一、改良肝素诱导体外低密度脂蛋白沉淀系统的应用（论文文献综述）
钟志惟[1]（2021）在《基于NIR-Ⅱ和汽泡的双辅助的肝素和尿激酶双药序列释放平台的构建及其体内外评价》文中进行了进一步梳理背景与目的:静脉血栓栓塞（VTE）是包括深静脉血栓（DVT）和肺栓塞（PE）在内的一种常见且可致命的疾病。DVT是严重危害人类健康的疾病之一,其发病率、致死率和致残率均居高不下,且急性血栓易导致残疾甚至死亡。目前,基于尿激酶（UK）的临床溶栓的传统药物存在用量大、半衰期短、易出血副作用等缺点。因此,迫切需要一种更高效的药物溶栓方法。纳米给药平台具有尺寸多样化、比表面积大、表面易修饰、载药量大、可降解等特点,可以改变药物的释放速率,增加给药体系的生物相容性和安全性,提高药物的生物利用度并减少其副作用。目前,纳米技术和药物治疗相互结合已经成为医学领域和生物材料应用领域的研究热点和方向。中空介孔硅（HMSNs）由于其具有高渗透、低密度、稳定的热力学、介孔硅（MSNs）自身的优良性能与特点、具有比表面积和孔容积大,孔径尺寸可调,结构高度有序,表面富含活性羟基（-OH）基团易于修饰、生物相容性好、可生物降解等优点,主要应用于纳米级传感器、催化反应、药物载体、生物医用等领域,尤其作为载体在药物传输系统中被广泛应用。普通肝素（UH）和UK都是临床上常用的抗血栓药物,且溶栓机理各不相同,理论上说,UH和UK联用是一种有希望的联合用药方式。但实际上,由于UH和UK带相反的电荷,直接联用溶栓效果不佳。为了改变这两种药物电荷排斥的劣势,我们拟开发一种双辅助（近红外-Ⅱ,汽泡）双药序列式药物释放的多功能溶栓平台（UK-UH@PDA@HMSNs）,这种序列释放可以成功解决UK与UH因电荷相互排斥难以直接混合联用的问题。本研究旨在探讨PDA@HMSNs的表征、光热性能、药物负载、药物释放以及生物相容性,评估UK-UH@PDA@HMSNs纳米溶栓复合物在体内、外的溶栓效果和生物安全性。方法:1.在综合比较已报道的各种制备HMSNs方法的基础上,我们选择了一种价格低廉、方法简便、实用性强的油水双相反应结合模板法制备可降解的HMSNs。负载UK后,利用界面聚合法HMSNs表面形成聚多巴胺（PDA）薄膜,最后在PDA薄膜外侧负载UH最终形成UK-UH@PDA@HMSNs纳米溶栓复合物。通过扫描电镜（SEM）、透射电镜（TEM）、原子力显微镜（AFM）、纳米粒度电位仪、比表面及孔隙度测试仪（BET）、傅里叶变换红外光谱仪（FTIR）、X射线衍射仪（XRD）、X射线光电子能谱仪（XPS）、热重分析仪（TGA）对HMSNs和PDA@HMSNs进行一系列形态和结构的表征。2.通过光热升温实验、紫外可见光分光光度计、药物负载及释放实验、溶血实验、细胞毒性实验、活-死细胞染色等实验对PDA@HMSNs的性能和生物安全性进一步的进行探究。3.通过体外溶栓实验、体内溶栓实验、血液生化分析、重要组织器官H&E染色等实验对UK-UH@PDA@HMSNs溶栓性能和体内生物安全性做全面评估。结果:1.SEM结果显示HMSNs具有多孔结构,相应的TEM结果显示HMSNs是一个具有巨大空腔的中空球。AFM进一步研究了PDA@HMSNs和HMSNs的形貌和立体结构,PDA@HMSNs的直径比HMSNs的直径大约20 nm。经过PDA包覆在HMSNs表面后,HMSNs的zeta电位由-6.86 mV变为2.68 mV。HMSNs和PDA@HMSNs的平均水动力直径分别为251.37±8.30 nm和601.77±85.88nm。与CTAC/m Si O2@s Si O2相比,HMSNs的比表面积和孔容显着增加。FTIR、XRD、XPS、TGA结果进一步说明PDA成功的在HMSNs表面修饰。2.体外研究发现PDA@HMSNs具有良好的光热升温效果。根据UH标准曲线和载药率公式,测得UK-UH@PDA@HMSNs中UH的载药率为16.15±1.39%。根据尿激酶试剂盒和载药率公式,测得UK的载药率为28.68±3.96%。在NIR-II照射的40 min内,UK的释放率显着增加,约为80.67%。然而,在没有NIR-II照射的情况下,UK-UH@PDA@HMSNs的累积释放率降至17.33%。在NIR-II激发下,UH在25 min内释放了约81%,然而在没有NIR-II照射的情况下,UH在30 min内仅释放了约20%。溶血实验、细胞毒性实验、活-死细胞染色实验结果显示PDA@HMSNs具有良好的细胞相容性和低毒性。3.体外溶栓实验结果显示,UK after UH组溶栓效果优于UK组,具有显着性差异（***p<0.01）。UK-UH@PDA@HMSNs+NIR-Ⅱ组的溶栓率显着高于UK+NIR-Ⅱ组（***p<0.001）。体内溶栓实验结果显示,UK-UH@PDA@HMSNs+NIR-Ⅱ比UK+NIR-Ⅱ具有更好的溶栓效果（**p<0.01）。最后,我们对SD大鼠进行了体内生物安全性评估,结果显示:SD大鼠在注射UK-UH@PDA@HMSNs后,主要器官的H&E染色图像未出现炎症或组织损伤等组织病理学异常的现象。大鼠肝肾功能和凝血功能在正常范围之内,治疗期间未出现出血等副作用,说明该溶栓系统在体内具有一定的生物安全性。结论:总之,对于血管栓塞性疾病,特别是下肢DVT的治疗,基于药物的溶栓系统的效率和生物安全性是与患者康复质量直接相关的重要因素。本文开发了一种双辅助（NIR-Ⅱ,汽泡）双药序列式释放的多功能溶栓平台（UK-UH@PDA@HMSNs）。体内外研究均证实UK-UH@PDA@HMSNs在NIR-Ⅱ的激发下具有安全和高效的溶栓作用。
蒋云霞[2]（2021）在《荔枝核总黄酮对HSC-T6的作用和差异蛋白质组学的研究》文中研究说明目的:以大鼠肝星状细胞T6细胞株（HSC-T6）为受试对象,探讨并完善荔枝核总黄酮（total flavonoids from Litchi Seed,TFL）拮抗肝纤维化的作用靶点与作用机制。方法:常规培养HSC-T6,分别观察TFL在不同时间和不同浓度对HSC生长增殖率的影响,从中选择最佳的TFL药物浓度进行后续实验;将HSC-T6分为细胞对照组和TFL实验组,细胞对照组的HSC-T6常规培养,TFL实验组采用上述最佳的TFL药物浓度干预HSC-T6,分别使用透射电子显微镜和ELISA方法检测各组HSC-T6的超微结构和基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、Ⅰ型胶原（ColⅠ）、Ⅲ型胶原（ColⅢ）含量的变化。制备肝纤维化模型大鼠,在大鼠腹部皮下注射40%四氯化碳橄榄油混悬液0.3 ml/100 g,2次/周,共8周。造模完成后,行肝组织病理染色检测,证实造模成功。将肝纤维化造模完成的大鼠分为模型对照组和TFL实验组,模型对照组大鼠在肝纤维化造模完成后常规饲养,TFL实验组大鼠予灌胃TFL 100 mg/（kg·d）,4周后收集模型对照组和TFL实验组的大鼠血清。检测各组血清对HSC-T6的最大无毒浓度,以最大无毒浓度为最佳诱导剂量孵育HSC-T6,诱导分化14天后提取全蛋白,通过DDA/DIA技术筛选出模型对照组和TFL实验组血清干预后的差异表达蛋白,并对差异蛋白进行GO、KOG、PPI、PATHWAY和亚细胞定位等生物信息学分析。结果:1.透射电镜结果显示TFL干预后HSC-T6的超微结构发生变化,细胞间隙变大,胞膜四周纤毛脱落,多角伪足减少,膜表面不平整,细胞浆内线粒体明显变形,线粒体嵴断裂或消失,粗面内质网扁池扩张,核糖体脱落,核内染色质浓缩或边聚,核膜皱缩,可见凋亡小体形成。2.ELISA 结果显示,TFL 干预后 HSC-T6 的 MMP-2、Col Ⅰ、Col Ⅲ含量下降。3.生物信息学分析结果显示,模型对照组和TFL实验组的差异蛋白共177个,其中上调蛋白84个,下调蛋白93个。GO分析显示,差异蛋白参与分子功能共10个条目,主要为分子结合和催化活性;细胞组分共18个条目,主要为细胞质和细胞器;生物过程共24个条目,主要为细胞过程、代谢过程、生物调节等。4.KOG注释分析显示,差异蛋白比对到KOG数据库共有23个子类和192条蛋白注释信息,其中细胞过程和信号传递是获得注释信息最多的分类,其次为信息存储与处理、新陈代谢作用和缺乏注释的蛋白等。5.PPI分析结果显示,存在互作关系的上调蛋白28个:SELENOH、C1QC、C1QB、APOE、ANGPTL4、NF1、GPX3、CLU、DMAP1、VTN、MYH14、SELENOM、HRG、PF4、HMOX1、IGH1A、IGG2A、IGHG、PGK2、PLIN2、KDM4C、ITIH4、BAZ2A、C9、ADH7、MGST1、GSTA1、ATP9B等。存在互作关系的下调蛋白42个:RAD51、HELZ2、PBK/TOPK、HMGCS1、UBE2T、UBE2C、DLGAP5、LOC100911660、PTEN、BLM、CYP51A1、MDC1、LRRK1、MVD、NSDHL、IDI1、SPC24、CDCA8、KNSTRN、CCNB2、FAM83D、HMGXB4、STARD4、HLTF、LIPG、UHRF1、KAT8、PCSK9、UBE2S、AMMECR1L、WDR76、ZNRD2、DDX10、MAP3K3、PIMREG、SMAD1、MCL1、MPRIP、FIGNL1、RPAP1、STMN1、SPP1 等。6.PATHWAY富集分析结果显示,KEGG代谢通路分为6个分支,共注释38项条目,分支包括细胞过程、环境信息处理、遗传信息处理、人类疾病、代谢和有机系统等,其中差异蛋白占比前三的分支为人类疾病、新陈代谢和有机系统。代谢通路主要包括原发性免疫缺陷、金黄色葡萄球菌感染、补体和凝血级联、系统性红斑狼疮、哮喘产生IgA的肠道免疫网络、免疫系统、萜类骨架的生物合成、自身免疫性甲状腺疾病、同种异体移植排斥、范可尼贫血途径、造血细胞谱系、非洲锥虫病、胆固醇代谢、类风湿关节炎、矿物质吸收、细胞色素P450对异生物的代谢、病毒性心肌炎、利什曼病、阿米巴病、癌症中的转录失调、扩张型心肌病、自然杀伤细胞介导的细胞毒性、FcεRI信号通路、B细胞受体信号通路、磷脂酶D信号通路、NF-κB信号通路、酮体的合成与降解、PI3K-Akt信号通路、肝细胞癌、药物代谢-细胞色素P450等。7.亚细胞定位结果发现这些差异蛋白主要位于细胞核、细胞质或细胞外,其余则较平均散布于胞质内膜、线粒体、过氧化物酶体、内质网、胞质网丝以及细胞骨架上。结论:1.荔枝核总黄酮（TFL）可下调HSC-T6的MMP-2、ColⅠ和ColⅢ的表达水平,对HSC-T6的生长增殖具有抑制作用。2.本实验基于DDA/DIA模式并通过GO、KOG、PPI、PATHWAY以及亚细胞定位等生物信息学技术分析后发现C1QC、C1QB、C9、SELENOH、SELENOM、GPX3、APOE、CLU、ANGPTL4、NF1、HRG、PF4、ITIH4、ADH7、RAD51、BLM、FIGNL1、MDC1、SPC24、KNSTRN、CDCA8、HELZ2、HMGCS1、MVD、IDI1、CYP51A1、NSDHL、LIPG、PBK/TOPK、FAM83D、DLGAP5、UBE2T、UBE2C、UBE2S、UHRF1、MAP3K3、LRRK1、SMAD、、MCL、等差异蛋白与肝纤维化疾病具有密切相关性;PI3K/Akt通路、NF-κB信号通路、胆固醇代谢、补体和凝血级联、细胞色素P450可能是TFL抑制HSC-T6生长增殖并诱导HSC-T6死亡的主要信号转导途径。3.TFL可能通过调控多个蛋白和参与多种信号传导通路抑制ECM的形成和诱导HSC-T6死亡,发挥拮抗肝纤维化的生物学效应。
张艳达[3]（2021）在《冠脉慢血流微循环障碍的机制和干预研究》文中进行了进一步梳理冠脉微循环障碍（Coronary microvascular dysfunction,CMD）在非阻塞性冠心病发病中起重要作用,也是其起病的重要机制,CMD引起的心血管事件严重影响患者的生活质量,疾病负担严重,已成为当前临床迫切需要解决的问题。作为临床上诊断相对容易的原发性CMD类型之一,冠脉慢血流现象（Coronary slow flow phenomenon,CSFP）是本课题的重点关注对象,纳入相关患者进行临床研究;脂肪乳输注诱导的小鼠CMD模型和棕榈酸（Palmitic acid,PA）干预的小鼠心脏微血管内皮细胞将被用于探究冠脉慢血流微循环障碍发病的深层机制。本课题将从临床到基础多层面探讨冠脉慢血流微循环障碍的可能发病机制和有效干预手段,为CMD的临床干预提供理论支撑。实验目的:对冠脉慢血流患者和对照组患者的外周血白细胞,进行全转录组测序和单细胞测序分析;比较两组患者的血浆生化指标,发现CSFP患者发病特点与规律。通过模拟CSFP患者临床特点诱导小鼠CMD模型、干预小鼠心脏微血管内皮细胞,探究脂肪乳输注诱导冠脉微血管功能障碍的深层机制。研究方法:1、冠脉慢血流患者白细胞全转录组及单细胞测序分析:对照组患者（n=28）和慢血流组患者（n=28）均来源于上海长征医院心内科2017年7月至2019年7月入院且行冠脉造影的患者。留取对照组和慢血流组患者血浆和白细胞,并收集患者低密度脂蛋白、甘油三酯、高密度脂蛋白和血压等临床化验检查结果。对冠脉慢血流组和对照组病人的外周血白细胞进行全转录组测序和单细胞测序分析。最后通过ELISA测定两组患者血浆中e NOS和s LOX-1水平,借助酶标仪测定血浆游离脂肪酸（Free fatty acids,FFAs）浓度。2、静脉输注脂肪乳诱导小鼠CMD模型及尼可地尔对CMD小鼠的改善作用:选取6周至8周C57雄性小鼠（20±2g）30只,随机分为假手术对照组（Control组）、CMD模型组（静脉输注脂肪乳诱导）（Model组）和模型联合尼可地尔干预组（Model+Nico组）。予以Control组小鼠输注生理盐水（0.1 m L/h）,路径为颈静脉,时间为6小时;予以Model组和Model+Nico组小鼠输注脂肪乳(20%Intralipid○R)和肝素（20 U/m L）混合溶剂（0.1 m L/h）,路径及输注时间同Control组。通过无创超声多普勒血流仪测定小鼠冠脉血流储备评估小鼠冠脉微循环功能和状态;通过Transdermal GFR Monitor检测小鼠肾小球滤过率改变;通过BX51显微镜评估小鼠提睾肌微循环血流状态,分析并记录提睾肌微血管的血流速度、白细胞粘附数量、白细胞滚动速度等微循环血流动力学指标。通过电镜分析小鼠心肌组织、肾脏组织超微结构,评估脂肪乳输注对小鼠心肌细胞、肾脏足细胞、心肌微血管和缝隙连接的影响。留取小鼠血浆,测定FFAs、IFN-γ、IL-1β、IL-6、NO、SOD和TNF-α浓度;留取小鼠外周血白细胞,进行定量PCR分析、ROS检测和流式分析等;留取小鼠心肌组织进行定量PCR、免疫组化和Western Blot明确AMPK-KLF2-e NOS信号通路的表达改变情况。3、脂肪乳输注诱导小鼠CMD的可能机制:通过密度梯度离心法分离获取小鼠外周血中性粒细胞,探究脂肪乳输注诱导中性粒细胞外网状陷阱释放。最后,在体验证中性粒细胞外网状陷阱消除对小鼠提睾肌白细胞粘附的影响。