一、永生化转基因成纤维细胞治疗帕金森病（论文文献综述）
岳学静[1]（2016）在《TGF-β1诱导RMMCs脑膜纤维化信号通路的研究》文中指出背景:脑积水（external hydrocephalus,EH）是临床常见颅脑疾病,严重影响到患者生活质量,成为沉重的家庭与社会负担。脑积水一旦形成,致残率很高。目前脑积水的临床治疗手段大多仅能缓解症状,并不能彻底治愈,因此,脑积水的治疗是神经病学科的一大难题。各种类型脑积水的共同原因是蛛网膜下腔纤维增生,粘连,软脑膜纤维化是其主要病理改变,主要表现为脑膜间皮细胞（meningeal mesothelial cells,MMCs）大量增殖以及细胞外基质的堆积。原代脑膜间皮细胞分离困难,体外培养要求条件较高,传代难度大,传多代后细胞贴壁率大幅下降,这些缺陷给体外研究带来困难,成为阻碍脑膜间皮细胞相关研究的重要技术难题。因此,体外培养脑膜间皮细胞并建立永生化细胞系可为脑膜相关疾病的研究提供方便可靠的细胞模型,对于了解脑膜间皮细胞在脑膜纤维化中的作用和功能意义重大。同时,有关脑膜纤维化的研究大多局限于影像学和组织学层面,对其分子水平的发病机制研究甚少。引起器官纤维化的细胞因子众多,近年来研究较广泛、深入的是TGF-β1（transforming growth factor-beta 1,转化生长因子-β1）。有研究结果证实,TGF-β1可引起脑膜间皮细胞CTGF（connective growth factor,结缔组织生长因子）的m RNA和蛋白表达上调,促使脑膜间皮细胞增殖并合成多种胶原等细胞外基质,导致脑膜纤维化的形成,因此阻断TGF-β1通路对抑制脑膜纤维化具有重要意义。但因TGF-β1还具有免疫调节和抑制炎性反应等重要生理功能,使直接阻断TGF-β1的治疗缺乏临床可行性,故应找寻TGF-β1下游新的治疗靶点以单纯阻断TGF-β1促纤维化的过程。p38 MAPK（p38 mitogen-activated protein kinase,p38丝裂原活化蛋白激酶）和ERK/MAPK通路（mitogen-activated protein kinases,MAPKs,丝裂原活化蛋白激酶;extracellular signal-regulated kinase,ERK,细胞外信号调节激酶）是信号转导的两条重要通路,有学者证明在多种细胞,如肺成纤维细胞,肾系膜细胞及肾成纤维细胞中p38信号通路和ERK/MAPK都可介导TGF-β1诱发的纤维化,但是两者是否参与TGF-β1对脑膜间皮细胞纤维化的诱导并不清楚。本课题尝试建立大鼠脑膜间皮细胞永生化细胞系并以外源TGF-β1为刺激因子建立体外脑膜纤维化的细胞模型,从基因转录和蛋白合成两个方面探讨p38MAPK和ERK/MAPK信号通路在TGF-β1诱导脑膜间皮细胞纤维化的具体作用,试图为脑积水的防治寻到有效的干预位点。目的:1.建立大鼠脑膜间皮细胞永生化细胞系。2.以TGF-β1为刺激因子建立体外脑膜纤维化的细胞模型,观察RMMCs中有无参与组织纤维化的p38 MAPK及ERK/MAPK的表达,并应用p38MAPK特异性抑制剂SB203580、ERK/MAPK的抑制剂U0126处理细胞,观察CTGF的表达,探讨脑膜纤维化的发生机制,为今后防治脑膜纤维化寻求有效的靶点。方法:1.大鼠原代脑膜间皮细胞的分离和培养:用胰酶消化组织块法收集大鼠原代脑膜间皮细胞;2.构建表达SV40LT的慢病毒载体并转染大鼠脑膜间皮细胞;3.应用扫描电镜、细胞免疫荧光化学、RT-PCR等技术从细胞形态、特异性标志物、目的基因的表达等方面对野生及转染SV40LT后的大鼠脑膜间皮细胞进行鉴定。4.用不同浓度的TGF-β1分别孵育培养RMMCs 24 h,采用q PCR测定CTGF的相对表达量,采用Western blotting测定p-p38MAPK、p-ERK1/2的信号强度;预先用不同浓度的SB203580或U0126处理RMMCs,观察TGF-β1诱导的CTGF表达是否受影响。采用q PCR测定CTGF m RNA的相对表达量,采用Western blotting测定CTGF蛋白质表达水平。结果:1.体外成功培养大鼠原代脑膜间皮细胞。分离培养的RMMCs在倒置显微镜下观察:细胞为多边形,汇合时呈铺路石样排列;扫描电镜下可见细胞表面有大量密集突起的绒毛;免疫细胞化学鉴定结果显示RMMCs抗波形蛋白抗原阳性,抗细胞角蛋白抗原阳性,抗第VIII因子相关抗原阴性,流式细胞术检测培养细胞的纯度达90%以上。2.构建含SV40LT基因的慢病毒表达载体,并成功转染RMMCs。转染后挑选单克隆RMMCs鉴定,扫描电镜下可见细胞表面有大量密集突起的绒毛;免疫细胞化学鉴定结果显示抗波形蛋白抗原阳性,抗细胞角蛋白抗原阳性,抗第VIII因子相关抗原阴性;RT-PCR鉴定目的基因SV40LT成功整合入RMMCs基因组。3.TGF-β1可诱导体外RMMC细胞发生纤维化,表现为纤维化标志物CTGF表达水平的显着增加;4.TGF-β1以浓度依赖的方式诱导脑膜间皮细胞中p38 MAPK通路的活化,SB203580可阻断TGF-β1对该信号通路的活化,并强烈抑制纤维化标记物CTGF的表达。SB203580预处理细胞后,再应用TGF-β1刺激,CTGF的诱导表达几乎被完全抑制。5.TGF-β1以浓度依赖的方式诱导脑膜间皮细胞中ERK/MAPK通路的活化。U0126可阻断TGF-β1对该信号通路的活化,但纤维化标志物CTGF的诱导表达不受影响。结论:1.经SV40LT的慢病毒载体成功建立RMMCs永生化细胞系。2.TGF-β1可通过激活p38 MAPK通路促进体外培养的脑膜间皮细胞CTGF表达。TGF-β1活化p38 MAPK通路促进CTGF表达是其致脑膜纤维化的重要机制之一。3.TGF-β1可以诱导细胞中ERK/MAPK通路的活化,但ERK/MAPK通路不参与TGF-β1致脑膜纤维化的过程。4.TGF-β1可通过多种途径促进体外培养的脑膜间皮细胞CTGF表达。
牛星[2]（2016）在《人端粒酶（hTERT）表达促进剂的筛选及其抗衰老活性研究》文中进行了进一步梳理衰老是人类健康领域的重大科学问题之一,由其引起的机体组织器官衰老问题也给整个生命科学和医学领域带来了严峻的挑战。研究表明,端粒对于细胞复制性衰老、整体性衰老以及由其引起的衰老相关疾病等生理病理过程起着重要的作用,端粒长度更被作为一种与生物衰老相关的标志物。端粒酶是细胞中负责延长端粒的一种核糖核蛋白复合体,其活性与人端粒酶逆转录酶（hTERT）表达密切相关,外源性表达hTERT可以提高细胞端粒酶活性,赋予其抗衰老或永生化能力。因此,hTERT表达促进剂有望成为抗衰老的新策略。本论文利用荧光素酶报告系统,构建促进hTERT表达化合物的筛选系统,对来自天津科技大学药物合成实验室的156种小分子化合物进行筛选,获得一种促进hTERT表达的化合物HKL2-3-35。分别用终浓度为4 μM和8 的化合物HKL2-3-35处理宫颈癌HeLa细胞,结果发现HKL2-3-35能够促进端粒的延长,促进细胞增殖和迁移,研究表明HKL2-3-35能够加快细胞由G1至S期的转换。同时,用终浓度为0.25μM和0.5 的化合物HKL2-3-35处理人胚胎成纤维细胞,发现化合物HKL2-3-35具有明显的抗衰老作用。另外,本论文对生活中接触到的系列环境因子化合物进行筛选,发现乙酸、咖啡因和乙酸乙酯能够促进hTERT的表达,与化合物HKL2-3-35促进效果相似,但具有更高的特异性。进一步研究发现,HeLa细胞经乙酸处理后,p21及p53 mRNA水平分别下调58.6%和31.4%;咖啡因处理后,p21及p53 mRNA水平分别下调11.6%和31.3%,表明hTERT表达促进剂可以加快细胞周期,增强细胞活力,减缓细胞衰老。综上所述,本论文筛选出化合物HKL2-3-3、乙酸、咖啡因和乙酸乙酯四种hTERT表达促进剂,为端粒酶的抗衰老机制研究提供更多的理论支持,也为开发治疗衰老相关疾病的药物提供新的策略。
贺小英[3]（2011）在《利用重组腺病毒介导人端粒酶催化亚基（hTERT）制备牛乳腺细胞体外模型的研究》文中提出乳腺上皮细胞是制作乳腺生物反应器并且评估乳腺特异性表达载体功能的靶细胞。由于乳腺细胞体外培养较为困难,到目前为止,能够用于乳腺特异表达载体功能检测的细胞系并不多见。此外,大量研究表明许多细胞系存在细胞异质性、基因变异等异常现象,因此,乳腺细胞系似乎更适合作为癌症模型的研究。而建立安全有效的乳腺细胞体外研究模型是解决乳腺生物反应器制备转基因动物的关键。因此,本研究首先优化了牛乳腺细胞体外培养条件,在此基础上,利用腺病毒介导人端粒酶催化亚基（hTERT）感染牛乳腺上皮细胞（bMGEs）,获得阳性细胞株hTERT-bMGEs,并进一步对其进行细胞生物学特性及功能鉴定,获得如下主要结果:1.利用二次组织贴壁法纯化细胞效果较好（即贴壁的乳腺组织通过显微镜观察,将有直接迁出bMGEs的组织重新分离贴壁）,此法获得的细胞纯化彻底,形态良好,生物学特征稳定,细胞增殖迅速。2.通过比较不同的生长因子对bMGEs体外增殖的影响,结果发现DMEM/F12基础培养液+10%胎牛血清+2 mM谷氨酰胺+10 ng/mL表皮生长因子+10μL/mL ITS +5μg/mL胰岛素+5μg/ mL氢化可的松是bMGECs体外培养最适液。3.构建了融合表达载体pEGFP-hTERT并检测体外培养bMGEs的转染效率,结果表明利用二次组织贴壁法获得的原代bMGEs能显着提高转基因的效率,最高转基因效率能够达到33%以上。