一、cDNA cloning and expression of earthworm fibrinolytic enzyme component A（论文文献综述）
吴娅丽[1]（2020）在《基于多组学模式的威廉环毛蚓抗血栓成分DPf3的分离鉴定及机制研究》文中研究说明研究背景:血栓性疾病是人类死亡的主要原因之一,临床常用具抗血小板、抗凝和溶栓等作用的药物对其进行治疗,但多数药物伴随出血副作用;中医认为血栓疾病与血瘀证密切相关,通常使用活血化瘀类药物治疗血瘀证,其中动物药（如水蛭、地龙等）为中医活血化瘀的常用药;地龙及含地龙的成方制剂作为抗凝剂和纤溶药物已应用了几个世纪,且被认为无出血副作用;口服蚓激酶制剂在许多国家用于保护心血管,且在我国已作为二类新药上市。中药动物药的研究一直是个难题,威廉环毛蚓作为《中国药典》:收录地龙品种,其抗血栓关键物质基础、作用靶点及机制均尚不明确,故缺乏科学依据指导其临床应用,因此,研究威廉环毛蚓的抗血栓物质基础及作用机制有重大意义。由于地龙的抗血栓成分主要为蛋白质,本研究借助转录组学-蛋白组学相结合的模式,阐释威廉环毛蚓的抗血栓物质基础,并初步探究其作用机制。研究目的:基于多组学模式鉴定威廉环毛蚓中所含蛋白质,通过分离纯化初步定位其抗血栓活性部位并鉴定分析该部位蛋白质成分的序列、结构和性质;利用动物模型评价该部位预防血栓形成的作用、溶栓作用及血管保护作用;通过分子对接和体外模型探讨其抗血栓作用靶点和机制,及血管保护作用机制;借助蛋白组学技术从整体分析其抗血栓及血管保护作用涉及的生物过程及信号通路。研究方法与研究结果:研究一威廉环毛蚓无参考基因转录组的构建及分析采用基于Illumina高通量测序平台的无参考基因RNA测序技术构建威廉环毛蚓的无参考基因转录组,进而构建其蛋白序列库,为后续研究提供支持。通过测序,共得到超过2000万的clean reads,其中高质量reads超过97%;Trinity拼接后,得到超过10万个转录本和unigenes;翻译所拼接的转录组数据,构建威廉环毛蚓蛋白序列库。ESTScan软件共预测11259个编码序列,可作为引物设计数据库使用。通过与公共数据库比对,共注释 38.21%的 unigenes。研究二威廉环毛蚓总提物的鉴定及抗血栓性质研究采用转录组学-蛋白组学-活性研究整合关联分析方法,以“研究一”所构建的蛋白序列库为数据库,鉴定威廉环毛蚓总提物的蛋白质成分;建立纤维蛋白原-凝血酶时间法（Fib-TT）用于抗凝血活性的体外评价,并基于该方法考察总提物在不同孵育体系中的抗凝活性变化,进而评价其抗血栓性质;研究总提物在不同体系中的蛋白质谱图变化,推测其抗血栓活性成分。从威廉环毛蚓总提物中鉴定到31种蛋白质成分;所建立的Fib-TT 法线性范围较宽,仪器精密度、重复性均良好,可用于威廉环毛蚓抗凝活性的体外评价;总提物的抗凝活性在近中性条件下较为稳定,在30-50℃下活性稳定;通过考察总提物经不同体系孵育后蛋白质图谱的变化,推测其抗血栓活性成分为分子量在26kDa附近的蛋白质。研究三威廉环毛蚓抗血栓成分的分离纯化及鉴定通过“研究二”发现威廉环毛蚓总提物具有较强的抗血栓活性,本实验基于Fib-TT法,采用离子交换色谱分离纯化威廉环毛蚓的抗血栓活性成分,命名为DPf3,采用SDS-PAGE和MALDI-TOF-MS确定其分子量;通过转录组学-蛋白组学整合研究方式,鉴定DPf3主要成分DPf3 ID NO.1和DPf3 ID NO.2的蛋白质种类;采用从头测序技术确定DPf3主要成分的蛋白质序列,圆二色谱考察其二级结构,I-TASSER预测其三级结构,SAVES评价预测模型;并通过溶血实验考察DPf3的血液相容性。研究发现DPf3的主要成分DPf3 IDNO.1和NO.2的分子量分别为36121.745 Da和24485.004 Da,分别含有329和241个氨基酸;de novo测序获得二者的蛋白质全序列,通过与所构建的本地蛋白序列库比对,分别为>Ac44553g1i11和>Dc43026gli12,序列覆盖度达100%;DPf3的二级结构包含α-螺旋（19%）,β-折叠（30%）和无规则卷曲（51%）;DPf3的浓度低于4.21 mg·mL-1时具有较好的血液相容性。研究四DPf3对血管损伤型斑马鱼血栓模型的作用研究采用普纳替尼致血管损伤型斑马鱼血栓模型考察DPf3预防血栓形成的作用、溶栓作用和血管保护作用。发现DPf3（4.2-12.5 ng/尾）具较强的预防血栓形成的作用,其预防能力较阿司匹林（45 μg·mL-1）无显着差异。同时,DPf3（4.2ng/尾）具明显的溶栓作用,其溶栓能力较尿激酶（5ng/尾）无显着性差异。此外,DPf3具较强的血管保护作用。研究五DPf3抗血栓活性的体外评价及机制研究通过分子对接和体外实验相结合的方式考察DPf3的抗血栓作用及作用机制。首先采用分子对接评价DPf ID NO.1和NO.2与纤维蛋白（原）、纤溶酶原、凝血酶间的相互作用;继而通过酶谱法、光散射法、形态学研究、纤维蛋白平板法、体外血栓法及凝血四项评价研究DPf3的抗血栓活性及机制。通过分子对接发现DPf3 ID NO.1和NO.2对纤维蛋白（原）、纤溶酶原均有直接作用,体外实验发现DPf3对纤溶酶原作用很弱,对纤维蛋白（原）及体外血栓均有很强的水解作用;与生成的纤维蛋白栓块相比,纤维蛋白原可能是DPf3的初始作用靶点,且DPf3对纤维蛋白原的作用更强;通过凝血四项评价,发现DPf3能显着延长APTT、降低Fib的含量,且具有延长TT的作用趋势。研究六DPf3血管保护作用机制的细胞模型研究选取HUVECs为研究对象,以（hi）ox-LDL为造模剂,通过研究经DPf3保护前后,损伤性HUVECs的细胞活力、细胞膜完整性、细胞内ROS水平、细胞迁移能力、粘附因子VCAM 1的表达及单核细胞的粘附、血管生成等的变化,来探讨DPf3的血管保护作用机制。研究发现,DPf3对血管具显着保护作用,DPf3能够提高损伤性HUVECs的细胞活力、保护其细胞膜的完整性,降低细胞内ROS的生成;降低粘附因子VCAM I的蛋白表达水平,减少单核细胞的粘附;削弱损伤性细胞的迁移能力,并抑制其新生血管的生成。研究七基于蛋白质组学研究DPf3对血管损伤型斑马鱼血栓模型的影响采用蛋白组学技术从整体水平研究DPf3抗血栓和血管保护作用所涉及的生物标志物、生物过程和信号通路。通过血栓模型组与正常对照组对比,共鉴定得到1149个差异蛋白标志物,其中表达显着上调和下调的蛋白分别有582个和567个;通过DPf3给药组和模型组对比,共鉴定出66个差异蛋白标志物,其中表达显着上调和下调的蛋白分别有46个和20个,具有显着回调作用的蛋白有23个。通过对差异蛋白标志物所涉及的生物过程和信号通路进行归纳与分析,发现DPf3发挥抗血栓和血管保护活性的机制主要与调节脂质代谢、调节能量代谢、补体与凝血系统、ECM受体相互作用、MAPK信号通路等相关。研究结论:本研究以“转录组学-蛋白组学”多组学结合的模式为基础,初步构建中药地龙威廉环毛蚓的本地蛋白序列库,通过分离纯化得到其抗血栓活性成分（DPf3）,对DPf3进行鉴定及机制研究。研究发现威廉环毛蚓总提物具良好的抗血栓活性,从中鉴定到31个蛋白质成分,其中分离所得DPf3具良好的预防血栓、溶栓及血管保护作用,且具较好的血液相容性,为威廉环毛蚓抗血栓的物质基础。DPf3的抗血栓机制为:（1）具有很强的纤维蛋白和纤维蛋白原水解活性,且能够激活纤溶酶原形成纤溶酶;（2）具有较强的直接溶栓作用;（3）通过影响内源性或/和共同凝血途径及第三种凝血途径产生抗血栓作用。DPf3对血管内皮的保护作用机制为:（1）提高损伤性血管内皮细胞的细胞活力,保护细胞膜的完整性,降低损伤性细胞内ROS的生成;（2）降低粘附因子VCAM 1的蛋白表达水平,减少单核细胞的粘附;（3）削弱损伤性细胞的迁移能力,从而降低炎症细胞的扩散;（4）抑制新生血管的生成,进而抑制血管新生内膜的形成。通过蛋白组学技术从整体水平研究,发现DPf3发挥抗血栓和血管保护作用的机制主要与调节脂质代谢、调节能量代谢、补体与凝血系统、ECM受体相互作用、MAPK信号通路等相关。综上,本研究基本证实了中药地龙威廉环毛蚓的抗血栓关键物质基础,明确其作用靶点并初步确定其作用机制,为威廉环毛蚓的临床使用提供科学依据,为进一步研究其抗血栓活性成分的分子机制提供基础和依据,并为中药动物药的研究提供思路和方法。
