一、乳腺癌耐药细胞中mdr-1与mrp基因的表达及As_2O_3对其表达的影响（论文文献综述）
程国荣[1]（2021）在《中药逆转肿瘤多药耐药及侵袭转移作用机制研究》文中进行了进一步梳理恶性肿瘤是威胁人类健康的重大疾病,肿瘤细胞多药耐药（Multidrug resistance,MDR）和侵袭转移的发生是临床上肿瘤治疗失败的主要原因。针对MDR和侵袭转移机制从中药中寻找高效、低毒的活性成分是目前抗肿瘤研究的重要课题之一。本论文从分子水平和细胞水平两方面出发,利用超高效液相色谱-质谱联用技术（UPLC-MS）筛选潜在的抗肿瘤活性成分,并基于代谢组学和细胞生物学相结合的研究策略对活性成分的逆转机制及抑制肿瘤侵袭转移作用机制进行深入研究。针对糖酵解过程中的关键限速酶-乳酸脱氢酶（LDH）在许多肿瘤细胞中高表达,被认为是浸润性癌重要靶点的特性,以LDH为靶分子,从中药中筛选其抑制剂。同时基于MDCK-MDR1细胞模型,进行P-糖蛋白（P-gp）介导的MDR逆转剂的筛选。1、中药中LDH抑制剂筛选建立固定化LDH方法,从大黄和虎杖中筛选潜在抑制剂。首先,以磁纳米粒子（MNPs）为载体,经氨基化修饰后,将LDH以共价键合的方式固定在MNPs表面,得到固定化LDH。为了获得最大的酶活力,采用单因素与响应面相结合的方法对固定化条件进行了优化,包括pH值、固定化时间和LDH浓度。在pH值为5.85、反应时间为3.14h、LDH浓度为0.37 mg/mL时,固定化LDH酶活性最佳,此时,LDH固定在MNPs上的量约为49μg/mg。随后,以galloflavin（阳性对照）、绿原酸和毛蕊花糖苷（阴性对照）为模型混合物,进行配体垂钓实验,对固定化LDH的特异性和选择性进行验证。最后,将固定化LDH方法与UPLC-MS/MS相结合,从两种富含蒽醌类化合物的天然产物（大黄和虎杖）中筛选潜在LDH抑制剂。从大黄和虎杖提取物中分别筛选并鉴定出9个和6个化合物,其中有3个化合物为二者所共有,这进一步证实了该方法的可行性。2、基于MDCK-MDR1细胞的P-gp抑制剂筛选利用P-gp过表达的MDCK-MDR1细胞,通过细胞毒性、罗丹明-123（Rh-123）蓄积与外排、Western blot实验和转运实验,对虎杖和白屈菜两种中药提取物及其主要成分进行P-gp抑制剂筛选研究。通过细胞毒性实验确定各个药物的IC20值,蒽醌类和多酚类化合物选择40、20、10 μM进行后续研究。Rh-123蓄积与外排实验显示虎杖提取物比白屈菜提取物对P-gp的抑制作用更强。对三类单体化合物比较,蒽醌类化合物对P-gp抑制作用最强,尤其是芦荟大黄素和大黄酚,其次是多酚类和3个毒性较大的生物碱。另外,通过不同药物处理时间对Rh-123蓄积的影响可以初步推测除虎杖苷、白藜芦醇三甲醚和白屈菜红碱外,其余化合物既能抑制P-gp的功能,又能抑制P-gp的表达。Western blot实验结果表明除虎杖苷和白屈菜红碱外,其余化合物均能抑制P-gp表达。选择效果最强的蕙醌类化合物芦荟大黄素、大黄酚和文献报道较多的白藜芦醇进行转运研究,结果表明芦荟大黄素和白藜芦醇能显着抑制P-gp底物地高辛的外排,而大黄酚没有这种抑制作用。此外,我们还补充了 5个结构相近且毒性较小的生物碱进行研究,发现苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱、槐果碱、氧化槐果碱对P-gp均有较好抑制作用,有望成为MDR逆转剂。3、芦荟大黄素（AE）逆转MDR机制研究基于乳腺癌MCF-7/ADR细胞耐药模型,研究AE的逆转效果及机制。AE能显着逆转MCF-7/ADR细胞对阿霉素（ADR）的耐药性,其逆转指数为4.86。20μMAE与ADR联用对P-gp的表达没有抑制作用,但能显着促进ADR在耐药细胞中的蓄积。通过荧光显微镜观察,显示AE能使ADR更多的进入细胞核中,细胞核是ADR发挥抗肿瘤作用的场所。P-gp对ADR的外排需要ATP水解提供能量,而AE能降低细胞内ATP水平,因而推测AE通过抑制P-gp的外排功能来发挥逆转作用。能量代谢途径的研究结果表明,AE与ADR联用可抑制糖酵解、TCA循环、谷氨酰胺代谢及相关氨基酸合成途径。此外,我们还发现AE不仅可以逆转ADR诱导的耐药,还可以诱导自噬作为防御机制,抑制这一过程可增强AE的逆转活性。此外,AE与ADR联合用药还可以导致MCF-7/ADR细胞G2/M期阻滞并通过DNA损伤、ROS生成、caspase-3激活诱导细胞凋亡。4、芦荟大黄素（AE）和大黄素（EMD）抑制乳腺癌侵袭转移作用机制研究采用基于UPLC-Q-TOF/MS技术的代谢组学方法对乳腺癌MCF-7细胞与人脐血静脉内皮细胞HUVEC共培养模型进行了考察,筛选并鉴定出25个生物标志物,涉及谷胱甘肽代谢、甲硫氨酸循环、嘌呤代谢和TCA循环等代谢通路,这些代谢通路均与肿瘤的恶性表型有关。采用共培养模型研究AE和EMD这两个同分异构体对MCF-7细胞侵袭转移的抑制作用。结果表明AE可以抑制MCF-7细胞的黏附、侵袭及血管生成,而EMD主要是抑制黏附。通过代谢组学的方法研究AE和EMD抑制MCF-7细胞侵袭转移的作用机制。AE和EMD组分别筛选出27个和13个生物标志物,涉及多胺代谢、维生素B6代谢、甲硫氨酸循环、TCA循环、谷胱甘肽代谢、嘌呤代谢和天冬氨酸合成等通路。选择这些通路上的典型代谢物进行定量分析,发现AE能显着降低这些代谢物的含量且效果明显强于EMD。
王开雷[2]（2020）在《粉防己碱逆转大肠癌LOVO/5-Fu多药耐药性的研究》文中研究说明研究背景和意义:大肠癌是全球第四大常见的癌症,每年大约有639 000人因大肠癌而死亡。近年来,我国大肠癌患者的发病率和死亡率呈现出一种显着上升的趋势,而且很多大肠癌患者在明确诊断时已经为中晚期,其治疗效果较差。寻找一种有效且可靠的治疗大肠癌的方法已成为一项现代医学亟需解决的问题。目前,有多种方法可用于治疗大肠癌,包括手术、放射治疗、化疗和生物治疗等。现阶段的医学指南认为手术和化疗为大肠癌主要而有效的治疗手段。尽管通过手术治疗可以使部分早期大肠癌患者得到根治性治疗,但是很多大肠癌患者在临床明确诊断时已经为肿瘤中晚期,手术切除肿瘤后部分患者会出现肿瘤的复发转移,因此化疗就成为大肠癌患者手术之后必要的治疗方法之一。大肠癌患者在手术治疗之后辅助以化疗,可以在很大程度上防止肿瘤复发转移;对部分中晚期大肠癌患者通过手术治疗无法将肿瘤完全切除干净时,通过化疗可以将残余肿瘤细胞杀灭或者抑制肿瘤细胞继续生长;对于有些肿瘤患者在确诊时已为晚期,且有广泛转移而无法进行手术,通过化疗可使肿瘤体积缩小,使患者的部分症状缓解,有时候甚至达到可以实施手术的可能。但是,在大肠癌患者进行化疗的过程中,除部分原发耐药者之外,还有部分肿瘤患者可能在治疗的过程中随着化疗疗程的增加,最终出现对某种化疗药物的耐药,甚至出现对多种化疗药物耐药,进而导致化疗失败,肿瘤复发转移。有研究表明由于肿瘤多药耐药的出现,大约有三分之一的大肠癌患者会出现肿瘤复发、转移。因此,多药耐药的出现是大肠癌化疗失败的主要原因之一。在大肠癌的化疗药物中,五氟尿嘧啶（5-Fluorouracil,5-Fu）作为最有效的临床药物之一,在临床治疗中有着广泛的应用,但是多药耐药的大肠癌细胞对5-Fu产生的耐药性也是大肠癌患者在临床化疗中失败的常见原因之一。因此探讨大肠癌细胞的耐药机制,寻找一种新的、有效的能够逆转大肠癌多药耐药的方法是当前在大肠癌研究中的热点问题之一。鉴于此原因,我们建立了具有良好稳定性和耐药性的五氟尿嘧啶耐药的大肠癌LOVO/5-Fu耐药细胞系,并利用LOVO/5-Fu耐药细胞株研究大肠癌耐药的分子机制,将多药耐药的大肠癌LOVO/5-Fu耐药细胞逆转为对化疗药物敏感的肿瘤细胞,同时研究其可能的逆转机制。P糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）是细胞膜上重要的转运蛋白,属于ABC转运蛋白（ATP依赖性转运蛋白）超家族成员,在引起肿瘤细胞产生多药耐药性（multidrug resistance,MDR）中起重要的作用。肿瘤细胞发生MDR的原因很多,其中的重要原因之一是P-gp增多,而P-gp是肿瘤细胞MDR1基因编码的。在人类中,MDR1 mRNA在肾上腺、胰腺、大肠、小肠等组织中是低表达状态,它参与了人体正常组织细胞的生长;在MDR表型的肿瘤细胞中,MDR1/P-gp有过量表达现象。有体外实验研究表明,MDR1基因和P-gp的表达水平越高,则MDR细胞内抗肿瘤药物的浓度越低,其耐药性越强。另有研究表明P-gp具有药物泵的功能,它可以将进入肿瘤细胞内的化疗药物主动地泵出细胞外,从而使蓄积在肿瘤细胞内的抗肿瘤药物减少,进而使肿瘤细胞发生MDR。C-jun N端激酶（c-jun N-terminal kinase,JNK）也被人们称之为应激活化蛋白激酶（stress-activated protein kinase,SAPK）,是一类丝氨酸/苏氨酸激酶,是哺乳类动物细胞中丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）家族中的重要成员之一。JNK信号通路在渗透压、氧化应激、电离辐射等多种环境应激因素以及生长因子、细胞因子（如TNF、IL21）作用下均可被激活,从而导致JNK/SAPK信号通路中的苏氨酸和丝氨酸双磷酸化而将其活化,最终导致JNK/c-jun信号通路被激活。在细胞生长、应激反应、癌基因转化、细胞分化以及细胞凋亡等多种生理和病理过程中JNK/SAPK信号通路均发挥着重要的作用。有研究发现,大肠癌的发生、发展以及耐药机制与JNK信号通路有着密切的关系。粉防已碱（Tetrandrine,Tet）又称汉防己甲素,是一种双苄基异喹啉生物碱,是从中草药粉防己根块中提取的。它具有抗炎、降低血压、阻断钙离子通道等广泛的药理作用,有研究报道称其可在体内外均表现有较好的逆转白血病细胞多药耐药的作用,其逆转耐药的机制为下调MDR1 mRNA/P-gp的表达、使抗肿瘤药物在细胞内积聚,同时使抗肿瘤药物的敏感性增加,进而导致肿瘤细胞凋亡。基于此,我们推测Tet可能会通过调节MDR1 mRNA/P-gp的表达,进而调节大肠癌在化疗过程中产生的MDR。我们在本研究中将Tet在体外作用于大肠癌LOVO/5-Fu耐药细胞株,研究Tet对大肠癌LOVO/5-Fu耐药细胞株的生长抑制及其诱导凋亡的情况,进而了解其对多药耐药的大肠癌LOVO/5-Fu细胞的逆转作用及其逆转机制。研究结果表明Tet通过抑制MDR1基因的表达,使P-gp的表达降低,进而逆转大肠癌LOVO/5-Fu对5-Fu的耐药。同时通过对JNK信号通路的研究发现,Tet可调控细胞内JNK和c-jun的磷酸化水平,进而调控细胞的耐药性。Tet可能成为逆转大肠癌多药耐药的一个重要逆转药物。方法:1.建立LOVO/5-Fu多药耐药细胞系本实验采取逐渐递增5-Fu药物浓度,并持续作用于大肠癌敏感细胞LOVO细胞株,进行体外诱导使其产生耐药性,逐步筛选出具有多药耐药性的LOVO/5-Fu细胞株。多次使用MTT法检测其多药耐药性,从而确认我们建立的LOVO/5-Fu多药耐药细胞系拥有良好的多药耐药性和稳定性。2.分析MDR mRNA和P-gp蛋白在大肠癌细胞LOVO和耐药细胞LOVO/5-Fu中的表达实时荧光定量PCR（Realtime-PCR）检测LOVO和LOVO/5-Fu细胞中多药耐药基因的MDR mRNA表达,Western blot检测LOVO和LOVO/5-Fu细胞中P-gp蛋白的表达。揭示MDR mRNA和P-gp蛋白在大肠癌LOVO和LOVO/5-Fu细胞中的表达情况。3.MTT法确定逆转剂的浓度使用不同浓度的Tet分别作用于LOVO细胞和LOVO/5-Fu细胞,MTT实验检测Tet对细胞抑制率的影响。4.耐药逆转试验使用Tet作用于LOVO/5-Fu细胞之后,MTT实验检测细胞抑制率,并进一步计算出IC50以及耐药指数。5.流式细胞术检测细胞周期分布Tet分别作用于LOVO和LOVO/5-Fu细胞后,采用流式细胞术检测各组细胞周期分布情况。6.流式细胞术检测细胞凋亡Tet分别作用于LOVO和LOVO/5-Fu细胞后,采用流式细胞术检测各组细胞凋亡率的变化情况。7.流式细胞术检测细胞P-gp的表达Tet分别作用于LOVO和LOVO/5-Fu细胞后,采用流式细胞术检测各组细胞P-gp的表达情况。8.PCR检测MDR1基因表达Tet分别作用于LOVO和LOVO/5-Fu细胞后,采用PCR检测MDR1基因表达情况。9.Western blot 检测 P-gp、JNK、p-JNK、c-jun、p-c-jun 蛋白Tet分别作用于LOVO和LOVO/5-Fu细胞后,采用Western blot检测各组细胞 P-gp、JNK、p-JNK、c-jun、p-c-jun 的表达情况。结果在本实验研究中,我们发现与对照组大肠癌细胞LOVO细胞相比,五氟尿嘧啶耐药的LOVO/5-Fu细胞中MDR mRNA表达水平明显上调,P-gp蛋白含量明显增高。进一步研究我们还发现使用Tet作用于LOVO/5-Fu细胞之后,可以增强LOVO/5-Fu细胞对五氟尿嘧啶的敏感性。使用Tet作用于LOVO和LOVO/5-Fu细胞之后,可以使LOVO/5-Fu细胞凋亡率升高,使被阻滞在G1期的细胞增多,而进入分裂期的细胞较前明显减少;LOVO/5-Fu细胞MDR1表达量和P-gp蛋白含量较未使用Tet作用之前明显降低。Tet作用于LOVO/5-Fu细胞后,p-JNK较未使用Tet的LOVO/5-Fu组细胞明显升高,其下游分子p-c-jun表达量也显着增加;加入JNK信号通路抑制剂SP600125之后,Western blot检测结果显示,Tet作用组细胞的p-JNK、p-c-jun较未加入JNK信号通路抑制剂SP600125之前表达量显着降低;各个组总JNK和c-jun表达量无明显变化。结论1、本实验方法建立的LOVO/5-Fu耐药细胞系有良好的耐药性和稳定性。2、LOVO/5-Fu组细胞中MDR mRNA表达水平和P-gp蛋白含量比LOVO组细胞中明显上调。3、Tet体外可以逆转人大肠癌多药耐药细胞株LOVO/5-Fu细胞的MDR。4、Tet可以通过对人大肠癌多药耐药细胞株LOVO/5-Fu细胞凋亡率和细胞周期的调控,改变细胞的MDR。5、Tet逆转人大肠癌多药耐药细胞株LOVO/5-Fu细胞MDR的机制可能是通过调控JNK信号通路,下调MDR mRNA和P-gp蛋白的表达来实现的。
