IL-18基因修饰DC肿瘤融合疫苗的抗肿瘤作用

一、IL-18基因修饰的DC肿瘤融合瘤苗的抗肿瘤效应（论文文献综述）

黄方^[1]（2018）在《TGF-β1缄默的白血病细胞来源的外泌体为基础的白血病疫苗抗白血病免疫效应的研究》文中进行了进一步梳理背景和目的:白血病复发的根源主要在于体内残存的白血病细胞（Minimal residual leukemia cells,MRL）。清除MRL以进一步延长患者治疗后的长期生存时间是如今白血病治疗的主要攻坚方向。针对白血病细胞的特异性免疫治疗既克服了传统化疗及造血干细胞移植的非靶向性,同时也为患者避免长期接受具有明显毒副作用的放化疗等传统治疗手段提供了新的治疗途径,因而近年来愈加受到关注。外泌体是真核细胞所分泌的,直径为30-100nm之间的微小囊泡。白血病细胞同样也可分泌外泌体,像其它肿瘤细胞源性外泌体（Tumor cell derived exosomes,TEX）一样,白血病细胞源性外泌体（Leukemia cell derived exosomes,LEX）富集有肿瘤细胞相关抗原（Tumor cell associated antigen,TAA）以及热休克蛋白（Heat shock protein,HSP）、MHC分子等重要的参与免疫应答相关分子,并可被抗原递呈细胞（Antigen presenting cells,APC）高效摄取从而诱导一定强度的特异性抗白血病免疫应答。此外,外泌体（Exosomes,EXOs）具有提取方便,便于储存,便于运输,不受MHC分子限制,可透过血脑屏障等优势,因而可被开发成潜在的白血病免疫治疗疫苗。然而临床前期研究显示,未经修饰的TEX作为肿瘤疫苗所诱导的抗肿瘤免疫反应相对较弱,且易出现免疫耐受,因而限制了其进一步的临床应用。同时研究发现,TEX中往往负载了一些具有免疫抑制效应的相关因子。其中TGF-β1是其主要的免疫抑制因子,可通过影响多种免疫细胞的表型及功能来削弱TEX诱导的特异性抗肿瘤免疫效应,是影响TEX免疫原性的重要因素之一。本研究拟通过基因修饰的手段缄默白血病细胞TGF-β1的表达,从而获得TGF-β1低表达的LEX,通过体外及体内实验验证TGF-b1缄默的白血病细胞来源的外泌体抗白血病免疫效应。研究方法:通过携带shRNA的慢病毒感染L1210白血病细胞缄默白血病细胞中TGF-β1的表达,利用密度梯度超高速离心法获得来源于TGF-β1缄默的白血病细胞源性EXOs（LEXTGF-?1si）。经扫描电镜、流式细胞技术及蛋白免疫印迹技术对LEXTGF-?1si的形态学特征与表型特征进行鉴定。利用共聚焦显微镜与流式细胞技术观察树突状细胞（dendritic cells,DC）对LEXTGF-?1si的摄取及其时效动力学。利用流式细胞技术、ELISA技术与混合淋巴反应检测LEXTGF-?1si对DC表型及功能的影响,并利用Real-time PCR及Western blot技术分析LEXTGF-?1si对DC表型调控的相关机制。通过细胞增殖实验、细胞毒杀伤实验及ELISA法分别检测了LEXTGF-?1si靶向结合的DC（DCLEX-TGF-?1si）所诱导的特异性CD4+T细胞增殖反应、CTL反应与Th1细胞因子分泌水平。应用动物模型研究了DCLEX-TGF-?1si所诱导的抗白血病免疫效应。实验结果:1.利用携带shRNA慢病毒载体感染L1210白血病细胞株可有效地缄默其TGF-β1的表达。通过对来源于TGF-β1缄默的白血病细胞源性EXOs（LEXTGF-?1si）形态学及表型的鉴定,结果提示LEXTGF-?1si符合EXOs的特征性形态,并表达EXOs特异性标志蛋白CD63、CD9与HSP70。与未经基因修饰的LEX比较,LEXTGF-?1si所负载的TGF-?1蛋白水平明显下调。2.LEXTGF-?1si可被DC高效摄取,并可较对照LEX更有效地上调DC表面共刺激分子（CD80和CD86）及MHC II类分子的表达水平,促进其IL-12p70和TNF-α的分泌并下调TGF-β1分泌。此外,在混合淋巴细胞实验中,DCLEX-TGF-?1si也可更高效地刺激T细胞增殖。同时本研究发现,LEX在DC成熟分化过程中通过降解转接蛋白Myd88从而影响TLRs/My D88/NF-κB通路活性,因而无法有效促进DC成熟,而LEXTGF-?1si则可有效逆转对Myd88蛋白的降解效应,从而保证DC中TLRs/My D88/NF-κB通路活性,这可能是LEXTGF-?1si相较于LEX可更有效地诱导DC成熟的机制之一。3.相较于未经修饰的LEX靶向结合的DC（DCLEX）,DCLEX-TGF-?1si可更有效地诱导抗原特异性CD4+T细胞增殖、Th1细胞因子分泌。细胞毒杀伤实验显示,在效/靶比为12.5:1以上时,经DCLEX-TGF-?1si诱导产生的CD8+T组对特异性靶细胞杀伤率明显高于DCLEX诱导的CD8+T细胞。4.在小鼠模型中,以DCLEX-TGF-?1si作为肿瘤预防疫苗及肿瘤治疗疫苗行免疫治疗,均可较DCLEX更显着地延长小鼠中位生存期并减缓肿瘤生长。DCLEX-TGF-?1si作为肿瘤治疗性疫苗时,可有效提高荷瘤小鼠外周血中CD4+T,CD8+T,Th1,Tc1细胞比例,并下调Treg细胞比例。结论:应用慢病毒载体在母细胞层面进行基因修饰以缄默TGF-β1从而下调白血病细胞EXOs中TGF-β1蛋白的改造手段是有效可行的。来源于TGF-β1缄默的白血病细胞源性EXOs可通过逆转EXOs源性TGF-?1对TLRs/My D88/NF-κB通路活性的抑制效应从而更有效地促进DC表型及功能成熟。而应用TGF-β1缄默的白血病细胞源性EXOs靶向结合的树突状细胞（DCLEX-TGF-?1si）为成分的抗白血病疫苗通过诱导更强大的抗原特异性CD4+T细胞增殖反应、CTL反应和Th1细胞因子分泌从而在体内诱导较DCLEX更强有力的特异性抗肿瘤免疫应答效力,可开发成为高效的抗白血病免疫疫苗。