李锐,廖鹏运,韩燃,肖湘,常争艳,李文平[2]（2012）在《蚯蚓纤溶酶的分离纯化及临床作用研究进展》文中认为蚯蚓纤溶酶是从蚯蚓中分离的一种丝氨酸蛋白水解酶,有抗凝溶血栓、抗癌抗肿瘤、抗炎、神经修复等作用,在临床上是预防和治疗血栓疾病的有效药物。本文对蚯蚓纤溶酶的分离纯化与药理作用加以概述,为临床蚯蚓溶栓药物的研究提供依据。
朱琦[3]（2009）在《单环刺螠纤溶酶分离纯化、免疫原性及其基因克隆的初步研究》文中研究说明目的:血栓栓塞性疾病（thrombotic disease,TD）是一种常见病和多发病,发病率、致残率、致死率皆高。药物溶栓是目前临床最有效的治疗手段。迄今为止,溶栓剂已发展了三代,但仍然存在一定的缺陷,有待研究开发出安全有效的新型溶栓剂。本研究旨在从海洋动物单环刺螠（Urechis unicinctus）体内提取纯化出一种新型的生物溶栓剂,在此基础上确定其分子特征、酶免疫原性,并克隆部分编码区cDNA,为进一步开展基因工程菌的构建,重组活性蛋白的表达的深入研究奠定基础。方法:将单环刺螠体腔液经离心,经分子量8,000Da和30kD截留分子量滤膜超滤、Sephadex G-75、DE 52阴离子交换层析柱和Sephacryl S-100HR凝胶柱分离等步骤进行酶的分离纯化。SDS-PAGE电泳和HPLC鉴定纯度,测定其分子量。N端测序及质谱从头测序（de novo）确定该酶的部分氨基酸序列。为研究单环刺螠纤溶酶作为一种潜在药物,其对药物安全性评价的影响和动物体内过敏反应,对该纤溶酶进行了初步免疫原性研究,以天然纤溶酶和加热变性纤溶酶分别免疫新西兰兔,采用背部皮下和后腿肌肉多点注射进行免疫,琼脂双向扩散法测定纤溶酶抗体效价。采用RT-PCR的方法,根据N端及另外3段氨基酸序列设计10条简并引物,组成18种组合,以单环刺螠消化道组织总RNA为模板,用RT-PCR的方法尝试克隆该种纤溶酶组分的cDNA片段。结果:通过酶的纯化最终获得一种纯酶组分,在SDS-PAGE电泳图谱上显示一条蛋白区带,经HPLC鉴定呈现单一峰,说明为纯品。蛋白质分子量测定为约26.4kDa。酶纯化倍数为10.2,回收率为13.9%,比活力达421.9U/mg。经专一性水解酶降解,N端测序及质谱分析,获取酶分子中5段多肽链的氨基酸序列,分别为:N端:ICGGSPADIT;中间部分序列:DMKR;RNRLPHACMPZR;ACVWYFVH;BNEGGYLDACM。经Blastp比对分析,没有发现同源性较高的序列,说明此酶为一种新发现的蛋白酶。琼脂双向扩散平板未出现免疫沉淀线,表明该酶免疫原性低,在兔体内未产生可检测的抗体量。本实验中克隆得到了3个基因片段,经Blastp搜索分析,其中2个片段与蚯蚓、白蚁等动物来源的内切葡聚糖酶相似性较高,1个与septin基因家族成员septin 11相似性较高。但设计引物所依据的氨基酸序列是根据质谱图推算出的,这种方法鉴定的可靠性有待进一步确定。可能需要再结合传统化学方法进行末端氨基酸序列测定,再分离基因。数据库所给出的结果虽然显示了一定的相似性,但尚不能确定获得的序列与搜索到的基因是同一类基因,也有可能是一种全新的具有纤溶活力的蛋白质。要最终证明其是否为纤维蛋白溶解酶,需要通过克隆全长cDNA序列,在原核或真核生物中表达,获得重组蛋白,测定是否具有纤溶活力。
殷鹏[4]（2009）在《去糖基化对蚯蚓纤溶酶部分生物学性质的影响》文中进行了进一步梳理以大豆胰蛋白酶抑制剂SBTI为配基,Sepharose-4B为载体的亲和层析从赤子爱胜蚓（Eisenia foetida）匀浆液中分离出了蚯蚓纤溶酶全组分,采用DEAE-Cellulose-52禺子交换柱层析和制备电泳分离纯化了蚯蚓纤溶酶单组分EfP-I-1和EfP-I-2。纤维蛋白平板法和BAEE测得组分EfP-I-1的比活力分别为0.30 IU/μg和3.79 U/μg,组分EfP-I-2的比活力分别为0.41 IU/μg和6.13 U/μg。Schiffs试剂染色证明蚯蚓纤溶酶为一组糖蛋白组分,全组分的含糖量为2.98%,单组分EfP-I-1和EfP-I-2含糖量分别为5.71%和1.93%。三种凝集素ConA,LCA,AAL点印迹结果表明,EIP-I-1和EfP-I-2都具有末端甘露糖残基和核心岩藻糖结构的糖形。分别以三氟甲基磺酸去糖基化前后的蚯蚓纤溶酶全组分EFEs为抗原免疫家兔,Western-blotting和ELISA结果表明,两种抗原的免疫原性和免疫反应性没有明显的差别。单组分EfP-I-1和EfP-I-2经三氟甲基磺酸去糖基化后失去了抵抗胰蛋白酶水解的能力,而蚯蚓纤溶酶全组分经去糖基化后完全丧失了纤溶活性。以糖苷酶A对固定在Sepharose-4B-SBTI上的蚯蚓纤溶酶进行去糖链处理,ConA-HRP亲和印迹和Schiff’s染色结果表明,蚯蚓纤溶酶的糖链被去除,纤维蛋白平板法检测去除糖链后纤溶酶活性降低大约30%。
田鹏[5]（2009）在《蚓激酶转基因苜蓿（Medicago sativa）及丹参（Salvia miltiorrhizae）的构建及检测》文中研究说明蚯蚓纤溶酶（Earthworm Fibrinolytic Enzymes,EFE）,又称蚓激酶,属于多组分的蛋白水解酶类,它们广泛分布于多种蚯蚓的消化道内腔及体液中,可能与摄取食物的吸收和利用有关。蚓激酶可以直接水解纤维蛋白,因此,它们既具有溶解现有血栓、也同时具有阻止血栓继续形成的功效;此外,有部分种类的蚓激酶还可以将纤溶酶原激活并转化为纤溶酶、或刺激人血管内皮细胞释放组织纤溶酶原激活剂（t-PA）,从而能够间接溶解血栓。与其它溶栓剂所不同的是,蚓激酶的毒副作用比较小,而且还可以口服给药,因此,作为一种新型的溶栓药剂,无疑具有十分广阔的应用前景。目前,在临床上应用的蚓激酶均源自人工饲喂的蚯蚓,然而,依靠人工从蚯蚓中提取蚓激酶仍然存在很多问题,比如蚯蚓饲养和繁殖周期长,生产工艺复杂和生产质量不稳定等,这些不利因素都在很大程度上制约了蚓激酶的规模化生产、利用及普及。在转基因植物中表达蚓激酶单一组分,开辟了利用植物生物反应器生产蚓激酶的新领域,可为今后蚓激酶药物降低生产成本和在临床上的更广泛应用奠定坚实基础。本研究选用苜蓿和丹参这两种常见的植物作为表达蚓激酶单一组分的宿主植物,这是因为:1)苜蓿是世界上最重要的豆科牧草之一,具有品质优、产量高、适应性强、易于贮存以及加工等许多的优点,此外,其作为生物反应器生产的重组类蛋白药物可直接口服,而且无毒无害,便于今后的规模化生产和推广;2)丹参作为一味历史悠久的中药,其本身具有扩张冠状动脉、降低胆固醇和血脂、抑制凝血和激活纤溶系统等多种作用,在临床治疗心脑血管疾病方面应用广泛且疗效十分显着。若实现蚓激酶在丹参中的表达,可通过二者的协同作用,进一步增强丹参在防治心血管疾病方面的疗效,改善丹参的药用品质。在苜蓿生物反应器构建过程中,利用本课题组先前建立的比较成熟的苜蓿组织培养再生体系,通过农杆菌介导方法,成功地将蚓激酶CST1和CST2-1基因分别导入到保定苜蓿中,先后获得转CST1基因的卡那霉素抗性再生苗130株和转CST2-1基因的卡那霉素抗性再生苗92株。对这些转基因植株进行PCR和PCR Southern检测,结果证实多数卡那霉素抗性植株分别含有上述蚓激酶编码组分。从PCR检测为阳性的转CST2-1基因再生植株中,任意选取两株进行基因组DNA Southern Blot检测,结果证实目的基因CST2-1确实已整合到苜蓿基因组中。通过ELISA,对外源蛋白表达情况进行了检测与分析,结果发现多数卡那霉素抗性植株在405nm处的吸光值都大于非转基因苗（阴性对照）,但与蚓激酶肠溶胶囊溶剂相比,其数值偏低,这表明蚓激酶基因在转基因苜蓿细胞中是有表达的,但表达效率非常低。外源转基因遗传稳定检测结果发现,经多3～5次无性继代培养后的转基因苜蓿叶片在含有卡那霉素的培养基上仍能正常分化出健康的愈伤组织,这表明外源的蚓激酶基因在转基因苜蓿中通过无性繁殖可以稳定遗传给后代。在丹参生物反应器构建过程中,首先通过对丹参的转化和培养条件进行了优化,使丹参再生幼苗的褐化和玻璃化现象大大减轻,更加完善了丹参的组织培养遗传转化再生体系。通过农杆菌介导方法,同样成功地将蚓激酶CST1和CST2-1基因分别导入到丹参中,分别获得卡那霉素抗性再生苗25株和33株。对这些再生植株进行PCR和PCR Southern检测和分析,结果证实多数卡那霉素抗性植株分别含有上述蚓激酶编码组分。从PCR检测为阳性的转CST2-1基因再生植株中,任意选取两株进行基因组DNA Southern Blot检测,结果证实目的基因CST2-1确实已整合到丹参基因组中。同样利用ELISA法对蚓激酶外源蛋白表达情况进行了检测与分析,结果发现外源蛋白表达普遍微弱,在一定程度上稍微高于转基因苜蓿的结果类似。外源转基因遗传稳定检测结果发现,经多3～5次无性继代培养后的转基因丹参叶片在含有卡那霉素的培养基上仍能正常分化出健康的愈伤组织,这表明外源的蚓激酶基因在转基因丹参中通过无性繁殖可以稳定遗传给后代。
