一、脊椎动物心脏形态发育的转录调控（论文文献综述）
李振通[1]（2021）在《石斑鱼杂交后代表型和遗传性状分析》文中研究表明石斑鱼（Epinephelus）,因其肉质鲜、嫩、爽口,并且富含各营养元素,是我国重要的海水经济鱼类,主要在我国东南沿海养殖,北方也有养殖。近年来,由于石斑鱼养殖技术的成熟,以及市场对石斑鱼需求的扩增,石斑鱼养殖规模快速增长。同时,在石斑鱼养殖中也引发相关问题,如石斑鱼种质退化、易感病、畸形率高等。石斑鱼养殖业的可持续健康发展需要具有优良性状的石斑鱼新品种来维持。杂交育种作为新品种培育的有效途径,是解决生物种质遗传资源退化的有效手段,在石斑鱼养殖中广泛应用。对于众多的杂交子代,对其表型以及遗传性状的研究尤为重要。1、云龙石斑鱼生长、畸形性状测定及转录组测序分析云龙石斑鱼是以云纹石斑鱼（Epinephelus moara）为母本,鞍带石斑鱼（Epinephelus lanceolatus）为父本进行杂交,培育出的杂交石斑鱼新品种。云龙石斑鱼兼具父母双方的优点,如生长速度快、营养丰富。与母本云纹石斑鱼相比,云龙石斑鱼表现出显着的生长优势,已通过国家新品种审核。本文利用雄性鞍带石斑鱼与雌性云纹石斑鱼建立了28个云龙石斑鱼杂交家系,另外建立3个云纹石斑鱼纯系。云龙石斑鱼家系的受精率平均值是55.5%±26.7%,畸形率平均值是8.3%±0.9%。在45-245日龄,云龙石斑鱼与云纹石斑鱼的生长曲线分别为W=0.0392L2.8912（R2=0.9869）,W=0.0255L3.0216（R2=0.9908）,在此生长过程云龙石斑鱼呈异速生长型,云纹石斑鱼是等速生长型。至245日龄时,云龙石斑鱼的体重与体长平均值分别为（316.7±57.3）g、（22.5±1.7）cm,云纹石斑鱼的为（123.2±30.2）g,（16.8±1.3）cm,云龙石斑鱼体重和体长分别是云纹石斑鱼的2.6倍,的1.3倍。对云龙石斑鱼与珍珠龙胆石斑鱼进行为期12个月的对比养殖,体重是珍珠龙胆的1.3倍,全长为1.2倍。云龙石斑鱼具有明显的杂种优势。石斑鱼育种中普遍存在畸形鱼的现象,给石斑鱼养殖业的发展带来了较大的经济损失。在我们培育的云龙石斑鱼家系中,平均畸形率为8.3%±0.9%,个别家系畸形率高达44.7%。目前,对石斑鱼畸形的发生研究缺少,因此我们借助Illumina Hi Seq测序技术对高畸形率家系的正常鱼与畸形鱼的脑、垂体和脊椎骨进行测序。在18个RNA-seq文库中,共获得10.5亿条高质量的reads。共组装了87,888个基因,注释到36,268个基因,长度在201-28,922 bp。我们对正常鱼和畸形鱼进行比较转录组研究,分别在脑、垂体、脊椎骨中获得398、136和2,341个差异表达基因,共有706个上调基因,2,169个下调基因。对差异表达基因进行GO功能富集分析和KEGG通路分析,发现与DNA结合、激酶活性、细胞因子受体反应、神经性配体受体作用、钙离子信号通路、细胞外基质受体作用、雌激素信号和矿物质吸收通路参与到脊椎骨畸形的发生中。进一步通过权重基因共表达网络分析得到与畸形性状相关的三个模块,筛选到一些相关性较高的基因,如细胞周期蛋白依赖性激酶4、E3泛素-蛋白连接酶RNF19A。在blue模块中,发现有多数基因与小白蛋白（OCM）、血小板糖蛋白Ibα链（GPIBA）、基质金属蛋白酶-9（Mmp9）相关联,这三个基因均与脊椎骨发育密切相关。另外通过q PCR验证表明本研究的转录组数据是高质量的,满足生物信息学分析要求。2、杂交石斑鱼线粒体结构及进化分析石斑鱼种类丰富多样,线粒体DNA有其特有的特点,是分子系统学研究的重要标记。本文对云纹石斑鱼（♀）×蓝身大斑石斑鱼（Epinephelus tukula）（♂）杂交子代的线粒体结构和系统进化进行分析。云纹石斑鱼（♀）×蓝身大斑石斑鱼（♂）杂交子代线粒体DNA长度为16,695 bp,包括13个蛋白质编码基因（PCGs）、2个核糖体RNA（r RNA）、22个转运RNA（t RNA）、1个复制起始位点和1个控制区（control）。基因的组成与顺序与其它脊椎动物一致。在这13个PCGs中,有12个分布在重链,ND6编码在轻链。杂交子代的线粒体全基因组在碱基使用上具有较高的AT,AT为正值,GC为负值。起始密码子除了COX和ND4的为GTG,ATP6的为CTG,其余皆为ATG。终止密码子有三种类型,包括T（ND2,COXII,ND3,ND4和Cytb）、TA（COXIII）,TAA（其余PCGs）。所有t RNA中除了t RNASer（AGN）由于缺少经典的环不能形成经典的三叶草式。进行系统发育树分析,发现云龙石斑鱼、云纹石斑鱼（♀）×蓝身大斑石斑鱼（♂）子代与云纹石斑鱼关系最近,显示杂交子代的线粒体遵循母本遗传特征,结果对于鉴定物种、系统进化和杂交育种具有指导意义。3、赤点石斑鱼♀×蓝身大斑石斑鱼♂杂交子代表型和遗传性状分析在石斑鱼杂交育种过程中,需要对杂交组合的可行性、杂交子代的遗传特性进行评估。赤点石斑鱼（Epinephelus akaara）♀与蓝身大斑石斑鱼♂是一个新的杂交组合,从生长发育、染色体分析、线粒体分析和微卫星分析四个方面展开对赤点石斑鱼♀×蓝身大斑石斑鱼♂杂交子代研究。赤点石斑鱼♀×蓝身大斑石斑鱼♂杂交子代在水温20.3-24.7℃,盐度30的条件下,历时40 h 55 min孵化出膜,完成整个胚胎发育,赤点石斑鱼为41 h 18 min。胚后变态发育阶段分为前期仔鱼（1-3 d）、后期仔鱼（4-31 d）、稚鱼期（32-57 d）、幼鱼期（58 d-）四个时期。至一龄时,杂交子代的体重达到（176.6±28.7）g,全长达（22.4±1.1）cm,赤点石斑鱼的体重达（81.4±15.0）g,全长达（17.5±1.0）cm,杂交子代体重是赤点石斑鱼的2.17倍,全长的1.28倍。与赤点石斑鱼相比,杂交子代的体表附有黑色斑块,条带不明显,体型与赤点石斑鱼相似。通过头肾-秋水仙素法,对四月龄的赤点石斑鱼和赤点石斑鱼♀×蓝身大斑石斑鱼♂杂交子代进制备染色体制片。使用油镜观察和分裂相统计,杂交子代的染色体数目为2n=48,比重为72%,核型公式是2n=3sm+3st+42t。赤点石斑鱼的染色体数目为2n=48,比重为70%,核型公式是2n=4sm+6st+38t,蓝身大斑石斑鱼的染色体核型为2n=2sm+46t,说明杂交子代的遗传物质来自于父母本各一套染色体。杂交子代的线粒体DNA长度为16,928 bp,包含包括13个PCGs、2个r RNA基因、22个t RNA基因、1个复制起始位点和1个控制区。与其他脊椎动物相似。对于蛋白质编码基因,基因密码子使用频率最高的是编码亮氨酸的密码子。杂交后代系统进化分析说明线粒体DNA在遗传中遵循母本遗传。利用24对微卫星标记对赤点石斑鱼、蓝身大斑石斑鱼以及杂交子代进行遗传性状分析。对于这24对微卫星位点,主要等位基因频率平均为0.4297,shannon多态信息含量平均为0.6531,其中有20个位点为高度多态性,平均值为1.4793。赤点石斑鱼、蓝身大斑石斑鱼以及E.AT的群内近交系数、总群体近交系数和群体间分化系数和基因流平均为0.0713、0.3097、0.2566、0.7242。三个群体的平均有效等位基因数最高的是赤点石斑鱼（3.5883）,然后是杂交子（3.3288）和蓝身大斑石斑鱼（1.9306）。平均观测杂合度大小为杂交子代（0.6447）、赤点石斑鱼（0.5089）、蓝身大斑石斑鱼（0.3097）。平均期望杂合度大小为杂交子代（0.6569）、赤点石斑鱼（0.56035）、蓝身大斑石斑鱼（0.3479）,3个群体多态信息含量介于0.3042-0.5898,最高的是杂交子代,表明杂交子代具有较高的遗传多样性。聚类分析表明杂交子代与母本赤点石斑鱼的遗传相似性较高,遗传距离较近。
张银[2]（2020）在《拟穴青蟹早期发育转录组分析及Hox基因SpUbx/SpAntp/SpAbd-A功能初步研究》文中进行了进一步梳理拟穴青蟹早期发育过程属于典型的变态发育,其幼体变态过程包括从胚胎到溞状幼体、大眼幼体再到仔蟹的过程。变态过程中,其个体形态和生活习性均发生巨大改变,最显着的形态变化是其腹部形态的改变,包括形状变扁、腹肢退化、失去游泳功能、折叠于头胸甲下方等,这种变化与拟穴青蟹底栖生活适应性密切相关。青蟹早期幼体在变态发育过程中存活率极低,这严重制约了青蟹人工养殖发展的步伐,因此对拟穴青蟹早期发育阶段的研究显得尤为必要。个体在变态过程中的形态和生活习性均发生巨大改变,然而,其变态发育的分子机制尚不清楚。为阐明拟穴青蟹幼体变态发育的分子机制,本研究首先通过转录组学手段,对拟穴青蟹早期变态发育阶段的基因及通路进行分析,探究拟穴青蟹早期变态发育阶段的关键生物学变化;然后,通过转录组数据筛选与形态发育相关的基因-Hox基因,分析Hox基因家族基因在拟穴青蟹早期不同发育时期的表达规律,并借助基因组对Hox基因簇进行基因组定位;最后,对在拟穴青蟹早期变态发育过程中形态发育相关的关键差异表达Hox基因SpUbx、SpAntp和SpAbd-A进行功能解析及调控机制研究。主要研究结果如下:1、通过对拟穴青蟹早期发育胚胎期、溞状幼体I期、溞状幼体III期、溞状幼体V期、大眼幼体和仔蟹I期的转录组测序,构建了拟穴青蟹早期变态发育时期的基因表达库,这些基因较多的参与机体催化活性、细胞过程、代谢过程和结合等功能以及嘌呤代谢、溶酶体、内吞作用、吞噬体和RNA转运等代谢通路。在拟穴青蟹幼体中高表达的胰凝乳蛋白酶可能与幼体食性的转变相关,在胚胎期高表达的基因中有较多的核糖体蛋白,钙化表皮蛋白在仔蟹I期中高表达可能与仔蟹表皮硬化相关,视蛋白在溞状幼体V期中高表达说明溞状幼体V期可能是视觉形成关键期,除此之外,还发现一些与消化、免疫、肌肉生长和能量代谢相关的基因也在不同时期中高表达。差异表达基因在各个时期的表达规律揭示了拟穴青蟹早期个体在消化功能、视觉形成和外壳形成等方面的特征变化。2、通过对拟穴青蟹早期变态发育关键的四个时期（胚胎、溞状幼体、大眼幼体和仔蟹）的转录组的比较分析发现,在胚胎期高表达的基因主要富集在核糖体、RNA转运、剪切体等与蛋白的翻译有关的通路和功能模块中,说明胚胎期中转录翻译过程较强;在溞状幼体I期上调的基因显着性的富集在无机离子转运和代谢、电压门控钙通道复合物、电压门控钠通道复合物和溶质:钠同工酶活性等与离子交换和渗透压调节相关的通路和功能模块中,同时视觉发育相关的通路--光传导也被显着富集,说明拟穴青蟹胚胎期到溞状幼体I期变态发育的过程中发生的主要变化体现在渗透压调节、视觉发育和消化功能等方面。在溞状幼体到大眼幼体及大眼幼体到仔蟹I期的发育过程中,在大眼幼体上调的基因显着富集的通路ECM受体相互作用和血管平滑肌收缩主要与肌肉生成相关,这可能与大眼幼体运动功能的加强有关。此外,还有一些与消化代谢和视觉相关的通路被显着富集。而在仔蟹中上调表达的基因主要编码钙化表皮蛋白和表皮原蛋白等,仔蟹时期表皮钙化的加强也是对底栖生活的一种适应。3、重点分析了与形态发育密切相关的Hox基因在拟穴青蟹早期不同发育时期的表达特征。从转录组数据中共筛选到122条与Homeobox相关的基因,其中有51个在拟穴青蟹早期发育过程中差异表达,包括5个簇状Hox基因Dfd、ftz、Antp、Ubx和Abd-A和一些非簇状Hox基因aristaless、cut-like、empty spiracles、engrailed、even-skipped、prospero和six1-like等,并且表达模式主要分为四类:Dfd、ftz、aristaless、empty spiracles和engrailed在胚胎期高表达,随后表达开始下降,这类基因占大多数;Antp和six1-like在胚胎期高表达,溞状幼体I期和III期表达开始下降,到溞状幼体V期又上升,大眼幼体和仔蟹I期开始表达降低;Ubx和Abd-A基因在溞状幼体V期显着高表达,其它时期无太大浮动。这些表达模式可能说明Hox基因参与了拟穴青蟹胚胎时期和幼体的形态发育。研究发现,拟穴青蟹簇状Hox基因在基因组上的位置与其它节肢动物一样是共线性的。4、Hox基因Ubx、Antp和Abd-A基因在幼体变态过程中的表达水平发生显着改变,暗示其可能参与了变态的调控。通过基因克隆、荧光定量和原位杂交等技术对Ubx、Antp和Abd-A基因的功能进行了初步研究。结果表明,SpUbx、SpAntp和SpAbd-A的c DNA全长分别为1,401 bp、1,402 bp和1,282 bp,分别编码315、236和180个氨基酸。在这三个基因的蛋白结构中,无规卷曲均占到大多数,预测这三个基因编码的蛋白均无跨膜结构域和信号肽切割位点。SpUbx和SpAntp基因在雌蟹和雄蟹的神经节、肠道、鳃和肌肉中高表达,SpAbd-A在肠道中的表达显着高于其它组织。在早期发育过程中,SpUbx、SpAntp和SpAbd-A的表达模式比较相近,在溞状幼体III期和V期的表达均较高。此外,在溞状幼体III期到V期的腹部,SpUbx和SpAntp显着低表达,SpAbd-A高表达,原位杂交结果显示三者在溞状幼体中的表达位置也主要位于胸腹部,而拟穴青蟹溞状幼体III期到V期主要处于胸腹部发育的关键阶段,由此推测,SpUbx、SpAntp和SpAbdA可能参与拟穴青蟹早期个体胸腹部发育过程。SpUbx和SpAntp在m RNA水平和蛋白水平的表达具有一致性,通过染色质免疫共沉淀技术发现UBX蛋白能与SpAntp启动子共同沉淀下来,说明Ubx可能通过结合SpAntp启动子区域来调节SpAntp基因在拟穴青蟹中的表达。综上所述,本研究构建了拟穴青蟹早期变态发育阶段的基因表达库。对变态发育关键阶段的差异表达基因进行了剖析。对与形态发育相关的Hox基因家族基因在早期不同发育时期的表达特征进行了研究,结合基因组定位,发现了Hox基因簇的共线性关系。筛选到在拟穴青蟹早期变态发育时期差异表达的Hox基因SpUbx、SpAntp和SpAbd-A基因,通过对这三个基因的克隆和表达特性分析,推测这三个基因参与拟穴青蟹早期个体胸腹部的发育,通过染色质免疫共沉淀技术发现Ubx通过结合SpAntp启动子区域来调节SpAntp基因在拟穴青蟹中的表达。本研究初步探究了拟穴青蟹幼体变态发育的调控机理,深入揭示拟穴青蟹变态发育机制和节肢动物Hox基因系统进化提供理论依据,对于促进苗种繁育工作的开展亦具有重要的现实和理论意义。