4.构建了含hTERT基因的重组腺病毒载体Ad-hTERT,并包装重组病毒rAd-hTERT,初始病毒滴度为3×107 pfu/mL,扩增后病毒滴度为2.3×1010 pfu/mL,感染bMGEs的MOI为10～20。5.实验比较了质粒载体（pEGFP-hTERT, pCI-neo-hTERT）和腺病毒介导的hTERT（Ad-hTERT）转染bMGEs的转染效率、阳性克隆率,结果表明Ad-hTERT感染bMGEs的效率是76±1%,pEGFP-hTERT转染bMGEs的效率仅有33±2%;经6-8次重复试验Ad-hTERT阳性克隆率50%,pEGFP-hTERT和pCI-neo-hTERT阳性克隆率为0。结果表明:重组腺病毒Ad-hTERT和质粒载体相比,具有高的转染效率和阳性克隆率。6.利用流式细胞仪、免疫荧光、实时定量PCR、Western blot、细胞增殖实验、TRAP-PCR等方法证实重组腺病毒介导的hTERT不仅能够刺激能bMGEs的体外增殖,而且维持了bMGEs的原始特性。尽管由于腺病毒不整合宿主染色体使得hTERT在bMGEs仅能够维持表达不到15代,但hTERT-bMGEs体外存活延长40代以上。7.通过Southern blot检测发现, hTERT-bMGEs中第5代,12代,18代,27代的端粒平均长度（TRF）为17.73 kb±0.80 kb,对照组第4代bMGEs中TRF为16.43 kb,第13代bMGEs的TRF仅为13.4 kb,结果表明端粒酶通过延长端粒长度来维持处于增殖旺盛的早期hTERT-bMGEs的寿命,在后期,p21WAF1-p53信号通路发生变化,表明端粒酶可能引发一些抑癌基因和转录因子的下调,从而促进后期没有端粒酶活性的hTERT-bMGEs的增殖。8.利用人溶菌酶乳腺特异性表达载体转染hTERT-bMGEs ,结果表明hTERT-bMGEs能够提高乳腺特异性表达载体的转染效率和阳性克隆率,在激素刺激下人溶菌酶在hTERT-bMGEs能够有效分泌表达。结果表明hTERT-bMGEs能够有效地用于评估乳腺特性表达载体的功能。9.以hTERT-bMGEs作为供核细胞,观察核移植重构胚的发育情况及胚胎质量,通过第18代和28代的hTERT-bMGEs比较结果发现不同代数的核供体细胞对核移植胚胎的发育率无显着影响,但是相比较第10代bMGEs,第28代的hTERT-bMGEs具有高的囊胚发育率和较高胚胎质量,结果证明hTERT-bMGEs可以作为体细胞核移植的供核细胞。
王婷[4]（2008）在《柔脑膜细胞具有神经干细胞特性的实验研究》文中进行了进一步梳理长期以来脑膜被视为是仅具有保护作用的非神经组织,在结构和功能上与脑实质有本质的不同,但在上世纪90年代Mercier等应用形态学方法清晰地勾勒出柔脑膜细胞与脑实质内胶质细胞、神经元之间有网状的复杂联系,从而提出柔脑膜细胞参与脑内某些生理或病理过程的可能性,引发了对柔脑膜功能的深入思考。新近的一些研究发现:脑膜中的柔脑膜细胞（leptomeningeal cells）表达和分泌多种细胞因子和生物活性物质,参与中枢的免疫调节和诱导发育神经元的迁移定位,并与小脑功能的完善及脑内酶屏障的构成密切相关。但是,柔脑膜细胞与神经元生长、分化的关系还存在争议。有研究认为柔脑膜细胞分泌的抑制神经突起生长的因子是神经元损伤后修复的障碍;也有研究指出柔脑膜细胞能分泌神经生长因子等多种促神经突起再生的因子,并作为滋养层支持神经干细胞的体外生长。新近的研究还注意到成年大鼠柔脑膜层有神经干细胞标记物Lex/ssea-1的表达。这些结果提示柔脑膜细胞与神经系统损伤修复、尤其与神经干细胞之间可能存在着某种特殊联系,为进一步探索柔脑膜细胞的功能提供了新思路。针对以上问题,我们以柔脑膜细胞为研究对象,设计了五组实验,从在体和体外细胞培养的角度,结合应用柔脑膜铺片、细胞培养、免疫组织化学染色、免疫荧光标记、BrdU掺入实验、Western blot等研究方法,对柔脑膜细胞可能具有的神经干细胞特性做了初步探讨。第一组实验观察了正常成年以及不同生长发育期大鼠脑内柔脑膜细胞是否表达经典的神经干细胞标志巢蛋白（nestin）;第二组实验在成功建立单纯柔脑膜细胞培养体系的基础上,检测了柔脑膜细胞能否表现出自我更新以及多向分化等神经干细胞的生物特性;第三组至第五组实验分别观察了不同调控因素（白细胞介素-6、抗抑郁药物以及机械损伤）对于柔脑膜来源神经干细胞增殖分化的影响。主要结果有:实验一一、正常成年SD大鼠及Balb/c小鼠的柔脑膜层中均可检测到神经干细胞特异性标记物nestin的表达,但表达水平低,主要局限于脑腹侧及大脑镰两侧的脑膜组织。两种动物柔脑膜组织中阳性细胞的形态与分布存在差异。二、不同生长发育期SD大鼠的柔脑膜细胞中nestin蛋白表达水平随生长发育呈进行性降低。柔脑膜铺片中除nestin/Thy1.1双标阳性的柔脑膜细胞外,也有GFAP/nestin阳性细胞存在。以上结果说明,不同生长发育期SD大鼠的柔脑膜细胞均可表达神经干细胞标志nestin,即具有神经前体细胞的增殖潜能,但此潜能随生长发育而进行性减弱。实验二一、比较脑膜组织在不同培养条件下柔脑膜细胞的纯度,发现以DMEM/5%FCS/5%HS培养时,培养体系中除柔脑膜细胞外,还存在约30%的星形胶质细胞和少量神经元;以DMEM/1%FCS/9%HS培养时,柔脑膜细胞纯度达90%以上,几乎没有神经元沾染。后者继续传代可使其纯度达97%以上,仅有极少数星形胶质细胞存活。结果提示改变培养条件及多次传代是建立单纯柔脑膜细胞体系的有效方法。二、检测单纯培养的柔脑膜细胞是否具有神经干细胞的基本生物学特性。发现:给予含生长因子EGF/bFGF的无血清条件性培养基后,柔脑膜细胞可自我增殖形成神经球样结构,其成球性呈bFGF浓度依赖性;再以胎牛血清诱导分化,可见除Thy1.1阳性的柔脑膜细胞外,还可分化为β-tubulin III、GFAP、RIP阳性的神经元及胶质细胞;并且柔脑膜细胞经多次传代仍可形成克隆球及多向分化,但能力逐渐减弱。以上结果说明,间充质来源的柔脑膜细胞经体外分离培养后能够表现出自我更新以及多向分化等神经干细胞的基本生物学特性,并可分化形成神经元。实验三一、白细胞介素-6（IL-6）可以诱导柔脑膜来源的神经球向神经元及胶质细胞多向分化,并显着提高分化神经元的比例。以多种神经元标记物鉴定分化神经元性质,提示其为5-HT阳性的未成熟神经元。二、免疫细胞化学染色及Western blotting结果均提示,IL-6孵育可显着上调其自身受体（IL-6Rα及gp130）在柔脑膜来源神经球内的表达,为柔脑膜细胞感受IL-6信号并发生应答反应提供了形态学基础。三、上述体系中,IL-6也引起磷酸化ERK1/2及STAT3分子在柔脑膜来源神经球中的表达。而分别给予其特异性抑制剂PD98059及AG490后,发现ERK1/2通路磷酸化的抑制可影响神经球向神经元及胶质细胞的分化,而STAT3通路磷酸化的抑制则以星形胶质细胞分化的受抑为主。同时, STAT3分子磷酸化提示gp130处于活化状态。以上结果说明,细胞因子IL-6可促进柔脑膜来源神经干细胞向神经元分化,而分化神经元呈5-HT反应阳性。IL-6刺激引起了其自身受体及磷酸化ERK1/2及STAT3信号分子在该细胞体系中的表达,提示上述细胞内分子机制可能参与了柔脑膜细胞向神经元、胶质细胞的分化。实验四一、以抗抑郁药物西酞普兰孵育柔脑膜来源的神经球,发现:西酞普兰能够维持神经球的克隆化生长、促进细胞增殖,并引起细胞内ERK1/2、STAT3信号分子磷酸化;以信号通路抑制剂预处理的结果显示,西酞普兰诱导细胞增殖的效应表现为ERK1/2通路依赖性。二、观察西酞普兰孵育对柔脑膜来源的已贴壁分化的神经干细胞的影响,发现:西酞普兰可促进神经干细胞继续分化,并显着上调分化神经元的比例;同时也引起了分化细胞内磷酸化ERK1/2、STAT3分子的表达。以信号通路抑制剂预处理的结果显示,上述体系中神经元和胶质细胞的分化分别表现为ERK1/2或STAT3通路依赖性。以上结果说明,西酞普兰可以诱导柔脑膜来源神经干细胞的增殖,也可促进其向神经元分化。但是调控细胞增殖分化的机制不同,分别表现为ERK1/2通路或ERK1/2及STAT3通路依赖性。实验五一、建立柔脑膜细胞的体外机械损伤模型,检测机械损伤对细胞增殖及逆分化的影响。结果显示:划伤刺激促进了柔脑膜细胞增殖,但不能诱导其表达nestin蛋白;而含生长因子的无血清条件性培养基可诱导损伤细胞形成神经球,后者在血清存在时向神经元及胶质细胞分化。二、观察损伤的柔脑膜细胞对正常星形胶质细胞增殖及逆分化的影响,发现:损伤的柔脑膜细胞可以诱导正常星形胶质细胞增殖并表达nestin,后者也可形成神经球并向神经元、胶质细胞分化。以上结果说明,机械损伤虽然不能直接诱导柔脑膜细胞分化为神经前体细胞,但可以刺激细胞分泌某些活性物质,诱导与之共培养的星形胶质细胞增殖并逆分化为神经前体细胞。并且,细胞微环境对于细胞能否表现出神经干细胞特性具有重要意义。结论本研究从不同的角度证实:起源于间充质组织的柔脑膜细胞能够表现出神经干细胞的基本特性,自我增殖并在适当条件下分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞;不同性质的刺激（细胞因子、抗抑郁药物以及机械损伤等）可调控其增殖分化;神经系统损伤时,柔脑膜细胞可能分泌活性物质而参与诱导脑内内源性神经干细胞的增殖活化。根据以上结果,我们提出了脑膜细胞可能是脑内潜在的神经干细胞的观点。这些初步发现将为我们更加全面、深入地认识柔脑膜细胞的功能奠定了基础,为神经损伤后的干细胞修复提供了新的思路。