程旭[3]（2020）在《基于肿瘤微环境设计多功能纳米前药用于逆转肿瘤多药耐药性》文中认为近些年来,化疗一直是癌症治疗的首选手段,在临床应用中可明显改善癌症患者生存状况。然而,传统的药物化疗缺乏选择性和靶向性,易被体内清除同时给患者带来严重的副作用,这些不利因素极大地限制了临床化疗疗效。随着纳米医学的发展,一些纳米药物制剂被设计用来提高化疗效应,尽管这些纳米制剂在一定程度上改善了抗癌药剂的不足,但是实际应用到临床并取得突出效果的仍然是极少的。机体的多种屏障（如血液循环、清除系统等）以及肿瘤的异质性（如细胞间质、流体压力、多药耐药等）严重阻碍了纳米药物制剂的临床转化。其中,肿瘤耐药的产生极易导致化疗失败或癌症复发。针对于此,研究人员开发了一些耐药抑制剂,并将它们整合（包载或键合）进纳米系统用来克服或者规避肿瘤药物抗性。然而,大多数的抑制剂在体内是低效的并且伴随严重的内生毒性,此外,这些纳米系统或多或少均存在一定的缺陷,包括工艺复杂、重复性差、稳定性差、过早释放或低释放、低摄取效率等。更加重要的是,恶性肿瘤涉及众多的耐药机制（如外排转运体的过表达、解毒系统、酸性隔离、缺氧、炎性环境等）,单一途径的逆转剂起到的作用往往是有限的。因此,开发多效性的耐药逆转剂或合理设计新型的多功能纳米制剂用于改善肿瘤耐药逆转、提高癌症治疗指数已成为当前研究的重中之重。在本论文中,我们针对肿瘤的异质性设计了三种多功能的纳米前药制剂用于克服癌症治疗中的药物抗性,期望通过多重协同效应或多模式作用取得更佳的癌症治疗疗效。设计思路及主要的研究内容、结果如下:（1）苯硼酸靶向及pH敏感的普兰尼克前药胶束的制备及其体内药效评价设计苯硼酸修饰的pluronic（F127-PBA）及阿霉素前体修饰的pluronic前药（P123-CAD）,两种功能化的聚合物通过薄膜水化法制备成尺寸适宜的杂化前药胶束。体外实验表明这种胶束粒子在生理条件下相当稳定,而在低pH下,酸敏感的β-羧酸酰胺断裂加速DOX释放。细胞实验证明苯硼酸能够增加前药胶束的内化、P123可以触发多种生物学效应（线粒体去极化、下调ATP、上调ROS等）从而介导耐药逆转。体内实验揭示了该前药胶束能够高效地聚集在肿瘤部位,同时主动靶向能够介导更多的粒子进入肿瘤细胞;抗肿瘤评估证实前药胶束在体内呈现最高的肿瘤生长抑制效率;病理学分析则进一步表明前药粒子没有造成明显的机体损伤或体重下调,提示其良好的生物安全性。作为一个结果,这种纳米前药系统或许能比已经进入临床III期的SP1049C具有更好的抗肿瘤性能,有望进一步用于临床转化。（2）自产氧的纳米酶前药粒子用于克服缺氧介导的化疗-光动力治疗抗性通过酰胺缩合反应将乳糖酸和阿霉素前体修饰到过氧化氢酶上,得到两亲性的生物大分子,在水溶液中与光敏剂Ce6共自组装成多功能纳米粒子。体外评估表明这种纳米系统呈现酸触发的药物释放行为,同时亲水外层能有效避免CAT降解,维持较高的酶催化活性。细胞实验表明乳糖酸可以通过受体介导的胞吞提高细胞内化前药粒子,进入细胞的纳米酶能原位分解H2O2产氧,导致HIF-1α降解及P-gp下调,最终克服化疗耐药性。此外,氧气再生进一步促进ROS生成,极大地提高光动力介导的细胞杀伤效应。体内评估证明了这种纳米酶粒子能够有效的缓解瘤内乏氧,进而同时增敏化疗-光动力治疗,导致最高的抗肿瘤效率（>90%）甚至消融部分肿瘤。这些结果表明了通过氧气增敏的联合化疗-光动力治疗策略在对抗恶性肿瘤上是有效的,值得进一步优化或评估。（3）自组装三元杂化纳米前药粒子用于克服肿瘤耐药抗性及侵袭设计二硫键连接的阿霉素二聚体、塞来昔布二聚体以及两亲性修饰PEI,三者共组装成杂化的多功能纳米前药粒子。在pH 6.8条件下,粒子表面电荷呈现明显的相转变（由负到正）,同时展现出明显的质子缓冲能力。在DTT作用下,二硫键断裂,进而导致粒子逐渐崩解,两种药物快速释放。细胞实验证明粒子的电荷翻转效应能促进细胞摄取,PEI可以破除酸性隔离,而塞来昔布则能下调P-gp表达,这些效应增加了阿霉素的胞内滞留和药理活性。此外,该纳米系统还能显着地抑制肿瘤细胞迁移、侵袭,同时阻滞细胞周期于G0/G1期,诱导更多的细胞凋亡。体内测试证明这种纳米前药靶向性强,能有效富集在肿瘤部位,进而提高药物生物利用度同时降低系统毒性。皮下抑瘤实验表明这种多效应前药能显着地抑制实体瘤生长（85%）,同时对根除肝、肺转移瘤也表现出突出的治疗效果。由此可知,针对癌症炎性环境的调控可以明显改善化疗疗效,这种多元杂化的设计或可用于临床上恶性肿瘤的协同治疗。
张帆[4]（2019）在《Notch-1通路与As2O3逆转肝癌HepG2/ADM细胞耐药性相关的实验研究》文中研究表明目的:研究As2O3（IC50）剂量联合Notch-1通路阻断剂（γ-分泌酶抑制剂MW167）对人肝癌HepG2细胞以及HepG2/ADM耐药细胞生物特性、耐药性及血管生成拟态（VM）形成能力的影响,探讨其影响作用与Notch-1信号通路的关系,进一步分析探讨As2O3逆转肿瘤多药耐药的机制,为丰富逆转肿瘤多药耐药（MDR）方案提供实验数据。方法:1.实验以人肝癌HepG2细胞、HepG2/ADM耐药细胞为研究对象,分四组（空白组、As2O3组、MW167组、MW167+As2O3联合组）,MTT法检测不同方案下细胞增殖抑制率;Transwell小室法测定不同方案下两组细胞侵袭能力,划痕愈合实验测定不同方案下两组细胞迁移能力。2.体外培养HepG2细胞、HepG2/ADM耐药细胞构建VM,采用PAS染色法鉴定VM。用单独和联合治疗方案应用于由肝癌HepG2细胞、HepG2/ADM耐药细胞构建的VM,并记录VM的数量、长度、面积,培养肝癌HepG2细胞、HepG2/ADM耐药细胞,接种凝胶12h后使用不同药物处理组干预。在接种药物48h后,于倒置显微镜观察,记录VM的数量,长度和面积的变化的发展。3.Western-blot检测各组Vimentin、E-cadherin、MMP-2、Mcl-1、MDR-1、Cyclin D1、Notch-1、Hes-1、NICD等相关蛋白的表达。4.统计软件SPSS19.0分析数据。结果:1.MTT法检测细胞的增殖抑制率,各治疗组均高于对照组,（p﹤0.05）;Transwell小室测得细胞侵袭能力:联合组<As2O3组<γ-分泌酶抑制剂MW167组<对照组（p﹤0.05）;细胞迁移能力:联合组<As2O3组<γ-分泌酶抑制剂MW167组<对照组（p﹤0.05）。2.人肝癌HepG2及HepG2/ADM细胞构建VM在不同治疗方案作用下,VM三维培养结果显示,分别观察在药物作用48H后高倍镜下观察HepG2及HepG2/ADM细胞VM的数量,长度,以及面积呈现联合组<As2O3组<γ-分泌酶抑制剂MW167组<对照组（p﹤0.05）。3.western-blot结果显示各治疗组于空白组对比Notch-1、Hes-1、NICD、蛋白表达含量降低;肿瘤耐药相关蛋白MDR-1、Mcl-1表达降低（p﹤0.05）,凋亡相关蛋白Cyclin D1的表达降低（p﹤0.05）。（VM）血管拟态以及（EMT）上皮-间质化,相关蛋白E-cadherin表达升高、MMP-2、Vimentin表达降低（p﹤0.05）。其中联合组蛋白表达于对照组相比（p﹤0.01）。结论:1.As2O3（IC50）联合MW167逆转肝癌HepG2/ADM细胞耐药性与降低细胞体外EMT发生、降低细胞迁移与侵袭能力、抑制体外三维构建VM的发生发展,密切相关。2.As2O3（IC50）与Notch-1通路抑制剂-MW167逆转肝癌HepG2/ADM细胞耐药机制可能存在共同靶点或共同通路作用。
张颖[5]（2019）在《补中益气汤干预肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞EMT改善顺铂耐药的研究》文中研究指明目的:本实验应用TGF-β1基因过表达慢病毒载体转染A549/DDP细胞,诱导A549/DDP细胞发生上皮间质转化后种植于裸鼠体内,以肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞为研究对象,明确肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞上皮间质转化与耐药相关蛋白的相关性,并应用补中益气汤加以干预,观察补中益气汤对肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞移植瘤的影响,应用分子生物学技术检测补中益气汤对肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞耐药相关蛋白LRP、MRP、P-gp和上皮间质转化分子标志物E-cad、α-CA、Vim、N-cad的干预效果及对PI3K/AKT信号通路的调节作用,以深入探讨补中益气汤通过干预上皮间质转化改善非小细胞肺癌顺铂耐药的作用机理,为临床应用培土生金法改善非小细胞肺癌耐药的理论治则提供实验依据。方法:1.肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞EMT与耐药相关蛋白的相关性研究将构建成功的TGF-β1空载慢病毒和TGF-β1过表达慢病毒分别转染A549/DDP细胞,感染成功的细胞进行接种。取BALB/C裸鼠18只,随机分为空白组、空载组、过表达,空白组接种A549/DDP细胞,空载组接种TGF-β1空载A549/DDP细胞,过表达组接种TGF-β1过表达A549/DDP细胞。细胞接种8d后,腹腔注射顺铂,0.0035 g·kg-1,2次/周。细胞接种32d后,处死裸鼠,取肿瘤组织。显微镜观察肿瘤组织形态,免疫组化、Western blot、Real-time PCR检测肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞EMT分子标志物E-cad、N-cad及肿瘤耐药相关蛋白LRP、MRP、P-gp蛋白和m RNA表达情况,免疫荧光双染检测E-cad、N-cad与LRP、MRP、P-gp的共定位情况,并进行相关性分析。2.补中益气汤干预肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞EMT改善顺铂耐药的研究取BALB/C裸鼠36只,随机分为空载组（NG组）,模型组（MG组）,顺铂组（DDP组）,补中益气汤低（BD组）、中（BZ组）、高（BG组）剂量组。空载组接种TGF-β1空载A549/DDP细胞,其余组接种TGF-β1过表达A549/DDP细胞。细胞接种8d后,进行药物干预。空载组和模型组腹腔注射生理盐水,0.0035 g·kg-1,2次/周,灌胃生理盐水,1m L/次,2次/d;顺铂组腹腔注射顺铂,0.0035 g·kg-1,2次/周,灌胃生理盐水,1m L/次,2次/d;补中益气汤组腹腔注射顺铂,0.0035 g·kg-1,2次/周,分别灌胃低(1.46g·kg-1生药)、中(2.92 g·kg-1生药)、高(5.84 g·kg-1生药)剂量补中益气汤,1 m L/次,2次/d。细胞接种32d后,处死裸鼠,取肿瘤组织。称量裸鼠瘤重,计算抑瘤率;镜下观察肿瘤组织形态学改变;免疫组化、Western blot、Real-time PCR检测肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞耐药相关蛋白LRP、MRP、P-gp及EMT分子标志物E-cad、α-CA、Vim、N-cad蛋白和m RNA表达情况,免疫荧光双染检测补中益气汤对E-cad、N-cad及LRP、MRP、P-gp共定位的影响,明确补中益气汤是否通过干预肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞EMT而改善顺铂耐药,并筛选出裸鼠体内最佳药物浓度。