子的表达改变,结果显示,BZAP45基因干涉后,细胞出现G1期阻滞,干涉前后p53、c-myc和P21的表达无明显变化;干涉后,caspase3的表达有所升高,而cyclin-D1和PCNA的表达有所降低。结论:1. BZAP45基因在黏液表皮样癌组织和细胞中高表达。2.成功构建了BZAP45基因干涉的慢病毒干涉载体。并成功将MC3细胞的BZAP45基因干涉,获得了稳定的细胞株。3. BZAP45基因被干涉后,Mc3细胞的体内和体外的生物学特性发生改变,细胞的恶性程度下降。4.BZAP45基因可能与黏液表皮样癌的发生和/或发展有关。
二、RNA干涉在P~(53)基因功能研究及未来基因治疗中的应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、RNA干涉在P~(53)基因功能研究及未来基因治疗中的应用（论文提纲范文）
（1）去乙酰化酶SIRT3在非小细胞肺癌恶性进展中的作用及其机制的初步研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 第一部分 SIRT3促进NSCLC的恶性进展 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 SIRT3促进PTEN缺失的NSCLC中P53的泛素化降解 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（2）NDRG2诱导线粒体Bad/p53复合物形成促进乳腺癌阿霉素治疗敏感性的机制探究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 第一部分 NDRG2在乳腺癌耐阿霉素细胞中的低表达状态分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试剂与材料 |
| 1.2 常用缓冲液 |
| 1.3 常用仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 MCF-7/ADR细胞的培养 |
| 2.2 NDRG2过表达细胞的构建 |
| 2.3 MTT法检测药物杀伤曲线 |
| 2.4 mRNA的提取与RT-qPCR |
| 2.5 蛋白定量检测 |
| 2.6 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.7 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 MCF-7/ADR细胞耐药性验证分析 |
| 3.2 NDRG2在MCF-7/ADR细胞中呈现低表达 |
| 3.3 MCF-7/ADR-NDRG2细胞的构建及验证 |
| 3.4 NDRG2促进MCF-7/ADR细胞对阿霉素的敏感性 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 NDRG2促进p53野生型乳腺癌细胞对阿霉素的敏感性 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试剂与材料 |
| 1.2 常用缓冲液 |
| 1.3 常用仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 蛋白定量检测 |
| 2.2 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.3 MTT法检测药物杀伤曲线 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 NDRG2过表达乳腺癌细胞的构建及验证 |
| 3.2 NDRG2促进p53野生型乳腺癌细胞的阿霉素敏感性 |
| 3.3 干涉NDRG2的表达抑制p53野生型乳腺癌细胞的阿霉素敏感性 |
| 3.4 干涉p53的表达抑制MCF-7/NDRG2细胞的阿霉素敏感性 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 NDRG2促进p53野生型乳腺癌细胞的DNA损伤反应 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试剂与材料 |
| 1.2 常用缓冲液 |
| 1.3 常用仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 蛋白定量检测 |
| 2.2 间接免疫荧光 |
| 2.3 DNA同源性重组效率的检测 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 NDRG2促进p53野生型乳腺癌细胞的DNA损伤反应 |
| 3.2 NDRG2抑制p53野生型乳腺癌细胞的DNA损伤修复能力 |