高昆[5]（2007）在《恒河猴骨髓间充质干细胞永生细胞系构建》文中指出背景和目的骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）具有多向分化潜能和低免疫原性，是细胞移植治疗和组织工程的良好选择。然而我们研究发现，恒河猴骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells from bone marrow of Rhesus monkey，RhBMSCs）体外增殖能力有限，传至20代细胞生长基本停滞。这必然限制了其在细胞移植和组织工程等领域中的研究和应用。建立永生化细胞系可能会有效地解决这一问题，从而为生物医学研究提供了标准化的工具细胞。材料与方法采用不同的分离方法和不同的培养方案对3岁龄的恒河猴BMSCs进行分离培养，并从形态学、表面抗原、分化潜能以及核型等方面进行鉴定；将含有人源端粒酶逆转录酶基因（human telomerase reverse transcriptase gene，hTERT）的质粒载体pCI-neo-hTERT稳定转入第2代RhBMSCs，并对转染细胞进行外源基因hTERT表达的RT-PCR检测；通过特异性抗原（SH-2、SH-3、SB-10、CD29、CD34、CD45和HLA-DR）检测、成骨诱导以及核型分析对细胞进行鉴定；传代培养、MTS法和细胞凋亡的流式检测分析细胞生长活性；裸鼠致瘤实验测定其有无致瘤性。结果结果表明hTERT基因可以成功转入RhBMSCs；转基因RhBMSCs表现出旺盛的增殖活性，相对于第15代未转基因RhBMSCs的33．5％的凋亡率来说，第40代转基因RhBMSCs的凋亡率只有4．5％，RhBMSCs的“寿命”明显得到延长；转基因RhBMSCs保持了正常RhBMSCs的细胞形态、克隆生长特性及核型；特异性抗原SH-2、SH-3、SB-10、CD29表达率均高于95％，CD34、CD45、HLA-DR表达率均低于4．5％，表型正常，纯度较高；转基因RhBMSCs保持了正常RhBMSCs的分化潜能；裸鼠致瘤实验结果呈良性。结论本研究证实了外源基因hTERT已成功转入RhBMSCs，首次通过转入hTERT的方式使RhBMSCs的体外传代“寿命”得以延长，细胞除了表现出旺盛的增殖活力外，其维持了与未转染的细胞相类似的表型（SH-2、SH-3、SB-10、CD29、CD34、CD45和HLA-DR）、核型和分化潜能。这将为应用基础研究提供稳定、安全、充足的标准化工具细胞来源。另外，在构建过程中涉及到的RhBMSCs分离、扩增、转染、鉴定和分化的方法和结果，不仅有助于我们了解与之近似的人的骨髓间充质干细胞的相关特性，而且也为以猕猴为动物模型的相关医学实验和移植临床前研究提供了基础数据。
庞全海[6]（2005）在《山羊骨髓间充质干细胞的分离培养及体外分化潜能的研究》文中认为骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）是来自于骨髓的两种干细胞之一,在人、小鼠、大鼠、兔、猪等许多物种的研究证明了该类干细胞具有体外分化为多种细胞表型的能力,有望成为未来细胞/基因治疗、组织工程的主要种子细胞之一。但是,迄今未见关于山羊,特别是成年山羊骨髓间充质干细胞分离、培养、分化等方面的系统研究报道。本研究目的在于阐明山羊骨髓间充质干细胞的生物学性能及其分化潜能,以便未来利用该类细胞作为疾病细胞/基因治疗的模型,以及利用该类细胞作为细胞生物反应器体外生产生物活性物质,进而建立山羊骨髓间充质干细胞细胞系。为此,本试验利用成年关中奶山羊为对象,较为系统全面地研究了其骨髓间充质干细胞的分离、培养、扩增、形态学、生长特性、细胞表面标志,以及体外诱导分化能力。结果如下: 1. 本试验应用贴壁分离法或密度梯度离心法成功分离获得关中奶山羊髂骨骨髓间充质干细胞,体外培养到第21 代,仍然保持其干细胞的特性,并已扩增到2.8×108细胞。2. 本试验所分离的关中奶山羊骨髓间充质干细胞呈多角形、三角形或长梭形,类似于人和其他物种的间充质干细胞。3. 扫描电镜下,山羊骨髓间充质干细胞表面较为粗糙,有多个突起,并有较多微棘和丝突,当多个细胞同时存在时,这些丝突相互搭接成网状。透射电镜下,山羊骨髓间充质干细胞的结构与其他物种基本相似,即表现为细胞内有大量扩张的粗面内质网、线粒体,分泌功能旺盛,具有该类细胞的典型特征:细胞核质比大、胞浆中细胞器少、核仁明显处于功能静息期。4. 免疫细胞化学分析表明,山羊骨髓间充质干细胞能够表达间充质干细胞的表面标志CD29、CD44、CD105、CD106 以及CD166（阳性）,而不表达造血干细胞的标志CD14、CD34、CD45、c-kit （阴性）,和其他物种的骨髓间充质干细胞相似。这些标志的检测有助于鉴定间充质干细胞。但本试验还发现,山羊骨髓间充质干细胞也表达TGF-α,其意义需要进一步阐明。5. 山羊骨髓间充质干细胞可以在体外用5-氮胞苷诱导分化为心肌细胞表型,能够表达α-actin 抗原,呈PAS 染色阳性,并分泌糖原,从而为未来利用这种细胞进行心脏疾病细胞/基因治疗的模型研究提供了科学依据。同时,这也是和骨髓造血干细胞的区别之一。6. 用HGF 和尼克酰胺向胰岛β-细胞诱导后,山羊骨髓间充质干细胞能够变为较典
徐强[7]（2004）在《TH基因修饰骨髓基质细胞源神经干细胞自体移植治疗恒河猴帕金森病模型》文中提出一．概述 帕金森病是1817年英国医生James Parkinson描述的，以运动困难、肌肉强直、静止性震颤为特征的锥体外系疾病。多在50～65岁起病，呈进行性缓慢病程，主要病理变化是黑质纹状体区的多巴胺能神经元的变性、缺失，导致脑内多巴胺能神经递质相对减少，但其病因和发病机制尚不十分明确。目前，药物治疗、各种外科治疗（核团损毁术和DBS）只限于症状控制，并不能阻止帕金森病患者的病程进展。随着神经干细胞、分子克隆和重组基因技术的逐渐成熟，使神经干细胞基因治疗帕金森病的前景更加光明。 目前，PD基因治疗研究主要有两个方向：一是脑内导入酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）基因，通过TH基因的有效表达，提高脑内DA水平，以缓解PD症状；或导入各种神经营养因子或抗凋亡基因（bcl-2）、抗氧化基因（CuZnSOD和MnSOD），改善黑质-纹状体的微环境，保护DA能神经元。二是联合基因治疗，即脑内导入两种以上的目的基因，希望同时达到上述目的。基因治疗的方法主要有：①体内直接转染法：把携带有治疗基因的载体（非病毒、病毒）直接注入到纹状体区，通过与周围细胞的粘附、吞饮、渗透、进入细胞内并与细胞内的染色体整合，或独自表达，表达产物的释放，起到生物药物泵的作用，发挥治疗作用，此方法简便、直接，但转染率低，易受到体内溶酶体中核酸酶的降解，靶向性差，基因表达程度低，可控性差，无法进行筛选和鉴定。②体外细胞介导法：体外细胞介导基因治疗结合基因转移技术和 弟一军医大学二零零一级博士学位论文导师:徐如祥教授脑内移植，可以在体外通过分子和生物化学技术对基因表达进行评估，首先是通过载体把目的基因转入到培养的靶细胞内，在体外进行筛选、鉴定，再进行扩增，然后移植于靶位点，转基因的表达功能通过生化技术和实验动物行为进行评估和监测。 帕金森病基因治疗的靶细胞有成纤维细胞，原代骨骼肌细胞、胶质细胞、胚胎中脑细胞、神经干细胞等。重组成纤维细胞、原代骨骼肌细胞虽然易于培养，能够发挥一定的治疗作用，但在脑内成活时间短、成活率低，不能与宿主细胞产生突触联系;胚胎中脑细胞、胚胎神经干细胞、成体神经干细胞存在非自体来源和来源有限的问题，限制了在帕金森病基因治疗上的应用。由于骨髓基质细胞容易获取，可以在体外大量扩增，而且可在一定条件下诱导成神经细胞并运用于自体移植，这为神经干细胞的应用提供了无限制的来源。骨髓源神经干细胞（NSCs一BMSCS）的开发和应用，克服了从脑组织获取神经干细胞的危险性和局限性，也避免了胎儿组织移植中存在的伦理、免疫排斥、来源有限等问题。以骨髓源神经干细胞为载体，进行基因转染、定向诱导神经干细胞为DA能神经元，替代变性的多巴胺能神经元，同时，神经干细胞分泌的神经营养因子则可以改善局部的微环境，起着营养支持的作用，从而可根本上遏制帕金森病的渐进病程。 本研究采用分子克隆、骨髓源神经干细胞培养和脑立体定向细胞移植等实验技术，将hTH基因分别构建入pEGFP一cZ和peDNA3.IHis真核表达载体中，构建了pEGFP一cZ一hTH和PcDNA3.IHis一hTH。同时，纯化提取pEGFP一cZ质粒，酶切鉴定后分别转入培养的骨髓源性神经干细胞，体外进行其基因表达情况的观察，证实成功表达后，将转染的骨髓源性神经干细胞定向注射入经右颈总动脉注射MPTP制作的偏侧恒河猴帕金森病模型的尾状核头部和黑质部位。移植后定期观察恒河猴的动作行为变化。5个月后行头部’“F一FDG PET、MRI和”9mrI’c一TRoDAf一lSPECT检查，分别观察细胞移植后脑内的代谢、结构和脑内DA能神经元的分布。最后，免疫组织化学观察移植细胞的分布情况。第7页第一军医大学二零零一级博士学位论文导师:徐条祥教授二.本实验的主要方法和结果:1.为适时观察基因在细胞内的表达，以户从VZ一TH为模板，PcR扩增，携带Eco班和BamHI双酶切位点的hTH目的片段，大小为1，500bp。 回收PcR产物与与pEGFP一cZ的双酶切片段连接，连接产物转化感 受态BL21，卡那霉素抗性筛选阳性克隆。提取质粒经酶切和测序鉴 定，结果显示:hTH目的片段测序结果与报道序列（gi:37 1 26）同源 性达100%;pEGFP一cZ一hTH酶切片段大小正确，说明已成功地将 hTH基因克隆到荧光表达载体pEGFP一cZ上。pEGFP一cZ为真核荧 光表达载体，5’端连接有报告基因即增强绿色荧光蛋白（enhance green fluorescent protein，EGFP）基因，EGFP在紫外光激发下可发强 绿色荧光，能较好的标示出细胞转染情况。2.为移植后跟踪移植细胞的迁移分布情况，以p认钱VZ一TH为模板，PCR 扩增携带KPul和xbal双酶切位点的hTH目的片段，大小为1，500bp。 回收peR产物与KPnl和Xbal双酶切peDNA3.lhis片段连接，连接 产物转化感受态大肠杆菌，氨节青霉素抗性筛选阳性克隆。提取质粒 经酶切和测序鉴定，结果显示:hTH目的片段测序结果与报道序列同 源性达100%;PcDNA3.lhis一hTH酶切片段大小正确，说明已成功地 将盯H基因克隆到真核表达载体PcDNA3 .lhis中。其中，PcDNA3.lllis