崔碧玉^[2]（2017）在《AFP+GP73+HepG2/DC融合瘤苗抗肝癌免疫应答的实验研究》文中认为目的:手术、放疗、化疗和生物免疫治疗是目前治疗恶性肿瘤的四大主要手段。树突状细胞（Dendritic cell,DC）是肿瘤生物治疗领域的焦点。目前,对DC/肿瘤融合细胞疫苗用于肿瘤治疗已进行了大量的研究,然而由于肿瘤细胞免疫原性低,抗原表达少,导致诱导的杀伤效应不强。甲胎蛋白（Alpha Fetoprotein,AFP）是目前临床应用最广泛的肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）标志物,且被用作肝癌免疫治疗的靶抗原。研究表明,AFP致敏的DC能够诱导出针对AFP阳性肝癌的细胞毒T淋巴细胞（Cytotoxic T lymphocyte,CTL）反应。高尔基体糖蛋白73（Golgi protein-73,GP73）是近年来发现的最有价值的肝癌标志。本课题组前期研究结果显示,HCC患者血清GP73水平显着升高,GP73诊断HCC的敏感性和特异性显着高于AFP;且免疫组化结果提示肝癌组织可产生大量的GP73,提示其可作为肝癌的分子标记物。为进一步明确GP73能否作为肝癌免疫治疗的靶抗原,联合AFP能否提高肝癌细胞的免疫原性,加强DC/肿瘤融合细胞疫苗的抗肿瘤免疫反应,本研究利用基因工程技术构建过表达AFP和GP73的肝癌细胞,并将过表达的肝癌细胞与DC在体外利用聚乙二醇（Polyethyleneglycol,PEG）融合,观察DC/肿瘤融合细胞诱导的CTL对肝癌细胞的杀伤活性。方法:利用基因工程技术分别构建携带AFP和GP73基因的慢病毒,并通过流式细胞仪筛选AFP和GP73均阴性表达的肝癌细胞株;通过病毒感染预实验确定病毒感染肝癌细胞的最佳条件,在最佳条件下,两种慢病毒分别或共转染筛选的肝癌细胞,利用倒置荧光显微镜观察转染效率;采用RT-PCR和Western blot实验从基因和蛋白水平验证得到的AFP-GP73-Hep G2、AFP+GP73-HepG2、AFP-GP73+HepG2和AFP+GP73+HepG2四组细胞AFP和GP73的表达;同时以密度梯度离心法分离健康志愿者外周血单个核细胞,细胞因子诱导培养DC;利用PEG诱导培养的DC与AFP+GP73+HepG2融合;CCK-8试剂盒体外检测融合细胞诱导的CTL对各组肝癌细胞的杀伤活性;荷瘤裸鼠融合疫苗的接种观察融合细胞疫苗体内的抑瘤效果。结果:筛选得到AFP-GP73-Hep G2肝癌细胞,慢病毒构建成功,转染AFP-GP73-Hep G2后,通过荧光倒置显微镜观察,显示转染效率均在85%以上,且RT-PCR和Western blot验证AFP在AFP+GP73-HepG2和AFP+GP73+HepG2中高表达,GP73在AFP-GP73+HepG2和AFP+GP73+HepG2中高表达,提示转染成功。外周血单个核细胞在细胞因子的作用下能够诱导分化为具有典型树枝状形态的细胞,与AFP+GP73+HepG2融合后高表达CD80、CD86和HLA-DR,表明具有较强的抗原提呈和启动T细胞免疫应答的功能。AFP+GP73+HepG2/DC诱导的CTL在体外对四组肝癌细胞具有杀伤作用,且对AFP+GP73+HepG2组细胞杀伤效应最明显,差异具有统计学意义;荷瘤裸鼠体内实验也证实,融合细胞疫苗对AFP+GP73+HepG2组裸鼠的肿瘤抑制效应最显着。结论:GP73也可作为肝癌免疫治疗的靶抗原,且与AFP联合可以更显着提高肝癌的免疫原性,加强融合细胞疫苗的抗肿瘤免疫效应,也对解决AFP阴性肝癌的免疫治疗提供了一条新策略。

崔碧玉,庞业滨,罗小玲^[3]（2016）在《肝癌树突状细胞疫苗的研究进展》文中研究指明肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,由于起病隐匿,不易早期诊断,手术切除后容易复发转移,且对放化疗均不敏感,总体治疗效果不理想。生物免疫治疗作为继传统肿瘤治疗的第4种模式,联合传统治疗对预防肝癌患者术后肿瘤的复发转移具有重要意义。树突状细胞（DC）是体内功能最强大的抗原呈递细胞,能激活静息期的T细胞,在肿瘤生物免疫中发挥着至关重要的作用,近年来对DC介导的肿瘤生物免疫治疗研究日益增多。