王海亮[6]（2008）在《蚯蚓纤溶酶基因多态性分析和各组分克隆产物的活性比较》文中进行了进一步梳理蚯蚓蛋白水解酶（earthworm protease,EP）是一类在蚯蚓体内分离到的具有纤溶酶活性和激活纤溶酶原作用的蛋白水解酶。因具有抗凝、纤溶和溶栓作用,可以作为溶栓药物治疗因血栓引起的各种疾病,因此也习惯被称为蚯蚓纤溶酶（earthworm fibrinolytic enzymes,EFE）。实验证明,不同实验室因取材或分离纯化手段不同,获得的组分也各不相同,但按照纯化的天然EP组分的蛋白N-末端序列保守性和抗原特异性,可以将EP大致分为四组,即P-0、P-Ⅰ、P-Ⅱ和P-Ⅲ。为了解该酶多组分的结构基础,本研究利用生物信息学数据库以及BLAST和DNAman软件,对已报道的27条EFE基因和Lumbricidae的dbEST进行分析,证明EFE基因具有多态性。与此同时,在已获得各组基因的基础上,对EFE克隆表达产物的活性差异进行了分析,为其生物化学、药理分析和生物工程方面的研究提供了参考资料。具体研究内容如下：1.根据纯化的天然EFE的N-末端序列信息,本研究在NCBI上进行BLAST,分别建立了P-0、P-Ⅰ和P-Ⅱ三组的EST数据库,利用DNAman进行拼接得到了若干条新序列。同源性证明,P-0和P-Ⅰ两个组的电子克隆产物与已报道的基因序列有差异,并分属于P-0两个亚组和P-Ⅰ四个亚组。2.P-Ⅲ组基因多态性分析证明,该组具有三个亚组：P-Ⅲ-1、P-Ⅲ-2和P-Ⅲ-3。本研究利用P-Ⅲ组的蛋白质序列两端保守性设计引物,经RT-PCR构建了该组基因的质粒（pUC18）文库,并依据差异部分设计的中间引物,从文库中筛选获得Efp-Ⅲ-2基因。加上本实验室原有的Efp-Ⅲ-1和Efp-Ⅲ-3基因,序列比对证明它们是蚯蚓体内P-Ⅲ组分基因多态性的表现,而且在Lum6ricidae科中与蚓种无关。该结果首次报道了由一个实验室从一个蚓种获得P-Ⅲ组分的三个亚组序列,从实验上验证了EST数据库中EFE基因多态性的结论。3.本研究在本实验室前期工作的基础上,分别将已构建好的表达载体pMAL-c2x-Efp-Ⅰ-0、pMAL-c2x-Efp-Ⅰ-1.pMAL-c2x-Efp-Ⅱ.pMAL-c2x-Efp-Ⅲ进行了表达、纯化。经Warburg-Christain法计算蛋白质浓度,底物电泳、酪蛋白平板和纤维蛋白平板法进行活性检测,证明EfP-Ⅲ的活性小于其它组分。然而实验已证明,天然EFE组分中EfP-Ⅲ的纤溶活性为最高。之所以出现这种差异,推测可能与该基因翻译后修饰,特别是与糖基化有关。
孔航天[7]（2008）在《蚓激酶基因在原核和毕赤酵母中的表达》文中提出血栓性疾病严重威胁人类的生命和健康,目前临床上用于治疗血栓性疾病的药物有种种缺陷。因此,新型溶栓药物的研制与开发成为当务之急。从传统中药——“地龙”（蚯蚓）中提取的蚓激酶,具有溶解血栓和防止血栓形成的双重药理作用,是一种理想的溶栓药物。因此,本课题试图利用DNA重组技术实现蚓激酶的异源表达,为基因工程药物的开发提供必要的理论和实验基础。首先我们尝试在大肠杆菌表达系统中表达蚓激酶,构建了高效表达载体pPelB-EPA,并转化到E.coli Rosetta进行表达,通过SDS- PAGE和Western blot验证,成功表达出目的蛋白,分子量为31KD,与预测相符。但由于蚓激酶是以包涵体形式表达,不具有纤溶活性。因此我们又尝试在毕赤酵母表达系统中表达蚓激酶,将分泌型重组表达载体pPIC9K -EPA用BglII线性化后,电转化导入毕赤酵母细胞,用MM和MD平板筛选出Muts和Mut+两种转化子表型,加甲醇诱导表达,经过SDS-PAGE和Western blot验证,Muts型转化子表达出目的蛋白,分子量为35KD,与预测相符。而Mut+型转化子未能表达目的蛋白。
周艳芬[8]（2007）在《瓜蒌（Trichosanthes kirilowii）等中草药纤溶酶的筛选、分离纯化与cDNA克隆》文中提出活血化瘀中草药具有“通利血脉，促进血行，消散瘀血”等主要作用，现代药理学研究也证明了活血化瘀中草药可以改善血液的血流动力学、血液流变学和微循环。目前已经从多种生物体内分离出来了能有效治疗血栓性疾病的纤溶酶，多属于丝氨酸蛋白酶类。本文的研究目的是筛选出具有纤溶酶活性的中草药品种，并对其进行分离和性质鉴定。首先选取瓜萎等42种在临床上具有活血化瘀作用的中草药，水浸提物经硫酸铵沉淀得到蛋白质提取物，利用纤维蛋白平板法测定纤溶酶活性，筛选具有纤溶酶活性的中草药品种。结果表明，瓜蒌、稀莶草、望江南、延胡索、益母草、竹节三七、牛膝、泽泻的蛋白质提取物具有明显的体外纤溶酶活性。将其中的牛膝、稀莶草水浸提物通过硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析分离，得到的牛膝40％-4、稀莶草60％-1、稀莶草60％-2、稀莶草60％-3和稀莶草80％-2组分具有较高的纤溶酶比活力。利用蛋白酶抑制剂对益母草纤溶酶提取物进行处理，结果表明，苯甲基磺酰氟、大豆胰蛋白酶抑制剂、糜蛋白酶抑制剂、苯甲脒能完全抑制益母草纤溶酶活性，EDTA、胃抑肽素、亮抑肽素、抑肽酶有部分抑制作用。认为益母草纤溶酶属于丝氨酸蛋白酶类。利用苯甲脒为配基、环氧氯丙烷活化的Sepharose 4B为载体，制备亲和层析分离介质。对益母草纤溶酶提取物进行亲和层析分离，得到具有纤溶酶活性、表观分子量分别为60 kD和33 kD的蛋白质组分。纤维蛋白平板、Fibrin-PAGE检测，新鲜瓜蒌蛋白提取物及瓜蒌蛋白提取物均具有纤溶酶活性。蛋白酶抑制剂实验表明，PMSF、大豆胰蛋白酶抑制剂可以完全抑制瓜蒌纤溶酶的活性，苯甲脒、鸡卵类粘蛋白有一定的抑制作用，说明瓜蒌纤溶酶属于丝氨酸蛋白酶类。用不同的蛋白质作为作用底物，发现瓜蒌纤溶酶提取物能够有效降解纤维蛋白原和纤维蛋白，而对牛血清白蛋白、牛血红蛋白、人免疫球蛋白基本无降解作用，表明该纤溶酶提取物毒副作用小。激活活性实验表明，瓜蒌纤溶酶的纤溶酶原激活活性明显高于其直接溶纤的活性，属于纤溶酶原激活剂。利用人工合成底物BAEE测定瓜蒌纤溶酶提取物，表明该物质具有胰蛋白酶活性，分析认为瓜蒌纤溶酶是将纤溶酶原中Arg557-Ile558键断裂，产生了纤溶酶。由于大豆胰蛋白酶抑制剂对瓜蒌纤溶酶的活性完全抑制，因此选用大豆胰蛋白酶抑制剂为配基，以环氧氯丙烷活化的Sepharose 4B为载体制备亲和层析介质，利用亲和层析对新鲜瓜蒌蛋白提取物进行了分离。得到了两个具有活性的、表观分子量分别为67 kD和55 kD的蛋白酶组分。瓜蒌纤溶酶提取物经DEAE-Sepharose和CM-Sepharose离子交换，分离出了表观分子量为62.5 kD的蛋白质组分（TkP-Ⅰ），其比活力为109.81 U／mg，样品纯化了3.58倍。利用植物丝氨酸蛋白酶N-末端序列，以及通过对植物丝氨酸蛋白酶的同源蛋白多重序列的比对，利用保守序列的氨基酸设计兼并引物，采用RT-PCR方法，扩增得到瓜蒌部分基因序列。