| 3.3 NDRG2抑制p53野生型乳腺癌细胞的同源重组修复能力 |
| 4 讨论 |
| 第四部分 NDRG2通过提高Bad的表达促进细胞的凋亡 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试剂与材料 |
| 1.2 常用缓冲液 |
| 1.3 常用仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.2 MTT法检测药物杀伤曲线 |
| 2.3 蛋白定量检测 |
| 2.4 mRNA的提取与RT-qPCR |
| 2.5 Bad siRNA的转染 |
| 2.6 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 NDRG2促进促凋亡分子Bad的表达 |
| 3.2 干涉Bad的表达抑制NDRG2促进细胞凋亡过程 |
| 3.3 NDRG2不改变Bad的mRNA水平 |
| 3.4 NDRG2促进Bad的蛋白稳定性 |
| 4 讨论 |
| 第五部分 NDRG2促进线粒体p53与Bad复合物的形成，抑制p53的核定位 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试剂与材料 |
| 1.2 常用缓冲液 |
| 1.3 常用仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 mRNA的提取与RT-qPCR |
| 2.2 蛋白定量检测 |
| 2.3 间接免疫荧光 |
| 2.4 胞核蛋白分离 |
| 2.5 线粒体分离 |
| 2.6 免疫共沉淀（Co-IP） |
| 2.7 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 NDRG2不改变p53的蛋白表达量 |
| 3.2 NDRG2抑制p53的转位入核能力 |
| 3.3 NDRG2促使p53定位于线粒体 |
| 3.4 NDRG2促使p53/Bad复合物的形成 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历与研究成果 |
| 致谢 |
（3）BMP4在阿霉素诱导肺癌细胞过早性衰老的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 一、BMPs 家族简介 |
| （一） BMPs 及其受体 |
| （二） BMP 激活的信号通路 |
| （三） BMP4 基因及其功能研究 |
| 二、细胞衰老与肿瘤关系 |
| （一） 细胞衰老的介绍 |
| （二） 复制性衰老与过早性衰老 |
| （三） 衰老与肿瘤的相关性 |
| 三、组蛋白乙酰化修饰与物基因的转录调控 |
| （一） 真核生物的染色质结构与基因的转录调控 |
| （二） 组蛋白乙酰化修饰与转录调控 |
| （三） 组蛋白乙酰转移酶的分类与功能 |
| 四、本论文研究的内容和意义 |
| （一） 立题依据 |
| （二） 本论文的研究内容和意义 |
| 实验材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| （一） 质粒 |
| （二） 抗体与蛋白质 |
| （三） 哺乳动物细胞系 |
| （四） 实验试剂 |
| 二、实验方法 |
| Ⅰ. 分子生物学实验方法 |
| （一） 分子克隆 |
| （二） 质粒大量制备的方法 |
| （三） 琼脂糖电泳 |
| （四） 哺乳动物细胞总RNA 的提取和反转录 |
| （五） PCR 和荧光实时定量（Real-time）PCR |
| （六） 染色质免疫沉淀实验（Chromatin immounoprecipitation，ChIP） |
| （七） RNA 干涉（RNAi） |
| Ⅱ. 细胞生物学实验方法 |
| （一） 哺乳动物细胞系的培养 |
| （二） 真核生物细胞系的脂质体和罗氏瞬时转染 |
| （三） 真核生物细胞的磷酸钙转染和荧光素酶报告基因检测 |
| （四） 建立稳定转染细胞系 |
| （五） 蛋白质的Western Blot 分析 |
| （六） 免疫荧光（Cellular Immonunofluorescence）实验 |
| （七） MTT 细胞活性检测实验 |
| （八） 衰老染色实验 |
| Ⅲ. 统计分析 |
| 实验结果与分析 |
| 一、BMP4 参与调节化疗药物阿霉素诱导肺癌细胞走向过早性衰老 |
| （一） 化疗药物阿霉素诱导肺癌细胞走向过早性衰老 |
| （二） BMP4 参与调节阿霉素诱导肺癌细胞走向过早性衰老 |
| 二、BMP4 参与调节阿霉素诱导衰老的的分子机制及意义 |
| （一） BMP4 过表达诱导肺癌细胞走向过早性衰老 |