赵慧英[8]（2004）在《神经干细胞和皮肤干细胞的体外培养及诱导分化神经细胞的研究》文中指出成体干细胞的发现及其诱导分化为神经细胞的研究为人类及动物神经系统各种疾病的治疗和损伤的修复开辟了一条新途径。为了寻求一种自体取材方便、安全有效的可用于诱导分化为神经细胞的成体干细胞，为神经系统疾病的替代治疗提供理想的移植材料。本实验在建立了胚胎小鼠神经干细胞和山羊皮肤干细胞体外分离、培养体系的基础上，分别对神经干细胞定向诱导分化多巴胺能神经元和皮肤干细胞诱导分化神经细胞的条件进行了研究。1．分离培养了小鼠胚胎大脑皮层神经干细胞。原代细胞在培养的第2～3 d即可见到分裂形成的细胞球，5～7 d形成许多大的神经球；生长曲线显示神经干细胞的生长呈持续增长趋势；单细胞克隆试验显示单个细胞可以自我分裂增殖形成神经球，构成的神经球的细胞继续传代培养，同样具有增殖和分化能力，其克隆率可达到93%；所培养的神经球经免疫细胞化学反应呈nestin阳性着色。2．分离神经干细胞时采用先机械吹打、过滤、静置，取上清，再离心的方法，换液时采取只加入不吸弃的方法，有利于获得纯化、健康的神经干细胞。采用只添加bFGF的干细胞培养液培养，可保持神经干细胞长期增殖并传至12代。培养液中撤除bFGF，并添加2%～5%的FBS后，神经干细胞所分化的细胞分别呈NF、GAFP和Galc-C阳性表达，表明神经干细胞可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，三者分别占分化细胞的21.1%、59.7%、19.2%。3．将NSCs重悬于含10% BSA和8% DMSO的NSCs冻存液中，采取4℃放置30 min→-20℃放置2 hr→放置液氮管口，气相中下降3次，每次30 min→最后置于液氮中的步骤冻存细胞；按常规方法对冻存细胞用1%～2% BSA的神经干细胞复苏液进行复苏，观察细胞复苏后的存活率。结果证明冻存时间长短对细胞的存活率的影响差异不显着，各代冻存细胞之间复苏后的存活率无显着性差异。 4．成功地用含2% B27、100 pg/mL白细胞介素-1、0.05 g/L维生素C、5 u/mL红细胞生成素的DMEM/F12组成的诱导剂将大脑皮质和中脑来源的神经干细胞诱导分化为多巴胺能神经元。所诱导细胞具有典型的神经细胞的形态特征，进行TH抗体免疫细胞化学染色鉴定，细胞的胞质呈棕黄色阳性着色，胞核不着色呈空泡状。TH表达的阳性细胞率，随着诱导时间的增加而增加；中脑来源的神经干细胞的诱导细胞的TH阳性率明显高于大脑皮层来源的神经干细胞的诱导细胞的TH阳性率，数据统计分析显示二者差异极显着；中脑源和大脑源的神经干细胞诱导的TH细胞的阳性率分别达到22.49%、10.65%。 <WP=7>5．用纹状体提取液与DMEM/F12按1∶1的比例组成的诱导液将中脑来源的14.49%的神经干细胞诱导为多巴胺能神经元，低于诱导剂组诱导分化的多巴胺能神经元。6．山羊皮肤干细胞在体外培养开始呈圆形或椭圆型、核大而明显，随后成集落样生长，并可维持14～20天。在角质细胞无血清条件培养液和自制的干细胞普通培养液均生长良好，两种培养液对皮肤干细胞克隆形成率的影响不显着,但对克隆持续时间的影响差异显着,且条件培养液中的皮肤干细胞克隆持续时间显着地高于普通培养液的干细胞克隆持续时间。皮肤干细胞在胚胎小鼠成纤维细胞饲养层和山羊成纤维细胞饲养层上均生长良好，两种饲养层细胞对皮肤干细胞克隆开始形成的时间的影响差异不显着，但对皮肤干细胞克隆持续时间的影响差异显着（P=0.049<0.05），胚胎小鼠成纤维细胞饲养层组显着地大于山羊成纤维细胞组。7．皮肤干细胞及干细胞克隆均表达整合素-β1，大小较一致呈圆形的细胞，其胞质被染成棕黄色，中央的细胞核不着色，如圆环，克隆样集落则整个被染成棕黄色。8．由山羊神经干细胞培养液上清1份与山羊成纤维细胞培养液上清1份混合，再添加10 ng/mL IGF-1和0.05 g/L Vc组成的诱导液可有效地将12％的山羊皮肤干细胞诱导为神经元样细胞。在培养的第5天可见3%的皮肤干细胞形状变长，有突起样的结构从细胞发出并呈神经细胞样结构；随诱导时间延长,突起更加明显,到第8～10天可以看到形状典型的神经细胞，皮肤干细胞变为神经元样的细胞。经免疫细胞化学染色，神经元样细胞呈NF染色阳性，证明为神经细胞。
刘瑾[9]（2004）在《版纳微型猪近交系骨髓间充质干细胞永生细胞系的构建和免疫调节研究》文中进行了进一步梳理除了探索生命奥秘的科学价值外，干细胞的研究将在人工器官、组织工程、创伤修复和人体功能重建的临床医学中有着极为广阔的应用前景。作为人体干细胞研究的外延，各种动物、特别是医学相关动物干细胞的研究也已悄然兴起。 间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）不仅具有自我更新和多向分化潜能，而且是造血系统的主要支持细胞，被认为是临床干细胞治疗的理想细胞来源和基因治疗的理想细胞载体。免疫排斥和器官的获得是当今移植的两大障碍，干细胞移植的核心问题仍是免疫学问题。 降低移植物免疫原性和抑制受体免疫系统功能是当前同种异体临床和实验模型中常用的的避免和延迟排斥的方法。MSCs在同种异体临床和实验模型中移植后，能被宿主“接受”，并且在宿主体内长期存活（Horwitz et al．，2002）。不仅如此，将MSCs与同种异体皮肤共同移植后，皮肤存活时间明显延长（Bartholomew et al．，2002）；与造血干细胞共同移植后，HSC“存活”率提高（Koc et al．，2000），以上资料提示，MSCs可能具有低免疫原和免疫调节特性。最近，对MSCs抑制同种异体T淋巴细胞增殖活性的免疫调节研究也取得较大进展，在干细胞研究领域掀起了新四川大学博士学位论文一轮热潮（Tse et al.，2003;Di Nieola et al.，2002;Krampera et al.，2002）。 供器官来源严重不足的问题已严重阻碍了器官移植术的推广和应用，无论怎样开发，人体器官总是有限的。面对这样严峻的考验，异种移植己被考虑为同种异体移植可能的有效替代途径之一。免疫排斥仍然是异种移植的第一障碍，Saito等（1999）的研究极大突破了以往人们对异种移植免疫排斥的认识，为异种成体干细胞移植提供了新的契机，但迄今为止，关于MSCs在异种移植中的免疫调节现象及其分子机制的研究少之又少，不利于异种MSCs的开发和应用。 版纳微型猪近交系（banna mini一pig inbred一line，BMI）己近交繁育到第20世代，为世界唯一育成的近交系大动物，是异种移植中很有希望的供器官源。此近交系猪来源的MSCs在干细胞治疗的基础和临床研究中尤有价值。然而，MSCs的衰老和有限的增殖能力限制了它在体外的大量增殖及对其生物学特征的深入理解，从而阻碍了其在临床和实验体系中的应用，建立成体MSCs永生细胞系迫在眉睫。有文献报道，表达猴病毒40（simian virus 40，SV4o）大T抗原足以使某些体细胞和干细胞逃避衰老而永生化，因此该研究旨在（1）通过转基因技术将SV40抗衰老基因导入BMI一MSCs，构建永生细胞系，并鉴定永生化MSCs干细胞形态和生长特性，特异抗原表达，多向分化潜能和致瘤性，探讨其在移植和材料生物相容性评价中的应用前景。（2）应用单向淋巴细胞混合培养模型，系统研究永生化BMI一MSCS对异种T淋巴细胞增殖的免疫原及免疫调节特性，初步探讨了其免疫抑制的分子机制，展望其在免疫调节和创伤修复中的应用前景。材料与方法 永生化BMI一MSCs的构建:密度梯度离心和贴壁法从第18世代BMI的骨髓中分离原代MSCs。将含有SV40大T抗原和新霉素抗性基因的质粒pSV3neo导入第3代BMI一MSCs。细胞增殖，干细胞标一记物表达，四川大学博卜学位论文分化潜能，衰老和致瘤性等用常规方法检测。 1.2x1O4hPBLS分别与等比例丝裂霉素C处理的永生化BMI一MSCs，BMI一PBLs，人脐静脉内皮细胞株ECV-304或10林g/m 1 Co叭于96孔板共培养6天，以确定永生化BMI一MSCS的免疫原性。调整BMI一MSCS的剂量，加入时间和混合培养时间，评价BMI一MSCS对hLPBL作用的剂量和时间依赖关系。