3.补中益气汤对肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞PI3K/AKT信号通路的影响取BALB/C裸鼠36只,随机分为空载组（NG组）,模型组（MG组）,顺铂组（DDP组）,最佳药物浓度+顺铂组（BCD组）,顺铂+LY294002组（DLY组）,最佳药物浓度+顺铂+LY294002组（BCDLY组）。空载组接种TGF-β1空载A549/DDP细胞,其余组接种TGF-β1过表达A549/DDP细胞。细胞接种8d后,进行药物干预。空载组和模型组腹腔注射生理盐水,0.0035 g·kg-1,2次/周,灌胃生理盐水,1mL/次,2次/d;顺铂组腹腔注射顺铂,0.0035 g·kg-1,2次/周,灌胃生理盐水,1 mL/次,2次/d;最佳药物浓度+顺铂组腹腔注射顺铂,0.0035 g·kg-1,2次/周,灌胃最佳浓度补中益气汤,1m L/次,2次/d;顺铂+LY294002组腹腔注射顺铂,0.0035 g·kg-1,2次/周,腹腔注射LY294002,0.025 g·kg-1,2次/周,灌胃生理盐水,1 m L/次,2次/d;最佳药物浓度+顺铂+LY294002组腹腔注射顺铂,0.0035 g·kg-1,2次/周,腹腔注射LY294002,0.025 g·kg-1,2次/周,灌胃最佳浓度补中益气汤,1m L/次,2次/d。细胞接种32d后,处死裸鼠,取肿瘤组织。免疫组化、Western blot检测肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞PI3K、AKT蛋白表达情况,免疫组化、Real-time PCR检测E-cad、N-cad蛋白和m RNA表达情况。结果:1.TGF-β1诱导的肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞EMT与耐药相关蛋白正相关HE染色结果显示,空白组、空载组细胞形态多见圆形或椭圆形,细胞核圆而均匀,细胞连接紧密,细胞间距较小;过表达组细胞可见纺锤形或长梭形改变,细胞核圆形或椭圆形,大小不一,细胞连接稀疏松散,细胞间距显着增宽。免疫组化结果显示,与空白组、空载组比较,过表达组上皮分子E-cad阳性产物表达较少,间质标记蛋白N-cad阳性产物表达较多,耐药相关蛋白LRP、MRP、P-gp蛋白阳性产物表达均显着增多。Western blot和Real-time PCR结果显示,与空白组、空载组比较,过表达组上皮分子Ecad在蛋白和基因水平上表达显着下调,间质标记蛋白N-cad和耐药相关蛋白LRP、MRP、P-gp在蛋白和基因表达均显着上调,差异具有统计学意义（P<0.05）。免疫荧光双染结果显示:与空白组、空载组比较,过表达组E-cad荧光表达明显减弱,而耐药相关蛋白LRP、MRP、P-gp荧光表达明显增强,各组共定位区均较少,E-cad与LRP、MRP、P-gp呈负相关（P<0.05）;与空白组、空载组比较,过表达组N-cad荧光表达明显增强,耐药相关蛋白LRP、MRP、P-gp荧光表达明显增强,过表达组共定位区明显增多,N-cad与LRP、MRP、P-gp呈正相关（P<0.05）。2.补中益气汤对裸鼠瘤重的影响与空载组比较,模型组瘤重明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较,顺铂组瘤重略微下降,但差异不具有统计学意义（P>0.05）;与模型组、顺铂组比较,补中益气汤各干预组瘤重均有不同程度下降,差异有统计学意义（P<0.05）,高剂量组下降最明显。随着补中益气汤浓度的增加,瘤重逐渐减小,抑瘤率逐渐上升。3.补中益气汤对肿瘤组织形态学的影响空载组细胞形态多见圆形或椭圆形,细胞核圆而均匀,细胞连接紧密,细胞间距较小。模型组细胞可见纺锤形或长梭形改变,细胞核圆形或椭圆形,大小不一,细胞连接稀疏松散,细胞间距显着增宽。补中益气汤干预组肿瘤细胞形态渐变为圆形或椭圆形,细胞间隙逐渐减小,细胞排列逐渐恢复紧密,高剂量组效果最明显。4.补中益气汤对肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞耐药相关蛋白的影响免疫组化结果显示,LRP、MRP、P-gp蛋白的阳性着色为深染的棕黄色颗粒,在各组均有表达。与空载组比较,模型组LRP、MRP、P-gp蛋白阳性产物表达明显增多。补中益气汤干预后,各组LRP、MRP、P-gp蛋白阳性产物表达均有不同程度下调,且补中益气汤浓度越高,效果越显着,具有一定的剂量依赖性。Western blot和Real-time PCR结果显示,与空载组比较,模型组LRP、MRP、P-gp在蛋白和基因水平上表达均明显上调（P<0.05）;与模型组、顺铂组比较,补中益气汤各干预组LRP、MRP、P-gp蛋白和m RNA表达均有不同程度下降,中、高剂量组具有统计学意义（P<0.05）。5.补中益气汤对肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞EMT的影响免疫组化结果显示,E-cad、α-CA、Vim、N-cad蛋白阳性着色为深染的棕黄色颗粒,各组均有表达。与空载组比较,模型组上皮分子E-cad、α-CA蛋白表达明显减少,间质标记蛋白Vim、N-cad蛋白表达明显增多;与模型组、顺铂组比较,补中益气汤干预组上皮分子E-cad、α-CA蛋白表达逐渐增多,间质标记蛋白Vim、N-cad蛋白表达逐渐减少。Western blot和Real-time PCR结果显示,与空载组比较,模型组上皮分子E-cad、α-CA蛋白和m RNA表达显着减少,间质标记蛋白Vim、N-cad蛋白和m RNA表达显着增多（P<0.05）;与模型组、顺铂组比较,补中益气汤中、高剂量组上皮分子E-cad、α-CA蛋白和m RNA表达增多,间质标记蛋白Vim、N-cad蛋白和m RNA表达减少（P<0.05）,高剂量组效果最为显着。免疫荧光双染结果显示,与空载组比较,模型组E-cad荧光表达明显减弱,N-cad荧光表达明显增强,耐药相关蛋白LRP、MRP、P-gp荧光表达明显增强。补中益气汤干预后,E-cad荧光表达逐渐增强,N-cad荧光表达逐渐减弱,耐药相关蛋白LRP、MRP、P-gp荧光表达逐渐减弱,E-cad与LRP、MRP、P-gp呈负相关（P<0.05）,N-cad与LRP、MRP、P-gp呈正相关（P<0.05）。6.补中益气汤对肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞PI3K/AKT信号通路的影响免疫组化和Western blot结果显示,与空载组比较,模型组p-PI3K、p-AKT蛋白阳性表达明显增多（P<0.05）;与模型组、顺铂组比较,最佳药物浓度+顺铂组、顺铂+LY294002组、最佳药物浓度+顺铂+LY294002组p-PI3K、p-AKT蛋白阳性表达逐渐减少（P<0.05）;与顺铂+LY294002组比较,最佳药物浓度+顺铂+LY294002组p-PI3K、p-AKT蛋白表达减少,差异有统计学意义（P<0.05）。免疫组化和Real-time PCR结果显示,与空载组比较,模型组上皮分子E-cad蛋白和m RNA表达明显减少,间质标记蛋白N-cad蛋白和m RNA表达明显增多;与模型组、顺铂组比较,最佳药物浓度+顺铂组、顺铂+LY294002组、最佳药物浓度+顺铂+LY294002组上皮分子E-cad蛋白和m RNA表达逐渐增多,间质标记蛋白N-cad蛋白和m RNA表达逐渐减少;与最佳药物浓度+顺铂组比较,最佳药物浓度+顺铂+LY294002组上皮分子E-cad蛋白和m RNA表达增多,而间质标记蛋白N-cad蛋白和m RNA表达减少。结论:1.肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞EMT与耐药相关蛋白表达呈正相关,EMT程度越高,肿瘤耐药相关蛋白表达越高,提示肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞EMT是顺铂耐药的重要机制之一。2.补中益气汤有限制肺腺癌移植瘤生长,改善肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞顺铂耐药,抑制肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞EMT的作用;该作用有一定的量效关系,高浓度(5.84 g·kg-1生药)为裸鼠体内最佳用药浓度。3.补中益气汤能够改善肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞顺铂耐药,其机制可能是通过抑制PI3K/AKT信号通路,上调上皮分子表达,下调间质标记蛋白表达,抑制肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞EMT,从而抑制EMT介导的耐药过程实现的。
范艳玲[6]（2019）在《Rack1调控P-glycoprotein活性促进乳腺癌细胞耐药的分子机制研究》文中认为目的:乳腺癌是危害全球女性健康的第一杀手,化疗在乳腺癌的治疗过程中占有重要地位。但是,多药耐药（Multi Drug Resistance,MDR）的出现导致化疗的失败,极大地限制了局部晚期和转移性乳腺癌的治疗效果。药物转运蛋白P-糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）能够将细胞内的化疗药物排出细胞外,其过量表达是MDR产生的主要原因之一。尽管在MDR细胞中关于P-gp的表达调控已被深入研究,但是目前对P-gp活性调控的研究还很少。Rack1（Receptor for Activated C Kinase 1）是细胞内的一种支架蛋白,介导不同蛋白质之间的相互作用,在肿瘤细胞抵抗化疗药物的过程中发挥重要作用。前期研究发现Rack1是P-gp的一个结合蛋白质,但是Rack1是否调控P-gp的转运活性,目前尚未可知。本研究中,我们利用多药耐药的乳腺癌细胞系,通过一系列体外细胞学实验,结合构建体内耐药移植瘤模型,明确耐药细胞中Rack1对P-gp转运泵活性的调控作用,并进一步探究Rack1调控P-gp活性的分子机制,为改善临床晚期耐药乳腺癌的治疗以及寻找新的治疗靶点提供线索。方法:1.采用特异性的小干扰RNA下调耐药细胞系中Rack1的表达,Western Blotting检测Rack1的敲减效果以及P-gp蛋白水平的变化。2.通过CCK-8的方法,分析MDR乳腺癌细胞系中降表达Rack1后对化疗药物表柔比星的敏感性变化,并通过软件计算相应的IC50值。3.将P-gp的荧光底物罗丹明123（Rhodamine,Rh123）加入细胞,孵育一段时间后,采用流式细胞技术检测下调Rack1前后细胞内Rh123的强度变化,分析P-gp转运活性的变化。4.利用化疗药物表柔比星的荧光特性,将其加入细胞孵育一段时间后,采用荧光显微镜观察细胞内表柔比星的荧光强度,分析敲减Rack1前后MDR乳腺癌细胞内表柔比星的蓄积情况。5.采用小干扰RNA技术,下调MDR乳腺癌细胞中Src的表达,免疫印迹法分析细胞内Src和P-gp的蛋白水平变化。6.在敲减Src表达后的MDR乳腺癌细胞系中,分别采用CCK-8的方法检测细胞对表柔比星的敏感性,采用流式细胞分析技术检测P-gp的转运活性,采用免疫荧光的方法分析细胞内表柔比星的蓄积情况。7.采用Src激酶家族特异性的抑制剂Saracatinib和Dasatinib,抑制Src的激酶活性,Western Blotting分析total-Src、phosphor-Src以及P-gp的蛋白水平变化。8.在MDR乳腺癌细胞系中抑制Src激酶活性后,分别采用CCK-8的方法分析细胞对化疗药物敏感性的变化,采用流式细胞技术分析细胞内Rh123的荧光强度及P-gp转运活性的变化,采用免疫荧光技术分析化疗药物在细胞内的蓄积情况。9.采用小干扰技术敲减细胞内Rack1的表达,免疫共沉淀分析P-gp/Src/Cav1（Caveolin-1）之间的相互作用;敲减细胞内Src的表达,免疫共沉淀分析P-gp/Rack1/Cav1之间的相互作用。10.构建表达针对Rack1非编码区序列的shRNA的慢病毒,构建稳定敲减Rack1的MDR乳腺癌细胞系。构建携带Flag标签的野生型Rack1WT和失去Src结合能力的Rack1Y246F突变体（将第246位的Y突变为F）表达质粒;在敲减Rack1的细胞中重新表达Rack1WT和Rack1Y246F,免疫共沉淀分析P-gp/Src/Cav1之间的相互作用。11.Western Blotting分析敲减Rack1和Src的表达或者抑制Src的激酶活性后对phosphor-Src和phosphor-Cav1的表达变化情况。12.