体外培养小鼠心脏微血管内皮细胞,建立PA干预细胞的浓度和时间梯度,通过CCK-8试剂盒和ROS检测试剂盒评估PA不同干预浓度和时间下小鼠微血管内皮细胞活力和心脏微血管内皮细胞氧化应激水平。通过Western Blot测定PA不同干预浓度或干预时间下小鼠心脏微血管内皮细胞AMPK-KLF2-e NOS信号通路表达改变。分别用AICAR、KLF2过表达质粒和尼可地尔干预心脏微血管内皮细胞,测定AMPK-KLF2-e NOS信号通路改变,探究AMPK激活、KLF2过表达或NO浓度升高时微血管内皮细胞活力和氧化应激水平,并验证AMPK激活对模型小鼠冠脉微循环障碍的影响。实验结果:1、人外周血白细胞全转录组测序分析发现,慢血流组共92个m RNA表达升高,共有129个m RNA表达降低,这些基因与脂类代谢、细胞粘附等生物过程密切相关。慢血流组上调lnc RNA共计738个,下调的共计472个。慢血流组上调circ RNA共计117个,下调的共计29个。单细胞转录组测序分析发现慢血流组调控生物粘附、抗氧化、免疫反应和代谢等生物过程的基因表达均发生了改变。与对照组相比,冠脉慢血流组血浆e NOS浓度降低,血浆FFAs、s LOX-1浓度升高（P<0.05）。冠脉慢血流组患者脂类代谢异常、血浆游离脂肪酸浓度升高和血管内皮功能障碍可能与冠脉微循环障碍的发生、发展相关。2、与Control组相比,Model组小鼠冠脉血流储备、肾小球滤过率显着降低,同时伴有提睾肌微小血管管壁白细胞粘附数量增加、滚动速度降低,外周血白细胞表面CD11b表达升高,白细胞KLF2 m RNA表达水平降低,ROS含量增高（P<0.05）。电镜分析提示Model组小鼠微血管内皮肿胀、心肌细胞缝隙连接断裂、足细胞足突融合。脂肪乳输注引起小鼠血浆FFAs、TNF-α和IL-6浓度升高。尼可地尔可显着改善脂肪乳静脉输注引起的小鼠冠脉血流储备和肾小球滤过率降低、提睾肌微血管内白细胞滚动速度降低、ROS和炎症因子产生增多,降低粘附于提睾肌微小血管管壁上的白细胞数量,下调外周血白细胞表面粘附分子CD11b的表达（P<0.05）。与Control组相比,Model组小鼠心肌组织AMPK-KLF2-e NOS通路抑制,而尼可地尔干预则可上调心肌组织e NOS的表达,升高NO浓度（P<0.05）。静脉输注脂肪乳可诱导小鼠CMD,其机制可能涉及AMPK-KLF2-e NOS信号通路抑制,而尼可地尔可能通过升高NO浓度来发挥改善CMD的作用。3、中性粒细胞外网状陷阱产生在脂肪乳诱导的微循环障碍中起着重要作用,中性粒细胞外网状陷阱清除可以降低提睾肌小血管壁白细胞粘附数量（P<0.05）。PA诱导的小鼠心脏微血管内皮细胞活力降低、氧化应激水平升高和AMPK-KLF2-e NOS信号通路抑制存在明显浓度和时间依赖。AMPK激活、KLF2过表达和e NOS激活都可以减轻棕榈酸引起的AMPK-KLF2-e NOS信号通路的抑制,改善细胞活力和氧化应激水平（P<0.05）。AMPK激活还可以改善CMD模型小鼠冠脉血流储备,减少提睾肌微小血管内白细胞粘附数量（P<0.05）。研究结论:全转录组和单细胞转录组测序分析发现慢血流患者外周血白细胞中与脂类代谢、抗氧化和粘附等相关的基因表达发生显着改变,且其血浆FFAs、s LOX-1浓度升高,血浆e NOS含量降低,提示脂肪酸代谢异常、白细胞粘附、内皮功能障碍可能与冠脉慢血流微循环障碍发病密切相关。升高FFAs浓度可以诱发小鼠CMD,其机制可能为AMPK-KLF2-e NOS信号通路抑制。升高NO浓度可通过减少炎症因子释放、降低细胞内ROS产生和抑制中性粒细胞外网状陷阱形成等来发挥其改善CMD作用。
李特[4]（2021）在《Phactr1缺乏通过促进M1巨噬细胞极化和泡沫细胞形成促进动脉粥样硬化进展》文中指出背景:目前部分研究提示磷酸酶肌动蛋白调控因子1（Phactr1）的遗传变异与动脉粥样硬化性心血管疾病相关,然而Phactr1是如何影响动脉粥样硬化的进展以及其相关机制尚未明确,需要进行深入研究及探讨。因此,明确Phactr1的作用机制及其影响将促进我们对动脉粥样硬化的进一步理解,根据相关研究结果,可能会发现治疗动脉粥样硬化疾病的新靶点。基于上述原因,深入研究其作用机制是一项具有重要临床意义的课题。目的:深入了解Phactr1在斑块稳定性中的作用,探讨Phactr1在动脉粥样硬化中潜在的作用机制,在Phactr1缺陷小鼠中对ox-LDL诱导的巨噬细胞极化,炎症反应和泡沫细胞形成进行研究。方法:应用Apoe基因敲除小鼠(Apoe-/-)、Phactr1全基因敲除小鼠(Phactr1-/-)、Apoe和Phactr1双基因敲除小鼠(Phactr1-/-Apoe-/-,DKO)及KLF4δMC过表达、Apoe、Phactr1基因敲除小鼠(KLF4δMC/Phactr1-/-Apoe-/-)建立动脉硬化模型,给予八周大雄性DKO和Apoe-/-小鼠高脂饮食（16%的脂肪和1.3%的胆固醇）,持续16周,对总甘油三酯（TG）,总胆固醇（TC）,低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）进行测定。对小鼠血管组织进行染色后评估细胞内脂质含量、斑块的形态、斑块的负荷、坏死面积以及纤维帽厚度。通过定量RT-PCR检测小鼠巨噬细胞中Phactr1 m RNA的表达。通过定量RT-PCR及ELISA分析对小鼠炎症反应程度（TNF-α和IL-6）进行评估。通过BM移植策略评估造血Phactr1缺乏对动脉硬化的影响。通过定量RT-PCR对TNF-α、IL-6、Arg1、CD206及KLF4的表达进行检测。同时,我们应用免疫印迹和定量分析检测LOX-1,SR-A,CD36,ABCA1、ABCG1及KLF4的蛋白质表达情况。用免疫印迹分析p38MAPK和CREB的磷酸化情况。通过双重荧光素酶报告基因测定系统对CREB反应元件的荧光素酶活性进行检测。结果:（1）Phactr1荧光强度在晚期动脉粥样硬化斑块中较强,并且主要在Mac2阳性细胞中表达,晚期病变的Apoe-/-小鼠Phactr1表达增加,而正常饮食的Apoe-/-小鼠Phactr1的表达实际上较低。（P<0.05）（2）高脂饮食16周后,Phactr1+/+和Phactr1-/-小鼠的体重和食物摄入量没有差异。高脂饮食的Apoe-/-小鼠血浆中TC,TG和LDL-C含量较高,Phactr1-/-Apoe-/-小鼠的血脂水平与Apoe-/-小鼠相当。（P<0.05）（3）主动脉窦横截面上的油红O染色显示,Phactr1-/-Apoe-/-小鼠的动脉粥样硬化斑块比Apoe-/-小鼠的动脉粥样硬化斑块更显着。Phactr1-/-Apoe-/-小鼠坏死核区域更大,纤维帽更薄,巨噬细胞堆积更多。Phactr1缺乏导致Apoe-/-小鼠主动脉窦动脉粥样硬化斑块中胶原蛋白的积累明显减少。（P<0.05）（4）Phactr1-/-Apoe-/-小鼠主动脉中TNF-α和IL-6含量更高,血浆中TNF-α和IL-6水平也升高。（P<0.05）（5）与移植了Apoe-/-BM细胞的Apoe-/-小鼠相比,移植Phactr1-/-Apoe-/-BM细胞的Apoe-/-小鼠的斑块更显着。富含脂质的坏死核的面积显着增加,纤维帽厚度相应减少,巨噬细胞负荷增加。（P<0.05）（6）移植Phactr1-/-Apoe-/-BM细胞的Apoe-/-小鼠,主动脉中TNF-α和IL-6的表达显着增加,血浆TNF-α和IL-6的水平升高。（P<0.05）（7）在存在ox-LDL的情况下,Phactr1的表达上调并在12小时达到峰值。ox-LDL至少部分通过Lox-1/NF-κB途径诱导巨噬细胞中Phactr1表达。（8）Phactr1的缺失显着促进BMDMs中M1巨噬细胞标志物如TNF-α和IL-6的表达,而M2表型标记物如Arg1和CD206的表达则显着降低。Phactr1-/-BMDMs中,M1巨噬细胞比例增加,而M2巨噬细胞比例则受到抑制。（P<0.05）（9）与Phactr1+/+BMDMs相比,Phactr1-/-BMDMs中的致动脉粥样硬化细胞因子水平更高,包括TNF-α,IL-6,RANTES,CCL2,IL-1β,IFN-γ以及M-CSF。Phactr1的沉默增强了ox-LDL诱导的这些细胞因子的表达。（P<0.05）（10）与Phactr1+/+BMDMs相比,Phactr1的缺失导致细胞内脂质含量显着增加。Phactr1-/-BMDMs中细胞内胆固醇含量明显高于Phactr1+/+BMDMs中的胆固醇水平。（P<0.05）（11）与Phactr1+/+BMDMs相比,Phactr1基因敲除导致BMDMs中LOX-1,SR-A和CD36的水平升高,而Phactr1基因敲除对ABCA1和ABCG1的表达没有明显影响。（P<0.05）（12）Phactr1和CREB在BMDM中直接相互作用。Phactr1和CREB之间的直接相互作用通过Flag-Phactr1和HA-CREB共转染的HEK293T细胞免疫共沉淀进一步证实。Phactr1过表达可增强CREB反应元件的活性。（P<0.05）（13）Phactr1-/-BMDMs中KLF4的表达降低。使用CREB抗体在KLF4启动子上进行的Ch IP-q PCR表明Phactr1敲除降低了CREB对BMDMs中KLF4启动子（片段1内的CREB结合基序）的结合。Phactr1过表达后HEK293T细胞中KLF4的转录活性显着增强。（P<0.05）（14）通过转导KLF4腺病毒（Ad-KLF4）来过表达KLF4可减少因Phactr1缺失诱导的M1表型标志物的表达,恢复M2表型标志物的表达。（P<0.05）（15）在Phactr1缺陷的BMDM中,KLF4过表达减轻了清道夫受体Lox-1,CD36和SR-A的增加趋势。（P<0.05）（16）KLF4上调显着降低了Phactr1-/-BMDM中细胞内胆固醇的含量。Ad-KLF4上调可减少因Phactr1缺乏所致的泡沫细胞的形成。油红色O染色区域的测量结果显示,与接受Phactr1-/-Apoe-/-BM的DKO(Phactr1-/-Apoe-/-)小鼠相比,接受KLF4δMC/Phactr1-/-Apoe-/-BM细胞的DKO小鼠斑块面积明显减少。（P<0.05）结论:（1）在小鼠动脉粥样硬化形成过程中巨噬细胞Phactr1表达增加。（2）Phactr1可抑制M1促炎表型,其减少可促进向易损斑块表型发展的速度,Phactr1可延缓动脉粥样硬化的进展。（3）Phactr1是巨噬细胞介导炎症、巨噬细胞极化以及泡沫细胞形成的关键因素。（4）KLF4过表达能够部分抵消因Phactr1缺乏对动脉粥样硬化斑块的加剧作用。
谷文[5]（2021）在《基于蛋白质羰基化对蛋白氧化损伤与功能受损程度的评估及其应用价值》文中研究表明背景:蛋白质羰基化是一种通过在氧化损伤过程中,表现出蛋白质结构功能的一种不可逆性的氧化应激和损伤,一般表现为蛋白质侧链氨基酸残基受到的氧化损伤形成蛋白质羰基化不可逆性损伤。测定蛋白质羰基化的含量的目的是准确对蛋白质氧化损伤与功能损伤程度进行评估,探索蛋白质氧化损伤与功能的关系。方法:1.选取巴氏储存的新鲜牛乳5例样本,每个样本做3个平行样本。按照温度和不同保存方式分为以下几组,室温保存样本组（每4个小时测定一次样本测定到24小时一共7组样本）、室温真空样本组（每4个小时测定一次样本测定到24小时一共7组样本）、室温加入抗菌素的牛乳样本组（每4个小时测定一次样本测定到24小时一共7组样本）、冷冻-20℃状态下反复冻融样本组（反复冻融循环5次样本一共5组）、冷冻-20℃状态下真空保存反复冻融样本组（反复冻融循环5次样本一共5组）。室温状态的3个样本组,以室温保存样本组作为对照,分别通过蛋白质羰基化含量化学法测定来与室温对照组结果进行比较。-20℃冻融循环的2个样本组以通过冷冻-20℃状态下反复冻融样本组作为对照,进行与-20℃真空样本组蛋白质羰基化含量测定结果比较。采集不同温度25℃、4℃、-20℃、-80℃状态下,新鲜牛乳样本按照不同温度梯度进行反复冻融样本,分别为按照温度梯度速冻速溶样本、按照温度梯度慢冻速溶样本、按照温度梯度速冻慢溶样本、按照温度梯度慢冻慢溶样本以及-20℃反复冻融样本,来测定蛋白质羰基化含量。基于研究发现构建羰基化实验模型。2.选取22例2019年体检者血清样本、22例2012年陈旧体检者血清样本以及冻融氧化损伤模型22例体检者血清样本,采用临床生化检测方法测定肝脏功能测定指标、糖代谢功能测定指标、心肌功能测定指标、肾脏功能测定指标进行检测。比较2019年体检者血清与2012年体检者血清生化数据、体检者血清与经模型氧化损伤（冻融）羰基化模型体检者血清生化数据以及两组生化指标和蛋白质羰基化含量,比较差异性和共同性来评估模型建立的可行性。3.基于蛋白质氧化损伤羰基化模型的建立,在以酶联免疫实验中的乙肝抗体检测实验（双抗原夹心ELISA检测）,ELISA酶标抗体和待测抗体血清样本以及正常抗体血清样本和正常酶标抗体进行组合,4种组合状态分别是酶标抗体与待测血清样本（组合1）、羰基化损伤酶标抗体与待测血清样本（组合2）、羰基化损伤酶标抗体与羰基化损伤待测血清样本（组合3）、酶标抗体与羰基化损伤待测血清样本（组合4）。以检测所得ELISA抗体含量和蛋白质羰基化含量作为比较各组ELISA羰基化损伤程度指标。根据比较各组ELISA结果和蛋白质羰基化含量结果,并对经过氧化损伤模型和正常测定组合进行比较,然后用配对检验分析,分析模型对酶标抗体和待测血清氧化损伤的损伤程度比较。4.基于蛋白质氧化损伤羰基化模型的建立,通过测定PCR和RT-PCR实验方法,采用经氧化损伤模型的试剂盒Taq酶和待测人DNA提取物样本以及正常试剂盒的Taq酶和待测人DNA提取物样本进行组合,有Taq酶与待测血清样本、羰基化损伤Taq酶与待测血清样本、羰基化损伤Taq酶与羰基化损伤待测血清样本、Taq酶与羰基化损伤待测血清样本四种组合。通过PCR定性实验与RT-PCR定量实验检测结果,根据比较各组数据结果,并对经过氧化损伤模型和正常测定组合进行配对分析,进而分析模型造成的氧化损伤对待测人DNA提取物和Taq酶结果的影响。结果:1.通过以室温状态牛乳作为对照组,放置真空和抗菌素牛奶作为实验组,进行蛋白质羰基化含量测定,室温状态牛乳样本、真空室温状态牛乳样本、抗生素室温状态牛乳样本都随着时间增加呈上升趋势,蛋白质羰基化含量逐渐增加。在室温状态下放置的牛奶在0、4、8、12、16、20和24小时时,蛋白质羰基化含量均值分别为9.58、10.14、18.28、28.09、54.38、77.84和127.28μmol/g。通过样本中蛋白质羰基化含量比较,表明蛋白质羰基化含量的增加是由于蛋白质的氧化损伤而不是细菌的生长,会在无菌条件下降低牛奶的质量。通过进行真空处理于延长牛奶的无菌新鲜度程度,发现牛奶无菌新鲜度与蛋白质羰基化有关。在室温状态下,在0、4、8、12、16、20和24小时分别为含抗生素的牛奶的蛋白质羰基化含量均值为8.37、12.94、14.08、22.87、32.00、73.83和89.78μmol/g,而不含抗生素的牛奶的蛋白质羰基化含量均值为9.58、10.14、18.28、28.09、54.38、77.84和127.28μmol/g。