王雷^[4]（2010）在《白细胞介素27基因转染食管癌患者树突状细胞的抗肿瘤效应及其机理研究》文中研究表明食管癌是人类常见恶性肿瘤之一,全世界每年约30万人死于食管癌。我国是食管癌高发区,发病率为20/10万,居世界该病例第一位,我国每年因食管癌死亡的人数占全部恶性肿瘤死亡的近四分之一。食管癌的治疗手段以手术切除为主,辅以化疗和放疗,但其远期疗效仍不够理想,治疗后患者五年生存率多年来徘徊在30%左右,转移和复发是患者死亡的主要原因。随着免疫学和分子生物学研究的进展和对肿瘤认识的逐步深入,明确了食管癌的发生、发展与机体免疫功能低下密切相关。因此,如何激发机体抗肿瘤免疫反应,杀灭体内残余癌细胞,是防治食管癌复发转移,提高疗效的关键。由此,生物治疗已成为肿瘤治疗的一种新策略。诱导机体抗肿瘤特异性和细胞毒活性T细胞产生,达到特异性攻击肿瘤的作用是肿瘤生物治疗的本质。树突状细胞（dendritic cell,DC）是机体内功能最强的抗原提呈细胞（antigen presenting cell,APC）,能摄取、加工提呈抗原,刺激初始T细胞增殖分化,处于启动、调控并维持细胞免疫应答的中心环节,对激发抗肿瘤免疫有重要作用,在肿瘤细胞和T细胞的相互作用中起桥梁和枢纽作用。成熟的DC能够表达高水平的共刺激分子、黏附分子及MHC分子,可有效内化、加工和提呈可溶性抗原、肿瘤抗原,并能激发初始T细胞,启动T细胞介导的特异性抗肿瘤免疫反应。荷瘤宿主体内DC的异常是肿瘤免疫逃逸机制的一个重要方面,DC数量减少和功能低下或缺陷,不能有效提呈肿瘤抗原和提供协同刺激信号,以致T细胞介导的抗肿瘤免疫不能有效发挥作用,因此,如何增加患者体内DC数量并活化DC功能是肿瘤免疫治疗的一个重要研究方向。细胞因子是免疫调节的重要因素,可以活化免疫细胞,增强免疫细胞的功能,有的细胞因子甚至可以直接杀伤肿瘤细胞。因此,通过适当载体将细胞因子基因定向导入肿瘤细胞,使其在宿主体内持续产生细胞因子,可增强机体免疫功能,并且活化的DC进而诱导产生特异性抗肿瘤免疫反应。白细胞介素27（Interleukin,IL-27）是2002年Pflanz等发现并命名的一种新的细胞因子,由活化的树突状细胞和巨噬细胞等抗原提呈细胞产生。IL-27具有免疫调节活性,在抗肿瘤免疫过程中起重要作用。由于该因子是新近发现的细胞因子,许多作用机制尚不清楚。本研究主要目的是深入探讨IL-27转染DC后在人食管癌细胞荷瘤小鼠体内外的抗肿瘤作用及其机理,为食管癌免疫治疗研究提供实验和理论依据。第一部分食管鳞癌及其引流淋巴结组织中树突状细胞CD1a和CD83的表达及其临床意义目的:探讨肿瘤组织浸润树突状细胞（tumor infiltrating dendritic cell, TIDC）CD1a和CD83在食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）组织和引流淋巴结中的表达及其与ESCC临床病理特征的关系。方法:选取河北医科大学第四医院胸外科2002年5月至2003年12月间手术切除并经病理确诊的78例ESCC组织、24例正常食管黏膜、35例正常淋巴结和32例转移淋巴结组织石蜡标本,采用流式细胞术检测上述组织TIDC中CD1a和CD83表达。结果:ESCC组织中CD1a和CD83的表达水平明显低于正常食管黏膜组织（均P<0.05）。CD1a表达水平与ESCC患者的浸润深度、临床分期、分化程度及淋巴结转移无相关性（均P>0.05）;CD83表达水平与ESCC患者的临床分期及淋巴结转移有关（P<0.05）。转移淋巴结组织中CD1a表达水平与正常淋巴结组相比无显着性差异（P>0.05）;转移淋巴结组织中CD83表达水平显着低于正常淋巴结组织（P<0.05）。结论:食管鳞状细胞癌组织和引流淋巴结组织TIDC中CD83表达水平反映食管癌的局部免疫状态,成熟TIDC数量减少使DC的抗原提呈功能降低,机体对食管癌细胞识别能力减退,从而导致肿瘤免疫逃逸。本研究为阐明食管癌免疫逃逸机制和开展食管癌的免疫生物学治疗提供了理论和临床基础。第二部分食管癌患者外周血细胞诱导、培养树突状细胞的实验研究目的:探讨从食管癌患者外周血分离、诱导与扩增树突状细胞（DC）的有效方法。方法:采用密度梯度离心法从食管癌患者外周血分离单个核细胞,分别加入GM-CSF（100ng/ml）+IL-4（50ng/ml）,（作为对照组）;GM-CSF（100ng /ml）+IL-4（50/ml）+flt-3L（40ng/ml） , （作为实验1组） ;第三组加入GM-CSF（100ng/ml）+IL-4（50ng/ml）+flt-3L（40ng/ml） +SCF（100ng/ml）,（作为实验2组）。