陈琪[3]（2020）在《先天性小耳畸形致病性拷贝数变异分子机制探究及低发际线耳廓再造》文中进行了进一步梳理背景及目的:先天性小耳畸形主要表现为不同程度的外耳形态异常或缺失,部分可伴有中耳发育异常及听力损失,严重影响患者的身心健康。我国属于先天性小耳畸形高发地区,目前发病率约3.06/万,且处于上升趋势。先天性小耳畸形致病机制的探究及治疗方法的改进一直是颅面先天畸形疾病研究的重要内容。遗传因素被认为是先天性小耳畸形最重要的致病因素,但单纯型小耳畸形的致病基因及相关机制目前仍未明确。近年,本团队通过对三个单纯型双侧小耳畸形大家系进行基因组连锁分析、靶向捕获结合二代测序技术定位了一段位于chr4:8701900-8702500（hg19）的共有致病拷贝数变异（Copy number variable,CNV）,并通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构造了该目标片段敲入（Duplication,DUP）及敲除（Knock out,KO）两种不同基因型小鼠,纯合DUP型小鼠成功复制了家系患者双侧小耳畸形表型而KO型小鼠则为一种双侧大耳畸形表型,经检测纯合DUP型小鼠外耳中Hmx1基因表达水平较野生型（Wild type,WT）高,而纯合KO型小鼠的则相对较低。本课题第一、二部分就该动物模型生物学特性及该CNV先天性耳畸形致病机制进行了深入分析和探讨。此外,针对低发际线小耳患者这种临床难治病人,我们在第三部分对本团队应用的一种全头皮单瓣扩张法耳再造术方法进行了介绍及回顾分析。方法:1.采用回交、测交等杂交方式,建立DUP、KO及WT三系遗传背景一致的小鼠家系。通过标准拍摄、磁共振扫描、遗传平衡分析等比较各基因型表型特征及遗传方式。结合该基因座片段基因组信息分析,明确其可能致病机制。2.对各基因型小鼠于不同时间点,收集外耳组织进行转录组测序,利用基因表达差异分析、富集分析及蛋白互作网络分析等筛选致病候选基因及相关信号通路。3.回顾本研究团队2015年1月至2019年4月收治并采用全头皮单瓣扩张法耳再造术结合强脉冲光疗法（Intense pulsed light treatment,IPLT）的极低发际线小耳患者的病例资料,详述操作步骤,归纳分析其疗效、并发症处理等,总结经验。结果:1.构建了第一个基于人类单纯型先天性小耳畸形家系研究定位的致病CNV小鼠家系,确认了 DUP基因型小鼠不完全显性遗传的“三角形”外耳畸形表型,KO基因型隐性遗传的“圆盘状”大耳畸形表型。2.该致病片段是Hmx1下游一个进化保守区域（Evolutionarily conserved region,ECR）的顺式作用增强子。此ECR是多物种中Hmx1基因正常表达的必要条件,能特异性地调控Hmx1在神经棘衍生的颅面间质（Craniofacial mesenchyme,CM）中的表达水平,且对Hmx1表达的调控具有基因剂量效应。3.转录组测序中,我们筛选出了 8个包括Hmx1基因在内表达水平与致病CNV数量相关的候选基因,及ECM受体相互作用通路、Wnt信号通路、MAPK信号通路、Notch信号通路及心脏肌肉收缩通路等相关信号通路。4.该项研究共纳入41例就诊于本团队的极低发际线小耳患者。随访时间为10个月到4年,治疗满意率为90.2%,9.8%部分满意;无不满意案例。5.相对于术前先进行IPLT的患者,扩张期间开始IPLT的患者总脱毛次数更少,且能获得更持久满意的脱毛效果,P<0.001。结论:本研究的目标片段是Hmx1基因的一个组织特异性ECR增强子,能特异性调控多物种Hmx1在神经棘衍生的CM中的表达,其CNV可致多物种发生单纯型先天性耳畸形。Hmx1、Tcap、Sln、Mb、Gapdh、Nell2、Rp121-ps10、Gm42047 是致病候选基因,MAPK信号通路、Wnt信号通路、ECM受体相互作用通路、心肌收缩通路等信号通路是相关信号通路。Nsun7及Nr5a2可能是Hmx1不同表达水平下的辅因子。本研究中筛选出的候选基因及信号通路涉及面广且互作关系复杂,进一步明确并验证其在外耳发育过程中的作用将对先天性耳畸形的致病机制的认识具有重要意义。另外,对于极低发际线小耳患者,全头皮单瓣扩张法耳再造术结合IPLT是一种安全有效的治疗方法。扩张期间的IPLT相对于术前的IPLT,脱毛效果更高效持久。
郭瑞[4]（2020）在《转录因子Lhx9和Lhx4在斑马鱼胚胎发生中的表达模式及其在视网膜发育中的功能研究》文中研究表明许多人类遗传性疾病都与LIM-同源异形框（LIM homeobox,LHX）基因有关。目前关于Lhx9和Lhx4在脊椎动物胚胎发育过程中的功能研究尚不完整,主要源于对其在胚胎发育中的时空表达模式不够清楚。此外,研究发现80%以上Lhx基因与视网膜的发育有关。然而,目前尚无研究报道Lhx9和Lhx4在斑马鱼视网膜中的表达模式和调控功能。本课题首先通过利用整胚原位杂交和切片原位杂交检测lhx9和lhx4在斑马鱼胚胎及视网膜发育中的表达模式。结果发现在24hpf到5dpf的斑马鱼胚胎中,lhx9和lhx4的表达随胚胎发育均呈动态变化。lhx9不但在大脑中表达,而且在视网膜内核层的内侧,心脏和胸鳍的发育过程中有较长时期的表达;lhx4不但在斑马鱼胚胎的大脑和脊髓中表达,而且在听囊发育的早期瞬时表达,在视网膜发育的后期lhx4持续在内核层的外侧和外核层表达。本课题通过morpholino（MO）技术成功构建了敲减lhx9或lhx4的斑马鱼模型,结果发现MO敲减lhx9不影响斑马鱼视网膜内不同类型细胞的分化发育以及视网膜结构和功能的发育。MO敲减lhx4导致斑马鱼胚胎出现类似人类遗传性垂体疾病（如联合性垂体激素缺乏症）的表型,无法用于研究Lhx4在视网膜发育过程中的功能。利用vivo-MO成功构建了敲减视网膜内lhx4的斑马鱼模型。结果发现敲减视网膜内lhx4会抑制内核层中Parvalbumin+无长突细胞和外核层中Rhodopsin+视杆感光细胞的分化形成,这些减少的视网膜细胞可能是通过高表达vsx2转化为过量的ON视锥双极细胞,从而损伤斑马鱼的视觉功能。本课题不仅首次全面展示了lhx9和lhx4在斑马鱼胚胎和视网膜发育中的表达模式,有助于进一步研究这两个转录因子在脊椎动物胚胎和视网膜发育中的重要功能;还首次利用MO敲减技术研究了lhx9和lhx4对斑马鱼视网膜发育的调控作用,为研究脊椎动物视网膜的发育调控机制提供了实验基础。因此,本课题有利于全面理解转录因子Lhx9和Lhx4在脊椎动物胚胎和视网膜发育中的表达模式和调控功能。
曹美玲[5]（2020）在《TBX1基因下游心脏发育相关差异表达基因筛选及功能研究》文中研究说明研究背景和目的:先天性心脏病（congenital heart disease,CHD）是新生儿常见的重大出生缺陷,是导致围产儿死亡和儿童死亡的主要原因。研究证实,CHD主要由于胚胎时期遗传与环境因素共同作用引起,其中遗传因素具有重要作用。心脏发育相关基因及信号通路与CHD关系的机制仍不明确。心脏发育过程为多基因共同调控的极复杂的生物学过程。研究表明转录因子可通过直接或间接调控靶基因的表达,而影响心肌细胞的迁移、增殖及分化,从而参与心脏发育及CHD的发生。TBX1基因是T-box基因家族成员之一,在胚胎发育早期表达,与心脏发育密切相关,是CHD的致病基因之一。目前,对TBX1基因的研究多集中于TBX1基因编码区的核苷酸变异或基因缺失和重复,而关于TBX1基因表达异常调控的研究较少。本课题组前期研究发现TBX1基因T350M多态性与法洛氏四联症（TOF）具有明显的相关性,可能是TOF的遗传易感基因。课题组首次发现CHD患者心肌组织中ACTC1基因表达水平降低,该异常可诱导胚胎发育时期心肌细胞过度凋亡,从而导致人类CHD的发生。课题组进一步研究发现ACTC1上游调控序列中存在HOXA3转录因子结合位点,转录因子HOXA3与TBX1相互作用参与心脏发育,与CHD的发生密切相关。胚胎早期发育过程中,凋亡相关的心肌细胞缺失是导致CHD发生的关键因素之一,与心肌细胞凋亡相关的基因调控异常可能是影响CHD发生的原因之一,其确切机制亟待研究。TBX3基因参与胚胎早期多器官发育,研究表明,TBX3基因可抑制细胞周期调节蛋白P21表达,从而发挥调控细胞周期、抑制细胞凋亡、促进增殖的作用。P21基因为周期蛋白依赖性蛋白激酶（CDK）家族的抑制剂,在调节细胞周期和细胞增殖过程中发挥关键作用,而其在心肌细胞中的作用尚未见报道。因此,有必要深入探讨TBX1基因下游心脏发育相关的差异表达基因,以及TBX3基因是否作为TBX1基因下游信号分子通过P21基因调控心肌细胞生物学功能。进一步阐明TBX1基因参与心脏发育信号通路的分子机制,有助于探索新的先天性心脏病产前诊断靶点,并为先天性心脏病靶向治疗提供新的理论依据。研究方法:第一部分:采用TBX1 siRNA转染大鼠胚胎心肌细胞H9C2细胞,利用高通量基因芯片技术,筛选TBX1基因下游心脏发育相关的差异表达基因,进行GO富集分析和KEGG数据库Pathway富集分析;Real-time PCR和ELISA方法验证TBX3基因在CHD心肌组织中的mRNA和蛋白表达情况。第二部分:建立TBX3基因沉默和过表达H9C2细胞,Real-time PCR和Western blot检测TBX3基因mRNA和蛋白表达;采用CCK-8和Ki67免疫荧光染色检测细胞活性;流式细胞术检测细胞周期分布,Western blot检测周期蛋白CyclinA,CyclinB1,CyclinD1表达;利用Hoechst33342染色和Annexin V/PI双重染色法检测细胞凋亡,Western blot检测凋亡相关蛋白cleaved PARP、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2表达;Jc-1法检测线粒体膜电位、试剂盒法检测线粒体ATPase活性和ROS含量;采用Real-time PCR和Western blot检测P21基因mRNA和蛋白表达,ChIP实验验证TBX3基因对P21的调控作用。最后,通过同时敲减TBX3基因和P21基因,检测P21基因对TBX3基因沉默诱导的P21基因表达和细胞增殖的影响。结果:第一部分:1.TBX1基因下游差异表达的基因995个,其中上调基因240个,下调基因755个。2.GO富集分析显示,上调差异表达基因富集度较高的生物学过程主要为:糖酵解过程、胆固醇合成、碳水化合物磷酸化、细胞迁移和脂质磷酸化等。与心脏相关的生物学过程包括:心脏瓣膜发育和心脏形态发生,相关的差异基因包括:Tgfb2、Sox9、Tab1。下调差异表达基因富集度较高的生物学过程主要为:细胞分化、染色体分离、有丝分裂细胞周期和对病毒的反应等。