在16和24小时观察中（32.00与54.38μmol/g）有显着差异（89.78与127.28μmol/g）。在室温放置第8小时加入抗菌素抑菌状态条件下,蛋白质羰基化含量指标含量与未加入抗菌素的普通巴氏牛奶相比,随着放置时间延长,蛋白质羰基化含量也随之延长,有无链青霉素抗菌素对牛奶蛋白质羰基化氧化程度开始出现差异,虽然蛋白质羰基化含量都在增加,但是加入抗菌素的新鲜巴氏牛奶的蛋白质羰基化含量一直比室温放置新鲜巴氏牛奶的蛋白质羰基化含量少。当温度保持在-20℃低温无菌状态下,真空样品的蛋白质羰基化含量为14.47、23.39、31.63、43.63、50.33和52.18μmol/g,而非真空样品的蛋白质羰基化含量为14.56、26.17、55.22、89.24、110.21和182.88μmol/g。真空存储方法的结果与非真空储存的结果前2次冻融循环次数时数值差异不大,但显示出真空比非真空方法有更好的稳定性,后3次循环显示出数值差异度较大。在第3、第4次出现了显着差异,在第5次冻融循环出现最大差异值即分别为43.63 vs 89.24、50.33 vs 110.21和52.18 vs 182.88μmol/g。在不同的冷冻条件下,以-20℃的普通冷冻保存为对照组,在ANOVA方差数据分析结果中,表明P<0.001（具有统计学差异性意义）。因此,在无菌低温条件下的慢速冷冻影响蛋白质的羰基化含量,表示慢速冷冻中冷冻保存的无菌状态显示出显着差异。2.采用新鲜体检者血清、陈旧体检者血清、经过蛋白质羰基化氧化损伤模型（冻融）的新鲜血清进行样本比较。通过采用独立样本t检验进行数据统计学分析。新鲜血清样本与其未进行反复冻融对照组血清共同进行的蛋白质羰基化含量检测。通过蛋白质羰基化氧化损伤机制进行冻融循环分析两组样本各11例,进行反复测量取均值测定蛋白质羰基化含量。以新鲜血清样本作为对照组,经过冻融循环的冻融样本为实验组。实验组和对照组均值分别为2.545和1.965μmol/g,表明经过冻融循环蛋白质羰基化含量与新鲜待测血清样本羰基化蛋白质含量相比含量增加。经统计学分析,待测样本冻融组与健康对照组的蛋白质羰基化含量的组间比较,具有显着统计学差异（P<0.001）,反复冻融体检患者的蛋白质羰基化含量浓度显着高于健康对照具有差异性。2012年与2019年待测血清样本羰基化含量经过多次测量取均值后为2.551与1.450μmol/g,2012年陈旧血清羰基化蛋白质含量比2019年羰基化蛋白质含量多,经统计学分析,待测样本蛋白质羰基化含量的组间比较,P<0.001,具有显着差异,2012年体检者的蛋白质羰基化含量显着高于2019年体检对照组,可认为2012年体检者血清蛋白质羰基化氧化损伤高于2019年体检者对照组。蛋白质羰基化含量以及临床生化酶类检测指标（丙氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶）和一些临床生化检测蛋白质指标（总蛋白、总胆红素、高密度脂蛋白）,都具有统计学的差异性P<0.05,表明冻融实验生化指标发生改变和陈旧血清实验生化指标发生改变具有吻合性,得出14项生化检测项目中:均无差异性的生化项目有4项,吻合率为100%;都分别具有差异性的生化指标有10项,有6项完全吻合,吻合率为60%,均有差异性和都无差异性的差异率数据可知,平均吻合率为80%。为氧化损伤损伤模型提供生化指标检测提供数据支撑。3.基于氧化损伤羰基化损伤模型的建立,经过蛋白质羰基化冻融模型的待测血清抗体与正常新鲜待测血清抗体各40例样本,进行分析经过配对样本t检验分析,羰基化损伤抗体组和对照抗体组的均值分别为为0.822与0.581,P<0.05（0.040）具有统计学差异,二者具有一定的统计学差异性,冻融血清抗体与正常血清抗体测定抗体吸光度值存在差异性。双抗原夹心测定通过蛋白质羰基化模型冻融的试剂盒标准酶标结合物和试剂盒正常酶标结合物两组双抗原夹心法测定实验进行配对分析,两组冻融标准酶标结合物组和不冻融正常标准酶结合物组,每组40例样本一共80例,均值分别是0.902和0.501,P值为<0.001具有统计学差异,说明二者具有一定差异性。将两个冻融因素进行组合可以得到6种组合分别是正常酶标结合物+正常血清抗体标本组与反复冻融酶标结合物+反复冻融血清抗体标本组配对比较（组合1）、正常酶标结合物+反复冻融血清抗体标本组与反复冻融酶标结合物+反复冻融血清抗体标本组配对比较（组合2）、正常酶标结合物+反复冻融血清抗体标本组与反复冻融酶标结合物+正常血清抗体标本组配对比较（组合3）、反复冻融酶标结合物+正常血清抗体标本组与反复冻融酶标结合物+反复冻融血清抗体标本组配对比较（组合4）、正常酶标结合物+正常血清抗体标本组与反复冻融酶标结合物+正常血清抗体标本组配对比较（组合5）、正常酶标结合物+正常血清抗体标本组与正常酶标结合物+反复冻融血清抗体标本组配对比较（组合6）,经统计学分析,蛋白质羰基化含量在组间比较具有统计学差异（P<0.05）（P值分别为0.006、0.009、0.002、0.011、0.000、0.001）。同时进行两因素冻融组与对照组进行结果分析,试剂盒标准酶结合物和血清中的抗体标本通过是否冻融因素分析二者之间关联性,经过配对样本Independent Samples Test进行数据分析试剂盒标准酶经过冻融羰基化分析P值<0.05（P=0.004）具有统计学差异,二者之间存在相关性。而抗体经过冻融羰基化分析P值为0.069>0.05不具有统计学差异,证明冻融抗体蛋白质不可逆性损伤可能不会对实验结果造成影响。4.基于氧化损伤模型的建立,通过定量实验角度来判断实验的可行性,为了进一步探讨蛋白质羰基化造成对荧光实时定量PCR试剂盒中的Taq酶的影响,通过单因素独立样本t检验分析,分别为正常Taq酶组、经过蛋白质羰基化模型冻融的Taq酶组,两组各有样本12例一共24例,两组均值分别为0.745和0.075,P值为<0.001,具有统计学意义。同时,为了进一步探讨蛋白质羰基化的测定结果是否由于荧光实时定量PCR测定中的人基因组DNA提取物造成,通过进行单因素独立样本t检验分析,人基因组DNA提取物通过蛋白质羰基化模型是否进行模型（冻融）进行分组,分别是未经过模型（冻融）的正常人基因组DNA提取物组和经过蛋白质羰基化模型冻融的人基因组DNA提取物组。两组样本各12例一共24例,均值分别为0.565和0.265,P值为<0.001,具有统计学意义。说明通过蛋白质羰基化模型冻融后的人基因组DNA提取物可能会出现损伤,进而影响实验结果。结论:1.无菌新鲜度概念的提出,表明无菌新鲜度与蛋白质羰基化有关,通过测定蛋白质羰基化含量检测判断无菌新鲜度程度,真空状态可在一定程度上保持延长无菌新鲜度状态。冻融次数增加加速无菌新鲜度的降低,逐渐降低冻存（缓慢冻存）对样本危害性大,冻存方式对无菌新鲜度有一定影响。2.以蛋白质反复冻融技术为基础,应用化学法测定蛋白质羰基化技术检测蛋白质氧化损伤能力建立冻融羰基化模型,表明实验建立蛋白质羰基化模型成功。同时,表明羰基化对血脂类生化检测指标和一些酶类功能生化检测指标有影响,对糖代谢类检测指标、肾脏生化类检测指标影响较小。3.对体检者抗体与标准蛋白酶的蛋白质羰基化损伤能力进行了检测,蛋白质羰基化对机体的免疫功能在抗体水平具有较小影响,对标准蛋白质酶类的蛋白质损伤影响较大。4.羰基化蛋白质对PCR和RT-PCR实验中的Taq酶有显着影响,同时氧化损伤DNA提取物也可能会对实验结果造成一定影响。DNA的损伤机制应进一步探讨。
郭丹郡[6]（2020）在《基于CaSR及Wnt/β-catenin信号通路的鸭蛋蛋清肽促钙吸收及促骨合成活性及机制研究》文中认为缺钙是全球范围内常见的健康问题,且随着社会人口老龄化日趋严重,骨质疏松症也日益成为重要的公共健康问题。本实验前期研究发现鸭蛋蛋清肽（Desalted duck egg white peptides,DPs）及蛋清源四肽VSEE在体内外实验模型中均具有良好的促钙吸收作用,其主要是通过激活TRPV6钙离子通道促进钙吸收的。然而对于钙敏感受体（Calcium sensing receptor,Ca SR）是否是DPs的另一作用靶标,以及DPs和VSEE是否能直接影响骨合成代谢尚不明确。本文采用阴离子交换柱、HPLC-ESI/MS/MS、分子对接虚拟筛选技术和在体小肠单向灌流法（Single-pass intestinal perfusion,SPIP）,考察了Ca SR是否介导DPs对肠钙吸收的调控作用,以期更全面地诠释鸭蛋蛋清肽的促钙吸收机理。此外,本文通过MC3T3-E1细胞和去势大鼠骨质疏松模型,并结合钙离子荧光探针技术、分子生物学手段、Micro CT分析、组织学观察等方法,将DPs促钙吸收研究拓展到促进骨合成研究,并对其相关机理进行了探究。同时,本文采用体外模拟胃肠道消化试验、Caco-2/HT-29共培养模型、药物代谢动力学试验,考察了VSEE的体外稳定性、转运吸收和相关机制,以及药物代谢动力学特征和代谢稳定性,旨在为VSEE未来的应用和开发上提供理论依据。本文主要研究结果如下:1.正构调节钙敏感受体鸭蛋蛋清肽的筛选与鉴定采用阴离子交换柱对DPs进行初步的分离纯化,筛选出具有高可溶性钙结合活性的组分（F3）,并对F3进行HPLC-ESI-MS/MS分析,解析出49条肽段,其中包含16条含有芳香族氨基酸的肽段。采用分子对接虚拟筛选技术对这16条肽段与Ca SR蛋白的亲和力进行预测,根据Total score打分从中选取了FAE、FNE、INSW、FDPE和NFE进行后续实验。在体小肠单向灌流实验结果表明:INSW和NFE能显着降低由NPS-2143引起的甲状旁腺激素（Parathyroid hormone,PTH）水平升高（P<0.05）,抑制率分别为45.80%和48.81%,并能显着提高小肠钙吸收百分比、吸收速率常数（Ka）和有效渗透系数（Peff）,显着上调十二指肠上Ca SR基因表达量（P<0.05）。此外,分子对接结果表明这两条肽段均能很好地进入Ca SR蛋白的活性口袋,并占据活性中心,其主要结合作用力为氢键作用和疏水相互作用,结合位点位于Ca SR蛋白的捕虫夹结构域（Venus flytrap domain,VFTD）,与芳香族氨基酸结合位点类似。2.DPs及VSEE对MC3T3-E1增殖、分化和矿化的影响及相关机制研究DPs（0.8-10mg/m L）和VSEE（0.2-2m M）在含或不含4m M Ca Cl2下分别处理前成骨细胞MC3T3-E15天和7天后发现,细胞增殖率均显着增加,并显着提高MC3T3-E1细胞在S期的比例（P<0.05）。DPs和VSEE在含/不含4m M Ca Cl2下分别处理MC3T3-E1细胞均能显着提高其碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）活性（P<0.05）,促进矿化结节的产生;DPs/VSEE+4m M Ca Cl2组的效果均优于相同浓度但不添加Ca Cl2处理组。此外,DPs、VSEE能显着上调Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白（Wnt3a、LRP5、β-catenin）表达量,以及相关下游蛋白Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2,Runx2）、骨保护素（Osteoprotegerin,OPG）蛋白的表达水平（P<0.05）,继而促进MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化。此外,在[Ca2+]i为2m M时,DPs能激活L-型钙离子通道,对促进MC3T3-E1细胞“外钙内流”有部分贡献;VSEE能诱导MC3T3-E1细胞内钙库中钙离子的释放,同时能激活L-型钙离子通道,且其促进细胞“外钙内流”的能力较DPs大幅提升。VSEE促MC3T3-E1细胞分化、矿化的构效关系研究结果表明,VSEE的酸性氨基酸簇“EE”对于MC3T3-E1细胞分化和矿化有重要的贡献;四肽氮端为“V”对MC3T3-E1分化和矿化的促进作用优于氮端为“A”;VSEE的丝氨酸“S”磷酸化后,其对MC3T3-E1细胞分化和矿化也具有明显的促进作用,但若外源添加钙离子时,则还需考虑钙磷比对骨形成的影响。3.VSEE体内外消化、吸收和代谢研究VSEE分别在37-100℃和p H 4-10下处理后,其含量均能保持在95%以上,VSEE先后经过胃蛋白酶和胰蛋白酶共同作用后,其含量仍能保持在80%以上;提示VSEE具有较高的体外稳定性,同时对消化酶也具有较高的耐受性。在Caco-2/HT-29细胞共培养模型中,VSEE的最优转运条件为转运时间2h和浓度0.5mmol/L,其转运量可达到16.51%;此外,VSEE是通过细胞旁路转运和小肽转运蛋白1（Peptide transporter 1,Pep T1）两种途径转运吸收的。药物代谢动力学研究发现,VSEE的血药浓度经时曲线符合1/C2权重的二室模型,其在大鼠体内的表观分布容积较小（1.17±0.15 L/kg）,但滞留时间（76.05±1.11 min）和半衰期（57.0±0.42 min）较长;提示VSEE脂溶性较差,但具有较好的稳定性,在体内不易被降解。4.鸭蛋蛋清肽对去势大鼠骨质疏松及脂质代谢紊乱的干预作用及机理研究在去势大鼠骨质疏松模型中,DPs和VSEE能显着降低血清中骨转换标志物ALP、I型原胶原N端前肽（N-terminal propeptide of type I procollagen,PINP）、I型胶原羟基端肽β降解产物（Cross-linked C-terminal telopeptide,β-CTX）水平（P<0.05）,显着提高股骨与胫骨干重指数和骨钙含量（P<0.05）;DPs和VSEE也可以有效地改善去势大鼠股骨与胫骨的生物力学性能,减轻骨微结构的破坏,增加骨小梁数量。同时,DPs和VSEE能显着上调骨骼中Wnt3a、LRP-5、β-catenin以及小肠中occludin、claudin-3蛋白的表达量（P<0.05）,也能显着改善肠道微生物种类组成和比例（P<0.05）。此外,DPs和VSEE能显着降低血清中总胆固醇（Total cholesterol,TC）、甘油三酯（Triglyceride,TG）、低密度脂蛋白胆固醇（Low density lipoprotein cholesterin,LDL-C）水平（P<0.05）,显着升高高密度脂蛋白胆固醇（High density lipoprotein cholesterin,HDL-C）水平（P<0.05）,且明显地减少脂肪细胞大小,减少肝脏组织中脂肪滴聚集。综上所述,DPs和VSEE能通过改善去势大鼠的小肠屏障功能、肠道微生物群落的结构,激活骨代谢和脂质代谢交叉信号通路——Wnt/β-catenin信号通路,进而对雌激素水平降低引起的骨质疏松症和伴随而来的脂质代谢紊乱有明显的改善作用。