于37℃、5%CO2环境下进行培养,动态观察细胞生长情况,流式细胞仪检测培养第六天时DC表面分子CD1a、CD83、CD80、CD86的表达水平。结果:上述不同刺激物均能从外周血单个核细胞成功诱导出DC,与对照组相比,实验组诱导出更多数量的DC,其中以实验2组最多;培养至第六天时,两实验组DC细胞表型CD1a表达率与对照组无明显差别（P>0.05）,CD83、CD80、CD86表达水平明显高于对照组（P<0.01）,其中以实验2组表达水平最高（P<0.01）。结论:联合应用GM-CSF、IL-4、flt-3L和SCF能有效的从食管癌患者外周血诱导培养出大量具有活性的DC,为进一步的临床应用研究奠定基础。第三部分抗原致敏IL-27基因修饰的树突状细胞诱导抗食管癌免疫反应的体外实验研究目的:探讨食管癌细胞抗原致敏白介素-27（IL-27）基因修饰的树突状细胞（DC）体外诱导CTL杀伤食管癌细胞的效能及其机制。方法:采用重组逆转录病毒介导IL-27基因转染食管癌患者外周血DC;反复冻融法提取食管癌细胞裂解产物并致敏经IL-27转染的DC;用RT-PCR检测IL-27基因的表达;ELISA法检测各组DC培养上清中IL-27、IL-12、IFN-γ的水平和不同组别诱导产生的各组CTL培养上清中IFN-γ的水平;流式细胞术分析各组DC表面CD1a、CD83、CD80、CD86的表达;四甲基偶氮唑盐（MTT）实验检测各组DC刺激T细胞增殖活性和检测各组DC诱导细胞毒T细胞（CTL）杀伤食管癌细胞的效能。结果:成功建立了能分泌IL-27的DCIL-27细胞,经RT-PCR和ELISA证实该细胞在mRNA和蛋白水平均可稳定表达IL-27;经抗原致敏IL-27基因转染的DC(DCIL-27+Ag)高表达CD1a、CD83、CD80、CD86分子,表达水平分别为[（55.50±6.62）%,（82.67±7.92）%,（78.33±7.31）%和（85.33±4.32）%],并可分泌高水平IL-12（107.85±7.20）pg/ml、IL-27（430.39±10.12）pg/ml及IFN-γ（411.97±17.80）pg/ml,可明显刺激同源T细胞增殖,增强CTL上清中IFN-γ水平（751.50±31.30）pg/ml,显着高于其它组;诱导产生CTL对食管癌细胞有强大的杀伤作用,显着高于其它组。结论:表达IL-27基因的DCIL-27+Ag细胞可增强体外诱导自体T细胞产生特异性抗食管癌免疫,其作用机制可能与IL-27基因修饰和抗原致敏活化了DC的第二信号表达,促进DC高分泌IL-27、IL-12,活化T细胞致使CTL分泌IFN-γ能力增强密切相关。第四部分抗原致敏IL-27基因修饰的树突状细胞激活特异性CTL对人食管癌裸鼠移植瘤生长的影响目的:研究食管癌细胞抗原致敏IL-27基因修饰的DC活化特异性CTL对人食管癌裸鼠移植瘤生长的影响,研究其诱导细胞凋亡的作用机制。方法:构建人食管癌细胞裸鼠移植瘤模型,共30只裸鼠随机分为5组,每组6只,分别用PBS（I组）、初始T细胞（II组）、DCnaive+初始T细胞（III组）、DCIL-27+初始T细胞（Ⅳ组）和DCIL-27+Ag+初始T细胞（Ⅴ组）,于肿瘤周围注射,间隔4天,共治疗5次。观察荷瘤小鼠的肿瘤体积、瘤重和抑瘤率;TUNEL法检测五组荷瘤小鼠肿瘤组织细胞的原位凋亡;流式细胞术检测移植瘤细胞的细胞周期、凋亡率及凋亡相关蛋白Fas和Caspase-3的表达。结果:免疫接种第Ⅴ组细胞治疗的荷瘤小鼠移植瘤组织的体积和重量分别为（0.56±0.07）cm3、（0.68±0.04）g,明显小于其它治疗组和对照组,差异有显着性意义（P<0.01）;抑瘤率为58.28%,明显大于其它治疗组和对照组,差异有统计学意义（P<0.01）。TUNEL法检测结果显示,免疫接种第Ⅴ组细胞荷瘤小鼠的肿瘤组织内凋亡细胞灶性分布,细胞核内有棕黄色颗粒,免疫接种第II、III、Ⅳ组细胞荷瘤小鼠肿瘤组织内可见少量凋亡细胞,I组仅见极少数散在分布的凋亡细胞。接种第Ⅴ组细胞荷瘤小鼠肿瘤组织中凋亡率明显高于其余接种组（P<0.01）。FCM分析结果显示,免疫接种第Ⅴ组细胞的荷瘤小鼠皮下肿瘤组织内细胞增殖指数为（23.92±1.60）%,显着低于其余接种组,差异有显着性意义（P<0.01）;而细胞凋亡率为（32.78±0.83）%,显着高于其余接种组,差异有显着性意义（P<0.01）;Fas和Caspase-3蛋白表达水平均明显高于其余接种组（P<0.01）。结论:食管癌细胞抗原致敏IL-27基因修饰DC可活化特异性CTL,在荷瘤小鼠体内对食管癌细胞具有强大细胞毒作用,显着抑制食管癌细胞体内增殖、促进其凋亡,为DC应用于食管癌的免疫治疗提供了理论和动物实验依据。