用培养池隔离BMI一MSCs和hPBLS，混培后评价细胞·细胞接触对抑制效应的影响。TGF一pl、FasL和IL一10抗体加入混培体系，观察它们是否能阻碍BMI一MSCs的抑制作用。用MTS法测定细胞增殖。结果以刺激指数51（Stimulation Index）和抑制率表示。结果 （l）原代BMI一MsCs持续增殖20代后，生长停滞，SA一p一Gal阳性率高达85%，流式分析显示，第15代BMI一MSCs在DNA含量小于2n的区域出现明显的“凋亡峰”，提示此细胞群体在传代过程中，细胞逐渐衰老。 （2） sv40转基因BMI一MSCs连续传180代后仍保持旺盛的增殖能力，而仅少量细胞SA一p一Gal表达阳性，细胞凋亡率极低，导入SV40的BMI一MSCS‘。寿命，，明显延长，获得‘泳生”。 （3）sv40转基因BMI一MSCs保持了正常BMI一MSCs的细胞形态，克隆生长特性、以及干细胞特异抗原的表达。明确了单克隆抗体SH一2、SH一3、SH一4、SB一10、SB一20、SB一21对应抗原在BMI一MSCs的表达分布规律。 （4）永生化BMI一MSCs保持了正常BMI一MSCs的成骨分化功能，能够促进多孔陶瓷材料的体内成骨。 （5）永生化BM卜MSCs与正常BMI一MSCs一样，生长有锚着依赖性，在裸鼠体内未表现致瘤性。 （6）永生化BMI一MSCs不引起hpBLs的增殖反应，而同为BMI来源四川大学博上学位论文的PBLs，ECV一304和ConA却能刺激hPBL增殖。结果提示BMI一MSCs可逃避异种T细胞的识别，具有低免疫原性。 （7）永生化BMI一MSCs对抗原或非抗原刺激引起的异种T细胞增殖均有抑制效应，且呈时间和剂量依赖关系。此结果提
孙兵[10]（2004）在《表达GDNF的骨髓基质干细胞治疗帕金森病的实验研究》文中指出帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是60岁以上患者高发的一种神经系统变性疾病，其主要特征是由于黑质纹状体多巴胺（DA）神经元缺失，临床表现为运动徐缓、静止性震颤、齿轮样强直等症状。但目前仍没有有效的方法中止和延缓黑质多巴胺神经元的进行性病变。近年来，PD的治疗的研究发展迅速，方法也是多种多样，基因治疗已进入临床实验。由于表达稳定、表达时程长，干细胞介导的基因治疗已成为目前研究的热点，因此，本文对应用表达GDNF的骨髓基质干细胞治疗帕金森病进行了初步研究。 细胞介导的基因治疗的疗效取决于两个方面，即目的基因和载体细胞。根据文献报道，我们选择胶质细胞源性神经营养因子（glial cell linederived neurotrophic factor，GDNF）为目的基因。GDNF是中脑多巴胺神经元的神经营养因子，也是TGF-βs超家族中的一员，被认为是目前保护多巴胺能神经元最有效的神经生长因子，以往的实验表明GDNF长期作用下可以显着增加黑质纹状体的多巴胺能神经元的数量，并能有效改善其神经缺失症状。我们在第一部分实验中，从大鼠的胎脑组织中成功地克隆了GDNF全长cDNA序列，测序结果与Genebank完全一致。 中枢神经系统移植的载体细胞应具备以下特点：（1）细胞容易分离获取；（2）能够在体内长期存活；（3）有效地表达目的基因；（4）不会引起宿主的免疫排斥反应。目前多种供体细胞已应用于神经移植，如成纤维细胞，雪旺氏细胞，星型胶质细胞，肾上腺髓质细胞，胎脑多巴胺能神经元，都取得了一定的疗效。但仍然存在着一些问题，如成纤维细胞容易表达GDNF的骨益纂质十细胞治疗帕金森病的实验研究中文提要户生胶原导致中枢神经系统的胶质化，星型胶质细胞培养时难以控制，胎脑移植物不能整合到宿主的组织中。最近的研究表明骨髓基质干细胞 mesenehymal Stem cell，bone marrow stroma一eells，BMSC)可以分化为神经元和星型胶质细胞;BMSC可以穿越血脑屏障，与局部的组织整合，其分化方向与细胞的迁移部位有关，即表现为迁移到脑组织中的不同位置分化为不同类型的神经细胞，无排斥反应。BMSC来源丰富、取材简便、容易分离纯化培养，在一定培养条件下，可以快速扩增，因此，BMSC是神经系统疾病基因治疗理想的细胞载体。 在得到载体细胞和目的基因后，我们进行了BMSC的基因工程化和大鼠帕金森病模型的移植治疗，BMSC能够良好地被基因工程化，在体内、外均能有效产生GDNF，并且在转染后，基本保持了BMSC的生物学性状，依然具有多向分化的潜能，在神经系统内存活较长的时间;工程细胞的移植后，GDNF在脑内的表达持续了至少21天，与对照组相比，治疗组纹状体中的TH阳性细胞的数量显着增加，并且明显改善了PD鼠行为学，证明移植BMSC一GDNF是治疗PD的有效手段。
二、永生化转基因成纤维细胞治疗帕金森病（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、永生化转基因成纤维细胞治疗帕金森病（论文提纲范文）
（1）TGF-β1诱导RMMCs脑膜纤维化信号通路的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一部分 大鼠脑膜间皮细胞永生化细胞系的建立 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分TGF-β1 诱导RMMCs脑膜纤维化信号通路的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述：脑积水、脑膜纤维化的研究进展和细胞永生化 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（2）人端粒酶（hTERT）表达促进剂的筛选及其抗衰老活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 端粒 |
| 1.1.1 端粒概述 |
| 1.1.2 端粒长度的测定方法 |
| 1.1.3 端粒酶的组成及作用 |
| 1.2 衰老 |
| 1.2.1 衰老概述 |
| 1.2.2 衰老的特征 |
| 1.2.3 衰老的研究方法 |
| 1.2.4 抗衰老药物的分类 |
| 1.3 端粒、端粒酶与衰老的关系 |
| 1.3.1 端粒与衰老的关系 |
| 1.3.2 端粒酶与衰老的关系 |
| 1.4 端粒、端粒酶与肿瘤的关系 |
| 1.5 本课题的研究内容和研究意义 |
| 1.5.1 本课题的研究意义 |
| 1.5.2 本课题的研究内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 细胞系 |
| 2.1.3 小分子化合物 |
| 2.1.4 试剂 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.1.6 主要溶液配置 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.2.3 质粒转化 |
| 2.2.4 质粒的提取 |
| 2.2.5 质粒的转染 |
| 2.2.6 荧光素酶报告实验 |
| 2.2.7 蛋白免疫印记技术 |
| 2.2.8 端粒长度检测 |
| 2.2.9 细胞增殖检测方法 |
| 2.2.10 细胞划痕实验 |
| 2.2.11 细胞周期检测 |
| 2.2.12 β-gal染色 |
| 2.2.13 DNA Ladder |
| 2.2.14 总RNA的提取 |
| 2.2.15 RNA反转录成cDNA |
| 2.2.16 RT-PCR |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 从小分子化合物库中筛选人端粒酶转录促进剂 |
| 3.1.1 人端粒酶转录促进剂(hTERT)的初步筛选 |
| 3.1.2 hTERT小分子表达促进剂的验证 |
| 3.1.3 hTERT小分子表达促进剂对细胞衰老的影响 |
| 3.2 外界环境因子对hTERT启动子活性的影响及其抗衰老活性的研究 |
| 3.2.1 外界环境因子对hTERT启动子活性的影响 |
| 3.2.2 咖啡因、乙酸、乙酸乙酯促进hTERT启动子活性的验证 |
| 3.2.3 咖啡因、乙酸、乙酸乙酯抗衰老活性研究 |
| 3.3 hTERT小分子促进剂抗衰老机制的研究 |
| 4 结论 |
| 5 展望 |
| 6 参考文献 |
| 7 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 8 致谢 |
（3）利用重组腺病毒介导人端粒酶催化亚基（hTERT）制备牛乳腺细胞体外模型的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 综述部分 |
| 第一章 牛乳腺上皮细胞研究进展 |
| 1.1 牛乳腺细胞体外培养发展历程 |
| 1.2 影响牛乳腺细胞体外增殖分化的因素 |
| 1.2.1 激素 |
| 1.2.2 细胞因子 |
| 1.2.3 细胞外基质 |
| 1.3 牛乳腺细胞的应用 |
| 1.3.1 医学领域 |
| 1.3.2 乳腺生物反应器 |
| 1.4 问题和展望 |
| 第二章 体外细胞增殖的分子学方法研究进展 |
| 2.1 端粒酶与细胞增殖调控 |
| 2.1.1 端粒和端粒酶结构 |
| 2.1.2 端粒酶与细胞增殖研究进展 |
| 2.2 SV40 与细胞增殖调控 |
| 2.2.1 SV 40 生物学特征 |