与心脏相关的生物学过程包括:心脏形态发生、胚胎心管形成、胚胎心导管左/右模式形成、心率调节以及心脏发育等,相关的差异基因包括:TBX3、Cited2、Tead2、Pln、Casq2、Dmd、Ift122、Kcne2、Dchs1、Nrp2、Gli2。3.KEGG数据库Pathway富集分析表明,差异基因中具有统计学意义的信号通路主要有:细胞周期、胞质DNA传感通路、减数分裂等。4.在CHD心肌组织标本中TBX3基因mRNA和蛋白表达水平着降低。第二部分:1.敲减TBX3基因明显抑制H9C2细胞增殖活性和Ki67蛋白表达;过表达TBX3基因作用相反。2.敲减TBX3基因显着增加G1期H9C2细胞数,减少S期H9C2细胞数,抑制Cyclin D1,Cyclin A和Cyclin B1表达;过表达TBX3基因可以增强细胞周期蛋白表达,对细胞周期分布无显着影响。3、TBX3基因沉默H9C2细胞表现出典型的凋亡形态特征,包括核碎裂和染色质浓缩,凋亡细胞百分比明显增加,cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、cleaved PARP、Bax表达上调、Bcl-2表达下调;过表达TBX3基因对细胞的凋亡状态无显着影响。4.敲减TBX3基因可显着下调H9C2细胞线粒膜电位和ATPase活性,增加ROS含量,并且增加胞质中细胞色素C含量,降低线粒体中细胞色素C含量。5.TBX3基因沉默使H9C2细胞中P21基因mRNA和蛋白表达水平显着升高,且TBX3蛋白与P21基因DNA存在靶向结合。6.同时敲减TBX3基因和P21基因使H9C2细胞中P21蛋白表达显着降低,并可明显恢复TBX3基因沉默诱导的H9C2细胞增殖能力的下降。结论:1.TBX1基因下游上调差异基因可能与生物合成和磷酸化反应等有关,下调差异表达基因可能与细胞分化、细胞周期和对某些生化物质的反应等有关;与心脏相关的生物学过程包括:心脏形态发生、胚胎心管左右模式形成、心脏左/右不对称发育、心率调节和心脏发育等。2.TBX3基因是TBX1基因下游心脏发育相关的基因。3.TBX3基因表达下调与CHD的发生相关。4.TBX3基因沉默抑制H9C2细胞增殖,使细胞周期阻滞于G1期。5.TBX3基因沉默诱导H9C2细胞线粒体功能障碍,促进细胞凋亡。6.P21基因是TBX3基因的下游靶基因。7.TBX3基因表达下调通过靶向调控P21基因的表达而抑制H9C2细胞增殖。
李惠莲[6]（2020）在《龟足幼虫变态的形态学观察及相关基因分析》文中指出龟足（Capitulum mitella Linnaeus）属于甲壳动物亚门,蔓足下纲,围胸目,指茗荷科,是我国重要的潮间带经济物种,因其具有独特的生态地位,也是进化生物学及生态学研究的重要物种。本文对龟足变态发育过程中幼虫形态结构的变化进行形态学描述,并结合龟足全基因组和转录组数据,利用生物信息学的方法,鉴定得到1个HMGR基因,4个CaMs基因,7个CthDs基因。对其中的CmHMGR、CmCaM1、CmCthD1这三个基因序列做生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR和整体原位杂交技术,对CmHMGR、CmCaM1和CmCthD1基因在不同发育时期龟足幼虫中的表达水平和表达器官也做了分析,为进一步了解龟足的变态发育过程提供科学依据。主要研究结果如下:1、龟足幼虫变态发育的组织切片观察龟足幼虫的变态发育经历了两个过程,分别是从无节幼虫阶段到金星幼虫阶段、以及从金星幼虫阶段到稚体阶段。本文通过组织切片方法观察龟足幼虫内部形态在变态过程中的演变情况,对复眼、单眼、消化道、胸肢、触角、白垩腺、油细胞等器官的变化进行形态学描述。2、HMGR、CaM、CthD基因家族鉴定与分析CmHMGR基因编码的蛋白序列由889个氨基酸组成,其分子质量为9.7k Da,等电点为5.69,含有一个HMG-Co A＿red和Sterol-sensing保守结构域,两个HMG-Co A结合位点,两个NADP（H）结合位点。4个CmCaMs基因编码的蛋白序列由137-224个氨基酸组成,分子质量大小约1.5-2.4k Da,等电点为4.09-5.34,且均具有2个EF-hand7结合残基和4个Ca2+结合位点,NJ进化树表明,4个CmCaMs聚为一枝,亲缘关系极近。7个CmCthDs基因编码的蛋白序列由332-397个氨基酸组成,分子质量大小约3.5-4.4k Da,等电点为4.35-9.25,均含有Asp结构域和2个天冬氨酸蛋白酶活性位点,CmCthD3含有1个A1＿propeptide结构域,从NJ树聚类分析可以看到7个CmCthDs聚为一枝,在进化程度上较为保守。3、CmHMGR、CmCaM1和CmCthD1基因的生物信息学分析CmHMGR基因有2667bp,分子式为C4261H6853N1185O1273S51,为疏水性蛋白,有68个磷酸化的位点,N端无疏水结构的信号肽,为跨膜蛋白,具有的4个跨膜区,α-螺旋和无规则卷曲是CmHMGR二级结构中最大的结构元件,从进化树分析图中发现,龟足首先与纹藤壶聚类,亲缘关系最近,再与昆虫聚为一枝,而不与同属甲壳动物的美洲海螯虾和三疣梭子蟹聚为一枝,表明CmHMGR与昆虫亲缘关系比较近。CmCaM1基因为732bp,CmCaM1分子式为C714H1129N187O255S11,为亲水性蛋白,有13个磷酸化位点,无跨膜区和信号肽,α-螺旋CmCaM1蛋白二级结构中最大的结构元件,从进化树结果来看,CmCaM1与昆虫及甲壳动物聚为一枝,表明CmCaM1在泛甲壳动物中进化地位较为保守,CaM进化上的保守性也能说明CaM在功能上有着非同一般的重要作用。CmCthD1大小为1191bp,蛋白质分子式为C1904H2941N515O580S15,为亲水性蛋白,存在一个N糖基化位点（Asp193）,在1-18个氨基酸之间含有信号肽位点,无跨膜区,延伸链和无规则卷曲是CmCthD1二级结构中最大的结构元件,从进化树结果来看,CmCthD1先与甲壳动物、昆虫和软体动物等无脊椎动物聚类,但自成一枝,表明该基因在进化上是既保守而又独特的存在。4、CmHMGR、CmCaM1和CmCthD1基因的时空表达分析荧光定量PCR实验结果显示,在龟足不同发育时期CmHMGR、CmCaM1、CmCthD1基因的表达量均存在差异:在Ⅵ期无节幼虫时期CmHMGR基因的表达水平达到最高值,促进无节幼虫变态为金星幼虫,在完成变态的3日龄金星幼虫、变态初期的金星幼虫、变态中期的金星幼虫、稚体时期的表达量均较低,促使金星幼虫完成到稚体的变态。金星幼虫CmCaM1基因的表达水平高于无节幼虫和稚体,表明CmCaM1基因对金星幼虫变态可能具有重要的作用。Ⅱ期无节幼虫CmCthD1基因表达水平较高,从Ⅵ期无节幼虫到变态中期CmCthD1基因的表达水平均极低,稚体的CmCthD1基因表达水平为最高,表明CmCthD1基因对龟足稚体的生长发育起重要作用。整体原位杂交实验结果表明,CmHMGR基因在Ⅵ期无节幼虫头部、附肢等各处均能检测阳性信号,在胃、肠表达强烈,从金星幼虫到稚体时期,CmHMG R基因在头部的触角、胸腹部的闭壳肌附近及胸神经节有特异性表达,推测CmHMGR基因可能参与了龟足幼虫变态、附着相关器官的发育调控,并且闭壳肌附近的强烈阳性信号指示大颚腺（MO）极有可能位于虫体的腹中部靠近闭壳肌的区域。CmCaM1基因在Ⅵ期无节幼虫的头部、胸腹部、附肢各处均能检测到十分明显的阳性信号,从金星幼虫到稚体时期的附肢触角、白垩腺及复眼、单眼有表达,推测CmCaM1可能参与了虫体胸肢的运动、白垩胶的分泌、单复眼迁移运动等。CmCthD1基因在Ⅵ期无节幼虫的头部、胸腹部、附肢各处均能被检测到十分明显的阳性信号,从金星幼虫到稚体时期,仅在虫体触角、腹部能检测到明显的阳性信号,说明CmCthD1对于龟足幼虫的生长发育有重要影响。
庄思斯[7]（2020）在《基于斑马鱼模型的miR-375过表达致心脏发育异常的作用机制研究》文中进行了进一步梳理先天性心脏病（Congenital heart disease,CHD）是全球婴儿出生缺陷中最常见的疾病,其发生率高,严重危害人类健康,给家庭和社会带来沉重的医疗和经济负担。CHD的发生机制仍尚未明确,可能是由复杂的遗传因素和环境因素共同作用的结果,随着新的基因测序技术,尤其是反向遗传技术的进步,一些新的基因被发现和CHD相关,因此展开了一系列的研究。Micro RNAs（mi RNA）作为一种小的非编码RNA,通过与靶基因的结合来调控靶基因的表达,在生物体生长发育和疾病发生等过程中发挥重要作用,尤其对心脏的正常发育具有重要意义。在先前对自然流产的室间隔缺损胚胎组织样本的研究中,课题组采用Microarray技术筛选出一系列差异性高表达的基因序列,对其中的mi R-375进行进一步深入的研究的基础上,前期研究在细胞学水平证实了mi R-375在心肌细胞分化中起着关键作用。本研究采用反向遗传学技术进一步通过斑马鱼模型来深入探讨mi R-375在斑马鱼心脏发育中的重要作用及其作用机制。通过在斑马鱼胚胎中显微注射不同浓度的mi R-375 mimic构建mi R-375过表达的动物模型,在体观察斑马鱼的心脏发育过程。我们发现mi R-375的过度表达对斑马鱼胚胎的心脏发育造成一系列的损伤,包括心率减慢、心包水肿和循环异常。同时,除了心脏的表型,斑马鱼其他器官也不同程度受到影响,包括脑、眼睛、消化系统、骨骼和尾鳍等,提示mi R-375过表达对胚胎的影响除了心脏还涉及其他多系统。通过实时定量PCR技术,我们证实了过表达mi R-375会显着抑制心脏发育相关基因的表达。进一步通过双荧光素酶报告基因研究证实了notch2是mi R-375的靶基因,同时过表达mi R-375之后NOTCH信号通路相关下游基因的表达也受到明显抑制,胚胎整体原位杂交技术显示心脏发育关键基因notch2的表达明显下调,表达范围变小。证实过表达mi R-375影响斑马鱼心脏发育是通过直接作用于靶基因notch2进而影响NOTCH信号通路实现的。综上所述,斑马鱼可以作为一种优质的动物模型运用于心脏发育的研究中,mi R-375可以通过作用于靶基因notch2影响NOTCH信号通路从而影响斑马鱼心脏的发育。
孙永祺[8]（2019）在《丙硫菌唑对斑马鱼胚胎发育影响和心血管毒性》文中提出丙硫菌唑由拜耳公司研发,2019年丙硫菌唑的产品在我国获得登记。目前对丙硫菌唑的研究主要集中在药效和残留方面,由于丙硫菌唑广泛使用于水稻田中,因此评价其对水生生物的影响非常重要。斑马鱼在毒理学研究中被广泛使用,被OECD列为标准实验生物。本文系统探讨了丙硫菌唑对斑马鱼的毒性影响:1.丙硫菌唑对斑马鱼的急性毒性:丙硫菌唑对胚胎、仔鱼和成鱼LC50（96h）分别为1.705、2.170和3.600 mg/L,对斑马鱼是中等毒性,敏感性为胚胎>仔鱼>成鱼。2.丙硫菌唑对斑马鱼胚胎发育的影响:斑马鱼胚胎暴露于0.22、0.43、0.85mg/L丙硫菌唑中,出现孵化率下降,畸形率上升,畸形包括卵黄囊肿、心包水肿、尾部弯曲和脊索弯曲,同时还出现了体长缩短、眼部面积减少和极为显着的心包面积增大的现象,因此后续实验中着重探讨对斑马鱼的心血管毒性。3.丙硫菌唑对斑马鱼胚胎心血管毒性:暴露于丙硫菌唑引起斑马鱼心脏功能障碍,导致心率下降,血红细胞含量与暴露浓度呈现明显的负相关效应。调控ATPase和Ca2+运输的关键基因atp2a1l、atp2a2a和心脏形态发生和基因表达的关键因子tbx5的表达量显着下降,推测丙硫菌唑抑制了斑马鱼心肌收缩和钙信号通路。丙硫菌唑还可以引起严重的心血管结构形态变化,包括心包水肿、SV-BA（静脉窦-动脉球）距离增加、心脏畸形,并引起心区部位的细胞凋亡。SV-BA间距的定量分析证实了心脏结构的严重畸形。心室肌球蛋白重链基因（vmhc）和心房肌球蛋白重链基因（amhc）在暴露组中下降,说明丙硫菌唑可以影响心脏肌球蛋白的表达;调节心肌分化、心脏环化的gata4表达量下调;肌球蛋白轻链基因myl7、触发心肌细胞初始分化的关键因素bmp2b、nkx2.5等多个基因的表达量降低,表明丙硫菌唑可能会影响心肌细胞的发育;hand2调控心脏和咽弓分化,表达量在高浓度组中出现上调,推测是因为丙硫菌唑暴露引起了它的过表达,以应对损伤;同时,和血管内皮发育相关的fli1基因表达量显着下降,说明丙硫菌唑暴露可以抑制斑马鱼的血管发育过程。
