一、自体移植脾组织内GAP-43神经的生成机制(论文文献综述)
李芳[1](2021)在《ADSCs通过调控神经细胞TGF-β1/Smad/PLOD2信号通路修复脊髓损伤的机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景脊髓损伤(Spinal Cord Injury,SCI)是指由于外界直接或间接因素导致的中枢神经系统疾病,受累神经细胞的结构和功能受损,最终导致损伤部位以下运动功能和感觉的缺失,严重影响患者生活质量,降低患者生命预期,给家庭和社会带来沉重的负担。由于神经细胞的再生能力较低,损伤后微环境改变等不良因素,脊髓损伤治疗预后较差,使脊髓损伤的治疗成为了世界性的医学难题。传统的脊髓损伤治疗方法手术减压、药物对症治疗及术后康复治疗,不能促进神经细胞和轴突的再生,没有从根本上恢复神经功能,因此需要联用新的有效治疗方法共同作用。随着近几年分子生物学和细胞生物学研究的巨大进步,细胞移植作为脊髓损伤的一种新型治疗手段受到了广泛关注和研究,间充质干细胞(mesenchymal stromal cells,MSCs)由于其低免疫原性,体外容易培养,能分泌大量生物活性分子,成为研究的热点。体内外实验表明,脂肪来源的间充质干细胞(adipose tissue-derived stromal cells,ADSCs)移植在治疗脊髓损伤中具有良好的应用前景。在脊髓损伤动物模型中,与骨髓间充质干细胞相比,脂肪来源的间充质干细胞体内移植到脊髓损伤部位时具有更高的存活率。也有研究表明,ADSCs可以通过分泌细胞因子和生长因子,促进轴突再生,减少炎症细胞的浸润和空洞形成,从而促进脊髓损伤的恢复。尽管已有研究证明ADSCs在治疗脊髓损伤中的作用,但ADSCs促进脊髓损伤修复的具体机制尚不完全清楚。Torres-Espin等研究发现,大鼠脊髓损伤后MSCs体内移植可促进前胶原赖氨酸-2-酮戊二酸 5-双加氧酶 2(procollagen-lysine,2-oxoglutarate 5-dioxygenase 2,PLOD2)表达,PLOD2可能通过促进胶原纤维的交联和细胞外基质重塑起到组织修复的作用。越来越多的研究表明,在肿瘤的侵袭和迁移过程中,HIF-1α、TGF-β1 和 microRNA-26a/b 等分子通过 PI3K-AKT、TGF-β/Smad 信号通路,调控PLOD2的表达。但是PLOD2在治疗脊髓损伤中发挥的作用,目前还未见文献报道。ADSCs可以通过分泌多种细胞因子促进脊髓损伤的修复,TGF-β1作为ADSCs分泌的重要因子,具有抗炎、修复和神经保护功能。ADSCs能否通过分泌TGF-β1,上调PLOD2的表达,进而促进脊髓损伤的恢复,成为本研究的重点。本研究分为三个部分,第一部分:ADSCs体外共培养对损伤神经细胞的修复作用,第二部分:ADSCs通过调控神经细胞TGF-β1/Smad3/PLOD2信号通路促进损伤神经细胞的修复,第三部分:ADSCs通过激活神经细胞TGF-β1/Smad3/PLOD2信号通路促进脊髓损伤大鼠功能恢复。第一部分ADSCs体外共培养对损伤神经细胞的修复作用研究目的1.从人脂肪组织中分离培养间充质干细胞,通过成脂成骨分化能力和细胞表面标志的表达对其进行鉴定。2.培养PC12细胞和大鼠皮质神经元原代细胞,体外建立神经细胞机械损伤模型。3.体外建立ADSCs和损伤神经细胞共培养体系,通过相关检测,明确ADSCs对损伤神经细胞的修复作用,以及PLOD2在ADSCs治疗神经损伤中的表达变化。研究方法1.ADSCs的分离培养及鉴定间充质干细胞从健康志愿者脂肪组织培养获得。P3-P5代的细胞用于后续实验。ADSCs经成脂成骨诱导分化后,Oil Red O染色,观察成脂诱导分化情况,Alizarin Red S和Von Kossa染色,观察成骨诱导分化情况。流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达情况。2.神经细胞机械损伤模型制备(mechanical injury,MI)150ng/mLNGF诱导PC12细胞向神经细胞分化,MAP2染色鉴定。取Wistar新生鼠大脑皮质,分离培养原代神经细胞,NeuN染色鉴定。使用10ul枪尖于6孔板内“井”字划割,造成神经元机械性损伤。3.ADSCs共培养对损伤神经细胞的影响ADSCs接种Transwell上室,每孔接种3×105细胞,接种24h后与机械损伤的PC12细胞或大鼠皮质神经元共培养3天,EdU实验检测ADSCs对神经细胞的促增殖情况。微板试剂盒检测细胞培养上清中LDH表达变化,qRT-PCR和western blot检测PLOD2和神经相关分子MAP2、NSE、GAP43和GFAP的表达。