| 2.2.2 SV40 与细胞增殖研究进展 |
| 2.3 c-Myc 与细胞增殖研究进展 |
| 2.3.1 c-Myc 生物学特征 |
| 2.3.2 c-Myc 与细胞增殖研究进展 |
| 2.4 HPV E6 和 E7 与细胞增殖研究进展 |
| 2.4.1 HPV E6 和E7 生物学特征 |
| 2.4.2 HPV E6, E7 与细胞增殖研究进展 |
| 2.5 问题与前景 |
| 第三章 腺病毒及其在生物领域中的应用 |
| 3.1 腺病毒分子生物学特征 |
| 3.1.1 腺病毒基因组结构和功能 |
| 3.1.2 腺病毒基因转录和复制 |
| 3.1.3 腺病毒感染途径 |
| 3.2 AdEasyTM 技术 |
| 3.2.1 AdEasyTM 系统概要 |
| 3.2.2 腺病毒载体构建 |
| 3.3 腺病毒分子领域研究进展 |
| 3.4 前景展望 |
| 试验研究 |
| 第四章 牛乳腺上皮细胞的体外分离培养与生物学特征 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 组织块迁移法获得的bMGEs 细胞生物学特征 |
| 4.2.2 免疫荧光结果 |
| 4.2.3 bMGEs 核型分析 |
| 4.2.4 不同体外培养条件对bMGEs 生长的影响 |
| 4.2.5 bMGEs 转染效率鉴定 |
| 4.2.6 pEGFP-hTERT 转染bMGEs 转染效率鉴定 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 乳腺细胞的分离培养 |
| 4.3.2 bMGEs 体外培养条件优化 |
| 4.3.3 bMGEs 转染效率鉴定及优化 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 hTERT 基因重组腺病毒载体构建及牛乳腺细胞的表达 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 重组腺病毒载体构建 |
| 5.2.2 重组腺病毒包装 |
| 5.2.3 荧光显微镜比较真核表达载体和腺病毒的转染效率 |
| 5.2.4 流式细胞比较真核表达载体和腺病毒载体的转染效率 |
| 5.2.5 表达载体的阳性克隆率 |
| 5.2.6 阳性细胞特性 |
| 5.2.7 hTERT-bMGEs 中hTERT 的mRNA 表达 |
| 5.2.8 hTERT 的序列结果分析 |
| 5.2.9 hTERT-bMGEs 中hTERT 的表达时序性 |
| 5.2.10 端粒酶活性检测 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 hTERT-bMGEs 的体外生物学特性检测 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 Western blot 检测β-酪蛋白的表达 |
| 6.2.2 hTERT-bMGEs 增殖效率检测 |
| 6.2.3 hTERT-bMGEs 增殖可能机制 |
| 6.2.4 hTERT-bMGEs 细胞特性检测 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 hTERT-bMGEs 的转基因及核移植功能检测 |
| 7.1 材料和方法 |
| 7.1.1 细胞株和载体 |
| 7.1.2 主要试剂 |
| 7.1.3 主要仪器 |
| 7.1.4 hTERT-bMGEs 转染效率的检测 |
| 7.1.5 hTERT-bMGEs 基因转染功能的检测 |
| 7.1.6 hTERT-bMGEs 核移植囊胚发育检测 |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 乳腺特异性表达载体pEBH |
| 7.2.2 荧光显微镜和流式细胞仪鉴定hTERT-bMGEs 的转染效率 |
| 7.2.3 表达载体的阳性克隆率 |
| 7.2.4 hTERT-bMGEs 评估表达载体 |
| 7.2.5 hTERT-bMGEs 对核移植胚胎体外发育的影响 |
| 7.3 讨论 |
| 7.4 小结 |
| 全文结论 |
| 创新之处和进一步研究的课题 |
| 创新之处 |
| 进一步研究的课题 |
| 参考文献 |
| 附录一 主要溶液配制 |
| 附录二 主要仪器设备 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）柔脑膜细胞具有神经干细胞特性的实验研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献回顾 |
| 第一部分 脑膜功能的研究进展 |
| 第二部分 神经科学领域干细胞的研究进展与应用前景 |
| 前言 |
| 正文 |
| 实验一 神经干细胞特异性标记物NESTIN在不同生长发育期大鼠柔脑膜细胞中的表达 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 实验二体外培养的柔脑膜细胞具有形成神经球并向神经元分化的特性 |
| 1 建立纯度较高的柔脑膜细胞培养体系 |
| 2 柔脑膜细胞具有形成神经球以及向神经元、胶质细胞分化的能力 |
| 实验三 白细胞介素-6 能够诱导柔脑膜来源的神经干细胞向神经元分化 |
| 1 IL-6 诱导柔脑膜来源的神经干细胞的分化 |
| 2 IL-6 诱导柔脑膜来源神经干细胞分化的细胞内机制 |
| 实验四 抗抑郁药物对柔脑膜来源的神经干细胞增殖与分化的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 实验五 机械损伤刺激不能直接诱导柔脑膜细胞逆分化为神经干细胞 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（5）恒河猴骨髓间充质干细胞永生细胞系构建（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 技术路线 |
| 第一部分 恒河猴骨髓间充质干细胞分离培养及鉴定 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二部分 恒河猴骨髓间充质干细胞永生细胞系构建 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三部分 转基因骨髓间充质干细胞的生物学性质 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 骨髓间充质干细胞临床应用研究进展 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）山羊骨髓间充质干细胞的分离培养及体外分化潜能的研究（论文提纲范文）
| 文献综述 |
| 第一章 间充质干细胞概述 |
| 1.1 间充质干细胞在体内的分布 |
| 1.1.1 骨髓源间充质干细胞 |
| 1.1.2 脂肪源间充质干细胞 |
| 1.1.3 脐带血间充质干细胞 |
| 1.1.4 其他组织中的间充质干细胞 |
| 1.2 间充质干细胞及其微环境 |
| 1.2.1 间充质干细胞体外生长需要的基本条件 |
| 1.2.2 间充质干细胞生长有关的细胞因子 |
| 1.2.3 间充质干细胞与造血干细胞的关系 |
| 1.3 骨髓间充质干细胞分化的调控 |
| 1.3.1 骨髓间充质干细胞成骨分化的调控 |
| 1.3.2 骨髓间充质干细胞成软骨分化的调控 |
| 1.3.3 骨髓间充质干细胞增殖分化调控的研究 |
| 第二章 间充质干细胞的分离培养及鉴定方法 |
| 2.1 样品的采集及间充质干细胞的分离 |
| 2.1.1 骨髓样品的采集及其MSCs 的分离 |
| 2.1.2 脂肪样品的采集及其MSCs 的分离方法 |
| 2.1.3 脐血样品的采集及其MSCs 的分离方法 |
| 2.2 骨髓间充质干细胞的培养方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 操作方法 |
| 2.3 间充质干细胞的体外扩增 |
| 2.3.1 培养基 |
| 2.3.2 影响骨髓MSCs 的体外培养扩增的因素 |
| 2.4 间充质干细胞的鉴定 |
| 2.4.1 间充质干细胞的形态学 |
| 2.4.2 MSCs 的表面标志 |
| 2.4.3 间充质干细胞的鉴定方法 |
| 2.5 间充质干细胞的冷冻保存及解冻复苏 |
| 2.5.1 间充质干细胞的冷冻保存 |
| 2.5.2 冻存间充质干细胞的解冻与复苏 |
| 2.5.3 冷冻前和解冻后间充质干细胞细胞活力及性能的检测 |
| 第三章 间充质干细胞的分化潜能 |
| 3.1 向中胚层细胞分化 |
| 3.1.1 MSCs 向成骨细胞分化 |
| 3.1.2 MSCs 向成软骨细胞分化 |
| 3.1.3 MSCs 向成脂肪细胞分化 |
| 3.1.4 MSCs 向心肌细胞分化 |
| 3.1.5 MSCs 向肌腱及骨骼肌细胞分化 |
| 3.2 向外胚层细胞分化 |
| 3.2.1 MSCs 向神经细胞分化 |
| 3.2.2 向表皮细胞分化 |
| 3.3 向内胚层细胞分化 |
| 3.3.1 MSCs 向肝系细胞分化 |