武立华^[5]（2010）在《CD40L转染小鼠结肠癌细胞致敏树突状细胞抗肿瘤作用的研究》文中认为目的:采用小鼠结肠癌细胞为研究对象。研究转染CD40L基因的小鼠结肠癌细胞抗肿瘤效应,以及表达CD40L基因的肿瘤细胞诱导骨髓起源的树突状细胞（dendritic cells,DC）产生免疫抗肿瘤作用的情况,分析CD40L基因及其瘤苗在结肠癌治疗中的效果及作用机制,探讨表达CD40L基因的肿瘤细胞和DC细胞相互作用的关系,为CD40L基因修饰疫苗在结肠癌的临床治疗研究提供理论依据。方法:1 CD40L真核表达载体的扩增、鉴定与大量制备将pMKITneo-CD40L质粒转化DH5ɑ感受态菌株进行扩增,采用质粒提取试剂盒提取质粒,用限制性内切核酸酶EcoR I酶切鉴定、PCR鉴定及质粒测序分析鉴定。将鉴定符合实验条件的质粒进行大量制备。2细胞培养和质粒转染及筛选稳定转染的细胞系采用脂质体转染法将全长的小鼠CD40L基因转染入结肠癌细胞株colon26中,用G418筛选抗药性克隆,并以相同的方法得到空载体转染细胞。3细胞转染效率测定用流式细胞术检测各组细胞CD40L的表达。分别用半定量RT-PCR法、激光共聚焦显微镜、Western印迹法检测各组细胞CD40L mRNA及蛋白的表达。4转染CD40L基因对细胞增殖的影响测定用MTS法测定各组细胞的增殖情况,并绘制细胞生长曲线。5转染CD40L基因对细胞侵袭能力的影响测定用半定量RT-PCR法检测各组细胞MMP-2 mRNA的表达。用Transwell法测定各组细胞的侵袭能力。6小鼠骨髓源性DC的制备取BALB/c雌性小鼠的胫骨和股骨骨髓细胞,在含GM-CSF、IL-4的10% FCS RPMI-1640中培养7天。收集非黏附的细胞并用CD11c+磁珠进行筛选,筛选后细胞用作DC。流式细胞术检测DC细胞表面CD11c的表达。7肿瘤细胞与DC共培养对DC功能的影响测定将各组细胞与DC共培养24 h后,流式细胞术检测DC细胞表面CD80、CD86、MHCⅠ、MHCⅡ的表达;用半定量RT-PCR法检测IL-12、IL-23、IL-18、IFN-γ、IFN-γ（Mig）基因mRNA的表达;用ELISA法检测共培养上清中IL-12、IL-23、IFN-γ的释放量。8荷瘤小鼠模型的建立收集呈对数生长期的colon26细胞,制成细胞悬液,调整细胞浓度为1×107/ml,于BALB/c小鼠右侧肩背部皮下注射细胞悬液0.1 ml,1×106/只,建立荷瘤小鼠模型。9 CD40L基因瘤苗的体内抑瘤作用在荷瘤小鼠模型建立后,于荷瘤小鼠腹腔分别注射DC、CD40L基因瘤苗、DC联合CD40L基因瘤苗（实验组）或PBS（对照组）,每组5只。观察肿瘤大小变化及治疗效果,经3次治疗后处死小鼠,留取血清、肿瘤、肝、脾组织用于后续实验。10用ELISA法检测荷瘤小鼠外周血中IL-12、IL-23、IFN-γ、IL-10、TGF-β的水平。11经HE染色,显微镜下观察肿瘤组织有无炎细胞浸润,观察肝、脾的组织病理学变化以及有无肿瘤细胞浸润。结果:1经酶切和PCR鉴定扩增质粒及含目的基因分子大小与已知质粒相同,扩增质粒所测核苷酸序列与已知的核苷酸序列相同。2经筛选分别得到了稳定转染CD40L基因和空载体基因的细胞系,转染细胞形态较野生型细胞无明显变化,细胞呈梭形生长,形态饱满。3经流式细胞术检测,转染CD40L基因后colon26/CD40L细胞CD40L表达率较colon26和colon26/vector增加;与colon26/vector和colon26相比,colon26/CD40L组细胞中CD40L mRNA表达量分别上调了45.32%和44.81%（P<0.05）,而colon26/vector和colon26相比,差异无统计学意义（P>0.05）;在激光共聚焦显微镜下可观察到colon26/CD40L组细胞CD40L表达较colon26/vector和colon26高;同时,Western印迹法也证实colon26/CD40L组细胞CD40L蛋白较colon26/vector和colon26分别上调了52.34%和53.58%（P<0.05）,而colon26/vector和colon26相比,差异无统计学意义（P>0.05）。4利用MTS法检测结果显示, colon26、colon26/vector和colon26/CD40L三组细胞在体外生长及细胞增殖无明显差别（P>0.05）。5经半定量RT-PCR法检测结果显示,colon26/CD40L组细胞较colon26/vector和colon26组细胞MMP-2 mRNA的表达减弱（P<0.05）;经苏木素染色观察,colon26/CD40L组细胞穿过Transwell小室较colon26/vector和colon26组细胞少（P<0.05）。6小鼠骨髓源性DC在体外培养过程中,细胞逐渐呈悬浮状态,细胞边缘可见不规则树突状突起,在培养第7天时用CD11c+磁珠进行筛选,筛选后CD11c+ DC纯度可达92.88%。7与colon26/CD40L共培养后,DC细胞表面CD80、CD86、MHCⅠ、MHCⅡ分子表达显着提高,与其它组比较有显着性差异;DC与colon26/CD40L共培养组有IL-12、IL-23、IL-18、IFN-γ、IFN-γ（Mig）基因mRNA的表达,在其它组未见;DC与colon26/CD40L共培养组上清中IL-12、IL-23、IFN-γ的释放量高于DC与colon26共培养组和DC组（P< 0.05）。8成功建立colon26荷瘤小鼠模型。9经过3次治疗后,colon26/CD40L与DC联合治疗组荷瘤小鼠肿瘤比colon26/CD40L治疗组、DC治疗组、对照组减小（P<0.05）,colon26/CD40L与DC联合治疗组抑瘤率为47.92%;colon26/CD40L治疗组、DC治疗组、对照组抑瘤率分别为32.95%、32.26%和0%。10 colon26/CD40L与DC联合治疗组荷瘤小鼠外周血血清中IL-12、IL-23、IFN-γ高于colon26/CD40L治疗组、DC治疗组和对照组,IL-10和TGF-β则呈较低水平（P<0.05）。11 HE染色结果显示,colon26/CD40L瘤苗治疗组、DC治疗组的肿瘤组织切片中可见到大量的肿瘤细胞,病灶周围有少量炎性细胞浸润,有坏死灶;而在联合治疗组肿瘤病灶内有大量炎性细胞浸润,并伴有大片坏死,肿瘤细胞散在分布,肿瘤局限化。以上三组均未发现肝、脾转移。对照组肿瘤组织切片中可见大量肿瘤细胞,但只见极少量炎细胞浸润,并可在肝、脾组织中发现转移灶。结论:表达CD40L的结肠癌细胞有利于DC和肿瘤细胞的相互作用,促进了DC的成熟,诱导了Th1型细胞因子的分泌,产生了T细胞依赖的抗肿瘤免疫反应。DC-CD40L-肿瘤细胞瘤苗有望成为结肠癌免疫治疗的一种新策略。