关震[9]（2019）在《Pdgfrα在小鼠心脏发育中的功能分析》文中研究指明血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor,PDGF）是多种类型细胞的分裂刺激素,在胚胎发育过程中,与多种器官间充质细胞、平滑肌细胞、血管周细胞以及肾脏的系膜细胞的发育密切相关,起到重要的调控作用。PDGF有四种亚型,包括PDGFA、PDGFB、PDGFC和PDGFD。具备生物活性的PDGF是由二条PDGF蛋白肽链组成的二聚体。一共可以形成五种具有活性PDGF配体,其中四种为同源二聚体,包括PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-CC和PDGF-DD;一种为异源二聚体PDGF-AB。PDGF通过激活二种酪氨酸激酶受体发挥作用,分别是血小板源性生长因子受体α和β（platelet-derived growth factor receptors,PDGFRαand PDGFRβ）。当PDGF配体结合到PDGFR时,可促使PDFGR二聚体化,从而激发受体激酶的活性。因此,PDGF信号可以通过三种类型的PDGFR二聚体传导,包括同源二聚体PDGFRαα和PDGFRββ和异源二聚体PDGFRαβ。有关PDGF信号通路在心脏发育中的功能及其调控机制所知甚少。本研究利用转基因和基因敲除小鼠模型,对Pdgfrα在小鼠心脏发育中的功能及调控机制进行了深入的研究,为进一步理解PDGF信号通路在心脏中的作用提供了重要的实验数据。首先,系统检测了Pdgfrα在各时期小鼠胚胎心脏中的表达。收集E10.5-E16.5各时期野生型小鼠胚胎,利用免疫荧光检测了Pdgfrα蛋白在各时期小鼠胚胎心脏中的表达模式。在E10.5-E11.5时,Pdgfrα在小鼠胚胎心脏的心室细胞中显着表达,在心房细胞中几乎不表达。在E12.5时,Pdgfrα的表达与E10.5-E11.5一致,只是其在心室细胞中的表达强度下调。到了E13.5时,Pdgfrα在小鼠胚胎心脏的心室细胞中也不再表达。到了E14.5-E16.5小鼠胚胎胚中,Pdgfrα在心脏的心室细胞中又开始出现表达,只是其整体表达强度较E10.5-12.5时期的低,同时其仍不在心房中表达。进一步利用Nkx2.5（工作心肌细胞的特异标记蛋白）抗体,检测其与Pdgfrα在心室中共表达情况,发现在E14.5-E16.5时期的胚胎心脏中,表达Pdgfrα的心室细胞不属于工作心肌细胞,而是心室中其他类型细胞（如成纤维细胞等）。此外,利用免疫荧光检测了Pdgfrα在E12.5-E16.5小鼠胚胎心脏窦房结中的表达模式。结果发现,从E12.5开始,Pdgfrα在窦房结中就有强烈的表达。随着小鼠胚胎不断发育,Pdgfrα在窦房结的表达量不断增强,一直到E15.5。但在E16.5小鼠胚胎心脏窦房结中,Pdgfrα的表达反而显着下调。Pdgfrα在早期（E10.5-E12.5）胚胎几乎所有的心室细胞（前体细胞）中表达,随后其表达转移到非工作心肌细胞中（主要为心肌间成纤维细胞等）。这预示着,Pdgfrα基因可能在调控心脏细胞的发育分化过程中发挥重要的作用。而且,可能与窦房结的形态发育有关。已有的报道表明,在PdgfrαEgfp/Egfp小鼠中,全敲除Pdgfrα可导致包括窦房结在内的静脉窦心肌细胞发育不全,并伴随Nkx2.5表达的上调。由于全敲除小鼠在E8.5后开始死亡,很难对其中的发育机制开展深入的研究。在本研究中,为解决早期胚胎死亡问题,我们利用Shox2-Cre和Pdgfrαflox/flox位点制备Pdgfrα在窦房结特异性敲除的小鼠模型,进一步开展研究。但我们惊奇的发现,与同窝对照小鼠比较,在Pdgfrα敲除小鼠中,未见窦房结的形态发育及心率和心电图异常。本研究又回头对E13.5PdgfrαEgfp/Egfp小鼠的窦房结进行了深入的检查,发现截止E13.5时,突变小鼠的窦房结形态也同窝野生型小鼠比较也未见任何异常,免疫荧光检测显示,Nkx2.5的表达水平也没有改变。我们认为,在小鼠窦房结的早期形态发生过程中,Pdgfrα不是必须的。我们的研究结果修正了前人有关对窦房结发育过程中Pdgfrα所起的作用的认识。在上一章的研究中,我们发现了PdgfrαEgfp/Egfp小鼠的心室壁的内层心肌发育异常,表现出人类心肌致密化不全的表型。由于PdgfrαEgfp/Egfp小鼠是全身性敲除了Pdgfrα,头部等器官发育异常,大部分胚胎约在E8.5死亡。虽然孕鼠在注射异丙肾上腺素后,可少量获得发育到E13.5的胚胎,但很难有效的进行Pdgfrα的敲除研究。因此我们进一步利用心肌细胞特异性的c Tn T-Cre小鼠与Pdgfrα条件性敲除小鼠(Pdgfrαflox/flox)交配,构建的c Tn T-Cre;Pdgfrαflox/flox小鼠可存活至出生左右。收获E13.5的c Tn T-Cre;Pdgfrαflox/flox胚胎进行细胞增殖、凋亡和下游分子机制等研究。我们首先精确分析了在野生型不同胚胎期小鼠心肌细胞的增殖情况,发现从E13.5开始,随着胚胎的发育,工作心肌细胞的增殖率呈现逐渐降低的趋势。其次我们对E13.5的c Tn T-Cre;Pdgfrαflox/flox小鼠心肌进行了细胞增殖测定,发现在心肌中Pdgfrα表达缺失明显导致了该时期心肌细胞增殖速率下调。随后我们还进行了细胞凋亡检测的发现,心肌中Pdgfrα表达缺失并不会导致细胞凋亡异常。我们进一步通过RNA-Seq对E13.5的c Tn T-Cre;Pdgfrαflox/flox和同窝对照的野生型小鼠的心室心肌进行了转录组差异基因分析,筛选出133个在敲除小鼠中呈现表达量明显上调的基因（log2Flodchange>2,p.value<0.05）和52个在敲除小鼠中呈现表达量明显下调的基因（log2Flodchange<-2,p.value<0.05）。进一步对这些基因进行了GO功能富集分析。发现上调和下调基因都在心肌组织发育,调节心脏生长等功能注释中大量富集。在这些差异基因中,Nkx2.5的表达随着Pdgfrα的敲除呈现明显的上调。利用免疫荧光,在E13.5的c Tn T-Cre;Pdgfrαflox/flox心肌中验证了这一结果,同时也通过荧光定量PCR验证了部分转录组筛选出来的差异基因在c Tn T-Cre;Pdgfrαflox/flox中的表达水平。综上所述,我们发现了在心肌中敲除Pdgfrα会导致细胞的增殖明显下调,并且导致心肌分化的关键基因Nkx2.5表达量明显上调,因此PDGF信号通路在心室心肌分化中有可能是通过Nkx2.5来发挥调控心肌增殖与发育分化。基因的缺失和过表达是遗传学小鼠研究中常见的研究方法。在第三章节的实验结果之上,我们进一步利用PDGFRα信号通路的条件性激活PdgfrαJ/+和PdgfrαK/+小鼠分别与c Tn T-Cre小鼠交配,在心脏中特异性激活Pdgfrα信号通路,并且进行表型分析和分子机制探究。其中PdgfrαJ/+小鼠是通过Pdgfrα的激酶区域位点的突变,实现PDGFRα信号通路的持续激活;PdgfrαK/+小鼠是通过突变Pdgfrα的活性抑制位点,实现PDGFRα信号通路的持续激活;K位点突变的活性增加量是J位点5倍。实验结果显示c Tn T-Cre;PdgfrαK/+和c Tn T-Cre;PdgfrαJ/+小鼠均能正常出生,而且成年。对这2种PDGFRα信号通路激活小鼠在成年和出生时的心电图检测发现,只有c Tn T-Cre;PdgfrαK/+小鼠的心电图呈现电轴右转,ST段下移的异常特征,而c Tn T-Cre;PdgfrαJ/+小鼠只呈现细微的异常。对P0的c Tn T-Cre;PdgfrαK/+和c Tn T-Cre;PdgfrαJ/+小鼠心脏进行了表型分析,结果显示c Tn T-Cre;Pdgfrα+/K小鼠的心脏呈现心室肥大的表型,但是c Tn T-Cre;PdgfrαJ/+小鼠与同窝野生型比较未见异常。其次,通过心脏切片的苯胺蓝染色,发现与同窝野生型小鼠相比,c Tn T-Cre;PdgfrαK/+小鼠胶原纤维含量在心室的内层心肌呈现明显增多,而c Tn T-Cre;PdgfrαK/+小鼠未见异常。进一步通过天狼猩红染色,发现c Tn T-Cre;PdgfrαK/+小鼠中III型胶原蛋白的比例大幅度提高,同时我们通过免疫荧光染色鉴定出c Tn T-Cre;PdgfrαK/+小鼠中Collagen蛋白表达同野生型相比明显提高,这些结果相互验证了心脏中PDGFRα信号通路的激活导致了心肌的纤维化程度提高。为力图解析发生这一表型的机制,检测了c Tn T-Cre;PdgfrαK/+小鼠心脏的增殖和凋亡情况。发现同野生型小鼠相比,c Tn T-Cre;PdgfrαK/+小鼠心脏的工作心肌细胞增殖速率增强,但凋亡未见变化。因此我们证明了PDGFRα信号通路的持续激活导致了小鼠心肌细胞增殖上调,进而导致了心肌纤维化细胞增多。进一步通过RNA-Seq对E13.5的c Tn T-Cre;PdgfrαK/+小鼠和对照小鼠的心肌组织进行差异表达基因分析,筛选出132个在c Tn T-Cre;PdgfrαK/+小鼠中呈现表达量明显上调的基因（log2Flodchange>2,p.value<0.05）和35个在c Tn T-Cre;PdgfrαK/+小鼠中呈现表达量明显下调的基因（log2Flodchange<-2,p.value<0.05）。对这些基因进行了GO功能富集分析,发现上调基因都大量富集在纤维化相关的功能注释中,而下调的基因的功能注释没有很显着的富集结果,但是下调基因集中我们发现了抑制心肌细胞增殖功能相关的基因,如Cdkn2a和Meis1的表达量随着PDGFRα信号通路的激活而下调,进一步证明了PDGFRα信号的激活将导致心脏细胞的增殖。而后,我们通过荧光定量PCR对与胶原合成表达以及细胞增殖相关基因进行了表达验证,证明了转录组数据的有效性。因此,在此章节的内容中,我们发现了在心肌中大幅度激活PDGFRα信号通路会导致心肌细胞的增殖速率上调,进而导致了心肌的纤维化程度提高,高强度的PDGFRα信号与激发心脏纤维化的发生和进展密切相关。
万世明[10]（2019）在《团头鲂肌间刺发育相关基因的发掘与功能研究》文中研究说明鱼类的肌间刺（intermuscular bones,IB）,又称肌间骨,是由肌肉中肌隔结缔组织连续同源骨化而来的膜骨,特异性的存在于肌隔中。世界上大部分淡水养殖鱼类,尤其是鲤科鱼类,都有一定数量的肌间刺。肌间刺的存在严重影响了鱼产品的食用与深加工,从而导致有肌间刺的鱼类不受消费者青睐。同时,含有肌间刺的鱼类不易出口,市场价格低,极大的影响了其经济价值。国内外对鱼类肌间刺的研究多处于形态发育方面,对于肌间刺发生发育分子机制的研究还非常缺乏。为进一步探究鱼类肌间刺的发生发育机制,本研究以我国特色经济养殖鱼类团头鲂（Megahbrama amblycephala Yih）,俗称武昌鱼,为研究对象。首先对团头鲂肌间刺及其相关组织的显微结构进行了观察,依托其组织差异以及潜在分化关系分别进行了m RNA与mi RNA的比较组学分析;基于肌间刺骨化出现的四个关键时期信息,进行了m RNA与非编码mi RNA的表达模式关联分析,发掘了大量与肌间刺发育相关的遗传信息。此外,考虑到幼年团头鲂（6月龄）与成年团头鲂（3龄）肌间刺形态特征的显着差异,我们构建了肌间刺组织的三代全长转录组数据库,补充了团头鲂基因组注释的同时,还以此为参考对两个阶段肌间刺组织内的lnc RNA与mi RNA的表达模式进行了比较分析,借此发掘了非编码RNA（non-coding RNA,nc RNA）在肌间刺生长过程中的调控机制。最后,基于前期实验结果,本研究通过CRISPR-Cas9基因编辑,表型观察,表达定量等方法对候选基因bmpr2a/2b进行了功能验证,揭示了其在骨骼发育中的作用。本论文从组织分化、阶段发育、生长发育三方面全面探究了团头鲂肌间刺组织中m RNA与nc RNA的表达模式与功能,构建了团头鲂肌间刺遗传数据库,为深入探讨鱼类肌间刺生长发育的分子机制奠定了重要的基础。主要研究内容如下:（1）组织切片观察结果揭示了团头鲂肌间刺、肌隔结缔组织以及肌肉组织的显微结构特征,表明肌间刺与肌隔结缔组织有着潜在的分化关系。基于其组织结构差异进行比较转录组分析,在肌间刺、肌隔结缔组织以及肌肉组织样本中分别发现了706,740及134个特异性表达unigenes。此外,在肌间刺与肌隔结缔组织、肌间刺与肌肉、肌隔结缔组织与肌肉三组比较中,分别发现了5,162、6,758和8,745个差异表达unigenes。GO及KEGG分析结果显示大量的unigenes富集到了TGF-β、Wnt、MAPK等骨骼发育相关的信号通路。同时,肌间刺与肌隔结缔组织的mi RNA比较组学分析揭示了218个团头鲂保守性mi RNA,隶属于97个mi RNA家族。其中188个mi RNAs在两个组织中都有表达,13和17个mi RNAs分别在肌间刺与结缔组织中特异性表达。