李晓霞[9]（2007）在《蚯蚓纤溶酶EfP-Ⅰ和抗菌肽EAP-1基因的克隆表达及活性分析》文中提出从GenBank查询到的蚯蚓纤溶酶（earthworm fibrinolytic enzyme, EFE）基因序列中,只有AY438624翻译的蛋白质序列与天然EfP-I在N-端具有较高的相似性。本研究根据该基因的5′与3′序列设计引物,通过RT-PCR从赤子爱胜蚓（Eisenia fetida）获得一个完整的基因（GenBank, DQ418454）。序列分析证明,由该基因编码蛋白质的N-末端与天然EfP-I的N-末端氨基酸顺序完全相同。ScanProsite prediction programs分析显示,该基因与AY438624相似性极高,二者均属于胰蛋白酶家族；不同的是,该基因编码的蛋白质序列中含有N-糖苷键的结构域,所以DQ418454是EfP-I中的一个新基因。在此基础上,我们构建了该基因的原核表达载体pMAL-c2X-Efp-I,并进行了转化、诱导和表达。Western blotting证明,表达产物同时具有MBP和EfP-I的抗原特异性,是MBP和EfP-I的融合蛋白（MBP-EfP-I）。经亲和层析分离纯化的MBP-EfP-I,在酪蛋白平板和纤维蛋白平板上表现出明显的纤溶酶活性。另外本研究还构建了非融合表达载体pBV221-Efp-I,经诱导,非融合产物EfP-I以包含体的形式得到表达,需要进一步的复性研究。相比之下,融合表达具有一定的优势,但该产物与天然蛋白在体内外是否具有相同的药理、药效作用,有待深入研究。抗菌肽（Antimicrobial Peptides, AMPs）是生物体内组成性或诱导性表达的一些具有抗菌活性的小分子内源肽,它们构成了机体防御病原体的快速而高效的天然免疫系统。蚯蚓经过几亿年的进化,逐渐形成了抵御外来微生物侵袭的机制,可以产生一些抗菌肽成分。本研究参考GenBank中登录的蚯蚓抗菌肽PP-1的mRNA序列（GenBank,AY167143）设计特异引物,通过RT-PCR从蚯蚓（Pheretima tschiliensis）中获得了与Pp-1 CDS相似性极高、3′非编码区差异较大的DNA新序列（GenBank,.DQDQ436458）。在此基础上,分别构建了该基因的融合表达载体pMAL-p2X-EAp-1和非融合表达载体pKW32-EAp-1,并进行了转化、诱导和表达。蛋白质电泳证明,两种表达载体均有表达产物,并且获得的融合表达产物MBP-EAP-1和非融合表达产物EAP-1的大小与预测相同。利用亲和层析分离纯化了MBP-EAP-1,但是没能检测到抗菌活性。根据与EAP-1蛋白质序列相似性极高的Lumbricin I （6-34）的序列,人工合成了该29肽。实验表明,Lumbricin I （6-34） 29肽具有广谱抗菌活性。根据大肠杆菌密码子的偏爱性,设计合成了该29肽单链编码DNA,通过PCR获得双链DNA基因,并成功得到pMD19-T-29aa克隆载体。测序证明克隆的序列与原设计一致。这些工作为以后的克隆表达打下了基础。
杜忠文[10]（2007）在《蚯蚓纤溶酶酶学性质及糖链分析》文中认为用亲和层析和制备PAGE从蚯蚓匀浆中提取并纯化了9种主要活性纤溶酶组分。考察了PMSF、aprotinin、benzamidine、chymostatin、leupeptin和SBTI对蚯蚓纤溶酶水解纤维蛋白活性的影响,并测出几种抑制剂对各单组分的半数抑制量。通过分析各组分酶学性质的差异性,得出结论：组分1#、2#既有类胰蛋白酶活性又有类糜蛋白酶活性：组分3#、4#对胰蛋白酶抑制剂和糜蛋白酶抑制剂都有较强的耐受性,有部分胰蛋白酶活性；组分4.5#属于类弹性蛋白酶：组分6.5#和7#的活性比较接近胰蛋白酶。各组分之间酶学性质存在一定差异性,每个组分都有自己独特的性质。用高碘酸-Schiff’s试剂鉴定蚯蚓纤溶酶为一组糖蛋白,重点选取2#作为研究对象,考察其糖链的初步结构,研究去除糖链前后蚯蚓纤溶酶活性的变化,抗原性变化以及抗蛋白酶水解能力的变化。发现组分2#的寡糖链含有甘露糖末端,同时具有核心岩藻糖。用两种糖苷酶（PNGase F和PNGase A）均不能在天然条件下去除蚯蚓纤溶酶糖链。用三氟甲磺酸（TMSF）水解2#糖链后,抗原性没有明显变化,纤维蛋白和BAEE水解活性完全丧失,失去抵抗胰蛋白酶和胃蛋白酶水解的能力。
二、cDNA cloning and expression of earthworm fibrinolytic enzyme component A（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、cDNA cloning and expression of earthworm fibrinolytic enzyme component A（论文提纲范文）
（1）基于多组学模式的威廉环毛蚓抗血栓成分DPf3的分离鉴定及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 血栓的研究进展概述 |
| 1 概述 |
| 2 血栓的形成过程 |
| 3 血栓性疾病的临床治疗用药 |
| 4 血栓性疾病研究模型的构建 |
| 5 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 中药地龙抗血栓活性成分研究进展 |
| 1 概述 |
| 2 地龙抗血栓活性物质 |
| 3 地龙抗血栓活性蛋白的研究 |
| 4 作用机制与毒副作用 |
| 5 临床应用 |
| 6 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第一章 威廉环毛蚓无参考基因转录组的构建及分析 |
| 第一节 概述 |
| 第二节 实验部分 |
| 1 实验材料 |
| 2 RNA提取、测序及转录本拼接 |
| 3 基因序列分析 |
| 4 基因功能注释和表达水平分析 |
| 第三节 本章小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 威廉环毛蚓总提物的鉴定及抗血栓性质研究 |
| 第一节 概述 |
| 第二节 实验部分 |
| 1 实验材料 |
| 2 威廉环毛蚓总提物的鉴定 |
| 3 威廉环毛蚓总提物的蛋白含量测定及抗血栓活性体外评价 |
| 4 威廉环毛蚓总提物的抗血栓性质研究 |
| 第三节 本章小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 威廉环毛蚓抗血栓成分的分离纯化及鉴定 |
| 第一节 概述 |
| 第二节 实验部分 |
| 1 实验材料 |
| 2 威廉环毛蚓抗血栓活性成分的分离纯化 |
| 3 抗血栓活性成分(DPf3)的鉴定 |
| 4 DPf3 ID NO.1和N0.2的结构预测及模型评价 |
| 5 DPf3的血液相容性评价 |
| 第三节 本章小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 DPf3对血管损伤型斑马鱼血栓模型的作用研究 |
| 第一节 概述 |
| 第二节 实验部分 |
| 1 实验材料 |
| 2 普纳替尼诱导斑马鱼血栓模型的建立及DPf3最大检测剂量的确定 |
| 3 DPf3对斑马鱼血管损伤型血栓形成的预防作用评价 |
| 4 DPf3对斑马鱼血管损伤型血栓的治疗作用评价 |
| 第三节 本章小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 DPf3抗血栓活性的体外评价及机制研究 |
| 第一节 概述 |
| 第二节 实验部分 |
| 1 实验材料 |
| 2 DPf3 ID NO.1和N0.2的分子对接研究 |
| 3 DPf3的纤维蛋白(原)水解活性评价 |
| 4 DPf3的纤溶酶原激活作用研究 |
| 5 DPf3血栓溶解活性的体外研究 |
| 6 DPf3对凝血四项影响的体外研究 |
| 第三节 本章小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 DPf3血管保护作用机制的细胞模型研究 |
| 第一节 概述 |
| 第二节 实验部分 |
| 1 实验材料 |
| 2 HUVECs细胞培养方法的建立及DPf3对细胞活力/毒性的影响 |
| 3 DPf3对ox-LDL损伤性HUVECs的保护作用研究 |
| 4 DPf3对ox-LDL损伤性HUVECs活性氧产生的影响 |
| 5 DPf3对(hi) ox-LDL损伤性HUVECs粘附作用的影响 |
| 6 DPf3对(hi) ox-LDL损伤性HUVECs迁移能力和血管生成的影响 |
| 第三节 本章小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第七章 基于蛋白质组学研究DPf3对血管损伤型斑马鱼血栓模型的影响 |
| 第一节 概述 |
| 第二节 实验部分 |
| 1 实验材料 |
| 2 斑马鱼样本的质量控制及评估 |
| 3 普纳替尼所致血管损伤型血栓形成的蛋白标志物分析 |
| 4 DPf3对血管损伤型斑马鱼血栓模型影响的蛋白质组学研究 |
| 第三节 本章小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（2）蚯蚓纤溶酶的分离纯化及临床作用研究进展（论文提纲范文）
| 1 纤溶酶的分离纯化 |