在稳定敲减Rack1的细胞中,分别采用Rack1WT和Rack1Y246F进行拯救,然后采用免疫印迹分析Rack1、total-Cav1、phosphor-Cav1的表达变化情况。13.构建野生型的Cav1(Cav1WT)和模拟磷酸化持续激活的Cav1Y14E突变体表达质粒,在敲减Cav1的细胞中重新表达Cav1WT和Cav1Y14E,免疫共沉淀分析其与P-gp的结合能力;两种拯救的细胞中,分别加入Src激酶抑制剂,利用流式细胞技术分析P-gp的转运活性。14.在重新表达Rack1WT和Rack1Y246F后,采用CCK-8的方法检测细胞对表柔比星敏感性的变化,采用流式细胞分析技术检测细胞内荧光强度的变化,分析P-gp转运活性的变化。15.将Rack1敲减组及其对照组细胞,Rack1WT-和Rack1Y246F-拯救组及其对照组细胞,接种至裸鼠皮下构建移植瘤,然后采用表柔比星治疗,分析不同组之间的肿瘤体积差异。结果:1.敲减MDR乳腺癌细胞系中Rack1的表达后,P-gp的蛋白水平没有显着变化。2.下调MDR乳腺癌细胞中Rack1的表达后,细胞对表柔比星的敏感性增加,IC50值降低。3.敲减耐药细胞中Rack1的表达后,Rh123荧光分子阳性细胞的比例增加,说明P-gp的外排能力减弱。4.敲减耐药细胞中Rack1的表达后,免疫荧光发现表柔比星在细胞中的蓄积量增加。5.在MDR乳腺癌细胞系中下调Src的表达,P-gp的蛋白表达水平不受影响。6.敲减耐药细胞Src的表达后,细胞对表柔比星的敏感性增加,IC50值降低;流式细胞技术检测Rh123荧光分子阳性细胞的比例增加,P-gp将Rh123转运到细胞外的能力下降;免疫荧光显示,表柔比星在细胞内的荧光强度增加。7.Saracatinib和Dasatinib两种抑制剂均能以剂量-依赖性地抑制Src的激酶活性,但不影响Src的表达,也不影响P-gp的表达水平。8.抑制Src的激酶活性后,耐药细胞对表柔比星的敏感性增加,IC50值下降;Rh123荧光分子在细胞内的蓄积量增加;免疫荧光发现细胞内表柔比星的荧光强度增加,表明P-gp的转运活性下降。9.下调乳腺癌耐药细胞中Rack1的表达后,P-gp和Src的蛋白水平没有显着变化,但二者的结合能力下降,同时,P-gp与Cav1的相互作用增加;下调Src的表达后,P-gp与Rack1的相互作用不受影响,P-gp与Cav1的结合能力增加。10.成功建立了Rack1稳定敲减的细胞系;在该细胞中外源性导入Rack1WT和Rack1Y246F突变体后,使得Rack1的表达水平恢复至接近内源性Rack1的水平;在Rack1敲减的细胞中,重新表达Rack1WT,恢复了P-gp和Src之间的相互作用,并抑制了P-gp与Cav1的结合;而重新表达Rack1Y246F突变体,不能够拯救P-gp和Src之间的相互作用,而且P-gp与Cav1之间仍有较强的相互作用。11.敲减耐药细胞中Rack1和Src的表达,或者抑制Src的激酶活性,均能抑制Cav1的磷酸化,对Cav1的本底表达水平没有影响。12.在稳定敲减Rack1表达的耐药细胞中,Cav1的磷酸化受到抑制,重新表达Rack1WT,可恢复细胞中Cav1的磷酸化,而Rack1Y246F突变体拯救组细胞,Cav1的磷酸化仍然受到抑制。13.有效地敲减耐药细胞中内源性Cav1的表达,外源性的Cav1WT和Cav1Y14E突变体在该细胞中的表达水平接近内源性水平;相比于Cav1WT,Cav1Y14E突变体与P-gp的结合能力减弱;流式细胞结果分析敲减Cav1的表达,增强了P-gp的转运能力;与Cav1WT相比,重新表达Cav1Y14E突变体可促进Rh123的外排,P-gp的转运能力增加;此外,Cav1WT拯救组细胞中使用Src抑制剂后会显着抑制P-gp的转运活性,而突变体拯救组细胞中使用Src抑制剂后对P-gp转运活性的抑制效果不明显。14.与Rack1Y246F相比,Rack1WT拯救的细胞能够恢复对表柔比星的抵抗,IC50值增加,P-gp转运Rh123的能力增加,Rh123阳性细胞所占比例增加。15.在体内裸鼠耐药细胞移植瘤模型中,稳定敲减Rack1组和Rack1Y246F拯救组小鼠接受表柔比星处理后,肿瘤体积明显缩小;而Rack1WT拯救组小鼠肿瘤对表柔比星的治疗产生抵抗。结论:本次研究证明,乳腺癌耐药细胞中Rack1和Src的表达正调控P-gp转运活性,促进肿瘤细胞对化疗药物抵抗。Rack1作为支架蛋白,介导了Src和P-gp之间的相互作用。在此相互作用复合体中Src磷酸化Cav1,后者由非磷酸化状态到磷酸化状态的转变,导致其与P-gp的相互作用下降,P-gp的转运活性从抑制状态变为激活状态。敲减Rack1或者破坏Rack1/Src/P-gp之间的相互作用可抑制P-gp的转运泵活性,P-gp将化疗药物泵出细胞外的能力下降,细胞内药物蓄积增加,对药物的敏感性增加,耐药能力减弱。综上所述,Rack1可作为新的潜在的治疗靶点用于开发抗肿瘤药物,逆转肿瘤细胞多药耐药。
姜秀星[7]（2019）在《千金藤素协同多柔比星逆转多药耐药和诱导K562/ADR细胞凋亡的分子机制研究》文中提出研究背景多药耐药（Multidrug resistance,MDR）是临床化疗的主要障碍。近年来,已经研究了一些逆转MDR的化疗策略。然而,由于肿瘤耐药性的产生,导致白血病患者的生存率较低,复发率较高。因此,确定新的治疗白血病的方法和手段仍然是一项挑战。自噬抑制被广泛认为是治疗包括白血病在内的癌症的一种很有前途的治疗策略,但目前仍缺乏有效和特异的自噬抑制剂阻碍了自噬抑制剂的应用。因此,开发新的低毒高效自噬抑制剂具有重要的临床意义。千金藤素（Cepharanthine,CEP）是从中药千金藤根提取的异喹啉生物碱,目前已经用于临床,主要用于升白细胞,并且毒副作用小。在本课题研究中,我们发现CEP能有效地阻断K562/ADR细胞自噬的降解,并能协同多柔比星（Doxorubicin,DOX）抑制K562/ADR细胞增殖和诱导细胞凋亡,进而逆转多药耐药。本论文对CEP协同DOX逆转K562/ADR耐药的分子机制进行深入研究。通过本论文研究,CEP有可能成为一种新型的自噬抑制剂,CEP与DOX等经典化疗药物的协同作用可以作为逆转人类白血病耐药的一种新的治疗策略。研究目的阐明CEP协同DOX逆转K562/ADR细胞耐药的分子机制机制,同时也为CEP联合DOX用于白血病的治疗提供理论依据。研究方法流式细胞仪检测细胞凋亡和ROS;Western Blot（免疫印迹法）检测蛋白表达水平;MTT实验（噻唑蓝法）检测细胞活性。研究内容和结果1.K562/ADR耐药细胞株的鉴定梯度浓度多柔比星均会降低K562与K562/ADR两种细胞存活率,但是多柔比星对K562/ADR细胞IC50更高。相同浓度多柔比星可诱导K562细胞大量凋亡而对K562/ADR细胞无明显影响。多药耐药标志蛋白Mdr-1在K562/ADR细胞中高表达而在K562细胞中无表达。通过以上实验证实所鉴定K562/ADR细胞株为耐药细胞株且耐药性很强。2.千金藤素联合多柔比星促进K562/ADR细胞Drp1去磷酸化和线粒体转位、线粒体分裂和细胞凋亡千金藤素联合多柔比星可以明显降低K562/ADR细胞存活率和增加细胞凋亡,且两药联合作用效果为协同作用。Western Blot结果显示,千金藤素联合多柔比星处理K562/ADR细胞可引起PARP-1的裂解、Caspase 3的激活以及cytochrome c从线粒体释放到细胞质。透射电镜观察发现,千金藤素联合多柔比星组的线粒体发生断裂且有大量自噬体聚集。分子机制研究结果显示,千金藤素联合多柔比星处理K562/ADR细胞可引起线粒体分裂关键蛋白Drp1（Ser637）去磷酸化及Drp1线粒体转位增加。同时我们发现全细胞以及线粒体上自噬标志蛋白LC3也明显增加,提示Drp1线粒体转位可能与自噬体堆积有关。3.千金藤素联合多柔比星导致自噬体过度堆积在其诱导K562/ADR细胞凋亡中发挥重要作用千金藤素联合多柔比星处理K562/ADR细胞可引起全细胞以及线粒体上自噬标志蛋白LC3的表达明显增加。预处理自噬抑制剂3-MA或采用shRNA敲降ATG7可明显阻断千金藤素联合多柔比星所引起的自噬体聚集和细胞凋亡。上述结果表明,过度的自噬体聚集在千金藤素联合多柔比星诱导K562/ADR细胞凋亡中发挥重要作用。4.千金藤素联合多柔比星促进ROS生成流式结果显示,千金藤素联合多柔比星可引起ROS的生成显着增加。预处理超氧阴离子(O2·-)清除剂TBAP可抑制ROS的生成,并可阻断千金藤素联合多柔比星引起的Drp1的去磷酸化和线粒体转位、线粒体分裂和细胞凋亡。结果提示,ROS的生成特别是超氧阴离子(O2·-)在千金藤素联合多柔比星诱导Drp1的去磷酸化和线粒体转位、线粒体分裂和细胞凋亡中发挥重要作用。结论千金藤素协同多柔比星导致自噬体过度堆积,促进ROS生成,诱导Drp1的去磷酸化和线粒体转位、线粒体分裂和细胞凋亡,最终逆转K562/ADR细胞耐药。
陈丹妮[8]（2019）在《MicroRNA-27b在乳腺癌生长与耐药中的作用机制及临床意义》文中指出化疗是乳腺癌全身治疗的基石,但化疗耐药的产生严重制约了治疗效果。化疗耐药的分子机制复杂,尚未完全阐明,其逆转剂的开发更是进展缓慢。已有研究表明,microRNAs（miRNA）可在转录后水平调节下游靶基因的表达,在乳腺癌化疗耐药中发挥着重要调控作用。肿瘤基因图谱（TCGA）是目前最大的癌症基因信息数据库,我们利用TCGA数据库,比对了大量乳腺癌组织与正常乳腺组织的miRNA表达谱。另外针对接受紫杉醇类药物治疗的患者,根据其化疗效果分出耐药组和敏感组,比对两组患者的乳癌组织中miRNA表达谱。从上述两部分比对结果中筛选出差异显着的miRNA,建立文库。髓样乳腺癌是三阴性乳腺癌中的一种特殊组织类型,以化疗为主要治疗手段。目前对髓样乳腺癌化疗耐药的研究甚少。我们以髓样乳腺癌多药耐药细胞Bads-200对紫杉醇的耐药性变化为主要研究目标,通过高通量实验从miRNA文库中筛选出可有效调控细胞耐药性的miRNA分子:miR-27b-3p。临床样本检测结果显示miR-27b在乳癌组织中显着下调,尤其是在紫杉醇耐药的乳癌组织中。统计分析发现,miR-27b在乳癌组织中低表达与疾病进展、不良预后密切相关。另外,miR-27b表达量与细胞对紫杉醇的耐药性呈显着负相关。体外实验表明,miR-27b可显着抑制髓样乳腺癌细胞的增殖及对紫杉醇等多种化疗药物的耐药性,这种抑制作用在其他乳腺癌细胞中同样有效。体内实验表明,miR-27b可显着增强紫杉醇对耐药细胞生长的抑制作用,降低肿瘤对紫杉醇的抵抗性。我们利用生物信息学技术预测了 miR-27b下游靶基因,并通过KEGG和GO分析筛选出与肿瘤发生、药物反应等重要信号通路相关的靶基因。经过双荧光素酶报告基因实验验证CBLB、GRB2是miR-27b的直接靶标。进一步的实验证实miR-27b可通过抑制CBLB、GRB2的表达,一方面下调Akt、Erk通路中重要蛋白的表达,抑制细胞增殖;另一方面抑制抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl的表达,促进细胞凋亡;这两方面的共同作用降低髓样乳腺癌细胞对紫杉醇的耐药性。综上所述,本课题筛得的乳腺癌耐药相关miR-27b可作为判断乳腺癌患者预后及疾病进展的风险预测因子;可通过下调CBLB、GRB2的表达,显着抑制乳腺癌的生长及耐药。这些研究结果将有助于加深我们对乳腺癌化疗耐药机制的理解,可为乳腺癌治疗提供潜在靶点,为化疗耐药逆转剂的开发提供新思路。