此外,本研究共发现了44个mi RNAs在两个组织中差异表达。其中,24个mi RNAs在肌间刺中高表达,20个mi RNAs在结缔组织中高表达。差异表达mi RNAs的靶基因功能注释结果显示新陈代谢是富集mi RNAs靶基因最多的KEGG信号通路。同时,大量mi RNAs靶基因也被富集到了Wnt、TGF-β、MAPK及破骨细胞分化等骨骼发育相关的信号通路,表明了这些差异表达mi RNAs及其靶基因可能在肌间刺分化过程中发挥潜在调控作用。（2）基于团头鲂肌间刺发育的四个关键时期信息（S1,肌间刺尚未出现S2,少量短的肌间刺出现;S3,肌间刺大量出现并快速生长;S4,肌间刺完全出现且形态稳定）及参考转录组的构建,我们在四个时期分别进行了肌间刺m RNA表达谱与mi RNA转录组分析,结果共获得52,918条unigenes,其中24,094个unigenes被注释到了258个KEGG信号通路,包括MAPK、Wnt、破骨细胞分化及TGF-β等骨骼分化相关的信号通路。不同时期间的差异表达分析在S1-vs-S2,S2-vs-S3,S3-vs-S4,S1-vs-S3,S2-vs-S4和S1-vs-S4比较组中,分别发现了149,492,419,723,512和808个差异表达基因及132、120、174、194、176和241个差异表达mi RNAs。TGF-β通路基因在四个时期的表达模式分析结果显示26个TGF-β通路基因的表达量在肌间刺四个发育时期持续下降,14个TGF-β通路基因的表达量持续上升。mi RNA-m RNA互作分析发掘了大量骨骼发育相关的mi RNAs与m RNAs,如mi R-133/133a/133b,mi R-222,mi R-3960及CL712.Contig1,Unigene28219,Unigene2429,Unigene271等。mi RNAs和m RNAs定量表达与RNA-seq结果的一致性,证实了本研究所发掘的分子资源的可靠性。最后,本研究使用双荧光素酶报告基因对骨骼发育相关mi RNAs与m RNAs的反向调控关系进行了验证。结果表明mi R-133b-3p mimics和mi R-206-3p mimics显着降低了野生型质粒（GLO-tgfbr1a,GLO-runx2a）的荧光素酶活性,但并未降低空载质粒的荧光素酶活性。实验结果也显示mi R-206-3p的过表达未引起野生型质粒GLO-runx2b的表达抑制,表明了软件预测靶基因的不确定性及验证实验的必要性。（3）率先对团头鲂肌间刺组织进行了单分子实时测序（Single molecule real time sequencing,SMRT）分析。结果鉴定出了26,302个已知基因的新亚型（isoforms）和6,033个新基因亚型,发现了5,875个基因的10,208个可变剪接事件（Alternative splicing,AS）,其中大多数可变剪接事件为外显子跳跃（Exon skipping）。此外,分析预测了5,639个基因中的8541个poly（A）位点、59个家族的1,462个转录因子和31,186个完整的开放阅读框,鉴定出4,458个融合转录本和5,199个长链nc RNA（lnc RNA）。这些结果为完善团头鲂基因组草图注释,充分揭示肌间刺转录本特征,深入探究鱼类肌间刺发育机制提供了重要参考。（4）幼年团头鲂（6月龄）与成年团头鲂（3龄）肌间刺组织间nc RNA（non-coding RNA,nc RNA）的比较组学分析揭示了两个时期间353个（170个上调,183个下调）和126（68个上调,58个下调）个差异表达的lnc RNA与mi RNA。随后,我们对Lnc RNA co-expression/location m RNA以及差异表达lnc RNA的靶向差异表达mi RNA进行了预测。基于预测结果,我们对lnc RNA,mi RNA与靶基因的竞争性结合调控关系进行了关联性分析,发掘了肌间刺生长相关的潜在调控网络,如lnc RNA-017869竞争性结合mi R-142a-5p,lnc RNA-001094竞争性结合mi RNA-1331a/b-3p,进而调控下游基因的表达。定量表达分析结果也验证了nc RNA在肌间刺不同生长阶段中的表达模式。（5）针对肌间刺发育相关候选基因bmpr2a与bmpr2b,我们在模式斑马鱼中进行了CRSPR-Cas9基因敲除实验,并重点关注了其在肌间刺以及骨骼发育中的作用。系统发育和基因组结构分析结果表明斑马鱼bmpr2a和bmpr2b基因在进化过程中具有不同的序列特征。基因敲除结果显示bmpr2a和bmpr2b功能缺失未引起肌间刺表型的显着变化,但bmpr2b-/-个体显示出了不同程度和类型的矿化骨畸形。表达分析中BMP-Smad信号分子与骨骼发育相关基因表达水平的显着变化以及bmpr2b-/-个体的表型改变揭示了bmpr2b在斑马鱼骨骼发育中的重要作用。
二、脊椎动物心脏形态发育的转录调控（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、脊椎动物心脏形态发育的转录调控（论文提纲范文）
（1）石斑鱼杂交后代表型和遗传性状分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一章 综述 |
| 1.1 杂交育种 |
| 1.1.1 鱼类杂交育种的发展 |
| 1.1.2 鱼类远缘杂交的障碍 |
| 1.1.3 鱼类远缘杂交不相容 |
| 1.1.4 鱼类远缘杂交的遗传学 |
| 1.1.5 石斑鱼杂交育种的研究进展 |
| 1.2 鱼类中的骨骼畸形 |
| 1.2.1 骨骼畸形原因 |
| 1.2.2 研究骨骼畸形的方法 |
| 1.2.3 鱼类骨骼畸形机制研究 |
| 1.2.4 石斑鱼中的畸形 |
| 1.3 鱼类染色体研究进展 |
| 1.3.1 染色体核型分析 |
| 1.3.2 染色体显带技术 |
| 1.3.3 荧光原位杂交技术 |
| 1.3.4 石斑鱼类染色体研究 |
| 1.4 分子标记的发展 |
| 1.4.1 线粒体DNA研究 |
| 1.4.2 微卫星分子标记的应用 |
| 1.5 转录组学 |
| 1.5.1 测序技术发展 |
| 1.5.2 石斑鱼转录组研究进展 |
| 1.6 研究内容 |
| 1.7 研究目的和意义 |
| 第二章 云龙石斑鱼与云纹石斑鱼、珍珠龙胆石斑鱼的生长性状及对比分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 云纹石斑鱼与云龙石斑鱼家系建立 |
| 2.2.2 云纹石斑鱼和云龙石斑鱼苗种培育 |
| 2.2.3 云龙石斑鱼与云纹石斑鱼及云龙石斑鱼家系间生长对比 |
| 2.2.4 云龙石斑鱼与珍珠龙胆石斑鱼生长对比 |
| 2.2.5 生长性状和畸形率统计 |
| 2.2.6 数据处理 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 云龙石斑鱼父系半同胞家系受精率 |
| 2.3.2 云龙石斑鱼父系半同胞家系畸形率 |
| 2.3.3 云龙石斑鱼家系间及父系半同胞家系间生长对比 |
| 2.3.4 云龙石斑鱼与云纹石斑鱼生长对比 |
| 2.3.5 云龙石斑鱼与云纹石斑鱼的生长曲线 |
| 2.3.6 云龙石斑鱼与珍珠龙胆石斑鱼生长对比 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 云龙石斑鱼家系的生长差异 |
| 2.4.2 云龙石斑鱼与云纹石斑鱼生长对比 |
| 2.4.3 云龙石斑鱼与云纹石斑鱼的生长曲线 |
| 2.4.4 云龙石斑鱼与珍珠龙胆石斑鱼生长对比 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 云龙石斑鱼畸形性状发生的转录组分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 鱼的来源 |
| 3.2.2 取样以及RNA提取 |
| 3.2.3 cDNA文库构建以及illumina测序 |
| 3.2.4 序列组装以及功能注释 |
| 3.2.5 差异基因分析 |
| 3.2.6 样本相关性及主成分分析 |
| 3.2.7 基因表达网构建 |
| 3.2.8 模块-性状关系以及关键基因鉴定 |
| 3.2.9 基因验证 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 正常鱼与畸形鱼的外在表现 |
| 3.3.2 云龙石斑鱼的脑、垂体和脊椎骨的转录组De novo组装与分析 |
| 3.3.3 Unigenes的注释 |
| 3.3.4 样本聚类以及差异基因鉴定 |
| 3.3.5 差异基因的GO富集分析 |
| 3.3.6 差异基因的KEGG分析 |
| 3.3.7 基因共表达网络的构建 |
| 3.3.8 畸形相关模块的鉴定以及功能注释 |
| 3.3.9 基因鉴定以及网络构建 |
| 3.3.10 荧光定量验证实验 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 石斑鱼线粒体基因组全序列分析与系统进化研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 样本采集与DNA提取 |
| 4.2.2 PCR扩增与测序 |
| 4.2.3 线粒体DNA注释及分析 |
| 4.2.4 系统发育树构建 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 线粒体基因组结构 |
| 4.3.2 蛋白质编码基因 |
| 4.3.3 转运RNA和核糖体RNA |
| 4.3.4 线粒体基因组的基因间隔和重叠区域 |
| 4.3.5 L链的复制起点和控制区 |
| 4.3.6 线粒体的母性遗传 |
| 4.3.7 系统发育关系 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 赤点石斑鱼♀×蓝身大斑石斑鱼♂杂交子代发育及生长比较 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 受精卵的获取与孵化 |
| 5.2.2 仔稚幼鱼的培育 |
| 5.2.3 取样与观察 |
| 5.2.4 数据处理 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 胚胎发育 |
| 5.3.2 胚后发育 |
| 5.3.3 E. AT与E. A生长性状比较 |
| 5.3.4 E. AT与E. A第二背鳍棘与第一腹鳍棘的变化 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 赤点石斑鱼♀×蓝身大斑石斑鱼♂杂交子代遗传特征分析 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 实验材料 |
| 6.2.2 头肾-秋水仙素法制备染色体 |
| 6.2.3 线粒体DNA序列测定 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 赤点石斑鱼♀×蓝身大斑石斑鱼♂杂交子代E. AT与E. A染色体数目及组成 |
| 6.3.2 E.AT线粒体DNA分析 |
| 6.4 讨论 |
| 6.4.1 杂交子代E.AT染色体组成 |
| 6.4.2 杂交子代E.AT线粒体 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 赤点石斑鱼♀×蓝身大斑石斑鱼♂杂交子代与父母本微卫星遗传多样性分析 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 材料与方法 |
| 7.2.1 试验材料 |
| 7.2.2 基因组DNA的提取 |
| 7.2.3 SSR引物 |
| 7.2.4 PCR扩增和自动荧光检测 |
| 7.2.5 数据统计与分析 |
| 7.3 结果 |
| 7.3.1 SSR位点多态性分析 |
| 7.3.2 基因位点的遗传分化 |
| 7.3.3 群体遗传多样性分析 |
| 7.3.4 哈代温伯格平衡检验 |
| 7.3.5 遗传距离与遗传一致度 |
| 7.4 讨论 |
| 7.5 小结 |
| 参考文献 |
| 科研成果 |
| 资助项目 |