| 1.1 纤溶酶的一般分离 |
| 1.2 纤溶酶基因的克隆和表达 |
| 2 蚯蚓纤溶酶的临床作用 |
| 2.1 抗凝溶血栓 |
| 2.2 抗肿瘤、抗癌 |
| 2.3 抗炎 |
| 2.4 神经修复 |
| 2.5 其他作用 |
| 3 展 望 |
（3）单环刺螠纤溶酶分离纯化、免疫原性及其基因克隆的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 血栓性疾病及其危害 |
| 1.1.2 血栓形成 |
| 1.1.3 血栓病治疗方法 |
| 1.1.4 抗血栓药物研究进展 |
| 1.1.5 天然来源溶栓剂 |
| 1.1.6 溶栓酶基因克隆表达研究进展 |
| 1.1.7 单环刺螠研究概况 |
| 1.2 立题依据及研究目标 |
| 1.2.1 立题依据 |
| 1.2.2 研究目标 |
| 第二章 单环刺螠纤溶酶的分离纯化 |
| 2.1 实验材料、试剂与仪器 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 主要试剂与仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 单环刺螠纤溶酶活力测定方法 |
| 2.2.2 蛋白质浓度的测定 |
| 2.2.3 纤溶酶粗品的制备 |
| 2.2.4 纤溶酶的纯化 |
| 2.2.5 蛋白质纯度鉴定及分子量测定 |
| 2.2.6 蛋白质测序 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 粗酶制备 |
| 2.3.2 Sephadex-G-75凝胶过滤层析 |
| 2.3.3 DE 52阴离子交换柱层析 |
| 2.3.4 Sephacryl S-100HR凝胶过滤层析 |
| 2.3.5 纤溶酶纯化总结 |
| 2.3.6 纤溶酶纯度鉴定 |
| 2.3.7 纤溶酶分子量测定 |
| 2.3.8 氨基酸序列测定及比对 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 单环刺螠纤溶酶免疫原性的初步研究 |
| 3.1 实验材料、试剂与仪器 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验试剂与仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 抗原的准备 |
| 3.2.2 免疫动物 |
| 3.2.3 血清中抗体效价的测定 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 单环刺螠纤溶酶基因cDNA的克隆 |
| 4.1 实验材料、试剂与仪器 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验试剂与仪器 |
| 4.1.3 常用液体配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 实验材料及器材的预处理: |
| 4.2.2 总RNA提取 |
| 4.2.3 RNA质量鉴定 |
| 4.2.4 cDNA第一链的合成 |
| 4.2.5 引物设计与合成 |
| 4.2.6 Touchdown PCR |
| 4.2.7 目的片段的回收及克隆 |
| 4.2.8 测序 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 总RNA提取 |
| 4.3.2 纤溶酶基因cDNA片段的克隆与分析 |
| 4.4 讨论 |
| 总结 |
| 1.主要研究结论与创新点 |
| 2.不足之处与未来展望 |
| 参考文献 |
| 发表文章 |
| 致谢 |
（4）去糖基化对蚯蚓纤溶酶部分生物学性质的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 前言 |
| 1.1 蚯蚓纤溶酶简介 |
| 1.1.1 蚯蚓简介 |
| 1.1.2 蚯蚓纤溶酶简介 |
| 1.1.3 蚯蚓纤溶酶研究历史与现状 |
| 1.2 糖蛋白简介 |
| 1.2.1 糖蛋白简介 |
| 1.2.2 糖链在糖蛋白中的重要作用 |
| 1.2.3 糖链的研究意义 |
| 1.2.4 糖蛋白研究方法 |
| 1.3 本实验室前期相关工作 |
| 1.4 本实验研究意义及主要内容 |
| 第2章 蚯蚓纤溶酶全组分分离及单组分纯化 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 仪器 |
| 2.1.4 方法 |
| 2.2 结果与讨论 |
| 2.2.1 蚯蚓纤溶酶全组分的分离 |
| 2.2.2 蚯蚓纤溶酶单组分的纯化 |
| 2.2.3 蚯蚓纤溶酶组分的活性测定 |
| 2.3 小结 |
| 第3章 蚯蚓纤溶酶糖链性质的初步鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 仪器 |
| 3.1.4 方法 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.2.1 Schiff's染色鉴定蚯蚓纤溶酶的糖蛋白 |
| 3.2.2 硫酸苯酚法测蚯蚓纤溶酶的糖含量 |
| 3.2.3 凝集素法分析蚯蚓纤溶酶糖链糖形 |
| 3.3 小结 |
| 第4章 TFMS去糖基化对蚯蚓纤溶酶性质的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 试剂 |
| 4.1.3 仪器 |
| 4.1.4 方法 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.2.1 TFMS去除糖链效果的检测 |
| 4.2.2 蚯蚓纤溶酶去糖基化前后的免疫原性 |
| 4.2.3 蚯蚓纤溶酶去糖基化前后的免疫反应性 |
| 4.2.4 去糖基化前后EfP-I-1,EfP-I-2对胰蛋白酶的抗性 |
| 4.2.5 TFMS去除糖链后蚯蚓纤溶酶活性变化 |
| 4.3 小结 |
| 第5章 糖苷酶去糖基化对蚯蚓纤溶酶活性的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 试剂 |
| 5.1.3 仪器 |
| 5.1.4 方法 |
| 5.2 结果与讨论 |
| 5.2.1 糖苷酶A对固定EFEs的去糖基化 |
| 5.2.2 蚯蚓纤溶酶经糖苷酶A去糖链后的酶活变化 |
| 5.3 小结 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表论文情况 |
（5）蚓激酶转基因苜蓿（Medicago sativa）及丹参（Salvia miltiorrhizae）的构建及检测（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1 蚓激酶的研究进展 |
| 1.1 蚓激酶的分离纯化 |
| 1.1.1 蚓激酶分离纯化方法 |
| 1.1.2 蚓激酶的分离纯化的研究进展 |
| 1.2 蚓激酶的理化特性 |
| 1.3 蚓激酶的分子生物学特性 |
| 1.3.1 蚓激酶组分 |
| 1.3.2 蚓激酶的核苷酸编码序列及同源性比较 |
| 1.4 蚓激酶的纤溶特性的研究 |
| 1.4.1 对纤维蛋白原及纤溶酶原研究 |
| 1.4.2 底物特异性研究 |
| 1.4.3 酶抑制剂的研究 |
| 1.5 重组蚓激酶的表达 |
| 1.6 蚓激酶的应用 |
| 1.7 存在的问题 |
| 1.8 展望 |
| 2 植物生物反应器的研究进展 |
| 2.1 植物外源蛋白表达系统 |
| 2.1.1 稳定的遗传表达系统 |
| 2.1.2 植物病毒表达系统 |
| 2.1.3 植物叶绿体表达系统 |
| 2.1.4 油体表达系统 |
| 2.2 植物反应器的优点 |
| 2.2.1 植物反应器是一种高效、廉价的生产系统 |
| 2.2.2 具有真核生物的加工修饰功能 |
| 2.2.3 具有应用安全性 |
| 2.3 存在的问题 |
| 2.3.1 外源蛋白在植物中表达一直都存在表达量低的问题 |
| 2.3.2 适用于做转基因宿主的植物范围还很窄 |
| 2.3.3 复杂糖基化问题 |