马乾章[9]（2018）在《小白菊内酯及大黄素抑制肠腺癌细胞增殖作用机制的实验研究》文中认为目的:近年来,新兴的化学生物学学科发展非常迅猛。该学科利用现有的数量庞大而且化学结构多样的小分子化合物库,针对研究者所需要的化合物的生物活性进行筛选,并以此为依据进行相关的作用机制研究。本研究所选药物为小白菊内酯和大黄素,二者是从天然植物中提取的小分子化合物。其生物活性均具有明显的抗癌作用,尤其是肠腺癌,近年来的研究逐渐增多。因此,延续我们前期对小白菊内酯和大黄素抗肠腺癌生物活性的研究,本课题采用体外实验的方式,对小白菊内酯诱导HCT-8/VCR细胞凋亡和耐药逆转作用机制靶点,以及大黄素诱导CACO-2细胞凋亡和调控PI3K/AKT信号通路的作用机制靶点进行了相关研究。通过对小白菊内酯和大黄素抗癌活性及作用机制的研究,为天然植物药物来源的小分子化合物抗癌作用提供基础,为天然植物药物用于临床肿瘤的治疗开拓市场。后续,我们将针对前期的研究成果,对两种小分子化合物的生物活性与其结构的相关性进行分析,对于不理想的结构进行修饰,为新的抗癌小分子药物的研发做出贡献。研究方法:一、小白菊内酯诱导HCT-8/VCR细胞凋亡和耐药逆转作用研究1、MTT法检测PTL对HCT-8、HCT-8/VCR细胞的增殖抑制作用培养结肠癌细胞株HCT-8、HCT-8/VCR细胞株,加入96孔板,实验组加入不同浓度的PTL,对照组则加等量不含药物的培养液,处理12、24、48小时后,MTT法检测各孔吸光度（OD）值,计算细胞增殖抑制率。2、流式细胞仪（Annexin V-FITC/PI染色）检测PTL对HCT-8、HCT-8/VCR细胞凋亡的影响。消化收集对照组、PTL5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L处理24h的HCT-8、HCT-8/VCR细胞,AnnexinV/FITC染色后,流式细胞仪检测,分析细胞凋亡百分比。3、吖啶橙（AO）/溴化乙锭（EB）荧光染色检测PTL对HCT-8、HCT-8/VCR细胞凋亡的影响。取对数生长期HCT-8、HCT-8/VCR细胞,每孔1×104个/ml、2ml接种于6孔板中,孔内放入盖玻片。设小白菊内酯浓度5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、及对照组共4组,每组3个复孔,每组给药24h后,取出盖玻片,固定、AO/EB染色、、封片,荧光显微镜观察,每组分别计数,每次计数细胞300个,计算凋亡率。4、Western-blot法检测PTL对HCT-8、HCT-8/VCR细胞Bax、Bcl-2、蛋白表达的影响。收集对照组、PTL5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L处理24h的HCT-8、HCT-8/VCR细胞蛋白,用western blot方法检测Bax、Bcl-2蛋白的表达。5、MTT法检测PTL对HCT-8/VCR的耐药逆转作用（1）取对数生长期HCT-8、HCT-8/VCR细胞,加入96孔板,分别加入不同浓度的VCR,处理24小时后,MTT法检测HCT-8、HCT-8/VCR细胞VCR的半数抑制浓度,及HCT-8/VCR对VCR的耐药指数。（2）取对数生长期HCT-8/VCR细胞,加入96孔板,分别设对照组、PTL5μmol/L、VCR（0.25、0.5、1、2、4、6、10μg/ml）、PTL5μmol/L+VCR各浓度组,处理24小时后,MTT法检测PTL对HCT-8/VCR的耐药逆转作用。6、流式细胞仪（Annexin V-FITC/PI染色）检测PTL对HCT-8/VCR的耐药逆转作用。消化收集对照组、PTL5μmol/L、VCR2μg/ml、PTL5μmol/L+VCR2μg/ml处理24h的HCT-8/VCR细胞,AnnexinV/FITC染色后,流式细胞仪检测,分析细胞凋亡百分比。7、Western-blot法检测PTL对HCT-8/VCR细胞P-gp、MRP、GST-π蛋白表达的影响。收集HCT-8对照组、HCT-8/VCR对照组、PTL5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L处理24h的HCT-8/VCR细胞蛋白,用western blot方法检测P-gp、MRP、GST-π蛋白的表达。二、大黄素诱导CACO-2细胞凋亡及对PI3K/AKT信号通路的调控作用研究1、MTT法检测大黄素对CACO-2细胞增殖抑制的影响对数生长期的CACO-2细胞,加入96孔板,实验组加入不同浓度的PTL,对照组则加等量不含药物的培养液,处理24小时后,MTT法检测各孔吸光度（OD）值,计算细胞增殖抑制率。2、流式细胞术检测大黄素对CACO-2细胞凋亡的影响。消化收集对数生长期的CACO-2细胞,以大黄素处理CACO-2细胞24h,终浓度分别为0μmol/L、15μmol/L、30μmol/L和60μmol/L,然后以AnnexinV/FITC染色,流式细胞仪检测,分析细胞凋亡百分比。3、DAPI染色检测大黄素对CACO-2细胞凋亡的影响取对数生长期CACO-2细胞,每孔1×104个/ml、2ml接种于6孔板中,孔内放入盖玻片。设大黄素浓度15μmol/L、30μmol/L和60μmol/L、及对照组共4组,每组3个复孔,,每组给药24h后,取出盖玻片,固定、DAPI染色、碳酸盐缓冲甘油封片,荧光显微镜观察,激发波长为359 nm。观察细胞凋亡情况。4、流式细胞术检测大黄素对CACO-2细胞周期的影响取对数生长期的CACO-2细胞,用RPMI-1640完全培养基制成2×104个/m1的单细胞悬液,接种于6孔培养板中,每孔2ml,37℃培养12小时,更换培养液,加入药物。大黄素物终浓度分别为0μmol/L、15μmol/L、30μmol/L和60μmol/L;对照组为加入完全培养基组,空白对照为只加入完全培养基,置培养箱中培养24h后,用胰酶消化细胞,调整细胞浓度为1x106个/ml,取0.25ml细胞,PBS清洗,1000rpm,4℃离心5分钟,弃上清（重复两次）;将细胞重悬于0.25ml结合缓冲液中,取0.1ml细胞悬液置于5ml流式管中,加入PI 20ul至终浓度50ug/ml,锡箔纸包住,避光4度染色30min,24h内上机检测。用流式细胞仪进行细胞周期检测,重复实验3次。5、Western-blot法检测大黄素对CACO-2细胞Bax、Bcl-2、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达的影响收集对照组、15μmol/L、30μmol/L和60μmol/L大黄素处理24h的CACO-2细胞蛋白,用western blot方法检测Bax、Bcl-2蛋白的表达。结果:1、PTL对HCT-8、HCT-8/VCR细胞的增殖抑制作用小白菊内酯对结肠癌HCT-8、HCT-8/VCR细胞株有增殖抑制作用,并呈浓度及时间依赖关系,PTL12h半数抑制浓度IC50分别为20.21±2.63μmol/L,21.52±3.25μmol/L。PTL24h半数抑制浓度IC50分别为15.46±1.22μmol/L,17.05±2.78μmol/L。PTL48h半数抑制浓度IC50分别为11.44±1.65μmol/L,10.85±2.02μmol/L。2、PTL对HCT-8、HCT-8/VCR细胞凋亡的影响。对照组HCT-8细胞凋亡率4.23%±0.75%,与对照组比较,经5、10、20μmol/L的PTL处理24h后,HCT-8细胞的凋亡率显着增加（p<0.05）,分别为8.23%±1.45%,22.46%±2.75%,38.16%±3.25%。对照组HCT-8/VCR细胞凋亡率4.42%±1.16%,与对照组比较,经5、10、20μmol/L的PTL处理24h后,HCT-8/VCR细胞的凋亡率显着增加（p<0.05）,分别为8.43%±0.95%,21.67%±3.53%,39.16%±3.51%。上述结果表明PTL以浓度依赖方式诱导HCT-8、HCT-8/VCR细胞凋亡。3、荧光染色检测PTL对HCT-8、HCT-8/VCR细胞凋亡的影响荧光染色结果显示,PTL以浓度依赖方式诱导HCT-8、HCT-8/VCR细胞凋亡。对照组HCT-8细胞凋亡细胞比率为10.33%±2.05%,与对照组比较,经5、10、20μmol/L的PTL处理24h后,HCT-8细胞的凋亡率显着增加（p<0.05）,分别为20.55%±3.55%,32.46%±3.76%,46.8%±4.28%。对照组HCT-8/VCR细胞凋亡细胞比率9.42%±1.25%,与对照组比较,经5、10、20μmol/L的PTL处理24h后,HCT-8/VCR细胞的凋亡率显着增加（p<0.05）,分别为18.66%±2.15%,30.65%±2.87%,45.44%±3.81%。4、Western-blot法检测PTL对HCT-8、HCT-8/VCR细胞Bax、Bcl-2蛋白表达的影响。对照组HCT-8、HCT-8/VCR细胞可见Bax低表达,与对照组比较,PTL 5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L组Bax表达显着增加（p<0.05）。对照组HCT-8、HCT-8/VCR细胞可见Bcl-2高表达,与对照组比较,PTL 5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L组Bax表达显着减少（p<0.05）。上述结果表明,PTL通过以浓度依赖方式增加HCT-8、HCT-8/VCR细胞Bax的表达,降低Bcl-2的表达,诱导HCT-8、HCT-8/VCR细胞凋亡。5、MTT法检测PTL对HCT-8/VCR的耐药逆转作用（1）VCR对结肠癌HCT-8、HCT-8/VCR细胞株有增殖抑制作用（p<0.05）,并呈浓度依赖关系（p<0.05）,VCR半数抑制浓度IC50分别为2.21±0.24μg/ml、38.9±3.04μg/ml,HCT-8/VCR对VCR的耐药指数为17.6倍。（2）VCR0.25、0.5、1、2、4μg/ml对HCT-8/VCR细胞无显着增殖抑制作用（p>0.05）,VCR 6、10μg/ml对HCT-8/VCR细胞有轻度增殖抑制作用（p<0.05）,PTL5μmol/L与VCR（0.25、0.5、1、2、4、6、10μg/ml）联用可显着增加VCR对HCT-8/VCR细胞的增殖抑制作用（p<0.05）。联用后VCR IC50为3.01±0.45μg/ml,与VCR单独应用时比较,IC50显着降低（p<0.05）,PTL可显着降低HCT-8/VCR对VCR的耐药指数（p<0.05）。上诉结果说明,PTL可显着增加显着增加VCR对HCT-8/VCR细胞的增殖抑制作用,逆转HCT-8/VCR的耐药。6、流式细胞仪（Annexin V-FITC/PI染色）检测PTL对HCT-8/VCR的耐药逆转作用。Annexin V-FITC/PI染色检测凋亡结果显示,对照组细胞凋亡率5.01%±0.47%,经VCR2μg/ml处理24h后,HCT-8/VCR细胞的凋亡率为6.93%±1.45%,与对照组比较,无显着差异（p>0.05）,经PTL5μmol/L处理24h后,HCT-8/VCR细胞的凋亡率为10.02%±0.86%,与对照组比较,凋亡率显着增加（p<0.05）,PTL5μmol/L+VCR2μg/ml处理24h的HCT-8/VCR细胞凋亡率为34.7%±2.33%,与VCR2μg/ml组及PTL5μmol/L组比较,凋亡率均显着性增加（p<0.05）。结果表明,PTL可显着增加VCR诱导HCT-8/VCR细胞凋亡能力,逆转HCT-8/VCR细胞对VCR的耐药。7、Western-blot法检测PTL对HCT-8/VCR细胞P-gp、MRP、GST-π蛋白表达的影响。western blot方法检测结果显示,HCT-8对照组可见P-gp、MRP、GST-π蛋白的低表达;与HCT-8对照组比较,HCT-8/VCR对照组P-gp、MRP、GST-π蛋白表达显着增加（p<0.05）;与HCT-8对照组比较,HCT-8/VCR对照组PTL5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L处理HCT-8/VCR细胞24h后,P-gp、MRP、GST-π蛋白表达显着减少（p<0.05）,且PTL浓度越大蛋白表达越低。8、随着大黄素浓度的逐渐提高,CACO-2细胞生存率逐渐降低,至200μmol/L,细胞生存率几乎接近0。而大黄素对CACO-2细胞培养24h的IC 50值为30μmol/L。9、随着大黄素浓度的逐渐升高,CACO-2细胞凋亡率也随之升高,从对照组的1.85%,升至60μmol/L大黄素组的42.66%。大黄素对CACO-2细胞诱导凋亡的作用呈剂量依赖趋势。10、30μmol/L和60μmol/L的大黄素干预后,细胞核明显浓缩,染色加深,偶见核染色质呈新月形聚集于核膜一边。尤其是60μmol/L的大黄素干预后,凋亡细胞核碎裂成大小不等的圆形小体,并被细胞膜所包绕,疑似凋亡小体。11、对照组细胞大部分处于G0/G1期,为62.3%,处于S期33.7%,处于G2/M期4.0%;大黄素干预后,细胞周期在G2/M期明显发生停滞,该期细胞数显着增多。并且随着大黄素浓度的提高,停滞于G2/M期的细胞也逐渐增多。以60μmol/L的大黄素组G2/M细胞周期阻滞最为明显。12、对照组细胞Bax呈低水平表达,而随着大黄素浓度的增高,表达水平逐渐上调;Bcl-2表达水平与Bax正好相反,对照组细胞Bcl-2、p-PI3K和p-AKT呈高水平表达,随着大黄素浓度的增高,表达水平逐渐下调。而非磷酸化PI3K、AKT表达水平各组间无明显差异。结论:1、小白菊内酯对HCT-8、HCT-8/VCR细胞具有抑制增殖及诱导凋亡作用,小白菊内酯对结肠癌细胞增殖抑制及诱导凋亡作用不受HCT-8/VCR细胞耐药性的影响,小白菊内酯可通过增加Bax的表达,降低Bcl-2的表达来诱导结肠癌细胞凋亡。2、小白菊内酯可显着增加VCR对HCT-8/VCR细胞的增殖抑制能力及凋亡诱导能力,小白菊内酯对HCT-8/VCR细胞具有耐药逆转作用。其机制主要是通过PTL降低HCT-8/VCR细胞P-gp、MRP、GST-π蛋白的表达,逆转HCT-8/VCR细胞的耐药性。3、大黄素对CACO-2结肠癌细胞的生长具有明显的抑制作用。其抗癌作用主要是由于诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞。此外,它还能抑制CACO-2细胞的PI3/AKT信号级联,提示大黄素在结肠癌治疗中的潜在应用。