研究结果1.ADSCs的分离培养及鉴定镜下观察从脂肪组织中分离出的细胞,呈典型的成纤维样梭形细胞;经成脂和成骨诱导培养基诱导分化后,Oil Red O染色成阳性,表明ADSCs具有成脂分化的能力,Alizarin Red S和Von Kossa染色成阳性,表明ADSCs具有成骨分化的能力;流式细胞仪检测其表面抗原的表达,结果显示ADSCs高表达CD13、CD44、CD73、CD90 和 CD105,低表达 HLA-DR、CD34 和 CD45。2.神经细胞的培养及鉴定PC12细胞经150ng/mL NGF诱导分化5-7天后,有神经突起长出,细胞形态类似于神经细胞,MAP2染色结果阳性。大鼠皮质神经元体外培养6-8天,细胞体较小,从胞体延伸出轴突和树突,轴突细长,NeuN染色结果阳性。3.ADSCs共培养促进损伤神经细胞的修复ADSCs与损伤神经细胞共培养三天,结果显示神经细胞伤口愈合率显着升高;EdU结果显示,ADSCs共培养能促进大鼠皮质神经元的增殖;LDH检测结果显示,ADSCs共培养可以抑制神经细胞LDH的释放;qRT-PCR和western blot结果显示,ADSCs共培养可以促进PLOD2和神经细胞相关分子MAP2、NSE和GAP43的表达,降低GFAP表达。研究结论1.我们成功地从脂肪组织中分离出间充质干细胞。2.ADSCs共培养可以提高损伤神经细胞伤口愈合率,促进大鼠皮质神经元的增殖。ADSCs共培养可以促进损伤神经细胞神经相关分子MAP2、NSE和GAP43的表达,降低GFAP表达。提示ADSCs可能通过提高神经元的存活率,促进神经细胞生长和轴突再生,减少胶质瘢痕的形成而促进损伤神经细胞的恢复。3.神经细胞机械损伤以后,PLOD2表达降低,ADSCs共培养可以促进损伤神经细胞PLOD2的表达。第二部分ADSCs通过调控神经细胞TGF-β1/Smad3/PLOD2信号通路促进损伤神经细胞的修复研究目的1.通过米诺地尔抑制神经细胞PLOD2的表达,检测抑制PLOD2表达对ADSCs神经修复作用的影响。2.ELISA检测共培养体系中TGF-β1的表达情况,同时使用外源性TGF-β1作用于损伤的神经细胞,明确TGF-β1的神经修复作用。3.SB431542 抑制 TGF-β1/Smad 信号通路,LY294002 抑制 PI3K/AKT 信号通路,明确PLOD2具体的信号调控通路。研究方法1.米诺地尔抑制神经细胞PLOD2的表达,检测PLOD2下调对ADSCs神经修复作用的影响不同浓度米诺地尔(0.25mM,0.5mM,1.0mM)作用于PC12细胞,筛选米诺地尔抑制PLOD2表达的最佳作用浓度。在ADSCs与神经细胞共培养体系中加入米诺地尔,免疫细胞化学技术、EdU实验和LDH释放实验检测抑制PLOD2基因表达对ADSCs神经保护作用的影响,qRT-PCR和western blot检测PLOD2以及神经相关分子MAP2、NSE、GAP43和GFAP的表达变化。2.TGF-β1对受损神经细胞的修复作用ELISA检测损伤神经细胞及ADSCs共培养上清中TGF-β1的表达。外源性TGF-β1(浓度分别为 0.31,0.62,1.25,2.5,5.0,10,20 ng/mL)作用于划痕损伤的 PC12 细胞,qRT-PCR 和 western blot 检测 PLOD2、P-AKT、AKT、P-Smad3和Smad2/3的表达变化。3.抑制TGF-β1/Smad、PI3K/AKT信号通路,对PLOD2表达的调控ADSCs与损伤神经细胞共培养体系中加入SB431542,抑制TGF-β1/Smad信号通路。PC12细胞经NGF诱导分化后,加入LY294002抑制PI3K/AKT信号通路。ELISA检测上清中TGF-β1的表达变化,qRT-PCR和western blot检测PLOD2、TGF-β1、P-Smad3、Smad2/3、P-AKT、AKT 和神经相关分子 MAP2、NSE、GAP43、GFAP的表达变化。研究结果1.抑制PLOD2的基因表达,体外实验结果显示ADSCs的神经细胞修复作用减弱根据qRT-PCR及western blot结果,我们最终确定米诺地尔实验浓度为0.5mM。在共培养体系中,MAP2的免疫荧光染色结果显示,抑制PLOD2表达,ADSCs的神经修复作用减弱。EdU结果显示,米诺地尔可以降低ADSCs对大鼠皮质神经元增殖的刺激作用。LDH释放实验表明,米诺地尔可增加共培养体系中LDH含量。qRT-PCR和western blot实验进一步证实,米诺地尔可以抑制神经细胞PLOD2、MAP2、NSE和GAP43的表达,促进GFAP表达。2.TGF-β1在修复神经细胞损伤中的作用ELISA检测结果显示,ADSCs共培养可以提高损伤神经细胞培养上清中TGF-β1含量。