| 2.3.4 植物生产的药用蛋白口服时易被胃蛋白酶降解 |
| 2.3.5 蛋白提取加工生产成本非常高 |
| 2.4 展望 |
| 3 苜蓿生物技术的研究进展 |
| 3.1 苜蓿的组织培养 |
| 3.1.1 品种基因型 |
| 3.1.2 外植体的类型 |
| 3.1.3 培养基的种类 |
| 3.1.4 激素的配比 |
| 3.2 苜蓿的遗传转化技术 |
| 3.2.1 农杆菌介导的遗传转化 |
| 3.2.2 基因枪法转化 |
| 3.2.3 电击法转化 |
| 3.3 苜蓿遗传转化的研究进展 |
| 3.3.1 转抗病虫害基因苜蓿的研究 |
| 3.3.2 苜蓿的品质改良 |
| 3.3.3 转抗逆基因苜蓿的研究 |
| 3.3.4 转抗除草剂基因苜蓿的研究 |
| 3.4 转基因苜蓿作为生物反应器的研究现状和应用前景 |
| 4 丹参生物技术的研究进展 |
| 4.1 丹参的离体培养 |
| 4.1.1 丹参的组织培养 |
| 4.1.2 丹参的细胞培养 |
| 4.1.3 人工诱导多倍体 |
| 4.2 丹参基因工程的研究进展 |
| 4.2.1 丹参次生代谢基因工程的研究 |
| 4.2.2 丹参抗病基因工程的研究 |
| 4.2.3 丹参抗逆基因工程的研究 |
| 4.2.4 其它丹参功能基因的研究 |
| 4.2.5 丹参作为植物反应器的研究 |
| 4.3 丹参生物技术的存在的问题与展望 |
| 5 本研究的目的和意义 |
| 第二章 苜蓿的遗传转化与转基因植株的检测 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 植物材料 |
| 1.1.2 菌株和质粒 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.1.4 培养基 |
| 1.1.5 PCR引物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 农杆菌介导的苜蓿转化 |
| 1.2.2 CTAB法提取苜蓿基因组DNA |
| 1.2.3 转基因植株的PCR检测 |
| 1.2.4 碱裂解法小量提取质粒DNA |
| 1.2.5 Southern分析 |
| 1.2.6 ELISA分析 |
| 1.2.7 蛋白纤溶活性的测定 |
| 1.2.8 TAME法测定转基因植株及蚓激酶肠溶胶囊中蚓激酶活性及标准曲线的绘制 |
| 1.2.9 转基因植株再生的Kan抗性检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 苜蓿转基因植株的获得 |
| 2.2 转基因植株的PCR检测 |
| 2.3 转基因植株的Southern检测 |
| 2.4 转基因植株表达蛋白的ELISA检测 |
| 2.5 蛋白纤溶活性的测定 |
| 2.6 TAME法测定转基因植株及蚓激酶肠溶胶囊中蚓激酶活性及标准曲线的绘制 |
| 2.7 转基因植株再生的Kan抗性检测 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 丹参的遗传转化与转基因植株的检测 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 植物材料 |
| 1.1.2 菌株和质粒 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.1.4 培养基 |
| 1.1.5 PCR引物 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 农杆菌介导的丹参遗传转化 |
| 1.2.2 基因组DNA的提取 |
| 1.2.3 转基因植株的PCR检测 |
| 1.2.4 碱裂解法小量提取质粒DNA |
| 1.2.5 Southern分析 |
| 1.2.6 ELISA分析 |
| 1.2.7 蛋白纤溶活性的测定 |
| 1.2.8 TAME法测定转基因植株中蚓激酶表达活性 |
| 1.2.9 转基因植株再生的Kan抗性的检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 丹参转基因植株的获得 |
| 2.2 转基因植株的PCR检测 |
| 2.3 转基因植株的Southern检测 |
| 2.4 转基因植株表达蛋白的ELISA检测 |
| 2.5 蛋白纤溶活性的测定 |
| 2.6 TAME法测定转基因植株中蚓激酶活性 |
| 2.7 转基因植株再生的Kan抗性检测 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 结论 |
| 本研究的创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（6）蚯蚓纤溶酶基因多态性分析和各组分克隆产物的活性比较（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 序言 |
| 1.1 蚯蚓 |
| 1.2 血栓病 |
| 1.3 蚯蚓纤溶酶 |
| 1.4 EFE的生化制备组分 |
| 1.5 EFE基因的研究 |
| 1.6 EFE基因表达 |
| 1.7 论文背景、思路及技术路线 |
| 1.7.1 本实验室前期工作基础 |
| 1.7.2 本研究的目的和意义 |
| 1.7.3 研究所用的表达载体的特点 |
| 1.7.3.1 克隆载体 |
| 1.7.3.2 表达载体 |
| 1.7.4 技术路线 |
| 1.7.4.1 技术路线一 |
| 1.7.4.2 技术路线二 |
| 1.7.4.3 技术路线三 |
| 第2章 蚯蚓纤溶酶序列多态性分析 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 生物信息学软件、数据库和网址 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.2.1 核酸序列信息收集和分析 |
| 2.1.2.2 数据库的建立 |
| 2.1.2.3 序列拼接 |
| 2.1.2.4 核酸序列比对 |
| 2.1.2.5 蛋白质序列比对 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 核酸序列信息收集和分析 |
| 2.2.2 电子克隆结果与分析 |
| 2.2.2.1 P-I-O组 |
| 2.2.2.2 P-I-1组 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 核酸序列多态性 |
| 2.3.2 蛋白质多态性 |
| 2.3.3 P-Ⅱ组电子克隆的问题 |
| 第3章 蚯蚓纤溶酶P-Ⅲ组分序列分析 |
| 3.1 主要实验材料 |
| 3.1.1 实验材料和试剂 |
| 3.1.2 配制试剂 |
| 3.1.3 主要实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 P-Ⅲ基因分析 |
| 3.2.2 蚯蚓EFP-Ⅲ-2基因片断的制备 |
| 3.2.2.1 蚯蚓总RNA的提取 |
| 3.2.2.2 引物设计 |
| 3.2.2.3 反转录合成cDNA第一条链 |
| 3.2.2.4 EfP-Ⅲ基因片断的扩增 |
| 3.2.3 P-Ⅲ质粒文库的构建 |
| 3.2.3.1 P-Ⅲ基因片段的回收 |
| 3.2.3.2 小量碱裂解法提取质粒PUC18 |
| 3.2.3.3 质粒PUC18和PCR产物的酶切 |
| 3.2.3.4 P-Ⅲ基因片段的琼脂糖凝胶回收纯化 |
| 3.2.3.5 纯化的P-Ⅲ基因片段与质粒PUC18的连接 |
| 3.2.3.6 CaCl_2法制备感受态细胞 |
| 3.2.3.7 质粒转化入感受态细胞 |
| 3.2.4 质粒文库的筛选与鉴定 |
| 3.2.4.1 白斑选取和菌种的点种 |
| 3.2.4.2 中间引物设计 |
| 3.2.4.3 白斑的菌落PCR鉴定 |
| 3.2.5 EfP-Ⅲ-2基因的序列测定 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 P-Ⅲ组分序列分析结果 |
| 3.3.2 蚯蚓EfP-Ⅲ-2基因片断的制备 |