付艺[7]（2020）在《JAML在糖尿病肾病足细胞脂质代谢稳态失衡中的作用及机制》文中进行了进一步梳理足细胞是一种高度分化的肾小球上皮细胞,是维持肾小球滤过屏障结构和功能正常的重要组成部分。足细胞损伤是导致糖尿病肾病（diabetic kidney disease,DKD）、局灶性节段性肾小球硬化症（focal segmental glomurular sclerosis,FSGS）、膜性肾病（membranousnephropathy,MN）和微小病变肾病（Minimal-changedisease,MCD）等肾小球疾病的重要原因。尽管目前对于足细胞损伤的机制研究取得了一定的进展,但在临床治疗中仍然缺乏特异性的有效策略。越来越多的研究表明,肾脏足细胞区域内脂代谢稳态失衡是导致糖尿病肾病等肾小球疾病发生发展的主要机制,并已成为目前本领域的研究热点。JAML（junctional adhesion molecule-like protein,Amical,连接粘附分子样蛋白）是JAMs家族中新发现的一个成员,属于分泌性的I型跨膜糖蛋白。以往研究表明JAML主要分布于各种固有免疫和适应性免疫细胞中,在免疫、炎症和组织稳态中发挥重要作用。近期发现,它在内皮细胞和上皮细胞中也有表达,当细胞受损伤刺激后,JAML的表达水平可明显上调。本研究我们首次发现了JAML可介导足细胞的脂质代谢稳态调控。发现在DKD和其他肾小球疾病患者肾脏中JAML的表达显着升高,并与脂质过度沉积和肾小球滤过率降低有关。进一步实验发现,足细胞特异性敲除JAML可以明显改善DKD和阿霉素诱导的FSGS小鼠的足细胞损伤和脂代谢紊乱。在机制上,JAML通过调控Sirtl/AMPK信号通路,调节转录因子SREBP1及其下游与脂肪酸、胆固醇合成相关的靶基因,从而调控足细胞的脂质代谢。本研究进一步发展和充实了对JAML生物学功能的新认识,并为DKD等肾小球疾病的防治提供了新的靶点和思路,具有重要的理论意义和潜在的应用价值。研究目的（1）探究新型连接粘附分子样蛋白JAML在糖尿病肾病等肾小球疾病中的表达情况。（2）阐明JAML在糖尿病肾病肾小球损伤及足细胞脂质代谢紊乱中的作用。（3）探讨JAML在糖尿病肾病足细胞脂代谢紊乱中的作用机制,为阐明DKD足细胞损伤的信号转导机制增加新的研究基础,并为临床探索有效延缓DKD进展的干预策略提供新的思路。研究方法第一部分:JAML在糖尿病肾病中的表达模式1.1检测临床病人血清和肾组织标本中JAML的表达情况（1）收集DKD患者（病理学分型Ⅱ型～Ⅳ型）及其他伴有蛋白尿的肾小球疾病包括FSGS、MCD及MN患者的血清和肾穿刺活检标本的病理切片。（2）记录患者的血肌酐（SCr）、估算的肾小球滤过率（eGFR）和24小时尿蛋白定量等临床化验指标。（3）酶联免疫法（ELISA）检测患者血清中JAML的水平。（4）免疫组化染色检测JAML在肾脏中的分布和表达变化。（5）分析DKD患者不同病理学分型（病理损伤严重程度不同）JAML的表达水平与损伤严重程度的关系;分析肾脏中JAML表达水平与SCr,eGFR和24小时尿蛋白定量的相关性。1.2糖尿病肾病动物模型中JAML表达变化（1）构建DKD动物模型:①自发性2型糖尿病db/db（BKS）小鼠模型:杂合子BKS db小鼠（db/m小鼠）进行自交可获得纯合子小鼠（db/db小鼠）,以db/m小鼠作为阴性对照。20周雄性小鼠留取血清及肾脏标本。②低浓度STZ联合HFD制备小鼠模型:6周龄健康雄性C57BL/6J小鼠给予“高脂饮食”（high fat diet,HFD）4周,单肾摘除后1周后连续3天小鼠腹腔注射低剂量链脲佐菌素（STZ,50mg/kg）,继续高脂饮食喂养约12周留取肾脏标本。（2）ELISA法检测小鼠血清中JAML的水平。（3）检测肾脏中JAML的表达与定位情况:①RT-qPCR和Western blot检测肾皮质中JAML的mRNA和蛋白表达水平。②免疫组化染色检测JAML在肾脏中的分布和表达变化。③JAML和足细胞标志蛋白Synaptopodin免疫荧光双标,激光共聚焦技术观察肾小球中JAML的细胞定位和表达变化。1.3体外模拟糖尿病肾病条件检测足细胞中JAML的表达变化（1）体外模拟DKD条件建立细胞损伤模型:分别采用高糖（highglucose,HG）、糖基化终末产物（advanced glycation end products,AGEs）、棕榈酸（palmitic acid,PA）、胆固醇（cholesterol）、氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein,ox-LDL）以及 DKD 患者血清处理足细胞（mouse podocyte,MPC）,Western blot检测JAML蛋白水平变化。（2）给予HG及PA处理肾脏其他固有细胞包括肾小球内皮细胞（glomerular endothelial cell,GECs）、系膜细胞（ratmesangial cell,RMCs）及肾小管上皮细胞（human kidney 2,HK-2）,Western blot 实验检测 JAML 蛋白水平变化。1.4局灶性节段性肾小球硬化模型中JAML的表达变化（1）动物模型构建:为了验证JAML在足细胞中的作用是否具有广泛意义,给小鼠尾静脉注射阿霉素（adriamycin,ADR）（12 mg/kg）构建FSGS模型,于第5、10周取材。（2）Western blot和免疫组化染色验证JAML表达情况。（3）体外用 ADR（0.15μg/ml）刺激足细胞 24h,Western blot 及 RT-qPCR 检测JAML表达变化。第二部分:JAML在糖尿病肾病足细胞损伤中的作用2.1构建JAML足细胞特异性敲除小鼠的DKD模型（1）动物模型构建:采用Cre-Loxp重组系统制备Jaml-loxp（Jamlflox/+）小鼠,并与足细胞-Cre（Podocin-Cre）小鼠进行杂交,获得足细胞特异性JAML敲除 Podocin-Cre+/Jamlfl/fl简写为 Cre+/Jamlfl/fl)小鼠。构建 STZ/HFD 诱导的Cre+/Jamlfl/fl小鼠DKD模型。另外,将Cre+/Jamlfl/fl小鼠与db/m小鼠进行杂交,最终获得足细胞特异性JAML基因敲除db/db（db/db//Cre+/Jamlfl/fl）小鼠。（2）提取鼠尾DNA鉴定小鼠基因型（3）验证JAML在足细胞中的敲除效率:①JAML与Synaptopodin免疫荧光共定位;②用免疫磁珠法分离肾小球,Western blot检测Cre+/Jamlfl/fl及其对照组小鼠肾小球中JAML蛋白水平。2.2足细胞JAML缺失可减轻糖尿病肾病肾脏损伤2.2.1足细胞特异性敲除JAML可改善糖尿病肾病足细胞损伤、减轻蛋白尿（1）检测肾大体形态、血生化和肾功能等基本指标包括体重、肾重、血压、心率、尿白蛋白/肌酐比、空腹血糖、血脂等。（2）过碘酸雪夫氏染色（PAS）染色检测肾小球形态变化和硬化程度。（3）应用透射电镜观察足突数量、足突融合、基底膜厚度等。（4）免疫荧光染色足细胞损伤后的标志性分子包括肾小球足细胞裂孔隔膜蛋白Podocin和Nephrin。2.2.2足细胞特异性敲除JAML可减轻肾小球炎症反应分离STZ/HFD诱导的DKD及对照组小鼠肾小球,通过RT-qPCR检测肾小球中的炎症因子白介素-6（IL-6）、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达变化。2.2.3足细胞中JAML基因沉默可改善高糖诱导的足细胞损伤利用慢病毒转染技术沉默足细胞中的JAML。（1）Western blot实验验证JAML沉默效率。（2）采用高糖（40mmol/L）刺激足细胞24h,RT-qPCR检测炎症因子变化。（3）流式细胞术检测足细胞死亡情况。（4）F-actin荧光染色激光共聚焦观察足细胞骨架重排。2.3足细胞JAML缺失可以减轻糖尿病肾病肾小球及足细胞内的脂质沉积2.3.1足细胞特异性敲除JAML可改善糖尿病肾病小鼠肾小球及足细胞内的脂质沉积。（1）肾脏组织冰冻切片进行油红O染色,检测两种模型小鼠肾小球的中性脂质沉积。（2）利用免疫荧光双标技术,synaptopodin标记足细胞、adipophilin标记脂滴,激光共聚焦观察肾脏足细胞中脂滴的沉积。2.3.2 JAML基因沉默可改善高糖诱导的足细胞脂质沉积利用慢病毒转染技术沉默足细胞中的JAML。（1）足细胞给予高糖（40mmol/L）刺激24h,以油红O染色和Nile Red荧光染色检测足细胞内的脂滴形成。（2）利用超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）技术进行足细胞脂质组学定量分析。2.3.3肾小球疾病患者肾活检样本中JAML与脂滴蓄积程度的相关性分析有研究表明,DKD、FSGS、MCD和MN的发病机制都与脂代谢紊乱密切相关。应用DKD、FSGS、MCD和MN患者肾活检样本的病理切片进行脂滴相关蛋白Adipophilin的免疫组化染色,分析肾脏中JAML表达水平与脂滴蓄积程度的相关性。2.4 JAML在局灶性节段性肾小球硬化足细胞脂代谢紊乱中的作用（1）采用Cre+/Jaml+/+和Cre+/Jamlfl/fl小鼠构建ADR模型,检测尿白蛋白肌酐比,PAS染色及TEM检测动物模型中肾脏形态学变化。（2）体外实验中,用ADR（0.15μg/ml）刺激足细胞24h,油红O染色检测足细胞中脂质沉积及基因沉默JAML对脂质沉积的影响。第三部分JAML在糖尿病肾病足细胞脂代谢稳态失衡中的作用机制3.1足细胞内JAML调控Sirt1的表达变化考虑到sirtuins是调节代谢、维持脂质和葡萄糖稳态的“主开关”,我们进一步检测了 sirtuins家族在DKD小鼠及足细胞中的表达变化,以及是否受JAML的调控。（1）Western blot检测SIRTs家族各亚型（Sirt1-7）在肾皮质中的蛋白水平变化。（2）免疫荧光双标SIRT1与足细胞标志蛋白Synaptopodin观察肾小球足细胞中SIRT1的表达变化。（3）体外实验中,用高糖（40mmol/L）刺激足细胞24h,Western blot检测Sirtl蛋白表达变化。同时,利用慢病毒转染过表达JAML检测Sirt1蛋白水平。3.2 JAML通过Sirt1调控AMPK的磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）是Sirt1信号通路重要的代谢整合因子,在细胞代谢和线粒体功能的调节和Sirt1有相似之处,所以我们进一步检测了 AMPK的活性。（1）Western blot检测肾皮质中p-AMPKα和AMPKα蛋白变化,验证JAML对AMPK磷酸化的调控。（2）利用JAML shRNA慢病毒转染足细胞沉默JAML,并同时转染Sirtl的小干扰RNA沉默Sirt1基因,检测高糖处理的足细胞中AMPK磷酸化的变化。3.3 JAML-Sirt1信号通路调控转录因子SREBP1及其下游靶基因的表达3.3.1利用转录组测序技术分析JAML下游信号通路安捷伦全基因组寡核苷酸测序用于分析组间差异表达基因,检测JAML基因沉默对高糖诱导的足细胞内下游基因的影响。3.3.2 JAML调控SREBP1及其下游信号通路（1）RT-qPCR验证足细胞中Srebp1,Srebp2及其下游靶基因如脂肪酸合成相关基因（Fasn,Acaca,Scd1）,胆固醇合成相关基因（Sqle）的mRNA水平变化。（2）Western blot 检测肾皮质 mSREBP1,FASN,ACC1,SCD1,SQLE 的蛋白表达。（3）RT-qPCR验证肾小球中Srebp1,Srebp2的mRNA水平。（4）Western blot检测肾小球中成熟体mSREBP1的蛋白表达变化。3.4 JAML-Sirt1-AMPK信号通路调控SREBP1的表达为了明确JAML是否通过Sirt1、AMPK调控SREBP1的表达,我们同时沉默足细胞中的JAML和Sirt1或者AMPK,给予高糖刺激后,Western blot检测成熟体mSREBP1的表达变化。3.5阿霉素诱导的足细胞损伤模型中JAML对Sirt1-AMPK-SREBP1信号通路的作用。慢病毒转染JAML shRNA的足细胞系,用ADR（0.15μg/ml）处理,,Western blot检测Sirt1、p-AMPKα及mSREBP1的表达变化。研究结果第一部分:JAML在糖尿病肾病中的表达模式1.1临床病人血清和肾组织标本检测JAML的表达情况（1）ELISA检测发现与健康受试者血清样本相比,DKD患者血清中JAML水平显着升高。（2）肾活检样本免疫组织化学结果显示,DKD、FSGS、MN和MCD患者的肾小球中JAML表达显着增加。（3）DKD患者肾小球中JAML表达水平与肾脏损伤严重程度呈正相关（4）在所有伴有蛋白尿的肾小球疾病患者的肾小球中JAML表达与血肌酐呈正相关,与eGFR呈负相关,而与24小时尿蛋白无相关性。1.2糖尿病肾病动物模型中JAML的表达变化（1）ELISA结果显示,db/db小鼠和STZ/HFD诱导的DKD小鼠血清中JAML含量显着升高。（2）Western blot、RT-qPCR及免疫组化结果显示,db/db小鼠和STZ/HFD诱导的DKD小鼠肾皮质中JAML的mRNA水平及蛋白表达均显着增多,且主要集中在肾小球。（3）JAML与Synaptopodin免疫荧光共定位结果显示,db/db小鼠足细胞中JAML表达显着升高。1.3体外模拟糖尿病肾病条件检测足细胞中JAML的表达变化HG、AGE、PA、胆固醇、ox-LDL以及DKD患者血清均可诱导足细胞内JAML的表达显着升高。然而,用HG刺激肾小球内皮细胞和系膜细胞,JAML未发生明显变化。1.4局灶性节段性肾小球硬化模型中JAML的表达变化（1）Western blot及免疫组化结果显示,ADR模型第5周JAML变化不显着,而第10周表达显着增加。（2）ADR刺激足细胞,JAML mRNA及蛋白表达均升高。第二部分:JAML在糖尿病肾病足细胞损伤中的作用2.1构建JAML足细胞特异性敲除小鼠的DKD模型（1）提取鼠尾DNA鉴定小鼠基因型,结果显示,Cre+/Jamlfl/fl即为足细胞Cre阳性且具有纯合Loxp-JAML小鼠,理论上可实现足细胞中特异性敲除JAML。（2）JAML与Synaptopodin免疫荧光双标共定位,发现足细胞中JAML表达水平显着降低。（3）免疫磁珠法分离肾小球,光学显微镜下观察具有代表性的肾小球样品纯度大于98%,肾小球样品纯度高且未被肾小管碎片污染。Western blot检测结果显示,Cre+/Jamlfl/fl小鼠肾小球中JAML蛋白表达降低,进一步证实JAML足细胞特异性敲除小鼠构建成功。2.2足细胞JAML缺失可减轻糖尿病肾病肾脏损伤2.2.1足细胞特异性敲除JAML可改善糖尿病肾病足细胞损伤、减轻蛋白尿（1）与正常对照组小鼠相比,STZ/HFD模型小鼠血糖、甘油三酯、胆固醇、高密度脂蛋白显着升高,体重降低,肾重体重比增加,而心率、血压未出现显着变化。JAML足细胞特异性敲除小鼠血压、心率未出现显着变化。STZ/HFD诱导的Cre+/Jamlfl/fl小鼠的尿白蛋白排泄明显减轻。