张吉成,王弼,贾军,封江南,陈涛,陈燕凌^[6]（2009）在《AFP和IL-18双表达腺病毒转染DC肝癌瘤苗的制备及表达》文中认为目的:制备IL-18基因修饰的树突状细胞AFP瘤苗,探索增强肝癌树突状细胞免疫治疗效果的新途径.方法:构建和制备rAd-IL18-AFP双基因表达的重组腺病毒,转染DC,应用RT-PCR和Western Blot方法检测IL-18和AFP基因在DC中的蛋白表达.结果:成功制备IL-18基因修饰的树突状细胞AFP瘤苗,rAd-IL18-AFP介导的IL-18和AFP基因能够在DC中进行蛋白表达.结论:成功制备IL-18基因修饰的树突状细胞AFP瘤苗,为进一步的肝癌免疫基因治疗研究打下基础.

李媛媛^[7]（2008）在《靶向基因修饰树突状细胞瘤苗治疗移植性肝癌的实验研究》文中研究说明目的建立体外诱导和扩增小鼠骨髓来源树突状细胞（DC）的方法,并对其形态和表型进行鉴定。方法在无菌条件下提取C57BL/6J小鼠骨髓细胞,利用细胞因子rmGM-CSF（50ng/ml）和rmIL-4（2ng/ml）联合诱导,于体外培养第6天收集部分疏松贴壁细胞,行流式细胞术（FACS）检测其表型,其余细胞加入rmTNF-a（50ng/ml）继续培养,刺激其成熟,并于48小时后行流式细胞术（FACS）检测其表型。在光镜和电镜下观察DC的形态特征。结果小鼠骨髓单核细胞经细胞因子（rmGM-CSF和rmIL-4）体外诱导培养24小时后,可见增殖性细胞集落,3天后集落增多明显,培养至第7天,收集悬浮细胞在光镜和电镜下均显示细胞表面不规则,呈树突状突起,具有DC的典型形态学特征。流式细胞术检测结果显示:经细胞因子（rmGM-CSF和rmIL-4）诱导的细胞表面均表达CD11c、MHCⅡ、CD80和CD86等DC表面分子,而经rmTNF-a刺激48小时后的细胞,其表达率明显提高,分别为[（81.60±10.02）%],[（78.70±11.35）%],[（65.30±5.73）%]和[（79.65±8.66）%],提示经rmTNF-a刺激后DC趋于成熟。结论细胞因子rmGM-CSF和rmIL-4可在体外联合诱导小鼠骨髓单核细胞发育成DC,体外诱导的DC经rmTNF-a刺激后,可迅速发育成熟,采用这种方法可以体外诱导扩增大量DC。目的构建小鼠甲胎蛋白（mAFP）基因转染的树突状细胞瘤苗（pAdBM5-mAFP-DC）。方法应用HEK293A细胞作为包装细胞,大量扩增含目的基因mAFP的重组腺病毒pAdBM5-mAFP;利用改良的CsCl超速离心法对其进行纯化;用TCID50法测定重组腺病毒滴度。从C57BL/6J小鼠骨髓分离单个核细胞,用重组小鼠白细胞介素4（rmIL-4）和重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rmGM-CSF）诱导和扩增DC。将重组腺病毒颗粒转染DC,用流式细胞术（FACS）检测转染前后DC细胞表面分子MHCⅠ、MHCⅡ、CD18a（LEA）、CD54（ICAM）、CD80（B7.1）、和CD86（B7.2）等的变化。结果获得了50μl纯化病毒液,病毒滴度达0.88×108 PFU/ml。将纯化的重组腺病毒pAdBM5-mAFP转染体外培养的DC,经mAFP基因转染后的DC分子表面高表达MHCⅠ、MHCⅡ、CD18a、CD54、CD80和CD86等分子,其分子表达率分别为69.3%、41.0%、42.1%、63.2%、39.4%和38.6%,与转染前比较差异有统计学意义（p＜0.05）。结论重组腺病毒pAdBM5-mAFP在HEK293A细胞中可成功扩增,所得病毒液量可满足体内基因转染实验的需要。所扩增的重组腺病毒pAdBM5-mAFP可成功转染DC而构建出pAdBM5-mAFP-DC转基因瘤苗;mAFP基因修饰后的DC能表达高水平的MHCⅠ、MHCⅡ、CD18a、CD54、CD80和CD86分子。目的探讨pAdBM5-mAFP-DC瘤苗对C57BL/6J小鼠移植性肝癌发生发展的阻断作用。方法40只C57BL/6J小鼠随机分为A、B、C、D和E组,每组8只。以免疫表达mAFP基因的重组腺病毒转染DC（pAdBM5-mAFP-DC）为A组;免疫表达mAFP基因的质粒DNA（pAdBM5-mAFP）为B组,免疫表达mAFP基因的另一种质粒DNA（pcDNA3.1（+）-mAFP）为C组;免疫单纯DC为D组,以注射单纯PBS为对照组E组。免疫方法:A组和D组在每只小鼠的右腋下注射5×105个细胞（0.1ml/次）,B组和C组在每只小鼠的右腋下注射10.0μg重组质粒（0.1ml/次）,E组,仅注射0.1ml PBS,每1周注射1次,连续免疫4次。在初次免疫后的第3周给所有小鼠移植Hepal-6肝癌细胞。观察小鼠移植瘤的生长情况,于移植肿瘤第14天取血,用ELISA法检测血清TNF-a和IFN-γ的水平,并处死小鼠,检查成瘤情况。同时对肿瘤组织进行组织病理学检查。结果pAdBM5-mAFP-DC瘤苗免疫可诱导强烈的免疫保护作用,瘤苗免疫小鼠能有效抵抗Hepal-6肝癌细胞的攻击,表现为肿瘤生长缓慢（至实验结束,A组有3只小鼠未长出移植瘤）。A、B、C、D和E组的瘤体重量分别为（0.05475±0.029148）g、（0.25425±0.092698）g、（0.14025±0.081074）g、（0.10400±0.027092）g、（0.29300±0.134784）g,A组瘤体重量最轻,与B、C、E组瘤体重量比较有显着性差异（P＜0.01）。计算肿瘤抑制率结果为:A组肿瘤抑制率为81.31%,显着高于其它组。各组小鼠血清中的TNF-a、IFN-γ含量结果表明:A组和D组小鼠血清中TNF-a、IFN-γ水平显着升高,A组血清中TNF-a、IFN-γ水平分别为（180.25±30.25,155.45±24.37）,D组血清中TNF-a、IFN-γ水平分别为（105.32±12.57,90.33±9.70）;A组和D组之间比较有统计学差异（p＜0.05）。组织病理学检查显示:各组肿瘤组织有不同程度的炎细胞浸润,各组比较,以A组最为明显,并以淋巴细胞浸润为主;除A组外,其他各组均见肿瘤因生长过快而血供相对不足所导致的缺血性坏死。结论将构建的pAdBM5-mAFP-DC瘤苗免疫小鼠,可以刺激小鼠体内产生强烈的抗肿瘤免疫反应,使荷瘤小鼠血清中细胞因子TNF-a、IFN-γ水平显着提高,体内诱导产生细胞毒性T细胞,向表达AFP的肝癌细胞趋化,并向肿瘤组织浸润,杀伤肿瘤细胞,从而抑制肿瘤的发生、发展。