| 3.3.2 MSCs 向胰岛细胞分化 |
| 3.3.3 向血管内皮细胞分化 |
| 3.4 MSCs 向其他细胞分化 |
| 3.4.1 MSCs 分化为肾细胞 |
| 3.4.2 MSCs 分化为其他细胞类型 |
| 3-1 骨髓间充质干细胞体外诱导分化潜能 |
| 第四章 间充质干细胞的研究现状及应用前景 |
| 4.1 干细胞的永生化问题 |
| 4.1.1 端粒、端粒酶及端粒酶逆转录酶 |
| 4.1.2 细胞永生化应用研究的现状 |
| 4.1.3 体外培养干细胞永生化的条件 |
| 4.1.4 间充质干细胞永生化的意义 |
| 4.2 临床细胞/基因治疗 |
| 4.2.1 治疗骨骼及关节疾病 |
| 4.2.2 治疗心血管系统疾病 |
| 4.2.3 治疗血液及造血系统疾病 |
| 4.2.4 治疗糖尿病 |
| 4.2.5 治疗肝脏疾病 |
| 4.2.6 治疗肿瘤或中风 |
| 4.2.7 治疗神经系统疾病 |
| 4.2.8 生产嵌合体动物和转基因动物 |
| 4.2.9 先天性疾病的治疗 |
| 实验研究 |
| 前言 |
| 第五章 山羊骨髓MSCs 的分离及其基本特性研究 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 试验仪器 |
| 5.1.3 方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 不同方法分离所得山羊骨髓MSCs 的情况 |
| 5.2.2 山羊MSCs 的基本结构 |
| 5.2.3 山羊MSCs 的生长曲线和群体倍增时间 |
| 5.2.4 山羊MSCs 的细胞表面标志 |
| 5.3 讨论与分析 |
| 5.3.1 不同分离方法对山羊MSCs 数量及活力的影响 |
| 5.3.2 培养传代及冷冻和解冻对山羊MSCs 的影响 |
| 5.3.3 山羊骨髓MSCs 样细胞的形态学特点 |
| 5.3.4 山羊骨髓MSCs 的细胞表面标志的探讨 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 山羊骨髓MSCs 诱导分化为心肌样细胞 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 试验材料 |
| 6.1.2 试验方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 山羊MSCs 向心肌细胞诱导后的形态学 |
| 6.2.2 山羊MSCs 向心肌细胞诱导后的染色检测 |
| 6.3 讨论与分析 |
| 6.3.1 诱导培养基对细胞形态结构的影响 |
| 6.3.2 MSCs 向心肌样细胞诱导分化的机制及诱导后细胞的检测 |
| 6.3.3 MSCs 诱导分化为心肌样细胞的临床及实践意义 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 山羊骨髓MSCs 诱导分化为神经样细胞 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 试验材料 |
| 7.1.2 试验仪器 |
| 7.1.3 试验方法 |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 山羊骨髓MSCs 向神经细胞诱导分化后细胞的形态 |
| 7.2.2 山羊骨髓MSCs 向神经细胞诱导分化后的免疫细胞化学染色 |
| 7.3 讨论与分析 |
| 7.3.1 不同浓度β-巯基乙醇对山羊MSCs 向神经细胞诱导分化的影响 |
| 7.3.2 不同诱导时间对山羊MSCs 向神经细胞诱导分化的影响 |
| 7.3.3 山羊MSCs 向神经细胞诱导分化后细胞表面标志的变化 |
| 7.4 小结 |
| 第八章 山羊骨髓MSCs 诱导分化为胰岛β-样细胞 |
| 8.1 材料与方法 |
| 8.1.1 试验材料 |
| 8.1.2 试验仪器 |
| 8.1.3 方法 |
| 8.2 结果 |
| 8.2.1 山羊骨髓MSCs 向胰腺诱导后细胞的形态学观察 |
| 8.2.2 山羊骨髓MSCs 诱导生成β-样细胞的检测 |
| 8.3 讨论与分析 |
| 8.3.1 诱导成分对山羊骨髓MSCs 向胰腺β-细胞分化的影响 |
| 8.3.2 诱导剂及刺激剂对山羊骨髓MSCs 形态和功能的影响 |
| 8.4 小结 |
| 第九章 山羊骨髓源MSCs 诱导分化为成骨细胞 |
| 9.1 材料与方法 |
| 9.1.1 试验材料 |
| 9.1.2 试验仪器 |
| 9.1.3 试验方法 |
| 9.2 结果 |
| 9.2.1 山羊骨髓MSCs 向成骨细胞诱导后的形态学观察 |
| 9.2.2 山羊骨髓MSCs 向成骨细胞诱导后的ALP 染色 |
| 9.2.3 山羊骨髓MSCs 向成骨细胞诱导后的茜素红染色 |
| 9.3 讨论与分析 |
| 9.3.1 山羊骨髓MSCs 诱导分化为成骨细胞的意义 |
| 9.3.2 诱导剂对山羊骨髓MSCs 形态改变及其成骨分化的影响 |
| 9.4 小结 |
| 结论 |
| 本研究的创新点 |
| 进一步研究的课题 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（7）TH基因修饰骨髓基质细胞源神经干细胞自体移植治疗恒河猴帕金森病模型（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 总材料和方法 |
| 第一部分 NSCs-BMSCs体外培养、生物活性物质的检测和抗原鉴定 |
| 第二部分 构建pEGPF-C2-hTH和pcDNA3.1His-hTH重组质粒和基因转染SNCs-BMSCs |
| 第三部分 恒河猴PD模型的制备和基因修饰NSCs-BMSCs自体移植 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 综述Ⅰ |
| 综述Ⅱ |
| 学习期间发表的论文 |
| 致谢 |
（8）神经干细胞和皮肤干细胞的体外培养及诱导分化神经细胞的研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 文献综述 |
| 第一章 干细胞诱导分化研究进展 |
| 1 诱导干细胞分化为神经细胞的研究 |
| 1.1 胚胎干细胞及其诱导分化为神经细胞的研究 |
| 1.2 神经干细胞及其诱导分化为神经细胞的研究 |
| 1.3 骨髓间充质干细胞及其诱导分化为神经细胞的研究 |
| 1.4 其他组织干细胞诱导分化为神经细胞的研究 |
| 1.5 分化神经细胞检测指标 |
| 1.6 展望 |
| 2 成体干细胞的可塑性研究 |
| 2.1 胚胎干细胞和成体干细胞比较研究 |
| 2.2 成体干细胞可塑性证据 |
| 2.3 对成体干细胞可塑性的质疑 |
| 2.4 成体干细胞可塑性的调控机制 |
| 2.5 成体干细胞可塑性研究展望 |
| 3 皮肤干细胞及其可塑性的研究进展 |
| 3.1 皮肤干细胞的来源、定位及培养 |
| 3.2 皮肤干细胞的鉴定 |
| 3.3 皮肤干细胞的分化机制 |
| 3.4 皮肤干细胞的应用 |
| 4 结束语 |
| 试验研究 |
| 第二章 胎鼠中枢神经系统神经干细胞的体外培养特性 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试剂的配制 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 神经干细胞的分离和原代培养 |
| 1.3.2 神经干细胞的传代培养 |
| 1.3.3 神经干细胞生长曲线的绘制 |
| 1.3.4 单细胞克隆试验 |
| 1.3.5 神经干细胞的冷冻与复苏 |
| 1.3.6 神经干细胞的分化培养 |
| 1.3.7 神经干细胞及其分化细胞的鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 神经干细胞的光镜特性 |
| 2.2 神经干细胞的生长曲线的绘制 |
| 2.3 神经干细胞的克隆率 |
| 2.4 神经干细胞的鉴定 |
| 2.5 不同冷冻复苏条件对神经干细胞的影响 |
| 2.6 神经干细胞的自然分化及其分化细胞的鉴定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 神经干细胞在神经系统的分布 |
| 3.2 神经干细胞分离培养方法 |
| 3.3 生长因子对神经干细胞生长的影响 |
| 3.4 神经干细胞的鉴定 |
| 4 小结 |
| 第三章 神经干细胞定向诱导分化神经元的研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 主要试剂的配制 |
| 1.2.2 诱导神经干细胞分化的诱导液的制备 |
| 1.2.3 胎鼠中脑神经干细胞的培养 |
| 1.2.4 诱导剂定向诱导神经干细胞分化为多巴胺能神经元 |
| 1.2.5 纹状体提取液定向诱导神经干细胞分化为多巴胺能神经元 |
| 1.2.6 诱导的多巴胺神经细胞行免疫细胞化学鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 诱导剂对神经干细胞诱导TH阳性细胞的影响 |