（2）在2型DKD模型中,与db/+小鼠相比,db/db小鼠血糖、甘油三酯、胆固醇、高密度脂蛋白以及低密度脂蛋白显着升高,体重显着增加,而心率、血压无显着变化。而JAML足细胞特异性敲除的db/db小鼠以上生理生化指标无显着差异。从12周龄开始,db/db//Cre+/Jamlfl/fl小鼠尿蛋白显着降低,杂合基因型db/db//Cre +/Jamlfl/+小鼠尿蛋白也有所缓解。（3）DKD小鼠形态学实验显示,Cre+/Jamlfl/fl模型小鼠显着缓解肾小球系膜基质增生,基底膜增厚、足突数量减少及足突宽度增加,而杂合基因型db/db//Cre+/Jamlfl/+小鼠肾脏损伤也部分改善。（4）JAML足细胞特异性敲除小鼠显着恢复Nephrin和Podocin表达,杂合基因型小鼠db/db//Cre+/Jamlfl/+也能够部分改善Nephrin和Podocin损伤。2.2.2足细胞特异性敲除JAML可减轻肾小球炎症反应RT-qPCR检测结果表明,足细胞特异性敲除JAML可抑制STZ/HFD诱导的DKD小鼠肾小球中炎症因子IL-6、ICAM-1、MCP-1、TNF-α的表达升高。2.2.3足细胞中JAML基因沉默可改善高糖诱导的足细胞损伤JAML基因沉默明显减轻HG诱导的足细胞中炎症因子IL-6、ICAM-1、MCP-1、TNF-α的表达;减轻足细胞死亡和改善足细胞骨架重排。2.3足细胞JAML缺失可以减轻糖尿病肾病肾小球及足细胞内的脂质沉积2.3.1足细胞特异性敲除JAML可改善糖尿病肾病小鼠肾小球及足细胞内的脂质沉积。（1）油红O染色结果显示,足细胞特异性敲除JAML可减轻DKD小鼠肾小球中脂质沉积。（2）免疫荧光标记Adipophilin和Synaptopodin,结果表明,足细胞特异性敲除JAML可显着减少DKD小鼠的足细胞内脂质沉积。2.3.2 JAML基因沉默可改善高糖诱导的足细胞脂质沉积（1）油红O染色和Nile Red荧光染色结果显示,HG可诱导足细胞中性脂质和脂滴增加,而JAML基因沉默可减少HG刺激下足细胞中脂质沉积。（2）脂质组学定量分析结果表明,JAML基因沉默能够降低HG诱导的足细胞内胆固醇酯（CE）、游离脂肪酸（FFA）、神经酰胺,磷脂酰乙醇胺（PE）,磷脂酰胆碱（PC）和鞘磷脂（SM）的水平。2.3.3肾小球疾病患者肾活检样本中JAML与脂滴蓄积程度的相关性分析免疫组化检测结果表明,在DKD、FSGS、MN和MCD患者肾小球中,Adipophilin的表达与JAML表达水平呈正相关。2.4 JAML在局灶性节段性肾小球硬化足细胞脂代谢紊乱中的作用（1）足细胞特异性JAML敲除能够减轻ADR模型小鼠的蛋白尿;PAS染色及TEM结果显示,足细胞特异性JAML敲除小鼠可减轻ADR诱导的肾脏损伤。（2）体外油红O染色结果显示,基因沉默JAML可以减少ADR诱导的足细胞中脂质沉积。第三部分JAML在糖尿病肾病足细胞脂代谢稳态失衡中的作用机制3.1足细胞内JAML调控Sirt1的表达变化（1）Western blot 结果显示,Sirt1、Sirt3、Sirt6 和 Sirt7 在 Cre+/Jaml+/+DKD小鼠肾皮质中显着降低,而Cre+/Jamlfl/fl小鼠中Sirt1的表达可明显恢复,Sirt7的表达也有部分恢复。（2）Sirt1和Synaptopodin的免疫荧光双标结果显示,STZ/HFD模型小鼠足细胞中Sirt1表达显着降低,而Cre+/Jamlfl/fl小鼠Sirt1表达明显恢复。（3）Western blot实验结果显示,足细胞中沉默JAML可恢复HG诱导的Sirt1蛋白水平降低;足细胞中过表达JAML,可抑制Sirt1的蛋白水平。3.2 JAML通过Sirt1调控AMPK的磷酸化（1）DKD小鼠模型的肾小球中p-AMPKα水平降低,而Cre+/Jamlfl/flDKD小鼠肾小球中p-AMPKα水平恢复。（2）Western blot实验验证Sirt1沉默效率,结果显示Sirt1沉默效果显着。进一步实验同时沉默JAML和Sirt1,发现HG和Sirt1基因沉默都能诱导AMPKα活性降低,而JAML沉默能够显着恢复p-AMPKα水平。3.3 JAML-Sirt1信号通路调控转录因子SREBP1及其下游靶基因的表达3.3.1利用转录组测序技术分析JAML下游信号通路通过分析转录组测序结果,我们发现足细胞内JAML的缺失可显着抑制HG诱导的转录因子Srebp1及其调控靶基因（Fasn、Acaca、Scd1和Sqle）的水平升高。3.3.2 JAML调控SREBP1及其下游信号通路（1）RT-qPCR及Western blot检测结果表明,足细胞中沉默JAML可显着降低HG诱导的Srebp1及其下游Fasn、Acaca、Scd1 和Sqle脂肪酸和胆固醇合成基因的mRNA和蛋白表达,而Srebp2虽然在HG条件下表达升高,但JAML基因沉默对其无明显作用。（2）DKD小鼠模型的肾小球中Srebp1和Srebp2的mRNA和蛋白水平均明显升高,足细胞特异性敲除JAML可抑制DKD小鼠肾小球中Srebp1的表达。3.4JAML-Sirt1-AMPK信号通路调控SREBP1的表达Western blot检测结果显示,HG处理的足细胞中沉默Sirt1或者AMPK均可抵消JAML基因缺失所引起的SREBP1表达的降低。说明JAML通过Sirt1和AMPK调控mSREBP1蛋白水平。3.5阿霉素诱导的足细胞损伤模型中JAML对Sirt1-AMPK-SREBP1信号通路的作用。Western blot实验结果显示,JAML基因沉默可恢复ADR诱导的Sirt1和p-AMPKα蛋白水平的降低,同时抑制ADR诱导的mSREBP1表达水平的升高。结论及创新性1.JAML在足细胞损伤肾病患者血清及肾脏中显着升高,相关性分析发现JAML蛋白水平与患者血肌酐呈正相关,和eGFR呈负相关。2.特异性敲除足细胞内的JAML显着抑制DKD小鼠足细胞损伤及蛋白尿生成,进一步发现基因沉默JAML可以抑制高糖诱导的足细胞脂质代谢紊乱。3.本实课题首次发现JAML通过调控Sirt1/AMPK/SREBP1信号通路作用于DKD足细胞脂代谢紊乱,为DKD的防治提供了新的治疗靶点与实验基础。4.JAML在足细胞损伤中的作用可能具有广泛意义。我们发现在阿霉素诱导的FSGS模型中,JAML在足细胞中表达升高,足细胞特异性敲除JAML可减轻足细胞损伤及脂代谢紊乱,可能也通过调节Sirt1/AMPK/SREBP1信号通路发挥作用。
吴娅丽[8]（2020）在《基于多组学模式的威廉环毛蚓抗血栓成分DPf3的分离鉴定及机制研究》文中研究表明研究背景:血栓性疾病是人类死亡的主要原因之一,临床常用具抗血小板、抗凝和溶栓等作用的药物对其进行治疗,但多数药物伴随出血副作用;中医认为血栓疾病与血瘀证密切相关,通常使用活血化瘀类药物治疗血瘀证,其中动物药（如水蛭、地龙等）为中医活血化瘀的常用药;地龙及含地龙的成方制剂作为抗凝剂和纤溶药物已应用了几个世纪,且被认为无出血副作用;口服蚓激酶制剂在许多国家用于保护心血管,且在我国已作为二类新药上市。中药动物药的研究一直是个难题,威廉环毛蚓作为《中国药典》:收录地龙品种,其抗血栓关键物质基础、作用靶点及机制均尚不明确,故缺乏科学依据指导其临床应用,因此,研究威廉环毛蚓的抗血栓物质基础及作用机制有重大意义。由于地龙的抗血栓成分主要为蛋白质,本研究借助转录组学-蛋白组学相结合的模式,阐释威廉环毛蚓的抗血栓物质基础,并初步探究其作用机制。研究目的:基于多组学模式鉴定威廉环毛蚓中所含蛋白质,通过分离纯化初步定位其抗血栓活性部位并鉴定分析该部位蛋白质成分的序列、结构和性质;利用动物模型评价该部位预防血栓形成的作用、溶栓作用及血管保护作用;通过分子对接和体外模型探讨其抗血栓作用靶点和机制,及血管保护作用机制;借助蛋白组学技术从整体分析其抗血栓及血管保护作用涉及的生物过程及信号通路。研究方法与研究结果:研究一威廉环毛蚓无参考基因转录组的构建及分析采用基于Illumina高通量测序平台的无参考基因RNA测序技术构建威廉环毛蚓的无参考基因转录组,进而构建其蛋白序列库,为后续研究提供支持。通过测序,共得到超过2000万的clean reads,其中高质量reads超过97%;Trinity拼接后,得到超过10万个转录本和unigenes;翻译所拼接的转录组数据,构建威廉环毛蚓蛋白序列库。ESTScan软件共预测11259个编码序列,可作为引物设计数据库使用。通过与公共数据库比对,共注释 38.21%的 unigenes。研究二威廉环毛蚓总提物的鉴定及抗血栓性质研究采用转录组学-蛋白组学-活性研究整合关联分析方法,以“研究一”所构建的蛋白序列库为数据库,鉴定威廉环毛蚓总提物的蛋白质成分;建立纤维蛋白原-凝血酶时间法（Fib-TT）用于抗凝血活性的体外评价,并基于该方法考察总提物在不同孵育体系中的抗凝活性变化,进而评价其抗血栓性质;研究总提物在不同体系中的蛋白质谱图变化,推测其抗血栓活性成分。从威廉环毛蚓总提物中鉴定到31种蛋白质成分;所建立的Fib-TT 法线性范围较宽,仪器精密度、重复性均良好,可用于威廉环毛蚓抗凝活性的体外评价;总提物的抗凝活性在近中性条件下较为稳定,在30-50℃下活性稳定;通过考察总提物经不同体系孵育后蛋白质图谱的变化,推测其抗血栓活性成分为分子量在26kDa附近的蛋白质。研究三威廉环毛蚓抗血栓成分的分离纯化及鉴定通过“研究二”发现威廉环毛蚓总提物具有较强的抗血栓活性,本实验基于Fib-TT法,采用离子交换色谱分离纯化威廉环毛蚓的抗血栓活性成分,命名为DPf3,采用SDS-PAGE和MALDI-TOF-MS确定其分子量;通过转录组学-蛋白组学整合研究方式,鉴定DPf3主要成分DPf3 ID NO.1和DPf3 ID NO.2的蛋白质种类;采用从头测序技术确定DPf3主要成分的蛋白质序列,圆二色谱考察其二级结构,I-TASSER预测其三级结构,SAVES评价预测模型;并通过溶血实验考察DPf3的血液相容性。研究发现DPf3的主要成分DPf3 IDNO.1和NO.2的分子量分别为36121.745 Da和24485.004 Da,分别含有329和241个氨基酸;de novo测序获得二者的蛋白质全序列,通过与所构建的本地蛋白序列库比对,分别为>Ac44553g1i11和>Dc43026gli12,序列覆盖度达100%;DPf3的二级结构包含α-螺旋（19%）,β-折叠（30%）和无规则卷曲（51%）;DPf3的浓度低于4.21 mg·mL-1时具有较好的血液相容性。研究四DPf3对血管损伤型斑马鱼血栓模型的作用研究采用普纳替尼致血管损伤型斑马鱼血栓模型考察DPf3预防血栓形成的作用、溶栓作用和血管保护作用。发现DPf3（4.2-12.5 ng/尾）具较强的预防血栓形成的作用,其预防能力较阿司匹林（45 μg·mL-1）无显着差异。同时,DPf3（4.2ng/尾）具明显的溶栓作用,其溶栓能力较尿激酶（5ng/尾）无显着性差异。此外,DPf3具较强的血管保护作用。研究五DPf3抗血栓活性的体外评价及机制研究通过分子对接和体外实验相结合的方式考察DPf3的抗血栓作用及作用机制。首先采用分子对接评价DPf ID NO.1和NO.2与纤维蛋白（原）、纤溶酶原、凝血酶间的相互作用;继而通过酶谱法、光散射法、形态学研究、纤维蛋白平板法、体外血栓法及凝血四项评价研究DPf3的抗血栓活性及机制。通过分子对接发现DPf3 ID NO.1和NO.2对纤维蛋白（原）、纤溶酶原均有直接作用,体外实验发现DPf3对纤溶酶原作用很弱,对纤维蛋白（原）及体外血栓均有很强的水解作用;与生成的纤维蛋白栓块相比,纤维蛋白原可能是DPf3的初始作用靶点,且DPf3对纤维蛋白原的作用更强;通过凝血四项评价,发现DPf3能显着延长APTT、降低Fib的含量,且具有延长TT的作用趋势。研究六DPf3血管保护作用机制的细胞模型研究选取HUVECs为研究对象,以（hi）ox-LDL为造模剂,通过研究经DPf3保护前后,损伤性HUVECs的细胞活力、细胞膜完整性、细胞内ROS水平、细胞迁移能力、粘附因子VCAM 1的表达及单核细胞的粘附、血管生成等的变化,来探讨DPf3的血管保护作用机制。研究发现,DPf3对血管具显着保护作用,DPf3能够提高损伤性HUVECs的细胞活力、保护其细胞膜的完整性,降低细胞内ROS的生成;降低粘附因子VCAM I的蛋白表达水平,减少单核细胞的粘附;削弱损伤性细胞的迁移能力,并抑制其新生血管的生成。研究七基于蛋白质组学研究DPf3对血管损伤型斑马鱼血栓模型的影响采用蛋白组学技术从整体水平研究DPf3抗血栓和血管保护作用所涉及的生物标志物、生物过程和信号通路。通过血栓模型组与正常对照组对比,共鉴定得到1149个差异蛋白标志物,其中表达显着上调和下调的蛋白分别有582个和567个;通过DPf3给药组和模型组对比,共鉴定出66个差异蛋白标志物,其中表达显着上调和下调的蛋白分别有46个和20个,具有显着回调作用的蛋白有23个。通过对差异蛋白标志物所涉及的生物过程和信号通路进行归纳与分析,发现DPf3发挥抗血栓和血管保护活性的机制主要与调节脂质代谢、调节能量代谢、补体与凝血系统、ECM受体相互作用、MAPK信号通路等相关。研究结论:本研究以“转录组学-蛋白组学”多组学结合的模式为基础,初步构建中药地龙威廉环毛蚓的本地蛋白序列库,通过分离纯化得到其抗血栓活性成分（DPf3）,对DPf3进行鉴定及机制研究。研究发现威廉环毛蚓总提物具良好的抗血栓活性,从中鉴定到31个蛋白质成分,其中分离所得DPf3具良好的预防血栓、溶栓及血管保护作用,且具较好的血液相容性,为威廉环毛蚓抗血栓的物质基础。DPf3的抗血栓机制为:（1）具有很强的纤维蛋白和纤维蛋白原水解活性,且能够激活纤溶酶原形成纤溶酶;（2）具有较强的直接溶栓作用;（3）通过影响内源性或/和共同凝血途径及第三种凝血途径产生抗血栓作用。DPf3对血管内皮的保护作用机制为:（1）提高损伤性血管内皮细胞的细胞活力,保护细胞膜的完整性,降低损伤性细胞内ROS的生成;（2）降低粘附因子VCAM 1的蛋白表达水平,减少单核细胞的粘附;（3）削弱损伤性细胞的迁移能力,从而降低炎症细胞的扩散;（4）抑制新生血管的生成,进而抑制血管新生内膜的形成。通过蛋白组学技术从整体水平研究,发现DPf3发挥抗血栓和血管保护作用的机制主要与调节脂质代谢、调节能量代谢、补体与凝血系统、ECM受体相互作用、MAPK信号通路等相关。综上,本研究基本证实了中药地龙威廉环毛蚓的抗血栓关键物质基础,明确其作用靶点并初步确定其作用机制,为威廉环毛蚓的临床使用提供科学依据,为进一步研究其抗血栓活性成分的分子机制提供基础和依据,并为中药动物药的研究提供思路和方法。