qRT-PCR和western blot检测结果显示,外源性TGF-β1作用于划痕损伤的PC12细胞,低浓度TGF-β1(0.31-2.5 ng/mL)促进PLOD2的表达,当TGF-β1浓度达到5 ng/mL时这一作用减弱,当TGF-β1浓度为10和20 ng/mL时则抑制PLOD2表达。Western blot检测结果显示,低浓度TGF-β1抑制P-AKT的表达,促进P-Smad3的表达,而高浓度TGF-β1则相反。3.TGF-β1/Smad信号通路在ADSCs促进损伤神经细胞修复中的作用共培养体系中加入SB431542可以降低共培养上清中TGF-β1的含量,抑制神经细胞TGF-β1、P-Smad3和PLOD2的表达,降低神经相关分子MAP2、NSE、GAP43的表达,提高GFAP表达水平。加入LY294002抑制P-AKT表达后,PLOD2表达下降。上述结果进一步证实了 AKT信号通路可以调控PLOD2的表达,但是当低浓度TGF-β1存在时,PLOD2主要受TGF-β1/Smad信号通路调控。研究结论1.米诺地尔抑制神经细胞PLOD2基因表达后,ADSCs的神经细胞修复作用减弱,提示PLOD2在ADSCs修复神经细胞损伤中发挥重要作用。2.ADSCs共培养可以增加细胞培养上清中TGF-β1的含量,低浓度TGF-β1抑制P-AKT的表达,促进P-Smad3和PLOD2的表达,而高浓度TGF-β1则相反。3.体外实验显示SB431542抑制TGF-β1/Smad信号通路后,降低ADSCs神经修复作用及PLOD2表达。ADSCs通过分泌低剂量TGF-β1,激活Smad3信号通路促进PLOD2表达,发挥神经修复作用。第三部分ADSCs通过激活神经细胞TGF-β1/Smad3/PLOD2信号通路促进脊髓损伤大鼠功能恢复研究目的1.建立脊髓损伤动物模型,体内实验验证ADSCs输注对脊髓损伤动物模型的治疗作用。2.大鼠体内输注SB431542,验证ADSCs通过激活神经细胞TGF-β1/Smad/PLOD2信号通路促进脊髓损伤功能恢复的作用。研究方法1.大鼠脊髓损伤模型制备大鼠腹腔麻醉后,以大鼠T8-T10棘突为中心取后正中切口切开,剥离并咬除棘突、椎板暴露脊髓,血管夹夹击脊髓30s,建立脊髓损伤模型。2.实验分组脊髓损伤模型制备成功3天后,大鼠分别给予PBS、ADSCs和SB431542原位注射。实验具体分为5组:假手术组,PBS对照组,ADSCs治疗组,ADSCs治疗+SB431542 组,SB431542 组。3.ADSCs输注对脊髓损伤的治疗作用在治疗后 3、7、14、21、28 天根据 BBB(Basso,Beattie,and Bresnahan)量化评分标准对所有动物运动功能进行评定。大鼠心脏取血,离心收集血清,ELISA检测血清中TGF-β1的含量。移植后3天随机取各组动物,取出脊髓组织,4%多聚甲醛固定,制作石蜡和冰冻切片,进行HE染色,尼氏染色,免疫组织化学染色检测脊髓组织中MAP2的表达。取出治疗3天后的脊髓组织,提取总RNA和总蛋白。qRT-PCR和western blot检测神经细胞相关分子(MAP2、NSE、GAP43和 GFAP)和 PLOD2、TGF-β1、P-Smad3 和 Smad2/3 的表达变化。研究结果1.ADSCs移植可以促进脊髓损伤大鼠功能恢复ADSCs移植可以促进大鼠运动功能的恢复,减少脊髓病变体积及空泡的形成,增加尼氏小体数量,促进脊髓神经细胞神经相关分子MAP2、NSE和GAP43表达,抑制GFAP表达。2.ADSCs通过激活神经细胞TGF-β1/Smad3/PLOD2信号通路促进脊髓损伤大鼠功能恢复ADSCs移植可以显着提高大鼠血清中TGF-β1的含量,促进脊髓神经细胞PLOD2、TGF-β1、P-Smad3的基因和蛋白表达。抑制剂SB431542输注明显抑制ADSCs对大鼠运动功能的恢复作用,脊髓组织结构损伤加重,神经细胞PLOD2、TGF-β1、P-Smad3 和神经相关分子(MAP2、NSE、GAP43)表达降低,GFAP表达增加,ADSCs的神经修复作用减弱。研究结论1.脊髓损伤动物实验研究结果显示,ADSCs移植可以促进脊髓损伤大鼠运动功能的恢复,同时也能促进神经元的存活,促进损伤结构的恢复。2.体内实验表明,ADSCs的治疗作用会被SB431542抑制。体内实验进一步证实ADSCs通过激活TGF-β1/Smad3信号通路促进神经细胞PLOD2表达,从而促进脊髓损伤的修复。