| 3.3.2.1 蚯蚓总RNA的提取 |
| 3.3.2.2 引物设计 |
| 3.3.2.3 EfP-Ⅲ基因片断的扩增 |
| 3.3.3 P-Ⅲ质粒文库的构建 |
| 3.3.4 P-Ⅲ质粒文库的筛选 |
| 3.3.5 测序结果和分析 |
| 3.3.5.1 测序结果 |
| 3.3.5.2 EfP-Ⅲ-1、EfP-Ⅲ-2和EfP-Ⅲ-3的蛋白质分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 P-Ⅲ核酸序列多态性问题 |
| 3.4.2 蚓种与多态性的问题 |
| 第4章 EFE基因克隆表达产物的活性分析 |
| 4.1 主要实验材料 |
| 4.1.1 实验材料和试剂 |
| 4.1.2 配制试剂 |
| 4.1.3 主要实验仪器 |
| 4.1.4 使用的质粒 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 感受态细菌的制备 |
| 4.2.2 感受态细菌的转化 |
| 4.2.3 菌落PCR检验阳性克隆 |
| 4.2.4 重组EFE的诱导表达与纯化 |
| 4.2.4.1 重组EFE的诱导表达 |
| 4.2.4.2 重组EFE表达产物的纯化 |
| 4.2.4.3 重组EFE纯化产物的蛋白质含量测定 |
| 4.2.4.4 酪蛋白平板及纤维蛋白平板法检测表达蛋白活性 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 EFE蛋白的诱导表达 |
| 4.3.2 EFE蛋白的诱导表达产物的纯化 |
| 4.3.3 蛋白质含量测定 |
| 4.3.4 酪蛋白平板 |
| 4.3.5 纤维蛋白平板 |
| 4.3.6 底物电泳 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 P-Ⅲ组分活性的问题 |
| 4.4.2 四组分克隆表达产物的活性大小问题 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）蚓激酶基因在原核和毕赤酵母中的表达（论文提纲范文）
| 提要 |
| 英文缩写词表 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 蚓激酶相关研究 |
| 第二章 外源基因的表达 |
| 第二篇 实验部分 |
| 第一章 蚓激酶在大肠杆菌中的表达 |
| 第二章 蚓激酶在毕赤酵母中的表达 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 致谢 |
（8）瓜蒌（Trichosanthes kirilowii）等中草药纤溶酶的筛选、分离纯化与cDNA克隆（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 溶栓药物的研究进展 |
| 1.1.1 血栓性疾病 |
| 1.1.2 临床应用的主要溶栓药物 |
| 1.1.3 溶栓药物的研究进展 |
| 1.1.4 植物源溶栓药物的研究进展 |
| 1.2 纤溶酶的性质及作用机制 |
| 1.2.1 丝氨酸蛋白酶的分类及其作用机制 |
| 1.2.2 植物丝氨酸蛋白酶的研究进展 |
| 1.3 溶栓活性体外检测方法 |
| 1.3.1 纤维蛋白平板法 |
| 1.3.2 发色底物法 |
| 1.3.3 酶联纤维蛋白溶解法 |
| 1.3.4 凝块溶解时间法 |
| 1.3.5 BAEE底物法 |
| 1.3.6 纤维蛋白自显影法和纤维蛋白-聚丙烯酰胺电泳法(Fibrin-PAGE) |
| 第2章 活血化淤中草药纤溶酶的筛选与鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 仪器 |
| 2.1.4 方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 活血化淤中草药纤溶酶的筛选 |
| 2.2.2 具有纤溶酶活性的中草药蛋白质含量 |
| 2.2.3 蛋白质提取物比活力的计算 |
| 2.3 讨论 |
| 第3章 牛膝与稀莶草纤溶酶的离子交换分离 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 溶液 |
| 3.1.3 仪器 |
| 3.1.4 方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 中草药样品的脱色素处理 |
| 3.2.2 离子交换缓冲液pH的确定 |
| 3.2.3 DEAE-Sepharose离子交换分离纯化蛋白 |
| 3.3 讨论 |
| 第4章 益母草纤溶酶的亲和层析分离 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 试剂 |
| 4.1.3 溶液 |
| 4.1.4 仪器 |
| 4.1.5 方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 蛋白酶抑制剂对益母草纤溶酶提取物的影响 |
| 4.2.2 苯甲脒偶联树脂最佳浓度的确定 |
| 4.2.3 益母草纤溶酶纯化分析 |
| 4.3 讨论 |
| 第5章 瓜蒌纤溶酶的部分酶学性质的研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 试剂 |
| 5.1.3 方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 蛋白酶抑制剂对瓜蒌纤溶酶提取物活性的抑制作用 |
| 5.2.2 瓜蒌纤溶酶提取物胰蛋白酶的活性测定 |
| 5.2.3 瓜蒌纤溶酶提取物对牛血红蛋白的水解 |
| 5.2.4 瓜蒌纤溶酶提取物对牛血清白蛋白的水解作用 |
| 5.2.5 瓜蒌纤溶酶提取物对人免疫球蛋白G的水解作用 |
| 5.2.6 瓜蒌纤溶酶提取物对纤维蛋白原的水解作用 |
| 5.2.7 瓜蒌纤溶酶提取物对纤维蛋白的水解作用 |
| 5.2.8 温度对瓜蒌纤溶酶提取物稳定性的影响 |
| 5.2.9 pH对瓜蒌纤溶酶提取物稳定性的影响 |
| 5.2.10 瓜蒌纤溶酶提取物激酶活性的检测 |
| 5.3 讨论 |
| 第6章 瓜蒌纤溶酶的分离纯化 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 试剂 |
| 6.1.3 大豆胰蛋白酶抑制剂的活性测定 |
| 6.1.4 瓜蒌粗提物的制备 |
| 6.1.5 鲜瓜蒌粗提物的制备 |
| 6.1.6 亲和层析分离瓜蒌纤溶酶的粗提物 |
| 6.1.7 反相层析分离瓜蒌纤溶蛋白 |
| 6.1.8 瓜蒌纤溶酶的离子交换分离 |
| 6.1.9 Sephacryl S-100分离瓜蒌酶 |
| 6.1.10 制备电泳分离瓜蒌纤溶酶 |
| 6.1.11 酸性电泳检测瓜蒌纤溶酶 |
| 6.1.12 纯化蛋白质的分析 |
| 6.1.13 等电聚焦电泳测定纯化的瓜蒌纤溶酶 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 纤溶酶活性测定 |
| 6.2.2 瓜蒌纤溶酶的亲和层析 |
| 6.2.3 反相层析分离瓜蒌纤溶酶 |
| 6.2.4 DEAE-Sepharose离子交换平衡缓冲液pH的确定 |
| 6.2.5 等电点的测定 |
| 6.3 讨论 |
| 第7章 瓜蒌纤溶酶的基因克隆及序列分析 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 材料 |
| 7.1.2 试剂 |
| 7.1.3 仪器 |
| 7.1.4 方法 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 瓜蒌纤溶酶兼并引物的设计 |
| 7.2.2 瓜蒌果实总RNA的提取及检测 |
| 7.2.3 瓜蒌蛋白酶cDNA的克隆和测序 |
| 7.3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
| 附录 |
（9）蚯蚓纤溶酶EfP-Ⅰ和抗菌肽EAP-1基因的克隆表达及活性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 蚯蚓纤溶酶EfP-Ⅰ基因的克隆表达及活性分析 |