| （二） BMP4诱导肺癌细胞走向过早性衰老重要通过上调周期相关蛋p16~（INK4a）和p21~（WAF1/cip1）表达实现的 |
| （三） 由BMP4 所激活的Smad 信号途径在BMP4 调节肺癌细胞衰老中其重要作用 |
| （四） p38MAPK 信号途径参与调节BMP4 诱导的肺癌细胞衰老 |
| 三、组蛋白乙酰化参与调节BMP4 对周期相关基因的表达调控 |
| （一） BMP4 通过促进p16~（INK4a）和p21WAF1基因转录来上调 p16INK4a 和p21~（WAF1/cip1） 蛋白水平 |
| （二） 乙酰转移酶p300 参与BMP4 促进启动子上组蛋白H3、H4 乙酰化水平增加 |
| （三） Smad 蛋白招募乙酰转移酶p300 到p16~（INK4a）和p21~（WAF1/cip1）启动子上促进组蛋白H3，H4 乙酰化水平增加 |
| 四、p53 和BMP4 途径共同参与阿霉素对衰老的促进作用 |
| （一） p53 在阿霉素诱导肺癌细胞走向过早性衰老中起重要调节作用 |
| （二） 共同干涉p53 和BMP4 明显抵制阿霉素对衰老的促进作用 |
| 讨论 |
| 一、BMP4 与化疗药物阿霉素抑制肿瘤的关系 |
| 二、BMP4 与 p53 途径共同参与调节阿霉素对衰老的促进作用 |
| 三、Smad 信号途径的效应因子 Smad 蛋白促进 BMP4 下游靶基因 p16~（INK4a）和p21~（WAF1/cip11）转录激活的具体机制 |
| 四、由BMP4 所激活的Smad 和p38MAPK 信号途径在调节BMP4 促进肺癌细胞衰老中相关性 |
| 五、组蛋白乙酰化在BMP4 促进衰老相关基因p16~（INK4a）和p21~（WAF1/cip1）表达中的调节作用 |
| 主要结论和创新点 |
| 一、主要结论 |
| 二、主要创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在学期间公开发表论文及着作情况 |
（4）沉默p53基因表达的稳定Vero细胞系的建立及初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 p53 研究概况 |
| 1.1.1 p53 概述 |
| 1.1.2 p53 的激活 |
| 1.1.3 p53 的抑制 |
| 1.1.4 p53 的生物学功能 |
| 1.1.5 病毒与p53 相互作用研究概况 |
| 1.2 RNA 干扰研究概况 |
| 1.2.1 RNA 干扰发生机制 |
| 1.2.2 诱导RNAi 的方法 |
| 1.2.3 慢病毒载体介导的RNA 干扰 |
| 1.2.4 慢病毒载体介导的RNA 干扰在病毒性疾病治疗中的应用 |
| 1.3 研究目的和意义 |
| 第二章 p53 基因RNAi 慢病毒载体的构建及鉴定 |
| 2.1 试验材料和方法 |
| 2.1.1 质粒、菌株与细胞株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 p53-shRNA 重组慢病毒表达载体的构建 |
| 2.1.5 慢病毒包装 |
| 2.1.6 病毒滴度的测定 |
| 2.2 试验结果 |
| 2.2.1 p53-shRNA 重组慢病毒表达载体的构建及鉴定 |
| 2.2.2 慢病毒包装与病毒滴度的测定结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 p53 基因表达沉默的稳定Vero 细胞系的建立及特性分析 |
| 3.1 试验材料和方法 |
| 3.1.1 质粒、菌种与细胞 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 初筛嘌呤霉素对Vero 细胞的最低致死浓度 |
| 3.1.5 慢病毒感染Vero 细胞及阳性细胞株的筛选 |
| 3.1.6 阳性细胞株的纯化 |
| 3.1.7 p53-knockdown Vero 细胞系的鉴定 |
| 3.1.8 p53 基因mRNA 表达水平检测 |
| 3.1.9 p53 蛋白表达水平检测 |
| 3.1.10 外源性药物Doxorubicin刺激检测p53表达抑制效果 |
| 3.1.11 p53 转录激活功能的检测 |
| 3.2 试验结果 |
| 3.2.1 嘌呤霉素对Vero 细胞的最低致死浓度 |
| 3.2.2 p53-knockdown Vero 细胞系不同细胞克隆Western blot 鉴定 |
| 3.2.3 半定量RT-PCR 检测结果 |
| 3.2.4 Western blot 检测结果 |
| 3.2.5 p53 转录激活功能的检测 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 p53 基因表达沉默的稳定Vero 细胞系的初步应用 |
| 4.1 试验材料与方法 |