邹云龙[2](2020)在《人源干细胞联合有序胶原支架移植治疗完全性脊髓损伤的研究》文中研究说明脊髓损伤是一种严重的创伤性疾病,它给全世界的患者及其家属带来了巨大的精神、身体和经济负担。伤后的脊髓组织很难得到修复和重建,其原因主要包括现有的治疗方法不能很好地模拟动物体内脊髓组织生长所需要的微环境和损伤后局部缺乏促进神经修复的营养因子;损伤后的局部微环境中形成了大量胶质瘢痕和神经再生抑制性分子,它们影响了轴突之间的信号传递,阻碍了神经修复;脊髓受损区缺乏支撑和引导神经元再生的生物材料支架,导致宿主或新生的神经元无法有序迁移到病损部位而发挥其修复作用。干细胞联合生物材料支架移植被认为是一种有效的脊髓损伤修复策略。生物材料支架不仅可以作为连接病变区域两端的桥梁,为促进细胞在损伤区内的驻留提供支撑平台。此外,有序结构的材料支架还可以促进细胞迁移、诱导神经元分化以及引导轴突轴向延伸。胶原蛋白是细胞外基质的主要成分,广泛分布于人体,且含量丰富,单个胶原分子呈现出超螺旋的绳状结构,该结构有利于细胞的粘附和生长。此外,由于其低免疫原性、良好的生物相容性和生物可降解性、适宜的孔隙率和机械强度等,胶原已经被证明是目前最适合修复脊髓损伤的天然高分子材料之一。干细胞移植能够补充或替代受损的神经元,并为神经再生营造了良好的环境基础。在众多用于修复脊髓损伤的干细胞中,间充质干细胞,由于其培养方法简单、增殖能力强、抗炎作用以及自分泌或旁分泌作用诱导脊髓损伤区神经元和血管再生、减少细胞凋亡等特点而被广泛地应用于脊髓损伤的基础研究中。其中,脐带组织来源的间充质干细胞具有来源充足、感染风险和免疫原性更低且不受伦理和道德的约束等优点。此外,神经干/祖细胞,因其具有向神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞分化,降低损伤区炎症反应和胶质瘢痕形成,以及改善局部营养微环境等特点,也被广泛地应用于脊髓损伤治疗。现有的用于修复脊髓损伤的人源神经干/祖细胞主要是从胎儿脑和脊髓组织中分离提取的。本论文研究主要由以下两部分组成:第一:人源间充质干细胞或神经干/祖细胞联合胶原支架治疗完全性脊髓损伤目前,人源脐带间充质干细胞和人源神经干/祖细胞均已获得多个国家的研究机构和医院的认可,并已经应用于完全或部分脊髓损伤修复的临床试验中。据Clinicaltrials.gov网站数据的调查结果,目前世界范围内涉及干细胞治疗的临床研究项目共有41个。这些项目中,有32个项目使用间充质干细胞(其中,4个选用脐带组织来源的间充质干细胞),4个项目使用人源神经干/祖细胞。尽管两种细胞都已经广泛应用于脊髓损伤的基础研究和临床试验,但并没有研究人员去对比两种不同类型的干细胞的治疗效果的差异。在此部分研究中,我们将人源脐带间充质干细胞和人源神经干/祖细胞分别接种在有序胶原支架上,随后将种有细胞的支架分别植入到全横断损伤的大鼠体内。体外研究中,我们制备并表征了多孔、有序结构的胶原蛋白生物材料支架;检测了干细胞在支架上的粘附和生长情况;体内实验部分,我们主要比较了两种干细胞治疗下的损伤区内的细胞存活和神经元分化差异、损伤微环境中的炎症反应和胶质瘢痕分布情况等对大鼠的运动功能恢复的影响。实验结果发现,与移植的人源脐带间充质干细胞相比,人源神经干/祖细胞在控制损伤区内胶质瘢痕形成方面起着同样而有效的抑制作用;但神经干/祖细胞移植不仅可以更好地促进Tuj-1和NF阳性的神经元再生,还能明显降低损伤区内CD68阳性免疫细胞的数量,继而更加明显地改善了大鼠的运动功能。第二:胎儿脊髓组织来源的神经干/祖细胞联合有序胶原支架促进完全性脊髓损伤后的功能修复据调查研究,现有的用于修复脊髓损伤的人源神经干/祖细胞主要是从胎儿脑和脊髓组织中分离提取的,然而我们并不清楚哪一种组织来源的神经干/祖细胞更加适合治疗脊髓损伤;神经干/祖细胞与胶原蛋白支架的联合移植疗法会不会起到更好的修复效果。为此,我们又进一步探究了人源神经干/祖细胞的两个亚型(即胎儿脑或脊髓组织来源的神经干/祖细胞)联合有序胶原海绵支架在全横断性脊髓损伤大鼠模型中的治疗效果。希望通过此种方法来重建受损的脊髓组织和改善恶劣的损伤微环境,更重要的是寻找到一种更适合治疗脊髓损伤的干细胞来源。此部分实验借助免疫荧光染色等方法重点观察了移植后损伤区内的细胞存活、神经元和胶质细胞的分化和成熟情况,损伤区内的营养因子分泌情况、炎症反应程度和胶质瘢痕分布情况。随后,我们又通过电生理检测、斜面实验和相关的运动功能评分对伤后大鼠的运动功能改善情况进行了评估。研究发现,与胎儿脑源神经干/祖细胞联合支架移植组相比,胎儿脊髓源神经干/祖细胞联合支架移植可以通过更有效地促进细胞的长期存活和神经元分化,减少炎症反应和胶质瘢痕形成来改善脊髓损伤微环境,继而加速了大鼠的运动功能恢复。综上所述,尽管人源脐带间充质干细胞与人源神经干/祖细胞移植在抑制胶质瘢痕形成方面起着同样而有效的作用,但在促进损伤区内的细胞长期存活和神经元分化,抑制炎症反应方面,人源神经干/祖细胞(特别是胎儿脊髓组织来源的神经干/祖细胞)的效果更为显着。所以,胎儿脊髓组织来源的神经干/祖细胞可能是修复脊髓损伤的更好选择,并且具有更大的临床应用潜力;此外,胎儿脊髓组织来源的神经干/祖细胞与有序胶原支架的联合疗法在完全性脊髓损伤大鼠体内构建了一个低炎症反应低和胶质瘢痕形成的微环境,促进了损伤区内神经干细胞的分化和成熟,从而改善了大鼠的运动功能。这一结果具有潜在的临床应用前景,为未来基于干细胞的脊髓损伤研究提供有利的科研基础和技术支持,同时也为脊髓损伤再生修复从基础研究向临床转化应用提供了一定的指导意义。