| 致谢 |
（2）拟穴青蟹早期发育转录组分析及Hox基因SpUbx/SpAntp/SpAbd-A功能初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 拟穴青蟹早期发育研究 |
| 1.1.1 拟穴青蟹的早期发育模式 |
| 1.1.2 拟穴青蟹早期发育过程中重要的生物学过程 |
| 1.1.2.1 拟穴青蟹早期发育时期的蜕皮 |
| 1.1.2.2 拟穴青蟹早期发育时期的形态变化 |
| 1.1.2.3 拟穴青蟹早期发育时期的食性转变 |
| 1.1.3 拟穴青蟹早期发育和幼体变态的研究进展 |
| 1.2 转录组测序及其在拟穴青蟹早期发育研究中的应用 |
| 1.2.1 组学技术和生物信息学的快速发展 |
| 1.2.2 拟穴青蟹的组学研究进展 |
| 1.2.3 组学解析在虾蟹早期发育研究中的应用 |
| 1.3 Hox基因家族在甲壳动物中的研究进展 |
| 1.3.1 无脊椎动物的Hox基因研究 |
| 1.3.2 Hox基因在甲壳动物中的表达模式 |
| 1.4 本研究的研究目的、意义及主要研究内容 |
| 第二章 拟穴青蟹早期不同发育时期的转录组研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 胚胎及幼体的取样 |
| 2.2.2 总RNA的提取 |
| 2.2.3 转录组测序 |
| 2.2.4 测序数据处理与分析 |
| 2.2.5 功能注释、GO分类与代谢通路分析及基因表达量分析 |
| 2.2.6 qRT-PCR定量验证 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 拟穴青蟹早期形态变化显微观察 |
| 2.3.2 拟穴青蟹早期发育时期转录组测序 |
| 2.3.2.1 转录组整体结果分析 |
| 2.3.2.2 基因功能注释 |
| 2.3.2.3 基因表达分析及相关性分析 |
| 2.3.2.4 差异表达基因功能注释 |
| 2.3.2.5 差异表达基因聚类分析 |
| 2.3.2.6 拟穴青蟹早期不同发育时期共差异表达基因分析 |
| 2.3.2.7 qRT-PCR验证 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 拟穴青蟹早期变态发育时期的比较转录组分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 基因的差异表达分析 |
| 3.2.2 差异表达基因的聚类及功能注释 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 胚胎期(E)与溞状幼体I期(Z1)的差异表达基因解析 |
| 3.3.1.1 EvsZ1 上调DEGs的功能注释 |
| 3.3.1.2 EvsZ1 下调DEGs的功能注释 |
| 3.3.2 溞状幼体V期(Z5)与大眼幼体(M)的差异表达基因解析 |
| 3.3.2.1 Z5 vs M上调DEGs的功能注释 |
| 3.3.3.2 Z5 vs M下调DEGs的功能注释 |
| 3.3.3 大眼幼体(M)与仔蟹(C1)的差异表达基因解析 |
| 3.3.3.1 Mvs C1 上调DEGs的功能注释 |
| 3.3.3.2 Mvs C1 下调DEGs的功能注释 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 Hox基因簇筛选及表达分析 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 拟穴青蟹Hox基因的筛选 |
| 4.3.2 簇状Hox基因在拟穴青蟹早期发育过程中的表达 |
| 4.3.3 非簇状homeobox基因在拟穴青蟹早期发育过程中的表达 |
| 4.3.4 在拟穴青蟹早期发育过程中差异表达的Hox基因 |
| 4.3.5 Hox基因在拟穴青蟹基因组中的定位 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 Hox基因Ubx/Antp/Abd-A基因的克隆和表达特性分析及互作关系研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.1.1 主要仪器和设备 |
| 5.2.1.3 主要试剂 |
| 5.2.1.4 幼体样品的采集 |
| 5.2.1.5 拟穴青蟹各组织样品的采集 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.2.2.1 总RNA的提取 |
| 5.2.2.2 第一链c DNA的合成 |
| 5.2.2.3 基因克隆 |
| 5.2.2.3.1 基因片段的验证 |
| 5.2.2.3.2 基因两端序列的克隆 |
| 5.2.2.3.3 序列拼接 |
| 5.2.2.3.4 生物信息学分析 |
| 5.2.2.3.5 qRT-PCR |
| 5.2.2.3.6 数据统计 |
| 5.2.2.4 整体原位杂交 |
| 5.2.2.4.1 探针的制备 |
| 5.2.2.4.2 整体原位杂交 |
| 5.2.2.5 多克隆抗体的制备 |
| 5.2.2.6 Western blotting |
| 5.2.2.7 RNA干扰 |
| 5.2.2.8 染色质免疫共沉淀 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 SpUbx、SpAntp和 SpAbd-A基因的克隆和生物信息学分析 |
| 5.3.1.1 SpUbx基因的c DNA全长序列和特征分析 |
| 5.3.1.2 SpAntp基因的c DNA全长序列和特征分析 |
| 5.3.1.3 SpAbd-A基因的c DNA全长序列和特征分析 |
| 5.3.2 SpUbx、SpAntp和 SpAbd-A基因的时空表达特性分析 |
| 5.3.3 SpUbx、SpAntp和 SpAbd-A基因在雌雄腹肢中的表达 |
| 5.3.4 SpUbx、SpAntp和 SpAbd-A基因在早期个体头胸部和腹部的表达 |
| 5.3.5 SpUbx、SpAntp和 SpAbd-A基因在早期个体中的表达定位 |
| 5.3.6 SpUBX和 SpANTP的蛋白表达 |
| 5.3.7 RNA干扰SpUbx基因的表达 |
| 5.3.8 SpUbx和 SpAntp的相互作用研究 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 总结、创新与展望 |
| 6.1 全文总结 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 附录 |
| 一、个人简介 |
| 二、攻读博士期间发表论文情况 |
| 三、攻读博士期间参与项目情况 |
| 四、攻读博士期间参加学术会议情况 |
| 五、攻读博士期间获得的荣誉和奖励 |
| 致谢 |
（3）先天性小耳畸形致病性拷贝数变异分子机制探究及低发际线耳廓再造（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 致病性CNV小鼠家系的构建及遗传特色与致病机制的分析 |
| 引言 |
| 1.1 实验对象及材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 1.6 参考文献 |
| 第二部分 利用转录组测序分析探究先天性耳畸形致病分子机制 |
| 引言 |
| 2.1 实验设备与试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 2.6 参考文献 |
| 第三部分 全头皮单瓣扩张法在极低发际线耳廓再造中的临床应用 |
| 引言 |
| 3.1 术前评估及患者选择 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 3.6 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 Hmx1基因（Nk5-3)的研究进展 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）转录因子Lhx9和Lhx4在斑马鱼胚胎发生中的表达模式及其在视网膜发育中的功能研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 斑马鱼的研究进展 |
| 1.2 斑马鱼视网膜的研究进展 |
| 1.3 LIM-HD转录因子在视网膜发育中的研究进展 |
| 1.4 研究目的和意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 主要试剂及配制 |
| 2.4 配鱼和收集鱼卵 |
| 2.5 核酸提取和荧光定量PCR |
| 2.6 制备核酸探针 |
| 2.7 整胚原位杂交 |
| 2.8 切片原位杂交 |
| 2.9 斑马鱼胚胎的显微注射 |
| 2.10 斑马鱼形态学观察 |
| 2.11 免疫荧光染色 |
| 2.12 光刺激反应行为学 |
| 2.13 统计分析 |
| 第三章 lhx9和lhx4 在斑马鱼胚胎发生中的表达模式 |
| 3.1 lhx9 在斑马鱼胚胎发生中的表达模式 |
| 3.2 lhx9 在斑马鱼视网膜发生中的表达模式 |
| 3.3 lhx4 在斑马鱼胚胎发生中的表达模式 |
| 3.4 lhx4 在斑马鱼视网膜发生中的表达模式 |
| 第四章 Lhx9 在斑马鱼视网膜发育中的功能研究 |
| 4.1 MO敲减lhx9 斑马鱼模型的构建 |
| 4.2 MO敲减lhx9 对斑马鱼胚胎形态发育的影响 |
| 4.3 MO敲减lhx9 对斑马鱼视网膜发育的影响 |
| 4.4 MO敲减lhx9 对斑马鱼视网膜细胞凋亡和增殖的影响 |
| 4.5 MO敲减lhx9 对斑马鱼光刺激反应的影响 |
| 第五章 Lhx4 在斑马鱼视网膜发育中的功能研究 |
| 5.1 MO敲减lhx4 斑马鱼模型的构建 |
| 5.2 MO敲减lhx4 对斑马鱼胚胎形态发育的影响 |
| 5.3 MO敲减lhx4 对斑马鱼视网膜发育的影响 |
| 5.4 MO敲减lhx4 对斑马鱼视网膜细胞凋亡的影响 |
| 5.5 MO敲减lhx4 对斑马鱼光刺激反应的影响 |
| 5.6 vivo-MO敲减视网膜内lhx4 斑马鱼模型的构建 |
| 5.7 vivo-MO敲减视网膜内lhx4 对胚胎形态发育的影响 |
| 5.8 vivo-MO敲减视网膜内lhx4 对视网膜发育的影响 |
| 5.9 vivo-MO敲减视网膜内lhx4 对视网膜内细胞凋亡的影响 |
| 5.10 vivo-MO敲减视网膜内lhx4 对斑马鱼光刺激反应的影响 |
| 第六章 讨论与结论 |
| 6.1 讨论与展望 |
| 6.2 结论 |
| 第七章 本论文的创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简历 |
（5）TBX1基因下游心脏发育相关差异表达基因筛选及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 :TBX1基因下游心脏发育相关差异表达基因的筛选与验证 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 组织标本 |
| 2.1.3 芯片 |
| 2.1.4 实验试剂 |
| 2.1.5 实验仪器 |
| 2.2 生物学信息分析软件 |
| 2.3 生物信息学数据库 |
| 2.3.1 Gene Ontology(GO)数据库 |
| 2.3.2 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)数据库 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 细胞培养 |
| 2.4.2 标本收集 |
| 2.4.3 细胞转染 |
| 2.4.4 提取细胞总RNA |
| 2.4.5 RNA反转录与c DNA合成 |
| 2.4.6 RT-PCR检测m RNA表达水平 |
| 2.4.7 芯片杂交及数据处理 |
| 2.4.8 酶联免疫吸附实验(ELISA) |