| 4.1.1 病毒与细胞 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 p53-knockdown Vero 细胞系的初步应用 |
| 4.2 试验结果 |
| 4.2.1 PRV 在p53-knockdown Vero 细胞中的多步生长曲线的测定结果 |
| 4.2.2 指示病毒复制的 gH 基因的半定量 RT-PCR 测定结果 |
| 4.2.3 指示病毒复制的 gH 蛋白的 Western blot 测定结果 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（5）促炎细胞因子及p53蛋白在哺乳动物禽流感致病中的作用研究（论文提纲范文）
| 内容摘要 |
| 英文缩写词 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 禽流感病毒研究进展 |
| 1 禽流感病毒病原学基础 |
| 2 禽流感流行病学特点 |
| 3 H5N1 禽流感流行现状 |
| 4 H5N1 禽流感病毒的变异 |
| 5 H5N1 禽流感病毒的起源及进化 |
| 6 结语 |
| 第2章 H5N1 禽流感病毒感染哺乳动物及人致病机制的研究进展 |
| 1 H5N1 禽流感病毒感染哺乳动物及人的概况 |
| 2 H5N1 禽流感病毒感染哺乳动物及人致病的分子基础 |
| 3 H5N1 禽流感病毒跨种属传播的分子机制 |
| 4 H5Nl禽流感病毒感染哺乳动物及其人的致病特征 |
| 5 H5N1 禽流感病毒感染哺乳动物及其人的致病机制 |
| 6 MIF 及 HMGB1 在炎性疾病中的致病作用 |
| 7 结语 |
| 第3章 天然免疫反应与病毒感染关系的研究进展 |
| 1 机体抗病毒天然免疫应答 |
| 2 宿主因子在抗病毒感染中的作用 |
| 3 p53 蛋白抗流感病毒的研究进展 |
| 4 结语 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 H5N1 禽流感病毒及小鼠细胞因子实时定量PCR方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第2章 促炎细胞因子 MIF 和 HMGB1 在 H5N1 禽流感病毒感染哺乳动物 致病中的作用研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第3章 H5N1 禽流感病毒感染 C57BL/6 小鼠模型的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第4章 p53 蛋白对H5N1 禽流感病毒感染复制的影响研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及取得的科研成果 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
（6）卵巢癌耐药细胞与非耐药细胞差异表达基因的验证与结构和表型变化研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 卵巢上皮恶性肿瘤多药耐药研究现况(文献综述) |
| 1 卵巢恶性肿瘤概述 |
| 1.1 卵巢癌的发病情况简述 |
| 1.1.1 卵巢癌的发病率及生存率 |
| 1.1.2 流行病学与致病因素 |
| 1.2 卵巢上皮恶性肿瘤的主要临床表现及诊断 |
| 1.2.1 肿瘤标志物 |
| 1.2.2 影像学检查 |
| 1.2.3 细胞学检查 |
| 1.2.4 腹腔镜探查术 |
| 1.2.5 联合诊断 |
| 1.3 卵巢上皮性癌一线常规治疗现况 |
| 1.3.1 卵巢癌手术治疗的研究近况 |
| 1.3.1.1 早、中期卵巢癌的手术治疗现状 |
| 1.3.1.1.1 全面分期手术的定义与价值 |
| 1.3.1.1.2 早期卵巢癌的手术切除范围及注意事项 |
| 1.3.1.1.3 阑尾切除在卵巢上皮性癌治疗中的价值 |
| 1.3.1.1.4 大网膜切除在卵巢癌治疗中的价值 |
| 1.3.1.1.5 腹膜后淋巴结清扫在卵巢癌治疗中的价值 |
| 1.3.1.1.6 卵巢癌的保守性手术现状 |
| 1.3.1.1.6.1 保守性手术的适应症与禁忌症 |
| 1.3.1.1.6.2 保守性手术的手术范围 |
| 1.3.1.1.6.3 保守性手术的价值 |
| 1.3.2 晚期卵巢癌的手术治疗现状 |
| 1.3.2.1 肿瘤细胞减灭术的原由及范围 |
| 1.3.2.2 肿瘤细胞减灭术的注意事项 |
| 1.3.2.3 影响肿瘤细胞减灭术的因素及在晚期卵巢癌临床治疗中的价值 |
| 1.3.2.4 复发卵巢癌的手术治疗 |
| 1.3.2.4.1 手术的目的与意义 |