韩卫[3](2020)在《Fidgetin Like 2-siRNA调控视神经损伤后神经节细胞存活和轴突再生研究》文中研究表明研究背景视觉信息占人类获取外界信息总量的85%,良好的视觉对人类的工作、生活至关重要。视神经是由视网膜神经节细胞(Retinal ganglion cell,RGC)的轴突汇聚而成。创伤造成的轴突损伤和RGC凋亡是视力不可逆丧失的常见原因。与中枢神经系统(Central Nervous System,CNS)的其他细胞类似,RGC轴突的再生能力极差。这主要归因于:轴突内在的再生能力较差;损伤造成胶质瘢痕对轴突再生的阻遏作用。科学研究证实,细胞微管骨架剪切酶Fidgetin Like 2(FL2)能够影响中枢神经元轴突的再生,抑制FL2的活性可以明显促进脊髓背侧神经元轴突的再生,甚至可以跨越胶质瘢痕。作为细胞骨架的重要成分,微管对哺乳动物细胞的形态、运动、复制、迁徙具有重要功能。对中枢神经元来说,适度的微管稳定能够促进轴突的再生和抑制细胞凋亡。RGC与脊髓背侧的神经元类似,均属于中枢神经元细胞,而近期的诸多证明显示FL2在RGC的胞浆内广泛表达,因此抑制RGC中FL2的表达是否可以促进RGC细胞轴突的再生,进而使机体在视神经损伤后视觉得到有效恢复,值得进一步探讨。在以上研究的基础上,本论文从体内及体外两个方面进行研究,分析FL2-siRNA对RGC存活及轴突再生的影响,以期给予临床一定启发。第一部分:Fidgetin Like 2-siRNA调控视网膜神经节细胞存活和轴突再生体外研究目的:视神经损伤后出现的视神经纤维丢失及视网膜神经节细胞(RGCs)的进行性凋亡,引起视功能不可逆的下降。本研究通过对体外培养的RGC-5细胞系进行靶向基因沉默,探讨Fidgetin Like 2-siRNA对RGC-5细胞存活及轴突再生的影响。材料与方法:采用RGC-5细胞株,进行体外培养,选取第三代细胞作为研究对象,在高糖DMEM培养基中培养24h后,将其分成以下三组:Control组(细胞不做任何处理)、U-FIGN组(Fidgetin Like2的过表达质粒转染RGC-5细胞)、D-FIGN组(Fidgetin Like 2-siRNA沉默FL2在RGC-5细胞中的表达)。具体检测项目如下:RT-PCR检测各组FL2 mRNA的浓度;免疫组织化学染色观察各组细胞内FL2蛋白、IL-6及IL-1β的表达;免疫荧光观察各组细胞内FL2、GFAP、GAP-43及突触素(Synaptophysin,SYN)的表达;线粒体膜电位测定各组细胞线粒体膜电位;ATP合成能力检测;TUNEL检测各组细胞凋亡;CCK-8检测各组细胞增殖;透射电镜检测各组细胞器变化;划痕实验及Transwell实验检测各组细胞迁移能力;Western-blot检测各组细胞FL2、GFAP、GAP-43及突触素SYN表达。结果:RT-PCR检测:各组之间FL2 mRNA的蛋白表达趋势为D-FIGN<Control<U-FIGN。免疫组织化学染色:FL2蛋白、IL-6及IL-1β的表达趋势为D-FIGN组<Control组<U-FIGN 组。免疫荧光检测:FL2蛋白与GFAP各组表达趋势为D-FIGN组<Control组<U-FIGN组;GAP-43及SYN的表达趋势为U-FIGN组<Control组<D-FIGN组。线粒体膜电位分析:FL2低表达细胞的线粒体膜电位呈现出红色荧光,随着FL2含量增加,细胞红色荧光逐步向绿色荧光转变,线粒体能量逐步从高能量状态向低能量状态转变;ATP合成能力:各组之间数据趋势为U-FIGN组<Control组<D-FIGN组。FL2的过表达可以降低线粒体ATP合成能力,发生细胞内能量供应不足现象,导致细胞死亡。细胞凋亡及增殖:结果提示各组细胞的早期凋亡趋势为D-FIGN(0.81%±0.52)<Control(1.67%±0.71)<U-FIGN(2.12%±0.95)。细胞增殖趋势为 U-FIGN组<Control 组<D-FIGN 组。透射电镜:对照组及D-FIGN组细胞器形态较为正常,线粒体及高尔基体整体形态正常,周围溶酶体及脂质沉淀的分布较少,而在FL2过表达后,细胞内部明显充斥溶酶体及脂质沉淀,细胞炎性效应明显,同时线粒体肿大,提示中毒现象发生。细胞迁移:划痕实验、Transwell试验各组表达趋势为U-FIGN组<Control组<D-FIGN 组。WB结果:FL2及GFAP各组表达趋势为D-FIGN组<Control组<U-FIGN组。