张晓美[9]（2020）在《利用蛹虫草菌丝体表达hFGF21及其降糖降脂的作用研究》文中研究说明FGF21（Fibroblast growth factor 21）是成纤维细胞生长因子家族的一个重要成员,具有显着的降血糖降血脂功效,是一种极具应用前景的治疗Ⅱ型糖尿病候选药物。然而,反复注射FGF21会增加患者的痛苦,为患者及其家庭甚至社会带来了沉重负担。为了开发出FGF21的口服制剂,本课题选用蛹虫草菌丝体为生物反应器高效表达人FGF21,通过体外和体内试验深入研究转hFGF21重组蛹虫草菌丝体的降糖降脂作用。1. 以GPD为真菌特异性启动子,以潮霉素为抗性筛选标记,利用PEG介导的遗传转化技术,将真菌特异性表达重组载体pCB130-hFGF21转化至蛹虫草原生质体中,分别考察350、400、450、500和550 mg/L潮霉素对蛹虫草菌丝体生长的影响,结果显示450 mg/L潮霉素为筛选的临界浓度。进一步通过基因组PCR、SDS-PAGE和Western blot等方法进行检测,最终获得了8株含有目的基因hFGF21的阳性菌丝体转化子,其转化率为12.3%,并将表达量最高的菌株命名为X06-49。2. 为了考察hFGF21在蛹虫草菌丝体的生长过程中的表达变化以及遗传稳定性,利用摇瓶发酵培养菌株X06-49,通过ELISA法检测菌株X06-49中的hFGF21含量,结果表明,最佳培养时间为7天,hFGF21含量为1.8 mg/g菌丝体;进一步将菌株X06-49摇瓶连续传代培养11代,通过ELISA法检测每一代菌丝体中hFGF21的含量,结果表明,转hFGF21重组蛹虫草菌株可稳定遗传至第7代,具有较好的遗传稳定性。3. 为了检测rhFGF21的体外活性,利用Ni-NTA镍离子亲和层析柱对含有组氨酸标签的rhFGF21进行纯化,并采用葡萄糖氧化酶和过氧化物酶法检测rhFGF21对小鼠前脂肪胚胎成纤维细胞（3T3-L1）的葡萄糖吸收活性。结果显示,与市售的FGF21相似,rhFGF21可促进3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖吸收作用,且具有剂量依赖性。进一步通过检测ERK代谢通路相关指标的表达变化,表明rhFGF21是与FGFR结合后通过激活ERK途径下游相关蛋白的磷酸化,进而发挥其对3T3-L1细胞的葡萄糖吸收作用。此外,将菌株X06-49和市售FGF21分别置于-20°C、4°C和37°C条件下储存24个月后,进行活性检测,结果表明重组蛹虫草中rh FGF21的相对活性分别为95%、80%和48%,明显优于市售FGF21干粉,说明蛹虫草菌丝体作为宿主具有保护rhFGF21活性的作用。4. 为了考察口服转h FGF21的重组蛹虫草菌丝体对Ⅱ型糖尿病的降糖和降脂作用,将db/db小鼠连续口服蛹虫草菌丝体60天,通过血糖检测、空腹血糖IGTT试验、胰岛素含量以及血脂含量检测,结果表明口服重组蛹虫草菌丝体可以有效降低db/db小鼠的血糖水平,增加胰岛素敏感性,改善胰岛素抵抗。显着降低（P<0.01）血液中甘油三脂（TG）、总胆固醇（T-CHO）、游离脂肪酸（NEFA）,低密度脂蛋白（LDL-C）的浓度,显着提高高密度脂蛋白（HDL-C）的浓度（P<0.01）,有效缓解糖尿病小鼠的血脂代谢紊乱。5. 为了考察口服转hFGF21蛹虫草菌丝体对db/db小鼠脂肪肝和胰腺的作用,分别检测db/db小鼠血清ALT和AST的含量,并通过荧光定量PCR技术检测脂肪肝相关炎症因子MCP-1、Cd11b、F4/80、CD68和TNF-a的mRNA表达水平变化,并观察脂肪肝组织的组织病理切片。结果显示,口服转hFGF21蛹虫草菌丝体显着降低db/db小鼠血液ALT和AST的含量（P<0.01）,显着降低脂肪肝炎症因子相关基因的表达（P<0.01）,明显减少db/db小鼠的脂肪肝中的脂肪颗粒数量。同时以细胞凋亡执行蛋白Caspase 3为检测指标进行胰腺组织免疫组化分析,结果显示口服转hFGF21蛹虫草菌丝体可以通过降低胰岛β细胞的凋亡来保护胰腺组织。6. 为了评估转hFGF21蛹虫草菌丝体的安全性,进行急性毒性和亚急性毒性试验。急性毒性试验证实,最大给药量为15 g·kg-1/d时未见死亡现象。亚急性毒性试验中,大鼠分高(10.5 g·kg-1/d)、中(1.05 g·kg-1/d)、低(0.35 g·kg-1/d)剂量给药28天,结果表明,口服中低剂量的重组蛹虫草菌丝体并未显着改变大鼠体重、各器官脏器比、血液学指标和血液生化指标,各个脏器的组织病理学切片结果中也未见有组织形态学的改变。初步证明转hFGF21蛹虫草菌丝体作为口服制剂安全无毒。
刘孝洁[10]（2020）在《心血管手术围手术期炎症反应与凝血功能关系研究》文中研究表明第一部分:冠状动脉旁路移植手术围手术期感染与血栓形成相关性研究目的:手术相关感染仍然是心脏手术患者的主要并发症之一,其与血栓形成的关系尚不清楚。本研究旨在探讨冠状动脉旁路移植术（CABG）患者术后感染与血栓形成的相关性。方法:连续纳入阜外医院2001年1月至2006年8月所有CABG患者的围手术期及术后随访资料。根据感染与否将患者分为两组。包括75例感染患者和2926例对照组患者。主要终点指标是围手术期血栓形成和长期血栓相关并发症。次要终点指标为术后5年的主要心脑血管事件（MACCEs）（包括死亡、心肌梗死、靶血管重建和卒中）。统计学方法采用logistic回归分析和COX生存分析。结果:术后感染的危险因素包括年龄、术前肌酐、慢性肺部疾病、体外循环时间、升主动脉阻断时间、肾功能衰竭史、体外循环、使用左心室辅助装置或主动脉内球囊反搏、重症监护室停留时间和气管插管时间。与对照组相比,术后感染使围手术期血栓形成增加 5.132 倍（OR,5.132;95%CI（2.040-12.911）,p<0.001）。术后感染与MACCEs显着增加无关（HR,1.855;95%HR（0.929-3.704）,p=0.080）。年龄与 MACCEs的显着增加相关（HR,1.040;95%HR（1.026-1.054）,p<0.001）。结论:CABG术后感染与围手术期血栓形成相关。积极控制围手术期感染风险可以减少围手术期血栓的发生,这为临床工作提供了依据。第二部分:冠状动脉旁路移植手术术前超敏C反应蛋白与术后出血相关关系研究目的:心脏手术术后出血仍然是临床工作中的一项挑战。大量研究表明超敏C反应蛋白（hsCRP）水平升高会增加心血管疾病的风险。目前尚无对冠状动脉旁路移植术（CABG）患者术前hsCRP浓度与术后出血量的相关性研究的报道。本研究旨在探讨CABG患者术前hsCRP浓度水平与术后24小时内出血量的相关关系。方法:连续纳入自2017年9月至2018年7月的1055例在阜外医院接受单纯初次CABG治疗的患者。记录患者术前hsCRP浓度、实验室凝血参数、术中数据及术后24小时出血量。主要终点是术后24小时内的出血量。采用单变量和多变量的线性回归分析对术前资料变量进行统计学分析。结果:单变量线性回归分析后发现,术前hsCRP浓度（B=-0.094,p<0.001）、血小板计数（B=-0.115,P<0.01）、血细胞计数（B=-0.127,p<0.001）、凝血酶原时间（PT）（B=0.052,P<0.01）、纤维蛋白原（FIB）（B=-0.096,p<0.01）与术后出血量相关。然而,术前hsCRP（B=-0.089,p<0.05）是术后出血量的独立预测因子。术前hsCRP浓度也与体质量指数（BMI）（B=0.068,p=0.038）、活化部分凝血活酶时间（APTT）（B=0.089,P<0.01）、FIB（B=0.519,p<0.01）相关。结论:我们的研究结果表明,术前hsCRP浓度是术后24小时内出血量的独立风险因素,是否成为未来CABG手术围手术期新的凝血指标有待进一步的研究。第三部分:恒河猴血清超敏C反应蛋白与纤维蛋白原相关关系研究目的:既往研究表明冠状动脉粥样硬化患者术前hsCRP与术后出血具有相关性,且与纤维蛋白原（FIB）具有相关性。但鉴于术前患者服用抗凝及抗血小板药物可能会影响FIB。本研究的目的是探讨恒河猴血清hsCRP与FIB的相关关系。方法:采集在北京大学分子医学研究所59例雄性恒河猴的血液。测定其血细胞常规、生化常规和凝血相关指标。主要终点指标为FIB水平。采用单变量和多变量线性回归分析进行统计学分析。结果:单变量线性分析后发现预测FIB的因素包括腰围（CW）（B=0.019,p=0.003）,体质量指数（BMI）（B=0.037,p=0.007）,hsCRP（B=1.224,p=0.001）。多变量线性回归分析后发现hsCRP能独立预测FIB（B=0.063,p=0.018）结论:本研究显示雄性恒河猴体内hsCRP与FIB相关。因此,揭示雄性恒河猴炎症指标与凝血指标具有相关性。
二、改良肝素诱导体外低密度脂蛋白沉淀系统的应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、改良肝素诱导体外低密度脂蛋白沉淀系统的应用（论文提纲范文）
（1）基于NIR-Ⅱ和汽泡的双辅助的肝素和尿激酶双药序列释放平台的构建及其体内外评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 静脉血栓栓塞概述 |
| 1.2 纳米技术 |
| 1.2.1 纳米技术概述 |
| 1.2.2 纳米技术在血管栓塞性疾病中的应用 |
| 1.3 我们实验室在抗血栓治疗方面的研究 |
| 1.4 介孔硅的发展 |
| 1.4.1 介孔硅的应用 |
| 1.4.2 中空介孔硅的合成和应用 |
| 1.5 天然相变材料-薄荷醇 |
| 1.6 近红外光的应用 |
| 1.7 聚多巴胺的合成和应用 |
| 1.8 本论文研究思路及主要内容 |
| 第2章 可降解的中空介孔硅及聚多巴胺修饰的中空介孔硅的合成和鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 HMSNs的合成 |
| 2.3.2 PDA@HMSNs的合成 |
| 2.3.3 HMSNs和 PDA@HMSNs的鉴定 |
| 2.4 统计分析 |
| 2.5 实验结果与讨论 |
| 2.5.1 材料的合成 |
| 2.5.2 材料的表征 |
| 2.6 本章小结 |
| 第3章 UH和 UK的负载及UK-UH@PDA@HMSNs的合成 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 主要试剂 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 UK-UH@PDA@HMSNs的合成 |
| 3.3.2 UH的载药率 |
| 3.3.3 UK的载药率 |
| 3.3.4 UH和UK的体外药物释放动力学 |
| 3.4 统计分析 |
| 3.5 实验结果与讨论 |
| 3.5.1 材料的合成路线 |
| 3.5.2 UH和UK的载药率 |
| 3.5.3 药物释放评估 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 PDA@HMSNs的体外性能及生物相容性研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验细胞和动物 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.2.3 主要仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞复苏 |
| 4.3.2 细胞换液 |
| 4.3.3 细胞传代 |
| 4.3.4 细胞冻存 |
| 4.3.5 细胞计数 |
| 4.3.6 PDA@HMSNs的光热转换性质 |
| 4.3.7 HMSN_S体外降解实验 |
| 4.3.8 采血和凝血 |
| 4.3.9 活-死细胞染色试验 |
| 4.3.10 细胞毒性评估 |
| 4.3.11 溶血试验 |
| 4.4 统计分析 |
| 4.5 实验结果与讨论 |
| 4.5.1 材料光热性能的研究 |
| 4.5.2 体外降解性实验 |
| 4.5.3 体外细胞相容性实验 |
| 4.6 本章小结 |
| 第5章 UK-UH@PDA@HMSNs的体内外溶栓及生物安全性研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料 |
| 5.2.1 实验标本 |
| 5.2.2 主要试剂 |
| 5.2.3 主要仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 细胞复苏 |
| 5.3.2 细胞换液 |
| 5.3.3 细胞传代 |
| 5.3.4 细胞冻存 |
| 5.3.5 细胞计数 |
| 5.3.6 体外溶栓的评价 |
| 5.3.7 体内溶栓的评价 |
| 5.3.8 细胞毒性评估 |
| 5.3.9 活体生物安全评估 |
| 5.4 统计分析 |
| 5.5 结果与讨论 |
| 5.5.1 体外溶栓评估 |
| 5.5.2 体内溶栓评估 |
| 5.5.3 细胞毒性实验 |
| 5.5.4 体内生物安全性评估 |
| 5.6 本章小结 |
| 第6章 结论和展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望与进一步的研究工作 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:本研究资助项目 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 纳米载体在溶栓治疗中的研究进展 |
| 参考文献 |
（2）荔枝核总黄酮对HSC-T6的作用和差异蛋白质组学的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞系 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要试剂与耗材 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 细胞培养及传代 |
| 2.2 检测TFL药物对HSC-T6增殖的影响 |
| 2.3 透射电子显微镜观察HSC-T6的超微结构 |
| 2.4 ELISA检测MMP-2、ColⅠ、ColⅢ的含量变化 |
| 2.5 肝纤维化动物造模分组及含药血清的制备 |
| 2.6 检测含药血清对HSC-T6增殖的影响 |
| 2.7 含药血清干预后蛋白质的收集与提取 |
| 2.8 DDA检测 |
| 2.9 DIA检测 |
| 2.10 主要数据库和数据指标 |
| 2.10.1 NR数据库和UniProt蛋白数据库 |
| 2.10.2 STRING蛋白互作数据库 |
| 2.10.3 GO数据库 |
| 2.10.4 KOG数据库 |
| 2.10.5 KEGG数据库 |
| 2.11 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 TFL药物对HSC-T6生长抑制率的影响 |
| 3.2 TFL药物对HSC-T6超微结构的影响 |
| 3.3 TFL药物对HSC-T6的MMP-2、ColⅠ、ColⅢ含量的影响 |
| 3.4 肝纤维化动物造模结果 |
| 3.5 不同浓度的含药血清对HSC-T6增殖的影响 |
| 3.6 肽段与蛋白的定量质控分析 |
| 3.7 DDA/DIA检测结果 |