| 2.4.9 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 总RNA质检 |
| 3.2 TBX1 siRNA转染效率评价 |
| 3.3 芯片杂交及芯片质量评价 |
| 3.3.1 芯片杂交扫描 |
| 3.3.2 芯片原始数据提取 |
| 3.3.3 主成分分析(PCA) |
| 3.3.4 通过箱线图查看数据的分布状况 |
| 3.3.5 绘制散点图评估芯片数据集中趋势 |
| 3.4 芯片数据差异基因筛选 |
| 3.5 差异表达基因GO富集分析 |
| 3.5.1 上调差异表达基因的GO富集分析 |
| 3.5.2 下调差异表达基因的GO富集分析 |
| 3.6 差异表达基因KEGG数据库Pathway分析 |
| 3.7 TBX3基因在CHD心肌组织中表达情况 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 :TBX1通过TBX3/P21途径参与大鼠胚胎心肌细胞H9C2 细胞生物学功能调控的机制研究 |
| 5 前言 |
| 6 材料与方法 |
| 6.1 主要试剂和仪器 |
| 6.1.1 细胞系 |
| 6.1.2 主要试剂 |
| 6.1.3 主要配置试剂及配置方法 |
| 6.1.4 主要仪器 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 细胞培养与转染 |
| 6.2.2 实时荧光定量PCR(Real-time PCR) |
| 6.2.3 CCK-8检测细胞活性 |
| 6.2.4 细胞周期检测 |
| 6.2.5 细胞凋亡检测 |
| 6.2.6 细胞免疫荧光染色 |
| 6.2.7 Hoechst33342 染色 |
| 6.2.8 线粒体膜电位实验 |
| 6.2.9 线粒体ROS检测实验 |
| 6.2.10 ATP_(ase)活性检测 |
| 6.2.11 染色质免疫共沉淀(ChIP)实验 |
| 6.2.12 蛋白质免疫印迹(Western blot) |
| 6.2.13 统计学分析 |
| 7 结果 |
| 7.1 沉默和过表达TBX3基因大鼠胚胎心肌细胞H9C2细胞系建立 |
| 7.1.1 沉默TBX3基因H9C2细胞系建立 |
| 7.1.2 过表达TBX3基因H9C2细胞系建立 |
| 7.2 TBX3沉默抑制H9C2细胞增殖 |
| 7.3 TBX3 沉默使H9C2 细胞细胞周期阻滞于G1期 |
| 7.4 TBX3沉默诱导H9C2细胞凋亡 |
| 7.5 TBX3沉默诱导H9C2细胞线粒体功能障碍 |
| 7.6 P21是TBX3的直接靶基因 |
| 7.7 TBX3基因负向调控P21对H9C2细胞增殖活性的影响 |
| 8 讨论 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）龟足幼虫变态的形态学观察及相关基因分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 1 龟足的生物学特性 |
| 1.1 龟足的分类地位 |
| 1.2 龟足的生活环境和分布 |
| 1.3 龟足国内外研究现状 |
| 1.4 蔓足类幼虫形态学研究 |
| 2 甲壳动物生长发育基因的相关研究 |
| 2.1 Y-器官(YO)、X-器官窦腺复合体(XO/SG) |
| 2.2 蜕皮相关基因及其调控机制 |
| 2.2.1 蜕皮抑制激素(MIH)基因 |
| 2.2.2 高血糖激素(CHH)基因 |
| 2.2.3 蜕皮激素受体(Ec R)基因 |
| 2.2.4 维甲酸X受体(RXR)基因 |
| 2.3 大颚腺(MO) |
| 2.4 MF相关基因及其调控机制 |
| 2.4.1 大颚腺抑制激素(MOIH)基因 |
| 2.4.2 戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因 |
| 2.4.3 法尼酸甲基转移酶(FAMe T)基因 |
| 2.4.4 Met受体基因 |
| 3 钙调蛋白的结构与功能 |
| 4 组织蛋白酶D的结构与功能 |
| 5 论文选题的理由或意义 |
| 6 技术路线 |
| 第一章 龟足幼虫变态发育的组织切片观察 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 实验材料 |
| 1.1.2 实验方法 |
| 1.2 结果与分析 |
| 1.2.1 Ⅱ期无节幼虫内部结构 |
| 1.2.2 Ⅵ期无节幼虫内部结构 |
| 1.2.3 金星幼虫内部结构 |
| 1.2.4 变态初期金星幼虫内部结构 |
| 1.2.5 变态中期金星幼虫内部结构 |
| 1.2.6 稚体内部结构 |
| 1.3 结论与讨论 |
| 第二章 HMGR、CaM、CthD基因家族鉴定与分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 主要药品及试剂 |
| 2.1.3 实验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 龟足中HMGR基因家族的鉴定 |
| 2.2.2 龟足中CaM基因家族的鉴定 |
| 2.2.3 龟足中CthD基因家族的鉴定 |
| 2.3 结论与讨论 |
| 2.3.1 HMGR基因家族 |
| 2.3.2 CaM基因家族 |
| 2.3.3 CthD基因家族 |
| 第三章 CmHMGR、CmCaM1和CmCthD1 基因生物信息学分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 CmHMGR基因序列的生物信息学分析结果 |
| 3.2.2 CmCaM1 基因序列的生物信息学分析结果 |
| 3.2.3 CmCthD1 基因序列的生物信息学分析结果 |
| 3.3 结论与讨论 |
| 3.3.1 CmHMGR基因 |
| 3.3.2 CmCaM1 基因 |
| 3.3.3 CmCthD1 基因 |
| 第四章 CmHMGR、CmCaM1和CmCthD1 基因的表达水平 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 主要药品及试剂 |
| 4.1.3 实验方法 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 总RNA的质量 |
| 4.2.2 龟足不同发育时期CmHMGR的相对表达量 |
| 4.2.3 龟足不同发育时期CmCaM1 的相对表达量 |
| 4.2.4 龟足不同发育时期CmCthD1 的相对表达量 |
| 4.3 结论与讨论 |
| 4.3.1 CmHMGR基因的表达水平 |
| 4.3.2 CmCaM1 基因的表达水平 |
| 4.3.3 CmCthD1 基因的表达水平 |
| 第五章 CmHMGR、CmCaM1和CmCthD1 基因的表达部位 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 主要药品及试剂 |
| 5.1.3 实验方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 RT-PCR结果 |
| 5.2.2 引物的筛选和实验的最佳条件 |
| 5.2.3 CmHMGR基因整体原位杂交结果 |
| 5.2.4 CmCaM1 基因整体原位杂交结果 |
| 5.2.5 CmCthD1 基因整体原位杂交结果 |
| 5.3 结论与讨论 |
| 5.3.1 CmHMGR的表达部位 |
| 5.3.2 CmCaM1 的表达部位 |
| 5.3.3 CmCthD1 的表达部位 |
| 第六章 结论 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）基于斑马鱼模型的miR-375过表达致心脏发育异常的作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分:miR-375过表达导致斑马鱼胚胎心脏发育异常 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 第二部分:miR-375抑制NOTCH信号通路调控斑马鱼胚胎的心脏发育 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 综述 心脏疾病斑马鱼模型的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 中英文缩略词对照表 |
| 攻读学位期间发表文章 |
| 致谢 |
| 附件 |
（8）丙硫菌唑对斑马鱼胚胎发育影响和心血管毒性（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 引言 |
| 1.1 农药对环境的影响 |
| 1.1.1 农药对环境系统的影响 |
| 1.1.2 农药对环境生物的影响 |
| 1.1.3 农药对人体健康的影响 |
| 1.2 三唑类杀菌剂丙硫菌唑 |
| 1.2.1 三唑类杀菌剂简介 |
| 1.2.2 三唑类杀菌剂对非靶标生物的毒性 |
| 1.2.3 丙硫菌唑简介 |
| 1.3 斑马鱼简介 |
| 1.4 论文设计思路 |
| 1.4.1 研究意义 |
| 1.4.2 研究内容和技术路线 |
| 2 丙硫菌唑对不同阶段斑马鱼的急性毒性 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验仪器 |
| 2.1.2 实验试剂与药晶 |
| 2.1.3 实验生物 |
| 2.1.4 胚胎急性毒性实验 |
| 2.1.5 仔鱼急性毒性实验 |
| 2.1.6 成鱼急性毒性实验 |
| 2.1.7 数据处理 |
| 2.2 实验结果与分析 |
| 2.3 讨论 |
| 3 丙硫菌唑对斑马鱼胚胎生长发育的影响 |
| 3.1 实验设备与材料 |
| 3.1.1 仪器与试剂 |
| 3.1.2 实验药品与试剂 |
| 3.1.3 实验材料 |
| 3.2 胚胎发育实验 |
| 3.2.1 暴露方法 |
| 3.2.2 胚胎发育指标检查 |
| 3.2.3 暴露水体中丙硫菌唑实际浓度测定 |
| 3.3 数据处理 |
| 3.4 实验结果与分析 |
| 3.4.1 丙硫菌唑对胚胎死亡率的影响 |
| 3.4.2 丙硫菌唑对胚胎孵化率的影响 |
| 3.4.3 丙硫菌唑对胚胎自主活动的影响 |
| 3.4.4 丙硫菌唑对胚胎的致畸效应 |
| 3.4.5 丙硫菌唑对胚胎形态发育的影响 |
| 3.4.6 暴露水体中实际浓度测定 |
| 3.5 讨论 |
| 4 丙硫菌唑对斑马鱼胚胎心血管毒性 |
| 4.1 实验设备与材料 |
| 4.1.1 仪器设备 |
| 4.1.2 实验药品与试剂 |
| 4.1.3 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 暴露方法 |
| 4.2.2 胚胎心血管发育相关指标检查 |
| 4.2.3 血红细胞染色 |
| 4.2.4 心区细胞凋亡染色 |
| 4.2.5 丙硫菌唑对胚胎心血管发育相关基因表达量的影响 |
| 4.3 数据处理 |
| 4.4 实验结果与分析 |
| 4.4.1 丙硫菌唑暴露对斑马鱼心脏功能的影响 |
| 4.4.2 丙硫菌唑暴露对斑马鱼心脏形态结构的影响 |
| 4.4.3 丙硫菌唑暴露引起斑马鱼心区细胞凋亡 |
| 4.4.4 丙硫菌唑暴露对心血管发育相关基因表达量的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 5 总结 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（9）Pdgfrα在小鼠心脏发育中的功能分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 第一章 Pdgfrα在小鼠心脏发育过程中的表达模式 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 材料与方法 |
| 1.2.1 实验材料 |
| 1.2.2 实验方法 |
| 第三节 结果 |
| 1.3.1 Pdgfrα在各时期小鼠胚胎心脏中的表达模式 |