高峰[10]（2018）在《As2O3逆转P-gp介导的白血病细胞多药耐药功能及机制的研究》文中指出目的:肿瘤化疗失败的主要原因是肿瘤细胞多药耐药性（multidrug resistance,MDR）的产生,即肿瘤细胞一旦对某种药物产生耐受,对其它结构各异、作用机制不同的化疗药物也产生交叉耐受,从而使肿瘤治疗的效果得不到显着提高,这一现象给临床治疗带来极大的障碍。MDR有多种机制,P糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）过表达是肿瘤细胞多药耐药的主要原因。P-gp由MDR1基因编码,又称ABCB1,是ATP结合盒（ATP-binding cassette,ABC）转运输蛋白家族成员之一,可通过ATP依赖的药物运输泵机制将细胞毒性试剂从细胞内运送到细胞膜外。白血病治疗主要依靠联合化疗和骨髓移植,临床上成年急性髓性白血病（acute myeloid leukemia,AML）患者中60-80%常规化疗后可以完全缓解,随着年龄增长复发/难治患者比例明显升高,且有研究表明复发难治患者白血病细胞P-gp表达明显高于治疗敏感组。P–gp在CD34+干细胞和恶性白血病细胞中表达,随着白血病细胞的分化,P–gp表达呈下降趋势,但CD34+表达与白血病细胞P-gp表达及功能的相关性还不十分清楚。P-gp表达被认为是临床急性髓性白血病不良预后的独立因素,且已经开展应用P-gp抑制剂逆转耐药的辅助治疗,但效果不佳。三氧化二砷（As2O3）是具有2000多年历史的传统中药,1985年被用于急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia,APL）治疗,目前As2O3在APL和一些实体瘤的治疗上都取得了一定的疗效。近来发现砷剂有抑制P-gp表达的作用,但目前关于三氧化二砷逆转多药耐药的作用机制仍不清楚。研究发现各种细胞压力如DNA损伤、血清饥饿等都可使MDR1发生活化,MDR1基因上游启动子区缺乏一般编码蛋白基因具有的TATA盒,而是具有与NF-Y和Sp家族转录因子结合的反向的CCAAT和GC富集区,这些转录因子蛋白可募集组蛋白乙酰转移酶启动周围组蛋白乙酰化,使染色质重塑,从而激活MDR1启动子,有研究报道表皮生长因子（EGF）、肿瘤坏死因子TNF-α、阿霉素、核因子κB（NF-κB）等各种活化信号都可刺激MDR1表达。Mathas等研究表明NF-κB除了可诱导抗凋亡基因表达而产生抗凋亡作用以外,还可直接诱导P-gp表达。Bentires-Alj等证实MDR1基因启动子区域的第一内含子内存在一个NF-κB结合序列,并且NF-κB能够激活连接MDR1启动子的报告基因转录,这提示As2O3可能通过抑制NF-κB来诱导细胞凋亡和抑制MDR1的表达,从而产生逆转耐药的作用。因此,本研究拟通过对AML患者白血病细胞P-gp表达、功能及其与CD34表达相关关系的分析和通过体内、体外实验检测As2O3对P-gp表达的影响,以及As2O3是否通过NF-κB途径影响MDR1启动子活性等进行分析,探讨As2O3逆转AML白血病细胞耐药机制,为AML临床化疗方案的制定提供依据。方法:本研究以85例临床AML患者、白血病药物敏感细胞系K562/S和耐药细胞系K562/D为研究对象,用免疫细胞化学方法检测AML患者白血病细胞P-gp表达和CD34表达,用流式细胞术检测P-gp功能,分析了CD34表达、P-gp表达及功能与临床急性髓性白血病病人耐药的相关关系;为证明As2O3是否具有逆转P-gp表达及耐药功能的作用,分别采用对P-gp表达阳性的3例复发/难治患者使用As2O3进行药物治疗,As2O310mg每日一次静脉滴注,持续治疗4天;分离9例P-gp表达阳性患者外周血单个核细胞进行体外培养,用终浓度为1μM的As2O3处理,用Real-time PCR方法检测用药前后原代培养的急性髓性白血病细胞和K562/D细胞的MDR1表达变化;K 562/D细胞以相同方式进行药物处理,用流式细胞术检测As2O3作用前后K562/D细胞总P-gp表达及药物释放功能的变化;为进一步分析As2O3逆转耐药的机制,用EMSA方法体外鉴定MDR1启动子区NF-κB反应元件,并通过Western印迹杂交实验检测As2O3对K562/D细胞NF-κB亚基p65、抑制因子IκB和磷酸化的IκB表达水平的影响;并通过构建MDR1启动子萤光素酶报告系统分析了NF-κB刺激因子TNF–α对MDR1启动子活性的调节作用和As2O3对TNF–α诱导的MDR1启动子活性的调节作用,并进一步构建野生型、突变型IκB表达载体和p65siRNA,通过萤光素酶报告基因检测系统鉴定NF-κB反应元件在As2O3对MDR1启动子活性调节中的作用。结果:免疫细胞化学实验显示63例初治组中23例P-gp+表达,占36.5%;22例复发/难治组中11例P-gp+表达,占50.0%,两组无显着差异（P>0.05）。63例初治组中P-gp+功能18例,占28.6%,22例复发/难治组中P-gp+功能13例,占59.1%,复发/难治组高于初治组（P<0.05）;63例初治组中20例CD34+,占31.7%;22例复发/难治组中13例CD34+,占59.1%,高于初治组（P<0.05）。CD34表达与P-gp表达呈正相关（P=0.0001.r=0.483）;CD34表达与P-gp功能也呈正相关（P=0.0001,r=0.550）;3、63例初治AML患者按年龄分为<50岁和≥50岁的年龄分组,46例<50岁初治组中8例CD34+（17.4%）,12例P-gp+表达（26.1%）,9例P-gp+功能（19.6%）;17例（≥50岁）初治组中11例CD34+（64.7%）,11例P-gp+表达（64.7%）,9例P-gp+功能（52.9%）,≥50岁组均高于<50岁组（P<0.05）;Real-time RT-PCR结果显示体内和原代培养急性髓性白血病细胞和耐药细胞系经As2O3作用后总MDR1表达下调;流式细胞术检测K562/D细胞经As2O3作用后P-gp表达及药物释放功能明显下降;EMSA实验在体外证明了MDR1启动子区+561+571为NF-κB反应元件;Western印迹杂交结果显示As2O3使K562/D细胞IκB降解减少,磷酸化IκB水平降低,核NF-κB p65减少;应用萤光素酶检测系统证明了TNF–α对MDR1启动子有正调控作用,As2O3可抑制TNF–α诱导的MDR1启动子活性;萤光素酶报告基因系统证明细胞转染野生型和突变型IκB表达载体后As2O3通过NF-κB反应元件对TNF–α诱导的MDR1启动子活性的抑制减弱,后者比前者减弱程度小;萤光素酶报告基因检测系统证明细胞转染p65siRNA后As2O3通过NF-κB反应元件对TNF–α诱导的MDR1启动子活性抑制明显减弱。结论:1、MDR1高表达是临床急性髓性白血病病人耐药的主要原因。2、As2O3可使K562/D细胞和临床急性髓性白血病细胞MDR1表达下调。3、As2O3可通过NF-κB通路逆转P-gp调节的白血病细胞耐药,MDR1基因上游存在一段NF-κB特异结合序列,NF-κB可通过与该序列结合调节MDR1基因表达,As2O3可能通过抑制磷酸化酶活性来抑制IκB磷酸化,进而抑制NF-κB活性,抑制MDR1基因表达,逆转白血病细胞耐药。
二、乳腺癌耐药细胞中mdr-1与mrp基因的表达及As_2O_3对其表达的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、乳腺癌耐药细胞中mdr-1与mrp基因的表达及As_2O_3对其表达的影响（论文提纲范文）
（1）中药逆转肿瘤多药耐药及侵袭转移作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 前言 |
| 1.1 肿瘤多药耐药的产生及分子机制 |
| 1.1.1 药物转运泵的外排 |
| 1.1.2 酶系统的改变 |
| 1.1.3 细胞周期的改变 |
| 1.1.4 膜脂的改变 |
| 1.1.5 细胞凋亡与自噬的改变 |
| 1.2 中药逆转肿瘤多药耐药的研究 |
| 1.3 肿瘤的侵袭转移 |
| 1.3.1 血管生成对肿瘤转移的作用 |
| 1.3.2 黏附分子在肿瘤转移过程中的作用 |
| 1.3.3 细胞降解机制在肿瘤转移过程中的作用 |
| 1.3.4 肿瘤微环境 |
| 1.4 细胞代谢组学研究 |
| 1.4.1 代谢组学概论 |
| 1.4.2 代谢组学研究流程 |
| 1.4.3 细胞代谢组学在肿瘤研究中的应用 |
| 1.5 本论文的研究思路 |
| 第2章 中药中乳酸脱氢酶抑制剂筛选研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 样品与试剂 |
| 2.2.2 LDH功能化磁纳米粒子的制备 |
| 2.2.3 表征 |
| 2.2.4 固定化LDH的活性测定及固载量计算 |
| 2.2.5 LDH固定化条件的优化 |
| 2.2.6 固定化LDH配体筛选条件优化 |
| 2.2.7 使用固定化LDH从大黄和虎杖提取物中筛选抑制剂 |
| 2.2.8 UPLC-MS/MS条件 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 固定化LDH的表征 |
| 2.3.2 LDH固定化条件优化结果 |
| 2.3.3 固定化LDH配体筛选条件优化结果 |
| 2.3.4 大黄中LDH抑制剂筛选及鉴定 |
| 2.3.5 虎杖中LDH抑制剂筛选及鉴定 |
| 2.4 结论 |
| 第3章 基于MDCK-MDR1细胞的P-gp抑制剂筛选研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 样品与试剂 |
| 3.2.2 细胞培养 |
| 3.2.3 毒性实验 |
| 3.2.4 细胞内Rh-123蓄积实验 |
| 3.2.5 细胞内Rh-123外排实验 |
| 3.2.6 Western Blot实验 |
| 3.2.7 转运实验 |
| 3.2.8 UPLC-MS/MS定量分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 中药提取物/单体化合物的细胞毒性研究 |
| 3.3.2 中药提取物/单体化合物对Rh-123蓄积的影响 |
| 3.3.3 中药提取物/单体化合物对Rh-123外排的影响 |
| 3.3.4 中药提取物/单体化合物对P-gp表达的影响 |
| 3.3.5 中药提取物/单体化合物的转运研究 |
| 3.4 结论 |
| 第4章 芦荟大黄素逆转肿瘤MDR作用机制研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 样品与试剂 |
| 4.2.2 细胞培养与毒性实验 |
| 4.2.3 细胞内ADR蓄积实验 |
| 4.2.4 Western Blot实验 |
| 4.2.5 实时荧光定量PCR实验 |
| 4.2.6 ADR在细胞内的分布 |
| 4.2.7 细胞内ATP含量的测定 |
| 4.2.8 能量代谢相关通路的定量分析 |
| 4.2.9 细胞周期实验 |
| 4.2.10 细胞内ROS水平的测定 |
| 4.2.11 Caspase-3活性测定 |
| 4.2.12 凋亡实验 |
| 4.2.13 定量与统计分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 AE逆转乳腺癌多药耐药 |
| 4.3.2 AE抑制P-gp的外排功能 |
| 4.3.3 AE对细胞内ADR分布的影响 |
| 4.3.4 AE降低细胞内ATP含量 |
| 4.3.5 AE对能量相关代谢通路的影响 |
| 4.3.6 AE能诱发MCF-7/ADR细胞自噬 |
| 4.3.7 AE对细胞周期的影响 |
| 4.3.8 AE对细胞凋亡的影响 |
| 4.4 结论 |
| 第5章 芦荟大黄素和大黄素抑制肿瘤侵袭转移作用机制研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 样品与试剂 |
| 5.2.2 细胞培养 |
| 5.2.3 细胞毒性实验 |
| 5.2.4 MCF-7细胞与内皮细胞黏附实验 |
| 5.2.5 MCF-7细胞侵袭转移实验 |
| 5.2.6 MMP-2、MMP-9和VEGF活性测定 |
| 5.2.7 软琼脂克隆实验 |
| 5.2.8 代谢组学细胞样品制备 |
| 5.2.9 UPLC-MS条件 |
| 5.2.10 数据处理和分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 MCF-7单独培养与共培养方式的比较 |
| 5.3.2 芦荟大黄素和大黄素的细胞毒性 |
| 5.3.3 芦荟大黄素和大黄素降低内皮细胞对MCF-7细胞的黏附 |