| 第1章 序言 |
| 1.1 蚯蚓纤溶酶的应用价值 |
| 1.2 蚯蚓纤溶酶的组分及分类 |
| 1.3 蚯蚓纤溶酶的基本结构性质 |
| 1.4 蚯蚓纤溶酶的基因工程研究 |
| 1.5 论文背景、思路及技术路线 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 主要实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 蚯蚓纤溶酶基因(Efp-Ⅰ)的制备 |
| 2.2.2 EfP-Ⅰ基因片段的TA克隆 |
| 2.2.3 EfP-Ⅰ基因片段的序列测定 |
| 2.2.4 pMAL-c2X-Efp-Ⅰ与pBV221-Efp-Ⅰ表达载体的构建 |
| 2.2.5 pMAL-c2X-Efp-Ⅰ在E.coli TB1中的诱导表达 |
| 2.2.6 表达产物的纯化 |
| 2.2.7 Western blotting |
| 2.2.8 纤溶酶活性检测 |
| 2.2.9 pBV221-Efp-Ⅰ在E.coli JM109中的诱导表达 |
| 第3章 实验结果与讨论 |
| 3.1 蚯蚓纤溶酶基因(Efp-Ⅰ)的制备 |
| 3.2 EfP-Ⅰ基因片段的TA克隆 |
| 3.3 测序分析及同源性比较 |
| 3.4 pMAL-c2X-Efp-Ⅰ和pBV221-Efp-Ⅰ表达载体的构建 |
| 3.5 pMAL-c2X-Efp-Ⅰ在E.coli TB1中的诱导表达和纯化 |
| 3.6 Western blotting |
| 3.7 纤溶酶活性分析 |
| 3.8 pBV221-Efp-Ⅰ在E.coli JM109中的诱导表达 |
| 第4章 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 蚯蚓抗菌肽EAP-1基因的克隆与表达 |
| 第1章 序言 |
| 1.1 抗菌肽概述 |
| 1.2 抗菌肽的分类及抗菌肽数据库 |
| 1.3 抗菌肽的作用特点 |
| 1.4 抗菌肽的活性及其作用机理 |
| 1.5 抗菌肽的基因工程研究 |
| 1.6 抗菌肽的应用 |
| 1.7 蚯蚓与蚯蚓抗菌肽 |
| 1.8 论文背景、思路及技术路线 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 主要实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 直隶环毛蚓抗菌肽基因(EAp-1)的制备 |
| 2.2.2 EAp-1基因片段的TA克隆 |
| 2.2.3 重组质粒测序分析 |
| 2.2.4 pMAL-p2X-EAp-1和pKW32-EAp-1表达载体的构建 |
| 2.2.5 pMAL-p2X-EAp-1诱导表达及产物纯化 |
| 2.2.6 抗菌活性测定 |
| 2.2.7 pKW32-EAp-1的诱导表达 |
| 2.2.8 Lumbricin Ⅰ(6-34)的29肽抗菌活性的测定 |
| 2.2.9 29肽基因的克隆表达 |
| 第3章 实验结果与讨论 |
| 3.1 蚯蚓抗菌肽基因(EAp-1)的制备 |
| 3.2 EAp-1基因片段的TA克隆 |
| 3.3 重组质粒的测序分析 |
| 3.4 pMAL-p2X-EAp-1和pKW32-EAp-1表达载体的构建 |
| 3.5 pMAL-p2X-EAp-1的诱导表达和产物纯化 |
| 3.6 抗菌活性检测 |
| 3.7 pKW32-EAp-1的诱导表达 |
| 3.8 Lumbricin Ⅰ(6-34)的29肽的抗菌活性检测 |
| 3.9 29肽基因的克隆表达 |
| 第4章 结论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 研究生期间发表的论文 |
（10）蚯蚓纤溶酶酶学性质及糖链分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 前言 |
| 1.1 蚯蚓纤溶酶 |
| 1.1.1 蚯蚓简介 |
| 1.1.2 蚯蚓纤溶酶研究现状 |
| 1.2 糖蛋白 |
| 1.2.1 糖蛋白的结构 |
| 1.2.2 糖蛋白的功能及其糖链部分的作用 |
| 1.2.3 糖蛋白的分析手段 |
| 1.3 前期研究、本论文的主要研究内容及意义 |
| 第2章 蚯蚓纤溶酶的分离和纯化 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 仪器 |
| 2.1.4 方法 |
| 2.2 结果与讨论 |
| 2.2.1 两种配基亲和层析效果对照 |
| 2.2.2 单组分纯化效果电泳图 |
| 2.3 小结 |
| 第3章 蚯蚓纤溶酶各组分生物学活性及酶学性质 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 仪器 |
| 3.1.4 方法 |
| 3.2 结论 |
| 3.2.1 各单组分活性对比 |
| 3.2.2 蚯蚓纤溶酶热耐受性试验结果 |
| 3.2.3 不同蛋白酶抑制剂对酶的纤维蛋白水解活性的作用 |
| 3.2.4 抑制剂对2、4组分BAEE活性的影响 |
| 3.3 小结 |
| 第4章 蚯蚓纤溶酶糖链分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 试剂 |
| 4.1.3 仪器 |
| 4.1.4 方法 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.2.1 Schiff's试剂染色结果 |
| 4.2.2 蚯蚓纤溶酶糖含量 |
| 4.2.3 紫外光谱分析糖肽键的类型 |
| 4.2.4 凝集素法分析蚯蚓纤溶酶糖链结构 |
| 4.2.5 单糖衍生化结果图 |
| 4.2.6 肼解法获得糖链情况 |
| 4.3 小结 |
| 第5章 蚯蚓纤溶酶糖链的去除及对酶的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 试剂 |
| 5.1.3 仪器 |
| 5.1.4 方法 |
| 5.2 结果与讨论 |
| 5.2.1 TMSF去除糖链效果鉴定 |
| 5.2.2 TMSF去除糖链后蚯蚓纤溶酶活性 |
| 5.2.3 TMSF去除糖链前后抗原性的变化情况 |
| 5.2.4 糖链与组分抗蛋白酶水解作用的关系 |
| 5.2.5 糖苷酶去除糖链情况分析 |
| 5.3 小结 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、cDNA cloning and expression of earthworm fibrinolytic enzyme component A（论文参考文献）
- [1]基于多组学模式的威廉环毛蚓抗血栓成分DPf3的分离鉴定及机制研究[D]. 吴娅丽. 北京中医药大学, 2020(04)
- [2]蚯蚓纤溶酶的分离纯化及临床作用研究进展[J]. 李锐,廖鹏运,韩燃,肖湘,常争艳,李文平. 经济动物学报, 2012(01)
- [3]单环刺螠纤溶酶分离纯化、免疫原性及其基因克隆的初步研究[D]. 朱琦. 中国海洋大学, 2009(11)
- [4]去糖基化对蚯蚓纤溶酶部分生物学性质的影响[D]. 殷鹏. 河北大学, 2009(03)
- [5]蚓激酶转基因苜蓿（Medicago sativa）及丹参（Salvia miltiorrhizae）的构建及检测[D]. 田鹏. 中国农业科学院, 2009(10)
- [6]蚯蚓纤溶酶基因多态性分析和各组分克隆产物的活性比较[D]. 王海亮. 河北大学, 2008(S1)
- [7]蚓激酶基因在原核和毕赤酵母中的表达[D]. 孔航天. 吉林大学, 2008(10)
- [8]瓜蒌（Trichosanthes kirilowii）等中草药纤溶酶的筛选、分离纯化与cDNA克隆[D]. 周艳芬. 河北农业大学, 2007(06)
- [9]蚯蚓纤溶酶EfP-Ⅰ和抗菌肽EAP-1基因的克隆表达及活性分析[D]. 李晓霞. 河北大学, 2007(S1)
- [10]蚯蚓纤溶酶酶学性质及糖链分析[D]. 杜忠文. 河北大学, 2007(S2)