| 1.3.2.4.2 手术的适应症,禁忌症及范围 |
| 1.3.2.4.3 影响手术效果的预后因素 |
| 1.3.3 化疗 |
| 1.3.3.1 一线化疗药物及方案的选择 |
| 1.3.3.1.1 一线化疗的指征 |
| 1.3.3.1.2 一线化疗药物以及方案的选择 |
| 1.3.3.2 腹腔化疗 |
| 1.3.3.3 维持或巩固化疗的临床价值 |
| 1.3.3.4 新辅助化疗 |
| 1.3.3.5 影响化疗疗效的临床病理因素 |
| 1.3.3.5.1 FIGO 分期 |
| 1.3.3.5.2 病理类型 |
| 1.3.3.5.3 残余灶的大小 |
| 1.3.3.5.4 化疗的用药剂量 |
| 1.3.3.5.5 肿瘤细胞产生耐药性 |
| 1.3.3.5.6 其它因素 |
| 1.3.4 影响腹腔化疗临床应用的因素 |
| 1.3.5 影响化疗疗效的分子病理因素 |
| 1.4 生物治疗 |
| 1.4.1 免疫治疗 |
| 1.4.2 过继性免疫治疗 |
| 1.4.3 抗体 |
| 1.4.4 细胞因子 |
| 1.4.5 肿瘤疫苗 |
| 1.5 基因治疗 |
| 1.5.1 自杀基因治疗 |
| 1.5.2 癌基因与抑癌基因治疗 |
| 1.5.3 免疫基因治疗 |
| 1.5.4 耐药基因治疗 |
| 1.5.5 抗肿瘤血管生成基因治疗 |
| 2 卵巢上皮恶性肿瘤的多药耐药 |
| 2.1 卵巢上皮恶性肿瘤多药耐药的原因及机理 |
| 2.1.1 卵巢癌多药耐药的分子机理 |
| 2.1.1.1 细胞内化疗药物浓度降低 |
| 2.1.1.2 P-糖蛋白 |
| 2.1.1.3 多药耐药相关蛋白 |
| 2.1.1.4 肺耐药蛋白 |
| 2.1.1.5 乳腺耐药蛋白 |
| 2.1.2 细胞内化疗药物代谢解毒增加 |
| 2.1.3 DNA 损伤修复能力增加 |
| 2.1.4 抗凋亡能力增加 |
| 2.1.5 p53 基因突变 |
| 2.1.6 信号传导通路 |
| 2.1.7 其它机制 |
| 2.1.7.1 细胞间连接 |
| 2.1.7.2 DNA 聚合酶 |
| 2.1.7.3 ATP7B |
| 2.2 卵巢上皮恶性肿瘤多药耐药的诊断 |
| 2.2.1 卵巢癌多药耐药的诊断 |
| 2.2.1.1 MDR-1 基因 |
| 2.2.1.2 肺耐药蛋白 |
| 2.2.1.3 GST-π |
| 2.2.1.4 mtP53 |
| 2.2.1.5 c-erbB-2 基因(HER-2 基因) |
| 2.2.1.6 DNA 错配修复基因 |
| 2.2.1.7 ATP7B |
| 2.2.1.8 多药耐药基因 SNPs 的检测 |
| 2.2.1.9 细胞凋亡相关基因 |
| 2.2.1.10 多基因联合检测在诊断多药耐药的价值 |
| 2.3 卵巢上皮恶性肿瘤多药耐的治疗 |
| 2.3.1 卵巢癌多药咐药的分型及治疗原则和目的 |
| 2.3.1.1 卵巢癌多药耐药的分型 |
| 2.3.1.2 卵巢癌多药耐药的治疗原则 |
| 2.3.1.3 治疗的目标及价值 |
| 2.3.2 多药耐药的化疗 |
| 2.3.2.1 二线化疗药物及方案的选择及疗效评价 |
| 2.3.2.2 顽固型卵巢癌的治疗 |
| 2.3.2.3 耐药型和难治型卵巢癌的治疗 |
| 2.3.2.4 影响二线化疗疗效的主要因素 |
| 2.3.2.5 常规化疗药物疗效预测分子靶向化疗 |
| 2.3.2.6 自体骨髓移植加大剂量化疗在卵巢癌多药耐药治疗中的应用 |
| 2.3.3 多药耐药的逆转耐药治疗 |
| 2.3.3.1 反义核酸技术 |
| 2.3.3.2 反义 RNA 技术 |
| 2.3.3.3 RNA 干涉技术 |
| 2.3.3.4 核酶基因转移技术 |
| 2.3.3.5 细胞因子基因逆转技术 |
| 2.3.3.6 针对 P-gp 的增敏治疗 |
| 2.3.3.7 针对 MRP 的增敏治疗 |
| 2.3.3.8 针对 BCRP 的增敏剂 |
| 2.3.4 多药耐药的手术治疗 |
| 2.3.5 多药耐药的的基因治疗 |
| 2.3.5.1 药物敏感基因 |
| 2.3.5.2 肿瘤免疫基因治疗 |
| 2.3.5.3 骨髓细胞修饰 |
| 2.3.6 多药耐药的综合治疗方案筛选及临床验证 |
| 2.3.6.1 单克隆抗体 |
| 2.3.6.2 腺病毒载体 |
| 2.3.6.3 中药治疗 |
| 2.3.6.4 亚致死量陡脉冲 |
| 3 卵巢上皮癌多药耐药差异表达基因研究现况 |
| 3.1 卵巢上皮癌多药耐药差异表达基因筛选鉴定技术 |
| 3.1.1 基因芯片技术 |
| 3.1.2 DDRT-PCT |
| 3.1.3 比较基因组杂交法 |
| 3.1.4 表达序列标签 |
| 3.1.5 基因表达的系列分析 |
| 3.1.6 消减杂交基因克隆技术 |