| 5.3.4 芦荟大黄素和大黄素抑制MCF-7细胞的侵袭转移 |
| 5.3.5 芦荟大黄素和大黄素对MCF-7细胞代谢的影响 |
| 5.3.6 生物标志物的定量分析 |
| 5.4 结论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
| 硕博连读期间发表的学术论文 |
（2）粉防己碱逆转大肠癌LOVO/5-Fu多药耐药性的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 LOVO/5-Fu耐药细胞系的建立及其MDR和P-gp的表达情况 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 结论 |
| 讨论 |
| 第二部分 粉防己碱逆转大肠癌LOVO/5-Fu细胞多药耐药性的研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 结论 |
| 讨论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| ENGLISH ARTICLEⅠ |
| ENGLISH ARTICLEⅡ |
（3）基于肿瘤微环境设计多功能纳米前药用于逆转肿瘤多药耐药性（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 肿瘤多药耐药性 |
| 1.2.1 肿瘤细胞因素 |
| 1.2.2 肿瘤环境因素 |
| 1.3 多药耐药逆转剂 |
| 1.3.1 ABC转运体抑制剂 |
| 1.3.2 GSH/GST抑制剂 |
| 1.3.3 HIF抑制剂 |
| 1.3.4 炎症抑制剂 |
| 1.3.5 其他抑制剂 |
| 1.4 纳米药物系统逆转肿瘤耐药策略 |
| 1.4.1 物理包封 |
| 1.4.2 化学键合 |
| 1.4.3 药物自组装 |
| 1.5 理想的纳米药物输送系统 |
| 1.5.1 稳定性 |
| 1.5.2 靶向性 |
| 1.5.3 释药性 |
| 1.5.4 联合治疗 |
| 1.6 本论文研究工作 |
| 1.7 参考文献 |
| 第二章 苯硼酸靶向及pH敏感的普兰尼克前药胶束的制备及其体内药效评价 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 阿霉素前体合成 |
| 2.3.2 pluronic前药聚合物合成 |
| 2.3.3 pluronic靶向聚合物合成 |
| 2.3.4 杂化前药胶束制备及表征 |
| 2.3.5 pH敏感性及稳定性评估 |
| 2.3.6 体外药物释放 |
| 2.3.7 细胞培养及唾液酸检测 |
| 2.3.8 细胞摄取 |
| 2.3.9 细胞毒性 |
| 2.3.10 逆转机制评估 |
| 2.3.11 细胞凋亡 |
| 2.3.12 动物模型建立及肿瘤部位药物分布 |
| 2.3.13 小鼠抑瘤实验及组织学分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 化学结构分析 |
| 2.4.2 前药胶束表征 |
| 2.4.3 pH敏感性评估 |
| 2.4.4 体外药物释放 |
| 2.4.5 细胞唾液酸水平 |
| 2.4.6 细胞摄取 |
| 2.4.7 细胞毒性 |
| 2.4.8 逆转机制评估 |
| 2.4.9 细胞凋亡 |
| 2.4.10 体内药物分布 |
| 2.4.11 体内抗肿瘤 |
| 2.4.12 病理学评估 |
| 2.5 小结 |
| 2.6 参考文献 |
| 第三章 自产氧的纳米酶前药粒子用于克服缺氧介导的化疗-光动力治疗抗性 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 两亲性生物大分子前药合成 |
| 3.3.2 前药粒子及Ce6 装载粒子制备 |
| 3.3.3 理化表征分析 |
| 3.3.4 pH触发DOX及 Ce6 释放 |
| 3.3.5 氧气生成及酶活性评估 |
| 3.3.6 缺氧细胞模型建立 |
| 3.3.7 体外HIF-1α及 P-gp分析 |
| 3.3.8 细胞摄取 |
| 3.3.9 胞外/内ROS评估 |
| 3.3.10 MTT分析 |
| 3.3.11 体外凋亡分析 |
| 3.3.12 体内药物分布及成像 |
| 3.3.13 免疫荧光分析 |
| 3.3.14 免疫组化分析 |
| 3.3.15 在荷瘤小鼠及裸鼠体内的抗肿瘤作用评估 |
| 3.3.16 体内安全性分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 大分子前药合成及表征 |
| 3.4.2 前药粒子及Ce6 装载粒子制备及表征 |
| 3.4.3 酶活性评估 |
| 3.4.4 pH触发的降解及释放 |
| 3.4.5 HIF-1α及 P-gp表达 |
| 3.4.6 细胞摄取 |
| 3.4.7 胞外/胞内PDT效应评估 |
| 3.4.8 细胞毒性评估 |
| 3.4.9 细胞凋亡评估 |
| 3.4.10 药代动力学及体内成像 |
| 3.4.11 体内缺氧及P-gp评估 |
| 3.4.12 体内抗肿瘤评估 |
| 3.4.13 生物安全性评估 |
| 3.5 小结 |
| 3.6 参考文献 |
| 第四章 自组装的PEI/DOX/CXB杂化前药粒子用于克服肿瘤抗性及侵袭 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与仪器 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 阿霉素与塞来昔布二聚体合成 |
| 4.3.2 双亲性PEI合成 |
| 4.3.3 纳米前药粒子制备及表征 |
| 4.3.4 电荷翻转及质子缓冲 |
| 4.3.5 体外药物释放 |
| 4.3.6 细胞毒性评估 |
| 4.3.7 细胞摄取及亚细胞共定位 |
| 4.3.8 P-gp定量检测 |
| 4.3.9 细胞划痕、迁移、侵袭评估 |
| 4.3.10 细胞周期 |
| 4.3.11 细胞凋亡 |
| 4.3.12 体内药物分布 |
| 4.3.13 实体瘤抑制及组织学评估 |
| 4.3.14 转移瘤抑制及免疫组化评估 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 化合物结构分析 |
| 4.4.2 前药粒子表征 |
| 4.4.3 质子缓冲及电荷翻转 |
| 4.4.4 体外药物释放 |
| 4.4.5 细胞摄取与亚细胞共电位 |
| 4.4.6 P-gp表达评估 |
| 4.4.7 细胞毒性 |
| 4.4.8 划痕、迁移、侵袭实验评估 |
| 4.4.9 细胞周期与凋亡 |
| 4.4.10 体内器官分布 |
| 4.4.11 体内实体瘤抑制评估 |
| 4.4.12 体内转移瘤抑制评估 |
| 4.4.13 生物安全性评估 |
| 4.5 小结 |
| 4.6 参考文献 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 缩略词 |
| 研究成果 |
| 致谢 |
（4）Notch-1通路与As2O3逆转肝癌HepG2/ADM细胞耐药性相关的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩写词表 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 第一部分 |
| 第二部分 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 As_2O_3和Notch信号通路对肿瘤细胞生物学特性以及多药耐药性(MDR的影响 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表 |
（5）补中益气汤干预肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞EMT改善顺铂耐药的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 论文一 肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞EMT与耐药相关蛋白的相关性研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文二 补中益气汤干预肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞EMT改善顺铂耐药的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文三 补中益气汤对肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞PI3K/AKT信号通路的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性自我评价及展望 |
| 参考文献 |
| 综述 中医药改善肿瘤化疗耐药的机制 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（6）Rack1调控P-glycoprotein活性促进乳腺癌细胞耐药的分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、Rack1的表达增加耐药细胞对化疗药物的抵抗 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验用细胞系和培养条件 |
| 1.1.2 实验用仪器、试剂和耗材 |
| 1.1.3 相关试剂配制 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 敲减Rack1的表达增加耐药细胞对表柔比星的敏感性 |
| 1.2.2 敲减Rack1后不改变药物转运蛋白P-gp的表达水平 |
| 1.2.3 敲减Rack1的表达减弱P-gp的转运活性 |
| 1.2.4 敲减Rack1后增加化疗药物在细胞内的蓄积 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、Src激酶活性促进肿瘤细胞耐药 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验用细胞系和培养条件 |
| 2.1.2 实验用仪器、试剂和耗材 |
| 2.1.3 试剂配制 |
| 2.1.4 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 Src的表达促进细胞对化疗药物的抵抗 |
| 2.2.2 下调Src的表达抑制P-gp的转运活性 |
| 2.2.3 下调Src的表达增加表柔比星的胞内蓄积 |
| 2.2.4 抑制Src激酶活性增加细胞对化疗药物的敏感性 |
| 2.2.5 抑制Src激酶活性减弱P-gp的转运能力 |
| 2.2.6 抑制Src激酶活性后增加化疗药物在细胞内的蓄积 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、Rack1介导Src与 P-gp之间的相互作用 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验用材料 |
| 3.1.2 实验用仪器、试剂和耗材 |
| 3.1.3 试剂配制 |
| 3.1.4 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 Rack1/Src/P-gp三者在乳腺癌耐药细胞中形成蛋白复合体 |
| 3.2.2 Rack1的表达介导Src与 P-gp的相互作用,同时抑制Cav1与P-gp的结合 |
| 3.2.3 Src的表达不影响Rack1与P-gp的相互作用,但能抑制Cav1与P-gp的结合 |
| 3.2.4 表达Rack1~(Y246F)不能介导Src与 P-gp的相互作用,但能增强Cav1结合P-gp |
| 3.2.5 Src的激酶活性调控Cav1的磷酸化 |
| 3.2.6 Src调控Cav1的磷酸化依赖于Rack1的表达 |
| 3.2.7 磷酸化的Cav1减弱与P-gp的结合能力,促进P-gp转运活性 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 四、拯救Rack1~(WT)的表达恢复肿瘤细胞对化疗药物的抵抗 |
| 4.1 对象和方法 |
| 4.1.1 实验用材料 |
| 4.1.2 实验用仪器、试剂和耗材 |
| 4.1.3 试剂配制 |