李宁^[8]（2007）在《阻断共抑制信号途径联合趋化抗原基因修饰瘤苗治疗肿瘤的研究》文中进行了进一步梳理恶性肿瘤已成为我国死亡率最高的疾病，近年来发病率有显着增高趋势。除了三大常规疗法，生物治疗为攻克肿瘤带来了新的希望。我们研究室经多年研究，在国际上首创了高效趋化抗原基因疫苗系统，本研究在分析了基因疫苗存在问题的基础上，应用前列腺癌趋化抗原基因修饰瘤苗，并通过阻断共抑制信号途径进行免疫治疗研究，分析抗肿瘤效应及相关机制，从而建立更为有效的联合免疫治疗肿瘤的新方案。联合治疗的策略是：将人前列腺特异膜抗原（hPSM）、小鼠前列腺酸性磷酸酶（mPAP）和人的前列腺特异抗原（hPSA）融合，称为3P抗原；以pcDNA3.1为载体，在3P的5′端连接次级淋巴组织趋化性因子（SLC），而在其3′端连接人IgG的Fc基因，得到基因重表达质粒pSLC-3P-Fc，即趋化抗原基因疫苗；以转3P基因的B16F10细胞为前列腺癌小鼠模型；应用pSLC-3P-Fc质粒转染B16F10细胞（B16F10-SLC-3P-Fc）作为前列腺癌趋化抗原基因修饰瘤苗，同时联合应用anti-CTLA-4或anti-B7-H1抗体进行免疫治疗。实验结果显示，基因修饰瘤苗能诱导较强的抗肿瘤免疫反应，与anti-CTLA-4或anti-B7-H1抗体的联合应用可以进一步提高抗肿瘤免疫效应，显着地抑制肿瘤的生长同时延长荷瘤小鼠的生存期，并使大部分小鼠无瘤生存。CTL活性检测表明经免疫的小鼠脾细胞既可产生针对3P抗原特异性的CTL，也可产生针对野生型B16F10的细胞毒效应。再攻击实验证明联合免疫可诱导较强的免疫记忆。CD4+和CD8+ T淋巴细胞亚群的体内删除实验说明，在联合免疫治疗效应期CD8+ T细胞发挥主要的抗肿瘤作用。研究结果表明，趋化抗原基因修饰细胞瘤苗结合共抑制分子通路的阻断作为联合免疫的治疗策略，可以增强免疫反应，并提高长期免疫效应。此外，我们以TC-1肿瘤为模型，研究了anti-CTLA-4和anti-B7-H1两种抗体联合应用的抗肿瘤效应，并初步探讨了作用机制。研究结果表明，两种抗体的联合应用可以产生协同抗肿瘤效应，提高针对TC-1肿瘤细胞的免疫排斥，其中CD8+ T细胞在免疫反应中发挥主要的抗肿瘤作用。从PHA活化的健康中国人外周血淋巴细胞总RNA中，扩增人CTLA-4基因胞外区cDNA片段，将其与人免疫球蛋白IgG的Fc段重组连接，插入到pHIgV中，得到融合基因表达载体。应用脂质体方法转染真核细胞CHO-dhfr-，氨甲喋呤（MTX）进行筛选，得到可以表达融合蛋白hCTLA-4-Fc的CHO-dhfr-细胞，为CTLA-4相关的研究奠定基础。

罗小玲,梁安民^[9]（2007）在《以树突状细胞为基础的肝癌免疫基因治疗》文中研究表明随着树突状细胞疗法的兴起和应用,很多学者在不同的动物模型上研究了应用负载肝癌抗原的树突状细胞瘤苗治疗肝癌的途径、效果及机制,并应用于临床治疗肝癌,取得了较好疗效,为肝癌的综合治疗及预防肝癌术后转移复发提供新的途径。