| 3.1.7 差异显示技术衍生的方法 |
| 3.1.8 差异基因的鉴定技术 |
| 3.2 卵巢上皮癌多药耐药差异表达基因筛选鉴定现况及临床价值 |
| 3.2.1 基因芯片应用 |
| 3.3 卵巢上皮癌多药耐药差异表达基因筛选鉴定存在问题 |
| 4 卵巢上皮癌多药耐药与基因甲基化的关系 |
| 4.1 基因甲基化的定义及主要检测手段 |
| 4.1.1 基因甲基化定义 |
| 4.1.2 主要检测手段 |
| 4.1.2.1 高效液相色谱柱(HPLC)及相关方法 |
| 4.1.2.2 SssI 甲基转移酶法 |
| 4.1.2.3 免疫化学法 |
| 4.1.2.4 氯乙醛法 |
| 4.1.2.5 特异性位点的 DNA 甲基化的检测 |
| 4.1.2.5.1 甲基化敏感性限制性内切酶法 |
| 4.1.2.5.2 直接测序法 |
| 4.1.2.5.3 甲基化特异性的 PCR |
| 4.1.2.5.4 甲基化敏感性单核苷酸引物延伸 |
| 4.1.2.5.5 结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法 |
| 4.1.2.5.6 甲基化敏感性单链构象分析 |
| 4.1.2.5.7 甲基化敏感性变性梯度凝胶电泳 |
| 4.1.2.5.8 荧光法 |
| 4.1.2.5.9 DNA 微阵列法 |
| 4.1.2.5.10 甲基化敏感性斑点分析 |
| 4.1.2.5.11 甲基化特异性多连接依赖性探针扩增 |
| 4.2 卵巢上皮癌多药耐药与基因甲基化的关系 |
| 4.3 卵巢上皮癌多药耐药基因甲基化检测的临床意义 |
| 4.3.1 治疗反应的标志物 |
| 4.3.2 化疗耐药和预后 |
| 5 卵巢上皮癌多药耐药与基因突变的关系 |
| 5.1 基因突变的定义及主要检测手段 |
| 5.1.1 基因突变的定义 |
| 5.1.2 基因突变主要检测手段 |
| 5.1.2.1 直接 DNA 序列分析法 |
| 5.1.2.2 单链构象多态性分析技术 |
| 5.1.2.3 温度梯度凝胶电泳分析 |
| 5.1.2.4 变性梯度凝胶电泳分析 |
| 5.1.2.5 变性高效液相色谱 |
| 5.1.2.6 异源双链分析 |
| 5.1.2.7 核酸分子杂交 |
| 5.1.2.8 核糖核酸酶切法 |
| 5.1.2.9 限制性内切酶酶谱分析 |
| 5.1.2.10 蛋白截短试验 |
| 5.1.2.11 聚合酶链反应—限制性片段长度多态性分析 |
| 5.1.2.12 等位基因特异性扩增法 |
| 5.1.2.13 等位基因特异性寡核苷酸分析法 |
| 5.1.2.14 毛细管电技术 |
| 5.2 卵巢上皮癌多药耐药与基因突变的关系 |
| 5.3 卵巢上皮癌多药耐药基因突变检测的临床意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 卵巢上皮癌卡铂耐药细胞与非耐药细胞差异表达基因的验证 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 卵巢上皮癌卡铂耐药细胞与非耐药细胞差异表达基因甲基化检测 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 卵巢上皮癌卡铂耐药细胞与非耐药细胞筹异表达基因突变检测 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 卵巢癌卡铂耐药相关肿瘤抑制基因表达与临床病理的关系研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）细胞周期检验点蛋白Nbs1的转录调控及功能（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 一、细胞周期检验点与肿瘤 |
| （一） 细胞周期检验点通路的组成成分 |
| （二） 细胞周期检验点通路 |
| （三） 细胞周期检验点与癌症的发生与治疗 |
| 二、细胞周期检验点蛋白N651的功能及研究进展 |
| （一） N651与DNA损伤修复 |
| （二） N651在DSB应答中的作用 |
| （三） N651与DNA复制 |
| （四） N651与细胞周期 |
| 三、c-Myc 的功能及研究进展 |
| （一） 关于Myc的结合与E-box |
| （二） Myc调控的基因 |
| （三） Myc与干细胞和肿瘤发生 |
| （四） Myc 的降解与Myc 靶基因的调控 |
| （五） Mxd 蛋白可以限制Myc 结合并抵消Myc 的功能 |
| 四、组蛋白乙酰化修饰、DNA 甲基化与真核生物基因的转录调控 |
| （一） 真核生物的染色质结构与转录调控的关系 |
| （二） 组蛋白乙酰化修饰与转录调控 |