| 1.3.2 Pdgfrα在各时期小鼠胚胎心脏窦房结中的表达模式 |
| 第四节 讨论 |
| 第二章 Pdgfrα的缺失不影响窦房结的形态发生及功能 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 第三节 结果 |
| 2.3.1 小鼠窦房结的形态发生 |
| 2.3.2 Pdgfrα与Shox2在窦房结的共表达 |
| 2.3.3 Shox2-Ce;Pdgfrα~(flox/flox)小鼠窦房结中的Pdgfrα敲除验证 |
| 2.3.4 条件性敲除窦房结中的Pdgfrα未导致窦房结发育异常 |
| 2.3.5 条件性敲除窦房结Pdgfrα未导致Nkx2.5在窦房结头部的异位表达 |
| 2.3.6 Pdgfrα条件性基因剔除小鼠呈现正常的心电图 |
| 2.3.7 Pdgfrα~(Egfp/Egfp)小鼠窦房结的Pdgfrα敲除验证 |
| 2.3.8 全身性敲除Pdgfrα未导致小鼠窦房结形态发生异常 |
| 2.3.9 Pdgfrα全敲除小鼠窦房结中Nkx2.5的正常表达 |
| 第四节 讨论 |
| 第三章 Pdgfrα的缺失导致小鼠心肌致密化不全 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 材料和方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 第三节 结果 |
| 3.3.1 E13.5 Pdgfrα~(Egfp/Egfp)小鼠胚胎心室出现心肌致密化不全 |
| 3.3.2 E11.5-E16.5野生型小鼠胚胎心脏工作心肌细胞增殖速率 |
| 3.3.3 心脏特异性的Pdgfra敲除小鼠的工作心肌细胞增殖速率检测 |
| 3.3.4 心脏特异性的Pdgfra敲除小鼠的工作心肌细胞的凋亡检测 |
| 3.3.5 心脏特异性的Pdgfra敲除和野生型小鼠心脏的转录组数据测序过滤 |
| 3.3.6 cTnT-Ce;Pdgfrα~(flox/flox)和野生型小鼠心脏的差异基因分析 |
| 第四节 讨论 |
| 第四章 Pdgfrα的持续性激活导致小鼠心肌纤维化 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 材料和方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 第三节 结果 |
| 4.3.1 心脏特异性激活PDGFrα信号通路的小鼠的表型分析 |
| 4.3.2 cTnT-Ce; Pdgfrα~(K/+)和野生型小鼠心脏的转录组数据测序过滤 |
| 4.3.3 cTnT-Ce; Pdgfrα~(K/+)和野生型小鼠心脏的转录组差异基因分析 |
| 第四节 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 |
| 致谢 |
| 索引 |
| 个人简历 |
（10）团头鲂肌间刺发育相关基因的发掘与功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 鱼类肌间刺研究进展 |
| 1.1 鱼类肌间刺形态发育学研究 |
| 1.2 鱼类肌间刺选育可行性分析与遗传学研究 |
| 2 动物骨骼发育相关信号通路与基因的研究进展 |
| 2.1 哺乳动物骨骼发育相关信号通路 |
| 2.2 哺乳动物骨骼发育相关基因 |
| 2.3 鱼类骨骼发育相关信号通路与基因 |
| 3 动物骨骼发育相关非编码RNA的研究进展 |
| 3.1 动物非编码RNA的分子功能与作用机制 |
| 3.2 ncRNA对哺乳动物骨骼发育的调控 |
| 3.3 ncRNA对鱼类骨骼发育的调控 |
| 4 高通量测序技术的发展及其在鱼类中的应用 |
| 4.1 高通量测序技术 |
| 4.2 高通量测序技术在鱼类研究中的应用 |
| 5 团头鲂肌间刺研究的目的和意义 |
| 第二章 团头鲂肌间刺,肌隔结缔组织与肌肉组织的显微结构观察及转录组分析 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 形态学观察 |
| 2.2.2 Total RNA提取 |
| 2.2.3 cDNA文库构建及高通量测序 |
| 2.2.4 原始数据质控、装配及数据库比对 |
| 2.2.5 Unigenes与 miRNA的差异表达分析 |
| 2.2.6 差异表达Unigenes与 miRNA靶基因的功能注释 |
| 2.2.7 Unigenes与 miRNA的表达模式验证 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 三种组织的切片及染色观察结果 |
| 3.2 三种组织的转录组数据分析 |
| 3.2.1 转录组数据装配 |
| 3.2.2 数据库比对 |
| 3.3 肌间刺与肌隔结缔组织的sRNA转录组数据分析 |
| 3.3.1 序列比对与分类注释 |
| 3.3.2 团头鲂miRNA鉴定 |
| 3.3.3 团头鲂miRNA异构体现象(isomiRs) |
| 3.4 unigene差异表达分析 |
| 3.4.1 三种组织间差异表达unigenes的发掘 |
| 3.4.2 三种组织间差异表达unigenes的功能注释 |
| 3.4.3 三种组织特异性表达unigenes的发掘与功能注释 |
| 3.5 miRNA差异表达分析 |
| 3.5.1 肌间刺与肌隔结缔组织间差异表达miRNA的发掘 |
| 3.5.2 肌间刺与肌隔结缔组织间差异表达miRNA靶基因预测及功能注释 |
| 3.6 Unigenes与 miRNAs的表达模式验证 |
| 4 讨论 |
| 第三章 肌间刺关键发育时期m RNA与 miRNA表达模式的关联分析与验证 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验动物和组织取样 |
| 2.2 Total RNA提取及cDNA文库构建 |
| 2.3 参考转录组装配及功能注释 |
| 2.4 不同发育时期基因表达谱分析 |
| 2.5 Mi RNA表达模式及 mRNA-miRNA互作分析 |
| 2.6 miRNA与 m RNA的表达验证 |
| 2.7 miRNAs与靶基因的调控关系验证 |
| 2.7.1 双荧光素酶报告载体构建 |
| 2.7.2 miRNAs mimics的合成 |
| 2.7.3 细胞转染 |
| 2.7.4 双荧光素酶活性检测 |
| 3 结果和分析 |
| 3.1 参考转录组的装配与注释 |
| 3.2 肌间刺不同发育时期的基因表达模式 |
| 3.3 不同发育时期miRNA表达模式分析 |
| 3.4 miRNA-m RNA互作关系分析 |
| 3.5 miRNA和 m RNA的表达模式验证 |
| 3.6 miR-133b-3p与 miR-206-3p的靶基因验证 |
| 4 讨论 |
| 第四章 团头鲂肌间刺三代全长转录组构建 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 Total RNA提取 |
| 2.2.2 Pac Bio Iso-Seq库的构建和测序 |
| 2.2.3 Iso-Seq下机数据处理,校正及参考基因组比对 |
| 2.2.4 基因结构分析 |
| 2.2.5 LncRNA分析 |
| 2.2.6 基因isoforms的验证 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 原始数据处理及全长转录本分析 |
| 3.2 参考基因组比对分析 |
| 3.3 基因结构分析 |
| 3.3.1 全长转录本分类及特征分析 |
| 3.3.2 可变剪接,多聚腺苷酸化及转录因子分析 |
| 3.3.3 ORF预测与融合基因分析 |
| 3.4 LncRNA分析 |
| 3.5 Unmapped转录本和新基因转录本的功能注释 |
| 3.6 基因isoforms的验证 |
| 4 讨论 |
| 第五章 肌间刺不同生长阶段lnc RNA与 miRNA的表达模式分析 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验组织及total RNA提取 |
| 2.2 文库构建及测序 |
| 2.3 原始数据质控与序列比对 |
| 2.4 LncRNA与 miRNA的鉴定与特征分析 |
| 2.5 lnc RNA与 miRNA的差异表达分析 |
| 2.6 lnc RNA与 miRNA的靶基因预测与功能注释 |
| 2.7 lnc RNA,miRNA与 m RNA的 ce RNA网络调控 |
| 3 结果和分析 |
| 3.1 LncRNA和 miRNA转录组数据过滤与比对 |
| 3.2 LncRNA和 miRNA的筛选与特征分析 |
| 3.3 LncRNA和 miRNA的差异表达分析 |
| 3.4 LncRNA与 miRNA的靶基因预测及功能注释 |
| 3.5 lnc RNA-miRNA-m RNA的 ce RNA网络 |
| 3.6 lnc RNA与 miRNA的表达验证 |
| 4 讨论 |
| 第六章 BMPII型受体基因在斑马鱼骨骼发育中的功能验证 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 系统发育分析和基因组结构分析 |
| 2.2 实验鱼,gRNA设计,突变体构建 |
| 2.3 突变体斑马鱼的表型观察 |
| 2.4 比较转录组分析 |
| 2.5 BMP-Smad通路基因和骨骼发育相关基因的定量表达分析 |
| 2.6 Western blot蛋白表达分析 |
| 3 结果和分析 |
| 3.1 染色体同线分析与bmpr2基因保守性分析 |
| 3.2 bmpr2a和 bmpr2b突变体斑马鱼的获得 |
| 3.3 bmpr2a~(-/-)与bmpr2b~(-/-)斑马鱼肌间刺发育正常 |
| 3.4 bmpr2b~(-/-)表现出不同程度的矿化骨畸形 |
| 3.5 Bmpr2b功能丧失导致BMP-Smad信号分子及骨骼发育相关基因表达量发生显着变化 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 主要研究结果 |
| 研究创新点 |
| 参考文献 |
| 附录一 附加文件详细信息 |
| 附表1 miRNA反转录特异性茎环引物 |
| 附表2 miRNAs荧光定量引物 |
| 附表3 miRNA反转录茎环引物 |
| 附表4 miRNAs荧光定量引物 |
| 附表5 基因isoforms验证引物 |
| 附表6 lnc RNA-miRNA-m RNA的 ce RNA网络(显示部分结果) |
| 附件7 矿化骨与软骨染色方法 |
| 附件8 bmpr2a突变体斑马鱼序列信息 |
| 附件9 bmpr2b突变体斑马鱼序列信息 |
| 附录二 攻读博士学位期间发表论文和授权专利 |
| 附录三 攻读博士学位期间所获得奖励与荣誉 |
| 致谢 |
四、脊椎动物心脏形态发育的转录调控（论文参考文献）
- [1]石斑鱼杂交后代表型和遗传性状分析[D]. 李振通. 上海海洋大学, 2021
- [2]拟穴青蟹早期发育转录组分析及Hox基因SpUbx/SpAntp/SpAbd-A功能初步研究[D]. 张银. 汕头大学, 2020(01)
- [3]先天性小耳畸形致病性拷贝数变异分子机制探究及低发际线耳廓再造[D]. 陈琪. 北京协和医学院, 2020(05)
- [4]转录因子Lhx9和Lhx4在斑马鱼胚胎发生中的表达模式及其在视网膜发育中的功能研究[D]. 郭瑞. 浙江大学, 2020(08)
- [5]TBX1基因下游心脏发育相关差异表达基因筛选及功能研究[D]. 曹美玲. 中国医科大学, 2020
- [6]龟足幼虫变态的形态学观察及相关基因分析[D]. 李惠莲. 福建师范大学, 2020(12)
- [7]基于斑马鱼模型的miR-375过表达致心脏发育异常的作用机制研究[D]. 庄思斯. 南京医科大学, 2020(06)
- [8]丙硫菌唑对斑马鱼胚胎发育影响和心血管毒性[D]. 孙永祺. 浙江农林大学, 2019(01)
- [9]Pdgfrα在小鼠心脏发育中的功能分析[D]. 关震. 福建师范大学, 2019(04)
- [10]团头鲂肌间刺发育相关基因的发掘与功能研究[D]. 万世明. 华中农业大学, 2019(01)