GAP-43及SYN各组表达趋势为U-FIGN组<Control组<D-FIGN组。结论:(1)实验过程中,FL2成功在RGC-5细胞内过表达或沉默;FL2具有一定致炎效应,它的过表达会导致RGC-5细胞炎性侵润程度加重,加剧RGC-5细胞的死亡。(2)FL2的过表达可以降低RGC-5细胞内线粒体ATP合成能力及膜电位变化,进而发生细胞内能量供应不足的现象,线粒体氧化还原状态失常、呼吸链解偶联,细胞无法得到足够的能量供给,发生凋亡或坏死。FL2沉默后线粒体功能有所改善,对RGC-5细胞具有保护作用。(3)在RGC-5细胞内,FL2过表达可以促进GFAP蛋白表达,激活星形胶质细胞,使得视神经损伤加剧,FL2沉默后,神经生长因子蛋白GAP-43表达增多,有利于细胞的存活及轴突再生过程。第二部分:Fidgetin Like 2-siRNA调控视神经损伤后神经节细胞存活和轴突再生体内研究目的:视神经损伤可导致视网膜神经节细胞(RGCs)的缺失、凋亡,引起不同程度的视力障碍。本研究通过钳夹视神经建立小鼠视神经损伤模型并加以干预,观察FL2-siRNA对视神经组织及RGC细胞损伤后的保护作用。材料与方法:本实验选取YFP小鼠45只作为研究对象,行双眼视神经钳夹伤手术,以建立视神经损伤模型。将小鼠分成三组:I-FIGN组(玻璃体腔内注射FL2-siRNA,1×10-3g/L,5μL)、P-FIGN(玻璃体腔内注射FL2的过表达质粒,1×10-3g/L,5μL)、Control组(玻璃体腔内注射生理盐水,5μL);具体观察项目如下:HE染色观察各组小鼠视网膜组织形态;RGC细胞存活率检测;免疫荧光检测分析各组小鼠视网膜组织内FL2、GFAP、GAP-43及SYN蛋白表达;视交叉及对侧神经元轴突退行性改变观察;甲苯胺蓝染色观察视神经的退行性改变情况;Western-blot检测分析FL2、GFAP、GAP-43及SYN蛋白表达。结果:HE染色:Control组细胞炎性反应严重,细胞间的层次清晰性差,整体结构逐渐混乱,细胞间连接性差;在注射FL2-siRNA后,细胞的层次逐渐加强,轮廓明显,整体结构比较规则;而P-FIGN组,细胞明显凌乱,较Control组而言,细胞间连接较差。细胞存活率:各组细胞的存活率为P-FIGN<Control组<Ⅰ-FIGN组;免疫荧光检测:FL2及GFAP各组表达趋势Ⅰ-FIGN组<Control组<P-FIGN组;GAP-43 及 SYN 的表达趋势为 P-FIGN<Control 组<Ⅰ-FIGN 组。神经元退行性改变:对照组小鼠视神经轴突部分呈念珠状,视神经纤维周围出现浑浊。当FL2表达浓度降低后,视神经轴突的念珠状有所减轻,炎症反应减轻;FL2过表达后,其神经轴突的念珠状继续延伸,逐步恶化,神经轴突向碎片状转变,视神经的退行性病变较为严重。甲苯胺蓝染色:对照组小鼠细胞的轴突为深蓝色,髓鞘多为圆形和椭圆形,细胞大小适中同时分布较为均匀,FL2低表达后,其排列更加规则;而在FL2过表达后,神经节细胞的轴突出现肿胀变形并聚集成团,神经纤维的排列亦较为混乱。WB结果:FL2及GFAP各组表达趋势为Ⅰ-FIGN组<Control组<P-FIGN组;GAP-43及SYN各组表达趋势为P-FIGN<Control组<Ⅰ-FIGN组。结论:(1)小鼠视神经夹伤模型制备成功,FL2成功在RGC细胞内过表达或抑制表达,FL2会促进小鼠视网膜组织炎性反应,激活星形胶质细胞,损伤视神经、降低神经生长因子蛋白表达含量,抑制RGC细胞的存活以及轴突的发育过程。(2)FL2可降低RGC细胞的存活率,加速视神经节细胞的死亡,同时对视神经轴突的退行性改变具有促进作用,导致轴突团簇肿胀,呈现念珠状甚至是碎片状。FL2沉默后,RGC细胞的存活率升高,神经节细胞的形态更加规则,轴突的发育状况好转,与体外研究结论一致。FL2-siRNA可作为治疗视神经损伤药物的新方向,值得临床参考。
龚佳幸[4](2020)在《基于DLP打印技术的组织工程牙髓重建及其生物学性能评估》文中提出研究背景牙髓发育自外胚间叶,内含有神经、血管、牙髓干细胞、成牙本质细胞等成分,主要起到感觉、营养、形成牙本质、防御及修复的作用。由于牙髓外周无让性的坚硬牙本质的存在,复合根尖孔较小、无有效侧枝循环等因素的协同作用,牙髓一旦发生炎症、受其他刺激和损伤后均较难恢复。目前,根管治疗术是临床上针对不可逆性牙髓病变或根尖周病变最为常规的治疗方式,然而失去了牙髓的牙体硬组织有脆性增加、容易染色等问题,活髓切断术、根尖诱导成形术、牙髓血运重建等手段都无法完美解决该问题,寻找一种新的治疗方式刻不容缓。研究目的本课题旨在采用组织工程方法原位构建功能化牙髓,为临床上牙髓病变与根尖周病变提供新的治疗策略。