| 3.8 GO富集分析 |
| 3.9 KOG注释分析 |
| 3.10 PPI分析 |
| 3.11 PATHWAY富集分析 |
| 3.12 亚细胞定位分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 理论基础 |
| 4.1.1 肝纤维化与肝星状细胞的理论基础 |
| 4.1.2 差异蛋白质组学的理论基础 |
| 4.1.3 中医药对肝纤维化认识的理论基础 |
| 4.1.4 荔枝核总黄酮(TFL)治疗肝纤维化的理论基础 |
| 4.2 TFL对HSC-T6生长增殖的影响 |
| 4.3 TFL对HSC-T6的ECM形成相关因子的影响 |
| 4.3.1 基质金属蛋白酶2(MMP-2) |
| 4.3.2 Ⅰ型胶原(ColⅠ) |
| 4.3.3 Ⅲ型胶原(ColⅢ) |
| 4.4 TFL对HSC-T6部分差异蛋白功能的讨论 |
| 4.4.1 上调蛋白 |
| 4.4.2 下调蛋白 |
| 4.5 TFL对HSC-T6差异蛋白部分信号通路的分析 |
| 4.5.1 PI3K/Akt通路 |
| 4.5.2 NF-κB信号通路 |
| 4.5.3 胆固醇代谢与合成 |
| 4.5.4 补体和凝血级联 |
| 4.5.5 细胞色素P450 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 综述 荔枝核总黄酮防治肝纤维化相关细胞因子及信号通路的进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介及攻读学位期间获得的科研成果 |
（3）冠脉慢血流微循环障碍的机制和干预研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 冠脉慢血流患者外周血细胞测序分析 |
| 一、引言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第二部分 脂肪乳输注诱导小鼠冠脉微循环功能障碍 |
| 一、引言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第三部分 脂肪乳输注诱导冠脉微循环障碍的机制 |
| 一、引言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 冠脉微循环障碍:非阻塞性冠心病潜在发病机制 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间的科研成果 |
| 致谢 |
（4）Phactr1缺乏通过促进M1巨噬细胞极化和泡沫细胞形成促进动脉粥样硬化进展（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 综述 动脉粥样硬化的影响因素 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 动脉粥样硬化与泡沫细胞形成及巨噬细胞的脂质代谢的相关性 |
| 1.2.1 巨噬细胞胆固醇摄取 |
| 1.2.2 胆固醇酯化及水解 |
| 1.2.3 胆固醇排出 |
| 1.2.4 与动脉粥样硬化中泡沫细胞的形成有关的GWAS发现 |
| 1.3 动脉粥样硬化与巨噬细胞炎症反应 |
| 1.3.1 不同巨噬细胞表型分布 |
| 1.3.2 巨噬细胞功能的多样性 |
| 1.3.3 巨噬细胞极化与动脉硬化 |
| 1.3.4 巨噬细胞与炎性介质 |
| 1.4 动脉粥样硬化与KLF4 |
| 1.4.1 KLF4 与泡沫细胞 |
| 1.4.2 KLF4 与巨噬细胞极化 |
| 1.5 动脉粥样硬化与Phactr1 |
| 1.5.1 Phactr1基因与蛋白 |
| 1.5.2 Phactr1基因的心血管作用 |
| 1.5.3 Phactr1基因多态性及心血管疾病的影响 |
| 第2章 Phactr1缺乏通过促进M1 巨噬细胞极化和泡沫细胞形成促进动脉粥样硬化进展 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 研究材料、器材及方法 |
| 2.2.1 主要研究器材及试剂 |
| 2.2.2 试验方法 |
| 2.2.3 统计分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 在小鼠动脉粥样硬化形成过程中巨噬细胞Phactr1表达增加 |
| 2.3.2 Phactr1的消耗可加剧动脉粥样硬化进展 |
| 2.3.3 Phactr1在巨噬细胞中的消耗会加速M1 巨噬细胞极化,炎症和泡沫细胞形成 |
| 2.3.4 Phactr1促进CREB激活和KLF4 转录 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（5）基于蛋白质羰基化对蛋白氧化损伤与功能受损程度的评估及其应用价值（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 基于羰基化对牛乳无菌新鲜度影响观察及其阻断羰基化的保鲜措施评价 |
| (一)材料与方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 标本来源 |
| 2.方法 |
| 2.1 影响蛋白质羰基化含量测定 |
| 2.1.2 牛奶的各种保护状态因素的保存方法 |
| 2.1.3 蛋白质羰基化含量测定 |
| (二)结果 |
| 1.室温保存状态每四个小时测定状态下牛奶蛋白质发生羰基化反应含量结果 |
| 2.室温下有无加入抗生素的牛奶蛋白羰基化含量牛奶蛋白质发生羰基化反应含量结果 |
| 3.室温下真空和非真空牛奶样品的蛋白羰基化含量 |
| 4.-20℃冻融条件下牛奶蛋白质的蛋白羰基化浓度 |
| 5.低温-20℃状态下真空和非真空的牛奶样本蛋白羰基化含量 |
| 6.使用不同方法进行多次冻融循环后牛奶蛋白质无菌新鲜度测定的羰基化含量 |
| (三)讨论 |
| (四)小结 |
| (五)参考文献 |
| 第二章 血清蛋白质羰基化模型的建立及蛋白质羰基化对血清生化检测影响的观察 |
| (一)材料与方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 试剂 |
| 2.标本采集及处理 |
| 2.1 新鲜血清 |
| 2.2 陈旧血清样本 |
| 2.3 反复冻融血清标本 |
| 3.蛋白质羰基化模型建立 |
| 4.方法 |
| 4.1 生化指标检测方法 |
| 4.2 迈瑞Mindray BS-800全自动生化分析仪系统的检测原理 |
| 4.3 建立蛋白质羰基化含量测定化学法 |
| 5.统计学方法 |
| (二)结果 |
| 1.蛋白质羰基化含量测定模型运用无菌新鲜度测定方法对血清标本蛋白质羰基化能力的分析 |
| 2 血清全自动生化分析仪测定各项临床生化指标指标结果 |
| 3 蛋白质羰基化含量测定新旧临床血清标本结果 |
| 4 新鲜与陈旧血清全自动生化分析仪测定肝功能指标、肾功能指标、糖代谢类指标结果 |
| 5.冻融组和陈旧组血清全自动生化分析仪测定肝功能指标、肾功能指标、糖代谢类指标结果比较 |
| (三)讨论 |
| (四)小结 |
| (五)参考文献 |
| 第三章 蛋白质羰基化对于酶联免疫检测结果的影响 |
| (一)材料与方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 试剂 |
| 2.标本采集及处理 |
| 2.1 新鲜血清抗体制备 |
| 2.2 冻融血清抗体制备 |
| 2.3 冻融酶标结合物的制备 |
| 3.实验方法 |
| 3.1 检测血清中乙型肝炎病毒表面抗体的酶联免疫吸附实验测定方法的建立 |
| 3.2 血清中抗体和蛋白质酶类羰基化水平测定 |
| 3.3 实验分组 |
| 4.统计学方法 |
| (二)结果 |
| 1.双抗原夹心法测定试剂盒酶标结合物和蛋白质羰基化的血清抗体 |
| 2.双抗原夹心法测定蛋白质羰基化的试剂盒酶标结合物和血清抗体 |
| 3.双抗原夹心法测定血清抗体和蛋白质羰基化的血清抗体单因素配对分析 |
| 4.双抗原夹心法测定试剂盒酶标结合物和血清抗体标本进行蛋白质羰基化的多因素联合分析与多因素线性回归分析 |
| (三)讨论 |
| (四)小结 |
| (五)参考文献 |
| 第四章 蛋白质羰基化与氧化应激对PCR检测结果的影响 |
| (一)材料与方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 试剂 |
| 2.标本采集及处理 |
| 3.方法 |
| 3.1 DNA的提取 |
| 3.2 蛋白质羰基化模型运用 |
| (二)结果 |
| 1.GAPDH通用引物的验证 |
| 2.荧光定量PCR对培养DNA的冻融Taq酶单因素分析扩增结果 |
| (三)讨论 |
| (四)小结 |
| (五)参考文献 |
| 三、全文总结 |
| 四、工作展望 |
| 五、综述 蛋白质羰基化对生物学功能的影响及测定技术的发展和应用 |
| 参考文献 |
| 六、附录 |
| 七、致谢 |
（6）基于CaSR及Wnt/β-catenin信号通路的鸭蛋蛋清肽促钙吸收及促骨合成活性及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1 钙敏感受体的研究进展 |
| 1.1 CaSR功能 |
| 1.1.1 钙调组织 |
| 1.1.2 非钙调组织 |
| 1.2 CaSR结构 |
| 1.3 CaSR配体 |
| 1.3.1 Ⅰ型配体 |
| 1.3.2 Ⅱ型配体 |
| 2 骨质疏松症的研究进展 |
| 2.1 危险因素 |
| 2.1.1 年龄 |
| 2.1.2 饮食模式 |
| 2.1.3 营养素摄入 |
| 2.1.4 生活方式 |
| 2.1.5 继发性原因与遗传因素 |
| 2.2 骨质疏松症的预防与治疗 |
| 2.2.1 药物治疗 |
| 2.2.2 非药物干预 |
| 2.3 骨代谢信号通路 |
| 2.3.1 OPG/RANKL/RANK |
| 2.3.2 BMP/Smad |
| 2.3.3 Wnt/β-catenin |
| 2.4 生物活性肽与骨质疏松症 |
| 2.4.1 乳源肽 |
| 2.4.2 胶原肽 |
| 2.4.3 其他来源 |
| 3 本课题的研究目的与意义 |
| 4 本课题的研究内容 |
| 5 本课题的创新点 |
| 第二章 正构调节钙敏感受体鸭蛋蛋清肽的筛选与鉴定 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验原料 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 仪器设备 |
| 2.2 DPs的分离纯化 |
| 2.3 可溶性钙结合量测定 |
| 2.4 高活性级份DPs的 RP-HPLC分析 |
| 2.5 高活性级份DPs的 HPLC-ESI/MS/MS分析 |
| 2.6 质谱解析 |
| 2.7 分子对接虚拟筛选 |
| 2.7.1 配体准备 |
| 2.7.2 受体蛋白准备 |
| 2.7.3 分子对接计算 |
| 2.8 大鼠在体小肠单向灌流实验方法 |
| 2.8.1 实验溶液和试验药物的配制 |
| 2.8.2 大鼠在体小肠单向灌流法 |
| 2.8.3 大鼠血清中甲状旁腺激素(PTH)检测 |
| 2.8.4 小肠钙吸收百分比、吸收速率常数(Ka)和有效渗透系数(Peff)计算公式 |
| 2.8.5 十二指肠CaSR基因检测 |
| 2.9 数据统计学处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 鸭蛋蛋清肽的分离纯化 |
| 3.2 鸭蛋蛋清肽的RP-HPLC分析 |
| 3.3 鸭蛋蛋清肽的质谱鉴定 |
| 3.4 分子对接虚拟筛选 |
| 3.5 六种含芳香族氨基酸小肽对大鼠肠钙吸收的影响 |
| 3.6 CaSR抑制剂对六种寡肽促肠钙吸收作用的影响 |
| 3.7 CaSR抑制剂对六种寡肽引起血清中PTH水平改变的影响 |
| 3.8 六种寡肽与CaSR抑制剂对大鼠十二指肠CaSR基因表达的影响 |
| 3.9 NFE、INSW与 CaSR蛋白分子对接 |
| 4 讨论 |
| 4.1 生物活性肽的活性预测 |
| 4.2 在体小肠单向灌流法 |
| 4.3 鸭蛋蛋清肽与钙敏感受体的作用 |
| 5 本章小节 |
| 第三章 DPS对 MC3T3-E1 增殖、分化和矿化的影响及相关机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验原料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞复苏 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 鸭蛋蛋清肽对MC3T3-E1细胞增殖的影响 |
| 2.2.4 MC3T3-E1细胞周期测定 |
| 2.2.5 鸭蛋蛋清肽对MC3T3-E1细胞分化和矿化的影响 |
| 2.2.6 MC3T3-E1细胞中相关蛋白的测定 |
| 2.2.7 MC3T3-E1 细胞中Ca~(2+)的测定 |
| 2.3 数据统计学处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 鸭蛋蛋清肽对MC3T3-E1细胞增殖的影响 |
| 3.2 鸭蛋蛋清肽对MC3T3-E1细胞周期的影响 |
| 3.3 鸭蛋蛋清肽对MC3T3-E1细胞分化的影响 |
| 3.4 鸭蛋蛋清肽对MC3T3-E1细胞矿化的影响 |
| 3.5 鸭蛋蛋清肽对Wnt/β-catenin信号通路的影响 |
| 3.6 鸭蛋蛋清肽对MC3T3-E1细胞内钙离子浓度的影响 |
| 3.7 鸭蛋蛋清肽促MC3T3-E1细胞“外钙内流”的机理探究 |
| 3.8 VSEE促 MC3T3-E1 细胞分化、矿化的构效关系研究 |
| 4 讨论 |
| 4.1 鸭蛋蛋清肽与Wnt/β-catenin信号通路的作用 |
| 4.2 钙振荡与骨形成 |
| 5 本章小节 |
| 第四章 VSEE体内外消化、吸收和代谢研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验原料 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 仪器设备 |
| 2.2 VSEE体外稳定性研究 |
| 2.2.1 VSEE的温度稳定性 |
| 2.2.2 VSEE的 pH稳定性 |
| 2.2.3 VSEE的体外消化稳定性 |
| 2.2.4 RP-HPLC分析 |