| （三） 组蛋白乙酰化修饰酶 |
| 五、组蛋白乙酰基转移酶p300/CBP 复合物的研究进展 |
| （一） p300/CBP 的结构 |
| （二） p300/CBP 的功能 |
| 六、本论文研究的内容和意义 |
| （一） 立题依据 |
| （二） 本论文的研究内容和意义 |
| 实验材料和方法 |
| 一、实验材料 |
| （一） 质粒 |
| （二） 蛋白质和抗体 |
| （三） 哺乳动物细胞系 |
| （四） 试剂 |
| 二、实验方法 |
| I. 分子生物学试验方法 |
| （一） 分子克隆 |
| （二） DNA 的琼脂糖电泳 |
| （三） 基因组DNA 提取 |
| （四） 质粒的大量制备 |
| （五） 哺乳动物细胞总RNA 的提取和反转录 |
| （六） 逆转录（Reverse Transcription, RT） |
| （七） PCR 和荧光实时定量PCR |
| （八） 染色质免疫沉淀（Chromatin Immunoprecipitation, ChIP） |
| （九） RNA 干涉（RNAi） |
| II. 细胞生物学实验方法 |
| （一） 哺乳动物细胞系的培养 |
| （二） 真核生物细胞的瞬时转染和荧光素酶报告基因检测 |
| （三） 脂质体转染 |
| （四） 蛋白质的Western Blotting 分析 |
| （五） 集落形成实验 |
| III 统计分析 |
| 实验结果与分析 |
| 一、c-Myc 通过上调 N651 增加了阿霉素作用后骨肉瘤细胞的集落形成存活率 |
| （一） 过表达c-Myc 和N651 都增强了骨肉瘤细胞对阿霉素的耐受力 |
| （二） RNA 干涉显示下调c-Myc 和N651 骨肉瘤细胞对阿霉素的敏感性增加 |
| （三） c-Myc 对骨肉瘤细胞的阿霉素的耐受力的影响与N651 有关，可能涉及了DNA 修复 |
| 二、c-Myc 促进了N651 的表达 |
| （一） 过表达c-Myc 促进N651 表达 |
| （二） 小RNA干涉实验显示内源的c-Myc调控N651表达 |
| 三、p300 促进了N651 表达 |
| （一） 过表达p300 促进N651 表达 |
| （二） 小RNA干涉实验显示内源的p300调控N651表达 |
| 四、N651 启动子区域c-Myc 结合位点的确定 |
| 五、c-Myc 招募了p300 |
| （一） c-Myc 和p300 对N651 的表达调控有协同作用 |
| （二c）-Myc 招募了p300 到N651 启动子区 |
| 六、c-Myc 过表达促进了组蛋白H4 乙酰化 |
| 讨论 |
| 一、c-Myc、N651 表达对阿霉素处理后骨肉瘤细胞集落形成存活率的影响的意义 |
| 二 c、-Myc 通过促进N651 表达影响DNA 损伤修复 |
| 三、p300 和组蛋白乙酰化促进了N651 表达 |
| 四、c-Myc 招募p300 到N651 启动子区（c-Myc 与p300 的关系探讨） |
| 五、N651启动子区c-Myc结合位点的确定及E-box的功能探讨 |
| 主要结论和创新点 |
| 一、主要结论 |
| 二、主要创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在学期间公开发表论文及着作情况 |
（8）减毒沙门氏菌携带共表达siRNA-mdm2与p53质粒抗前列腺癌的实验研究（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第1章 文献综述 |
| 1 单克隆抗体治疗 |
| 2 细胞因子治疗 |
| 3 过继免疫治疗 |
| 4 肿瘤疫苗治疗 |
| 5 肿瘤的基因治疗 |
| 6 肿瘤基因治疗载体 |
| 7 展望 |
| 第2章 材料 |
| 2.1 主要试剂 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 质粒和菌株 |
| 2.4 细胞株 |
| 2.5 实验动物 |
| 2.6 正常前列腺组织及前列腺癌组织的来源 |
| 2.7 主要试剂及培养基的配制 |
| 第3章 方法 |
| 3.1 免疫组织化学染色 |
| 3.2 SIRNA-MDM2 与 P53 共表达质粒 PCDNA3.1-U6SI-MDM2-P53(PMP53)的构建 |
| 3.3 PMP53 共表达质粒对人前列腺癌PC-3 细胞的影响 |
| 3.4 减毒沙门氏菌携带SIRNA-MDM2 与P53 共表达质粒对人前列腺癌作用的体内研究 |
| 3.5 统计学处理 |
| 第4章 结果 |
| 4.1 MDM2、P53 在人正常前列腺组织、前列腺癌组织中的表达 |
| 4.2 SIRNA-MDM2 与P53 共表达PCDNA3.1-U6SI-MDM2-P53 质粒的构建 |