研究方法与研究结果hDPSC可通过酶消化法从人牙髓中获得,该细胞具有较强的增殖能力,高表达间充质干细胞标志物CD105、CD73与CD90,几乎不表达内皮标志物CD144,因此,该细胞是一种扩增能力较强、干性程度较高的间充质干细胞。在体外培养时,hDPSC可以向成骨、成脂、成软骨、成神经、成血管方向分化。核磁共振谱显示我们成功合成了Gel MA,明胶上的部分氨基被MA取代后,仍然保留优良的生物相容性,同时机械性能提高,并具备光固化能力。冻干的Gel MA表现为典型的多孔支架结构。随后,我们采用基于DLP的3D打印技术进行逐层打印,构建了载hDPSC的Gel MA微球,直径为400μm,外形圆润饱满,包裹hDPSC,细胞在基础培养基中可增殖、铺展,即Gel MA水凝胶具有较好的生物相容性。此外,Gel MA可在机体内缓慢降解。通过对比Microsphere搭载的hDPSC、2D-Gel MA表面与2D-PS基板表面的hDPSC的生物学行为,包括细胞活性、铺展情况、增殖情况、干性维持能力与各向分化能力,我们了解到:hDPSC在三维与二维环境内都可以发生明显增殖,其中在2D硬质基板上增殖最为迅速。三维培养的hDPSC铺展速度较慢,体型较2D-PS组小,但具有更强的干性维持能力。此外,hDPSC在软基质表面的干性维持能力较硬质2D-PS基板表面的干性维持能力强。三维培养的hDPSC相比于二维培养的(Gel MA基底或PS基底)更具备向成神经、成血管方向分化的能力;在成牙本质向分化潜能方面,各组没有显着差异。此外,Gel MA降解未引起明显的炎症。随后,我们进行了原位或异位的动物实验,用于构建组织工程牙髓。首先,我们成功制备了暴露牙本质小管的部分脱矿牙本质片段,用作外周支架以构建牙髓牙本质复合体。将载hDPSC微球(Microsphere组)、hDPSC聚合体(Cell aggregation组)和hDPSC悬液(Cell division组)植入至根管4周或8周后,可形成粉红质软的组织工程牙髓。组织工程牙髓内的仍有大量细胞处于增殖阶段,Microsphere组和Cell aggregation组形成的组织工程牙髓内有微血管形成,且可检测到神经信号与成牙本质标志物的信号,其中Microsphere组的成神经及成牙本质能力相对更高,特异性标志物的表达水平与人正常牙髓较为一致,增殖、干性、炎症相关指标也有一定程度相似。大动物(小型猪)原位牙髓再生实验结果表明Microsphere、Cell aggregation均可在在根管中形成组织工程牙髓。根尖孔处均形成了致密组织团块,中部可见高度血管化的新生牙髓,并有少量均匀排列在周围的成牙本质样细胞形成;相比于Cell aggregation组,Microsphere组在牙髓腔上段形成的组织更接近正常牙髓结构,Cell division组未形成完整的组织工程牙髓,形成的组织主要在根管下1/3处,考虑为细胞悬液沉降后发生部分流失。我们进一步研究了载hDPSC Microsphere的神经向分化能力,通过脊髓损伤模型在组织学与功能学层面的修复情况证明该载细胞微球可修复神经,提示组织工程牙髓亦可能具备神经向分化的能力。结论本研究采用基于DLP的3D打印技术构建了载DPSC的Gel MA水凝胶微球,通过注射治疗获得再生牙髓。本文研究结论主要如下:1)hDPSC可通过酶消化法从人牙髓中获得,该细胞是一种扩增能力较强、干性程度较高的间充质干细胞。2)采用DLP打印技术构建的载hDPSC Gel MA微球可为细胞生长提供软质三维环境,有利于hDPSC维持干性并保留多方向分化的能力。3)位于微球上的hDPSC在体内具备维持干性与增殖的能力、形成血管与神经的能力及形成牙本质细胞的能力,可用于构建组织工程牙髓,有望在未来作为牙髓病变及根尖周病变的组织工程疗法应用于临床。
钱运[5](2019)在《石墨烯导管促进周围神经长段缺损再生研究》文中研究表明目的周围神经缺损伤广泛发生于严重外伤后,常引起支配区域的感觉和运动功能障碍,极大影响患者生活质量,且疗效不佳。神经导管的应用逐渐成为替代方案。为了最大限度地模拟体内生长环境,理想的神经导管应具备机械引导、电流传导和刺激血管再生的功能。然而大部分神经导管只能起到机械性通道的作用,因此神经修复情况仍不满意。本课题将制备氧化石墨烯纳米粒/聚己内酯导电神经导管,并探究其在促进周围神经长段缺损再生中的作用,同时探讨潜在修复机制。方法采用一体成型工艺制备氧化石墨烯/聚己内酯神经导管,通过扫描电镜和透射电镜分别观察导管表面结构和氧化石墨烯纳米颗粒结构;此外,检测氧化石墨烯与聚己内酯间作用力、神经导管弹性模量、断裂伸长率及导电能力。分别制备氧化石墨烯/聚己内酯支架和聚己内酯支架,体外实验培养施旺细胞,观察施旺细胞在不同支架上的形态结构,通过活死细胞染色、CCK法、免疫荧光染色、Western Blot、q-PCR法检测细胞毒性、增殖、黏附水平及神经标记物表达。