| 2.2 纹状体提取液对神经干细胞诱导TH阳性细胞的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 神经干细胞定向诱导分化的意义 |
| 3.2 定向诱导神经干细胞分化为多巴胺能神经元的影响因素分析 |
| 3.2.1 神经干细胞的来源对分化细胞表型的影响 |
| 3.2.2 诱导物的选择与神经干细胞的分化 |
| 4 小结 |
| 第四章 山羊皮肤干细胞的分离培养与鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 主要实验材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 主要试剂和培养液的制备 |
| 1.2.2 小鼠胚胎成纤维细胞的获取及处理 |
| 1.2.3 山羊皮肤成纤维细胞的培养及处理 |
| 1.2.4 皮肤干细胞的原代培养 |
| 1.2.5 皮肤干细胞的传代及纯化 |
| 1.2.6 表皮干细胞的鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 山羊皮肤成纤维细胞的培养特性 |
| 2.2 胚胎小鼠成纤维细胞的生长特性 |
| 2.3 丝裂酶素C处理的成纤维细胞 |
| 2.4 皮肤干细胞的生长特性形态 |
| 2.5 不同培养条件对皮肤干细胞生长的影响 |
| 2.5.1 不同饲养层对皮肤干细胞生长的影响 |
| 2.5.2 不同培养液对皮肤干细胞生长的影响 |
| 2.6 皮肤干细胞的鉴定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 影响皮肤干细胞生长的因素分析 |
| 3.1.1 滋养层的选择 |
| 3.1.2 皮肤干细胞的分离培养 |
| 3.2 皮肤干细胞的鉴定方法 |
| 4 小结 |
| 第五章 皮肤干细胞诱导分化神经细胞初探 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 主要试剂的配制 |
| 1.2.2 山羊胎儿神经干细胞培养液上清液的制备 |
| 1.2.3 山羊皮肤干细胞分化培养液的制备 |
| 1.2.4 山羊皮肤干细胞诱导分化培养及鉴定 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（9）版纳微型猪近交系骨髓间充质干细胞永生细胞系的构建和免疫调节研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1 版纳微型猪近交系间充质干细胞永生细胞系的建立 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 动物 |
| 1.1.2 材料与试剂 |
| 1.1.3 仪器及设备 |
| 1.1.4 方法 |
| 1.1.4.1 原代骨髓间充质干细胞的培养 |
| 1.1.4.2 质粒的准备 |
| 1.1.4.3 真核细胞转染和筛选 |
| 1.1.4.4 BMI-MSCs和转基因BMI-MSCs的传代培养 |
| 1.1.4.5 衰老标记物的表达 |
| 1.1.4.6 流式细胞分析 |
| 1.1.4.7 核型分析 |
| 1.1.4.8 双层软琼脂克隆形成试验 |
| 1.1.4.9 裸鼠致瘤试验 |
| 1.1.4.10 单克隆抗体的制备 |
| 1.1.4.11 间充质干细胞特异标记单克隆抗体鉴定 |
| 1.1.4.12 脂肪细胞的形成 |
| 1.1.4.13 细胞外矿化物质的沉积 |
| 1.1.4.14 转基因BMI-MSCs的裸鼠体内成骨实验 |
| 1.1.4.15 数据处理及统计分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 原代BMI-MSCs的分离和鉴定 |
| 1.2.2 转基因BMI-MSCs的构建和筛选 |
| 1.2.3 转基因MSCs永生性分析 |
| 1.2.4 流式分析 |
| 1.2.5 核型分析 |
| 1.2.6 致瘤性鉴定 |
| 1.2.7 转基因永生化对干细胞特征的影响 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 成体干细胞的衰老与永生 |
| 1.3.2 永生化BMI-MSCs与材料生物相容性评价 |
| 1.4 小结 |
| 2 永生化BMI-MSCs对hPBLs增殖的抑制效应及分子机制初探 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料与试剂 |
| 2.1.2 仪器与设备 |
| 2.1.3 方法 |
| 2.1.3.1 外周血淋巴细胞的分离纯化 |
| 2.1.3.2 MSCs和刺激细胞的制备 |
| 2.1.3.3 MTS法检测细胞活力 |
| 2.1.3.4 永生化BMI-MSCs的免疫调节作用 |
| 2.1.3.5 BMI-MSCs的免疫调节机制 |
| 2.1.3.6 数据处理及统计分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 永生化BMI-MSCs对hPBLs的刺激效应 |
| 2.2.2 永生化BMI-MSCs对hPBLs的免疫调节作用 |
| 2.2.3 FasL和TGF-β1在MSCs免疫抑制中的作用 |
| 2.2.4 BMI-MSCs FasL和TGF-β1的表达 |
| 2.2.5 细胞-细胞接触对抑制效应的影响 |
| 2.2.6 MSCs加入时间对抑制效应的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 永生化BMI-MSCs的低免疫原性 |
| 2.3.2 永生化BMI-MSCs对异种T细胞增殖的免疫调节及分子机制 |
| 2.3.3 MSCs免疫调节作用的应用前景 |
| 全文总结 |
| 综述 间充质干细胞的生物学特征及应用研究进展 |
| 1 概述 |
| 1.1 MSCs的分离培养 |
| 1.2 MSCs的表面分子 |
| 1.3 间充质干细胞的体外分化 |
| 1.4 间充质干细胞的永生化 |
| 2 MSCs的免疫学特征 |
| 2.1 MSCs的免疫原性 |
| 2.2 MSCs对淋巴细胞增殖的抑制作用 |
| 3.细胞-宿主的界面反应 |
| 3.1.移植物和宿主的免疫反应 |
| 3.2 细胞的移入 |
| 3.3 植入细胞在体内的分化 |
| 4 MSCs移植在疾病治疗中的研究进展 |
| 4.1 骨和软骨修复 |
| 4.1.1 成骨不全 |
| 4.1.2 关节和跟腱修复 |
| 4.2 心血管修复 |
| 4.3 神经系统功能恢复 |
| 4.4 治疗肌肉萎缩症 |
| 4.5 抗纤维化 |
| 4.6 免疫调节 |
| 4.6.1 治疗自身免疫性疾病 |
| 4.6.2 预防GVHD |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 英文缩写词表 |
| 个人简历 |
（10）表达GDNF的骨髓基质干细胞治疗帕金森病的实验研究（论文提纲范文）
| 引言 |
| 第一部分 大鼠GDNF的克隆和序列分析 |
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 结论和讨论 |
| 第二部分 胶质细胞源性神经营养因子在骨髓基质干细胞中的表达 |
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 结论和讨论 |
| 第三部分 表达胶质细胞源性神经营养因子的骨髓基质干细胞治疗大鼠帕金森病的实验研究 |
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 结论和讨论 |
| 综述 |
| 博士期间发表的文章 |
| 致谢 |
四、永生化转基因成纤维细胞治疗帕金森病（论文参考文献）
- [1]TGF-β1诱导RMMCs脑膜纤维化信号通路的研究[D]. 岳学静. 郑州大学, 2016(03)
- [2]人端粒酶（hTERT）表达促进剂的筛选及其抗衰老活性研究[D]. 牛星. 天津科技大学, 2016(05)
- [3]利用重组腺病毒介导人端粒酶催化亚基（hTERT）制备牛乳腺细胞体外模型的研究[D]. 贺小英. 西北农林科技大学, 2011(04)
- [4]柔脑膜细胞具有神经干细胞特性的实验研究[D]. 王婷. 第四军医大学, 2008(01)
- [5]恒河猴骨髓间充质干细胞永生细胞系构建[D]. 高昆. 四川大学, 2007(05)
- [6]山羊骨髓间充质干细胞的分离培养及体外分化潜能的研究[D]. 庞全海. 西北农林科技大学, 2005(02)
- [7]TH基因修饰骨髓基质细胞源神经干细胞自体移植治疗恒河猴帕金森病模型[D]. 徐强. 第一军医大学, 2004(04)
- [8]神经干细胞和皮肤干细胞的体外培养及诱导分化神经细胞的研究[D]. 赵慧英. 西北农林科技大学, 2004(04)
- [9]版纳微型猪近交系骨髓间充质干细胞永生细胞系的构建和免疫调节研究[D]. 刘瑾. 四川大学, 2004(02)
- [10]表达GDNF的骨髓基质干细胞治疗帕金森病的实验研究[D]. 孙兵. 苏州大学, 2004(01)