褚晓源^[10]（2007）在《小鼠肠癌RNA转染mIL-12修饰树突状细胞激发抗肿瘤活性研究》文中研究表明第一部分小鼠肠癌RNA转染mIL-12修饰的树突状细胞诱发特异性CTL的研究目的:研究小鼠结肠癌细胞CT-26 RNA体外转染mIL-12基因修饰的树突状细胞（dendritic cells,DC）,观察其诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）能力方法:小鼠骨髓细胞体外以rmGM-CSF、rmIL-4诱导培养获取DC,流式细胞仪检测纯度;293细胞扩增携带mIL-12基因的重组腺病毒,体外转染DC;Trizol法提取CT-26细胞总RNA,应用TransMessenger体外转染mIL-12基因修饰的DC;ELISA法检测细胞上清及小鼠血液中mIL-12水平,LDH释放法检测小鼠体内特异性CTL活性。结果:小鼠骨髓细胞经诱导培养后,获得大量高纯度的DC,流式细胞仪检测CD11c+的DC > 90%;携带mIL-12基因重组腺病毒转染的DC细胞高表达mIL-12;CT-26细胞总RNA体外转染mIL-12基因修饰的DC后,回输小鼠,能明显提高小鼠体内mIL-12的水平并可以诱导体内生成较高水平的CTL活性,而以RNA转染Ad-LacZ修饰DCs后的对照组及RNA转染DC的对照组,可诱导机体生成中等水平的特异性CTL活性,DC、PBS对照组则均未诱导机体生成特异性CTL活性。结论:小鼠肿瘤总RNA转染mIL-12基因修饰的树突状细胞后,免疫接种小鼠,可提高小鼠体内mIL-12的水平,并能有效诱导机体产生较高水平的特异性CTL活性。第二部分小鼠肠癌RNA转染mIL-12修饰树突状细胞激发抗肿瘤活性研究目的:研究以小鼠结肠癌细胞CT-26 RNA作为抗原物质,体外转染mIL-12基因修饰的树突状细胞（dendritic cells,DC）,观察其激发特异性抗肿瘤效应。方法:小鼠骨髓细胞体外以rmGM-CSF、rmIL-4诱导培养获取树突状细胞,流式细胞仪检测纯度;293细胞扩增携带mIL-12基因的重组腺病毒,体外转染树突状细胞;Trizol法提取CT-26细胞总RNA,应用TransMessenger体外转染mIL-12基因修饰的树突状细胞,免疫接种小鼠。ELISA法检测细胞上清及小鼠血液中mIL-12水平,LDH释放法检测小鼠体内细胞毒性T淋巴细胞（CTL）杀伤活性。结果:小鼠骨髓细胞经诱导培养后,获得大量高纯度的树突状细胞,流式细胞仪检测CD11c+的树突状细胞> 90%;提取的CT-26细胞总RNA体外经TransMessenger介导,转染mIL-12基因修饰的树突状细胞后,回输小鼠,可以诱导体内生成较高水平的特异性CTL活性,亲本肿瘤接种后小鼠100%长期存活,而以该RNA转染Ad-LacZ修饰DC后的对照组及RNA转染DC的对照组,诱导机体生成的特异性CTL活性显着低于实验组（P<0.01）,亲本肿瘤接种后小鼠60%长期存活,DC、PBS对照组则均未诱导机体生成特异性CTL活性,小鼠无长期存活。结论:小鼠树突状细胞经小鼠肠癌CT26细胞总RNA转染后,进一步以mIL-12基因修饰,免疫接种小鼠,可在体内有效提呈肿瘤抗原,诱导机体产生高水平的CTL,更有效地激发特异性抗肿瘤免疫效应。

二、IL-18基因修饰的DC肿瘤融合瘤苗的抗肿瘤效应（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、IL-18基因修饰的DC肿瘤融合瘤苗的抗肿瘤效应（论文提纲范文）

（1）TGF-β1缄默的白血病细胞来源的外泌体为基础的白血病疫苗抗白血病免疫效应的研究（论文提纲范文）

（2）AFP+GP73+HepG2/DC融合瘤苗抗肝癌免疫应答的实验研究（论文提纲范文）

（3）肝癌树突状细胞疫苗的研究进展（论文提纲范文）

（4）白细胞介素27基因转染食管癌患者树突状细胞的抗肿瘤效应及其机理研究（论文提纲范文）

（5）CD40L转染小鼠结肠癌细胞致敏树突状细胞抗肿瘤作用的研究（论文提纲范文）

（7）靶向基因修饰树突状细胞瘤苗治疗移植性肝癌的实验研究（论文提纲范文）

（8）阻断共抑制信号途径联合趋化抗原基因修饰瘤苗治疗肿瘤的研究（论文提纲范文）

（10）小鼠肠癌RNA转染mIL-12修饰树突状细胞激发抗肿瘤活性研究（论文提纲范文）

四、IL-18基因修饰的DC肿瘤融合瘤苗的抗肿瘤效应（论文参考文献）

• [1]TGF-β1缄默的白血病细胞来源的外泌体为基础的白血病疫苗抗白血病免疫效应的研究[D]. 黄方. 上海交通大学, 2018(01)
• [2]AFP+GP73+HepG2/DC融合瘤苗抗肝癌免疫应答的实验研究[D]. 崔碧玉. 广西医科大学, 2017(01)
• [3]肝癌树突状细胞疫苗的研究进展[J]. 崔碧玉,庞业滨,罗小玲. 医学综述, 2016(07)
• [4]白细胞介素27基因转染食管癌患者树突状细胞的抗肿瘤效应及其机理研究[D]. 王雷. 河北医科大学, 2010(01)
• [5]CD40L转染小鼠结肠癌细胞致敏树突状细胞抗肿瘤作用的研究[D]. 武立华. 河北医科大学, 2010(04)
• [6]AFP和IL-18双表达腺病毒转染DC肝癌瘤苗的制备及表达[J]. 张吉成,王弼,贾军,封江南,陈涛,陈燕凌. 第四军医大学学报, 2009(18)
• [7]靶向基因修饰树突状细胞瘤苗治疗移植性肝癌的实验研究[D]. 李媛媛. 广西医科大学, 2008(10)
• [8]阻断共抑制信号途径联合趋化抗原基因修饰瘤苗治疗肿瘤的研究[D]. 李宁. 中国协和医科大学, 2007(09)
• [9]以树突状细胞为基础的肝癌免疫基因治疗[J]. 罗小玲,梁安民. 中国肿瘤, 2007(04)
• [10]小鼠肠癌RNA转染mIL-12修饰树突状细胞激发抗肿瘤活性研究[D]. 褚晓源. 第二军医大学, 2007(04)

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