| 2.3 Caco-2/HT-29 细胞共培养模型建立 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 VSEE对 Caco-2和HT-29 细胞的毒性作用 |
| 2.3.3 Caco-2/HT-29 共培养模型建立 |
| 2.3.4 细胞跨膜电阻测定 |
| 2.3.5 阿尔新蓝染色 |
| 2.3.6 药物转运 |
| 2.4 VSEE在大鼠体内的药物代谢动力学试验 |
| 2.4.1 VSEE在大鼠血浆中HPLC分析方法的建立 |
| 2.4.4 药物代谢动力学检测及相关参数 |
| 2.4.5 VionIMS QTOF MS/MS验证 |
| 2.5 数据统计学处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 VSEE体外稳定性研究 |
| 3.1.1 温度对VSEE稳定性的影响 |
| 3.1.2 pH对 VSEE稳定性的影响 |
| 3.1.3 体外消化酶对VSEE稳定性的影响 |
| 3.2 Caco-2/HT-29 细胞共培养模型的建立与评价 |
| 3.2.1 共培养细胞单层跨膜电阻值(TEER) |
| 3.2.2 阿尔新蓝染色实验 |
| 3.3 VSEE转运吸收及相关机理研究 |
| 3.3.1 不同转运时间对VSEE转运吸收的影响 |
| 3.3.2 不同浓度的VSEE对转运吸收的影响 |
| 3.3.3 VSEE转运吸收的机理探究 |
| 3.4 VSEE在大鼠体内的药物代谢动力学研究 |
| 3.4.1 VSEE在大鼠血浆中HPLC分析方法的建立 |
| 3.4.2 药物代谢动力学检测及相关参数 |
| 3.4.3 Vion IMS QTOF MS/MS验证 |
| 4 讨论 |
| 4.1 VSEE的结构与消化稳定性的关系 |
| 4.2 VSEE的结构与肠道吸收的关系 |
| 4.3 VSEE的药代动力学特点 |
| 5 本章小结 |
| 第五章 鸭蛋蛋清肽对去势大鼠骨质疏松及脂质代谢紊乱的干预作用及机理研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验原料 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 仪器设备 |
| 2.2 去势大鼠骨质疏松模型实验方法 |
| 2.2.1 动物分组与给药 |
| 2.2.2 血清指标测定 |
| 2.2.3 骨生物力学指标、骨干重指数、骨钙含量测定 |
| 2.2.4 MicroCT分析 |
| 2.2.5 小肠、脂肪和肝脏的组织学观察 |
| 2.2.6 骨组织、小肠相关蛋白的测定 |
| 2.2.7 盲肠内容物中微生物分析 |
| 2.3 数据统计学处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 鸭蛋蛋清肽对去势大鼠骨质疏松的干预作用及相关机理研究 |
| 3.1.1 血清ALP、OCN、β-CTX和PINP分析 |
| 3.1.2 各组大鼠骨干重指数、骨钙含量 |
| 3.1.3 各组大鼠骨生物力学指标分析 |
| 3.1.4 大鼠股骨Micro-CT分析 |
| 3.1.5 Wnt/β-catenin通路相关蛋白分析 |
| 3.1.6 各组大鼠小肠绒毛面积、紧密连接蛋白分析 |
| 3.1.7 盲肠微生物16SrRNA的测序分析 |
| 3.2 鸭蛋蛋清肽对去势大鼠脂代谢紊乱的干预作用 |
| 3.2.1 各组大鼠体重、皮下脂肪、腹腔脂肪 |
| 3.2.2 各组大鼠血清中TC,TG,LDL-C和 HDL-C分析 |
| 3.2.3 各组大鼠脂肪HE染色和肝脏油红O染色分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 雌激素缺乏与骨质疏松症 |
| 4.2 雌激素缺乏与脂质代谢 |
| 4.3 脂质代谢紊乱与骨质疏松症 |
| 4.4 肠道屏障与骨质疏松症 |
| 4.5 肠道微生物与骨质疏松症 |
| 5 本章小节 |
| 第六章 结论与展望 |
| 1.主要结论 |
| 2.展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（7）JAML在糖尿病肾病足细胞脂质代谢稳态失衡中的作用及机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号缩略 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 1、实验动物 |
| 2、药品和试剂 |
| 3、药品及试剂配制方法 |
| 4、实验器材 |
| 第一部分: JAML在糖尿病肾病中的表达模式 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附录 |
| 第二部分: J JAML在糖尿病肾病足细胞损伤中的作用 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附录 |
| 第三部分: JAML在糖尿病肾病足细胞脂代谢稳态失衡中的作用机制 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表论文 |
| 原始条带 |
| 外文论文一 |
| 外文论文二 |
| 附件 |
（8）基于多组学模式的威廉环毛蚓抗血栓成分DPf3的分离鉴定及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 血栓的研究进展概述 |
| 1 概述 |
| 2 血栓的形成过程 |
| 3 血栓性疾病的临床治疗用药 |
| 4 血栓性疾病研究模型的构建 |
| 5 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 中药地龙抗血栓活性成分研究进展 |
| 1 概述 |
| 2 地龙抗血栓活性物质 |
| 3 地龙抗血栓活性蛋白的研究 |
| 4 作用机制与毒副作用 |
| 5 临床应用 |
| 6 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第一章 威廉环毛蚓无参考基因转录组的构建及分析 |
| 第一节 概述 |
| 第二节 实验部分 |
| 1 实验材料 |
| 2 RNA提取、测序及转录本拼接 |
| 3 基因序列分析 |
| 4 基因功能注释和表达水平分析 |
| 第三节 本章小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 威廉环毛蚓总提物的鉴定及抗血栓性质研究 |
| 第一节 概述 |
| 第二节 实验部分 |
| 1 实验材料 |
| 2 威廉环毛蚓总提物的鉴定 |
| 3 威廉环毛蚓总提物的蛋白含量测定及抗血栓活性体外评价 |
| 4 威廉环毛蚓总提物的抗血栓性质研究 |
| 第三节 本章小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 威廉环毛蚓抗血栓成分的分离纯化及鉴定 |
| 第一节 概述 |
| 第二节 实验部分 |
| 1 实验材料 |
| 2 威廉环毛蚓抗血栓活性成分的分离纯化 |
| 3 抗血栓活性成分(DPf3)的鉴定 |
| 4 DPf3 ID NO.1和N0.2的结构预测及模型评价 |
| 5 DPf3的血液相容性评价 |
| 第三节 本章小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 DPf3对血管损伤型斑马鱼血栓模型的作用研究 |
| 第一节 概述 |
| 第二节 实验部分 |
| 1 实验材料 |
| 2 普纳替尼诱导斑马鱼血栓模型的建立及DPf3最大检测剂量的确定 |
| 3 DPf3对斑马鱼血管损伤型血栓形成的预防作用评价 |
| 4 DPf3对斑马鱼血管损伤型血栓的治疗作用评价 |
| 第三节 本章小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 DPf3抗血栓活性的体外评价及机制研究 |
| 第一节 概述 |
| 第二节 实验部分 |
| 1 实验材料 |
| 2 DPf3 ID NO.1和N0.2的分子对接研究 |
| 3 DPf3的纤维蛋白(原)水解活性评价 |
| 4 DPf3的纤溶酶原激活作用研究 |
| 5 DPf3血栓溶解活性的体外研究 |
| 6 DPf3对凝血四项影响的体外研究 |
| 第三节 本章小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 DPf3血管保护作用机制的细胞模型研究 |
| 第一节 概述 |
| 第二节 实验部分 |
| 1 实验材料 |
| 2 HUVECs细胞培养方法的建立及DPf3对细胞活力/毒性的影响 |
| 3 DPf3对ox-LDL损伤性HUVECs的保护作用研究 |
| 4 DPf3对ox-LDL损伤性HUVECs活性氧产生的影响 |
| 5 DPf3对(hi) ox-LDL损伤性HUVECs粘附作用的影响 |
| 6 DPf3对(hi) ox-LDL损伤性HUVECs迁移能力和血管生成的影响 |
| 第三节 本章小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第七章 基于蛋白质组学研究DPf3对血管损伤型斑马鱼血栓模型的影响 |
| 第一节 概述 |
| 第二节 实验部分 |
| 1 实验材料 |
| 2 斑马鱼样本的质量控制及评估 |
| 3 普纳替尼所致血管损伤型血栓形成的蛋白标志物分析 |
| 4 DPf3对血管损伤型斑马鱼血栓模型影响的蛋白质组学研究 |
| 第三节 本章小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（9）利用蛹虫草菌丝体表达hFGF21及其降糖降脂的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 1.选题依据及研究背景 |
| 2.本研究的基本内容 |
| 3.本研究的目的及意义 |
| 4.本研究的创新点 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 FGF21的研究进展 |
| 1.1 FGF21的体外活性 |
| 1.2 FGF21的体内活性 |
| 1.3 FGF21在非人类灵长类动物中的靶标验证 |
| 1.4 FGF21的结构与功能的关系 |
| 1.5 FGF21相关制剂的研发 |
| 第二章 菌物生物反应器的研究进展 |
| 2.1 生物反应器的研究进展 |
| 2.2 蛹虫草的研究进展 |
| 2.3 蛹虫草的活性成分 |
| 2.4 蛹虫草菌丝体作为生物反应器的应用前景 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 pCB130-hFGF21 重组载体在蛹虫草菌丝体中转化及鉴定 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果与分析 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 蛹虫草菌丝体表达的hFGF21的遗传稳定性分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 蛹虫草菌丝体表达的hFGF21的体外活性分析 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 转hFGF21蛹虫草菌丝体对糖尿病小鼠血糖和血脂的影响 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 转hFGF21基因蛹虫草菌丝体对糖尿病小鼠肝脏和胰腺的影响 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 转hFGF21蛹虫草菌丝体的毒理试验研究 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（10）心血管手术围手术期炎症反应与凝血功能关系研究（论文提纲范文）
| 主要缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分: 冠状动脉旁路移植手术围手术期感染与血栓形成相关性研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分: 冠状动脉旁路移植手术术前超敏C反应蛋白与术后出血相关关系研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分: 恒河猴血清超敏C反应蛋白与纤维蛋白原的相关关系研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述一: 心血管手术围术期炎症与凝血相关关系的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二: C反应蛋白与炎症:构象改变影响功能 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
四、改良肝素诱导体外低密度脂蛋白沉淀系统的应用（论文参考文献）
- [1]基于NIR-Ⅱ和汽泡的双辅助的肝素和尿激酶双药序列释放平台的构建及其体内外评价[D]. 钟志惟. 南昌大学, 2021
- [2]荔枝核总黄酮对HSC-T6的作用和差异蛋白质组学的研究[D]. 蒋云霞. 广西中医药大学, 2021(01)
- [3]冠脉慢血流微循环障碍的机制和干预研究[D]. 张艳达. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [4]Phactr1缺乏通过促进M1巨噬细胞极化和泡沫细胞形成促进动脉粥样硬化进展[D]. 李特. 吉林大学, 2021(01)
- [5]基于蛋白质羰基化对蛋白氧化损伤与功能受损程度的评估及其应用价值[D]. 谷文. 大连医科大学, 2021(01)
- [6]基于CaSR及Wnt/β-catenin信号通路的鸭蛋蛋清肽促钙吸收及促骨合成活性及机制研究[D]. 郭丹郡. 华中农业大学, 2020(04)
- [7]JAML在糖尿病肾病足细胞脂质代谢稳态失衡中的作用及机制[D]. 付艺. 山东大学, 2020(01)
- [8]基于多组学模式的威廉环毛蚓抗血栓成分DPf3的分离鉴定及机制研究[D]. 吴娅丽. 北京中医药大学, 2020(04)
- [9]利用蛹虫草菌丝体表达hFGF21及其降糖降脂的作用研究[D]. 张晓美. 吉林农业大学, 2020(01)
- [10]心血管手术围手术期炎症反应与凝血功能关系研究[D]. 刘孝洁. 北京协和医学院, 2020(05)
标签：高蛋白质食物论文; 蛋白质结构论文; 血清蛋白论文; 血清低密度脂蛋白论文; 抗原抗体论文;