| 4.3 共表达质粒PMP53 对人前列腺癌PC-3 细胞作用的体外研究 |
| 4.4 减毒沙门氏菌携带共表达质粒PMP53 对人前列腺癌作用的体内研究 |
| 第5章 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表文章 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
（9）MDM2-siRNA靶向阻断对骨肉瘤抑制作用的实验研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| 缩略语表 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 第一节 骨肉瘤基因治疗现状 |
| 第二节 MDM2基因的研究进展 |
| 第三节 P53基因治疗在骨肉瘤中的应用 |
| 第四节 RNAi与基因沉默 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一节 MDM 2在骨肉瘤组织中的表达及临床意义 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 第二节 PGCsilencer~(TM)-MDM2 siRNA重组质粒的构建与体外实验研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 第三节 RNA干扰沉默MDM2治疗骨肉瘤的体内实验研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文论着 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 致谢 |
（10）BZAP45基因与黏液表皮样癌关系的研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 正文 |
| 第一部分 免疫组织化学及 Real-time PCR 验证基因芯片结果 |
| 实验一 Real-time PCR 检测黏液表皮样癌组织和细胞及正常唾液腺组织和细胞中 BZAP45 的表达 |
| 实验二 免疫组织化学检测人黏液表皮样癌及正常唾液腺组织 BZAP45 表达 |
| 第二部分 BZAP45 基因 RNA 干扰慢病毒载体的制备及目的细胞感染 |
| 实验一 目的基因 RNAi 设计 |
| 实验二 vshRNA 载体的构建 |
| 实验三 慢病毒小量包装 |
| 实验四 RNA 干扰有效靶点筛选（RT-PCR 筛靶） |
| 实验五 慢病毒大包装实验 |
| 实验六 Mc3 细胞慢病毒感染 |
| 第三部分 BZAP45 沉默后Mc3 体外及体内生物学行为的改变 |
| 实验一 细胞计数 |
| 实验二 MTT 实验 |
| 实验三 平板克隆形成实验 |
| 实验四 细胞划痕实验 |
| 实验五 Transwell 实验 |
| 实验六 透射电镜 |
| 实验七 BZAP45 基因干涉后Mc3 体内生物学的改变 |
| 第四部分 BZAP45 影响MC3 细胞生物学行为的机制初探 |
| 实验一 细胞周期检测 |
| 实验二 免疫荧光检测相关因子的表达 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
四、RNA干涉在P~(53)基因功能研究及未来基因治疗中的应用（论文参考文献）
- [1]去乙酰化酶SIRT3在非小细胞肺癌恶性进展中的作用及其机制的初步研究[D]. 熊延路. 中国人民解放军空军军医大学, 2018
- [2]NDRG2诱导线粒体Bad/p53复合物形成促进乳腺癌阿霉素治疗敏感性的机制探究[D]. 韦伊芳. 第四军医大学, 2017(02)
- [3]BMP4在阿霉素诱导肺癌细胞过早性衰老的作用及机制研究[D]. 苏冬梅. 东北师范大学, 2010(11)
- [4]沉默p53基因表达的稳定Vero细胞系的建立及初步应用[D]. 刘超. 中国农业科学院, 2010(02)
- [5]促炎细胞因子及p53蛋白在哺乳动物禽流感致病中的作用研究[D]. 侯小强. 吉林大学, 2010(08)
- [6]卵巢癌耐药细胞与非耐药细胞差异表达基因的验证与结构和表型变化研究[D]. 唐兆前. 广西医科大学, 2010(08)
- [7]细胞周期检验点蛋白Nbs1的转录调控及功能[D]. 施寒清. 东北师范大学, 2010(10)
- [8]减毒沙门氏菌携带共表达siRNA-mdm2与p53质粒抗前列腺癌的实验研究[D]. 汲坤. 吉林大学, 2009(08)
- [9]MDM2-siRNA靶向阻断对骨肉瘤抑制作用的实验研究[D]. 吕佳音. 吉林大学, 2009(08)
- [10]BZAP45基因与黏液表皮样癌关系的研究[D]. 李绍青. 第四军医大学, 2009(12)