| 4.1.4 实验方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 耐药细胞中拯救Rack1~(WT)的表达,恢复对表柔比星的抵抗 |
| 4.2.2 体内实验,敲减Rack1表达的肿瘤细胞对表柔比星的敏感性增加,经Rack1~(WT)拯救的肿瘤细胞对表柔比星的治疗产生抵抗 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 对肿瘤多药耐药与逆转肿瘤多药耐药的认识 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）千金藤素协同多柔比星逆转多药耐药和诱导K562/ADR细胞凋亡的分子机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 K562/ADR耐药细胞的鉴定 |
| 2.1 实验材料与方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 千金藤素协同多柔比星诱导K562/ADR细胞线粒体分裂和细胞凋亡的分子机制 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 千金藤素协同多柔比星诱导K562/ADR细胞产生ROS |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 千金藤素阻断自噬降解导致自噬体过度聚集进而增敏多柔比星 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 自噬作为白血病治疗新策略 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（8）MicroRNA-27b在乳腺癌生长与耐药中的作用机制及临床意义（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文对照表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 问题的提出 |
| 1.3 研究路线 |
| 1.4 本文创新点 |
| 1.5 研究意义 |
| 2 乳腺癌化疗耐药相关miRNAs的筛选与鉴定 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验思路 |
| 2.3 实验材料 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.5 实验结果 |
| 2.5.1 TCGA数据库筛选与乳腺癌生长及耐药相关的miRNAs |
| 2.5.2 高通量鉴定可显着下调乳腺癌细胞耐药性的miRNAs |
| 2.5.3 MiR-27b、miR-204表达量在乳腺癌组织中显着下调 |
| 2.5.4 MiR-27b表达失调与紫杉醇耐药相关 |
| 2.5.5 MiR-27b的表达失调与乳腺癌患者的预后相关 |
| 2.5.6 MiR-27b的表达量与乳腺癌的恶性程度相关 |
| 2.6 讨论 |
| 2.7 本章小结 |
| 3 MiR-27b可抑制乳腺癌生长与耐药 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验思路 |
| 3.3 实验材料 |
| 3.4 实验方法 |
| 3.5 实验结果 |
| 3.5.1 MiR-27b可抑制乳腺癌细胞增殖、逆转紫杉醇耐药 |
| 3.5.2 MiR-27b可影响乳腺癌细胞对多种化疗药物的耐药性 |
| 3.5.3 MiR-27b可抑制乳腺癌细胞的克隆形成 |
| 3.5.4 MiR-27b可促进乳腺癌细胞的凋亡 |
| 3.5.5 MiR-27b可在体内抑制乳腺癌的生长和耐药性 |
| 3.5.6 低表达miR-27b可在体内促进乳腺癌的生长 |
| 3.6 讨论 |
| 3.7 本章小结 |
| 4 MiRNA-27b下游靶基因的确定 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验思路 |
| 4.3 实验材料 |
| 4.4 实验方法 |
| 4.5 实验结果 |
| 4.5.1 生物信息学预测miR-27b的下游靶标 |
| 4.5.2 筛选与乳腺癌生长及耐药相关的靶基因 |
| 4.5.3 确定miR-27b的直接靶标 |
| 4.5.4 MiR-27b可在体外抑制CBLB、GRB2的表达 |
| 4.5.5 MiR-27b可在体内抑制CBLB、GRB2的表达 |
| 4.5.6 CBLB、GRB2表达失调与紫杉醇耐药相关 |
| 4.6 讨论 |
| 4.7 本章小结 |
| 5 MiR-27b抑制乳腺癌细胞增殖与耐药的机制研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验思路 |
| 5.3 实验材料 |
| 5.4 实验方法 |
| 5.5 实验结果 |
| 5.5.1 CBLB、GRB2可在体外促进乳腺癌细胞的增殖、耐药 |
| 5.5.2 MiR-27b通过抑制CBLB、GRB2从而抑制细胞的增殖与耐药 |
| 5.5.3 MiR-27b可逆转CBLB、GRB2对凋亡的调控作用 |
| 5.5.4 CBLB、GRB2可抑制AKT、ERK信号通路 |
| 5.5.5 MiR-27b可抑制AKT、ERK信号通路 |
| 5.6 讨论 |
| 5.7 本章小结 |
| 6 预测乳腺癌中以耐药相关miRNAs为中心的调控网络 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 实验思路 |
| 6.3 生信平台 |
| 6.4 实验方法 |
| 6.5 实验结果 |
| 6.5.1 筛选关键miRNAs下游表达失调的靶基因 |
| 6.5.2 蛋白互作网络的构建及生物信息学分析 |
| 6.5.3 蛋白互作网络中筛选枢纽基因 |
| 6.5.4 筛选miRNAs上游表达失调的IncRNAs |
| 6.5.5 构建以关键miRNAs为中心的调控网络 |
| 6.6 本章小结 |
| 附图1 |
| 附图2 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
（9）小白菊内酯及大黄素抑制肠腺癌细胞增殖作用机制的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 小白菊内酯对HCT-8、HCT-8/VCR细胞的增殖抑制及诱导凋亡作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 统计学处埋 |
| 3 结果 |
| 3.1 PTL对HCT-8、HCT-8/VCR细胞的增殖抑制作用 |
| 3.2 PTL对HCT-8、HCT-8/VCR细胞凋亡的影响。 |
| 3.3 荧光染色检测PTL对HCT-8、HCT-8/VCR细胞凋亡的影响 |
| 3.4 Western-blot法检测PTL对HCT-8、HCT-8/VCR细胞Bax、Bcl-2蛋白表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二部分 小白菊内酯对HCT-8/VCR细胞耐药逆转作用及机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 统计学处埋 |
| 3 结果 |
| 3.1 MTT法检测PTL对HCT-8/VCR的耐药逆转作用 |
| 3.2 流式细胞仪(Annexin V-FITC/PI染色)检测PTL对HCT-8/VCR的耐药逆转作用 |
| 3.3 Western-blot法检测PTL对HCT-8/VCR细胞P-gp、MRP、GST-π蛋白表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三部分 大黄素通过调控PI3K/AKT信号通路诱导CACO-2凋亡的实验研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 统计学处埋 |
| 3 结果 |
| 3.1 大黄素对CACO-2细胞的增殖抑制作用 |
| 3.2 大黄素对CACO-2细胞凋亡的影响。 |
| 3.3 DAPI染色检测大黄素对CACO-2细胞凋亡的影响 |
| 3.4 流式细胞术检测大黄素对CACO-2细胞周期的影响 |
| 3.5 Western-blot法检测大黄素对CACO-2细胞Bax、Bcl-2、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 总结 |
| 本研究自我创新性评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 第一篇 结肠癌研究现状 |
| 1.1 结肠癌的流行病学研究现状 |
| 1.2 结肠癌的致病因素 |
| 1.3 结肠癌相关基因的研究进展 |
| 1.4 结肠癌的治疗 |
| 第二篇 肿瘤多药耐药逆转剂研究进展 |
| 2.1 化学药物逆转剂 |
| 2.2 基因治疗逆转剂 |
| 2.3 免疫逆转剂 |
| 2.4 中药逆转剂型 |
| 2.5 其它 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）As2O3逆转P-gp介导的白血病细胞多药耐药功能及机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 急性髓性白血病细胞P-gp表达及As_2O_3逆转耐药功能的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.2 技术路线 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 AML患白血病细者胞CD34、P-gp表达及P-gp功能的分析 |
| 3.2 As_2O_3对AML患者白血病细胞及K562/D细胞MDR1 mRNA表达的影响 |
| 3.3 As_2O_3对K562/D细胞P-gp蛋白表达及功能的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 As_2O_3下调白血病细胞MDR1表达机制的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.2 技术路线 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 MDR1启动子区NF-κB反应元件的体外鉴定 |
| 3.2 As_2O_3对K562/D细胞NF-κB p65亚基、IκB和磷酸化IκB蛋白水平的影响 |
| 3.3 MDR1启动子活性分析及TNF–α和As_2O_3对其活性的影响 |
| 3.4 NF-κB反应元件在As_2O_3引起的MDR1启动子活性抑制中的作用 |
| 论文图片 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 论文结论 |
| 本研究创新性自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
四、乳腺癌耐药细胞中mdr-1与mrp基因的表达及As_2O_3对其表达的影响（论文参考文献）
- [1]中药逆转肿瘤多药耐药及侵袭转移作用机制研究[D]. 程国荣. 中国科学技术大学, 2021(09)
- [2]粉防己碱逆转大肠癌LOVO/5-Fu多药耐药性的研究[D]. 王开雷. 山东大学, 2020(09)
- [3]基于肿瘤微环境设计多功能纳米前药用于逆转肿瘤多药耐药性[D]. 程旭. 安徽大学, 2020(07)
- [4]Notch-1通路与As2O3逆转肝癌HepG2/ADM细胞耐药性相关的实验研究[D]. 张帆. 石河子大学, 2019(01)
- [5]补中益气汤干预肺腺癌荷瘤裸鼠A549/DDP细胞EMT改善顺铂耐药的研究[D]. 张颖. 辽宁中医药大学, 2019(01)
- [6]Rack1调控P-glycoprotein活性促进乳腺癌细胞耐药的分子机制研究[D]. 范艳玲. 天津医科大学, 2019
- [7]千金藤素协同多柔比星逆转多药耐药和诱导K562/ADR细胞凋亡的分子机制研究[D]. 姜秀星. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)
- [8]MicroRNA-27b在乳腺癌生长与耐药中的作用机制及临床意义[D]. 陈丹妮. 浙江大学, 2019(03)
- [9]小白菊内酯及大黄素抑制肠腺癌细胞增殖作用机制的实验研究[D]. 马乾章. 中国医科大学, 2018(03)
- [10]As2O3逆转P-gp介导的白血病细胞多药耐药功能及机制的研究[D]. 高峰. 中国医科大学, 2018(12)