建立15mm大鼠坐骨神经缺损模型,在术后6周、12周和18周评估功能学、电生理学、组织形态学水平,同时检测损伤区域微血管化程度,并测定血管形成相关信号通路表达。结果氧化石墨烯/聚己内酯导管为多层多孔结构,呈现出良好的机械性能和导电性能,同时明显促进施旺细胞活性。体内实验显示,氧化石墨烯/聚己内酯导管组的轴突和髓鞘再生水平与自体神经移植疗效接近,明显优于聚己内酯导管对照组。此外,氧化石墨烯/聚己内酯导管还能促进微血管形成,而AKT-eNOS-VEGF信号通路可能在此过程中起重要作用。结论氧化石墨烯/聚己内酯神经导管具有良好机械强度、导电性和生物相容性,能显着促进长段周围神经缺损再生并改善血管微环境,在神经组织工程领域有巨大潜力。
马纯灿[6](2018)在《探讨小儿外伤性脾切除移植脾组织的手术方法及疗效分析》文中进行了进一步梳理[目的]脾切除自体脾网膜移植术是一种有效保存脾脏功能的方法,目前主要应用于脾外伤,手术的操作及围手术期病人的管理关系到移植脾组织的存活状况和功能恢复的效果,为了评价了小儿外伤脾切除网膜移植术后移植脾组织存活状况与效果,对小儿外伤后脾破裂自体脾网膜移植术后进行了相关的研究,希望此研究能够对自体脾组织移植术手术的要领、注意事项以及手术的必要性提供参考价值。[方法]本院在2010年8月至2018年2月期间收治到的小儿外伤后脾破裂病人,本文选择了47例脾切除自体网膜移植手术病人组;16例脾破裂保守治疗病人组;11例脾破裂单纯脾切除病人组;32例正常病人组,将施行脾切除自体脾组织移植术的患者设为观察组,其他3组患者设为对照组。对脾切除自体网膜移植手术病人组复查移植脾组织B超;所有患儿复查血常规、免疫功能,将分组的数据结果利用SPSS 22.0进行统计学处理,评价小儿外伤脾切除网膜移植术后移植脾组织存活状况与效果。[结果]复查B超检查提示:腹腔原手术区网膜上可见数目不等低回声结节,形态规则,边界欠清,内回声尚均质,CDFI:结节区检出低速静脉血流信号、回流汇入网膜静脉。经过统计学分析,血小板、C4、lgA、lgM、lgG这5个指标有区别(P<0.05)。对此5个有差异的指标做进一步的两两比较(SNK法),结果显示:血小板;正常组和脾移植组2组与保守组、脾切除彼此间有差异(P<0.05)。C4;脾切除与其他3组有差异(P<0.05)。lgA;脾切除组和正常组2组与脾移植组和保守组2组有差异(P<0.05)。lgM;脾切除组与保守治疗组有差异(P<0.05)。lgG;脾切除组与脾移植组、保守治疗组、正常组有差异(P<0.05)。[结论]1.小儿外伤后脾破裂自体脾网膜移植术移植脾组织不同程度存活。2.血小板、C4、lgA、lgM、lgG有统计学意义,说明小儿外伤后脾破裂自体脾网膜移植术是有效果的,对患儿血小板、免疫功能的恢复有临床意义。3.脾破裂自体脾网膜移植手术是有效果的。
张晓雯[7](2017)在《rhEPO对大鼠不同程度视神经损伤修复的实验研究》文中研究表明目的:建立不同程度视神经损伤动物模型,观察其损伤后电生理的变化、组织形态学的改变和自然转归,采用局部玻璃体腔注射重组人促红细胞生成素(recombinant human erythropoietin,rhEPO),观察其对中重度钳夹伤后视神经的修复作用。并检测半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、神经生长相关蛋白-43(growth associated protein43,GAP-43)、髓磷脂碱性蛋白(myelin basic protein,Mbp)的表达,探讨rhEPO对视神经损伤的修复机制。方法:(1)100只健康级成年Wistar大鼠随机分为四组,空白对照组、轻度损伤组、中度损伤组、重度损伤组,每组25只大鼠。以显微血管夹于球后1-2mm处垂直钳夹视神经,时间分别为2s、15s、30s,制作轻、中、重度视神经损伤模型,空白对照组只暴露不钳夹视神经。如果大鼠伤眼瞳孔散大,直接对光反射消失,间接对光反射存在,视网膜血管无出血或梗塞,伤后5min内血流完全恢复可纳入实验。1h后行闪光视觉诱发电位(flash visual evoked potential,FVEP)检查,损伤眼波形下降或消失,对照眼波形正常视为造模成功。分别于损伤后1d、4d、7d、14d、28d行FVEP检查后处死大鼠,取实验眼及正常的视神经及视网膜做病理切片,进行HE染色,光镜下观察形态学的改变,并分析不同损伤组的FVEP的变化。(2)80只健康级成年wistar大鼠,随机分为4组,中度损伤对照组、重度损伤对照组、中度损伤治疗组、重度损伤治疗组,每组20只大鼠,成功建立视神经损伤模型后,治疗组给予玻璃体腔注射rhEPO 6ul(60IU),而损伤对照组给予生理盐水6ul。各组分别于4d、7d、14d、28d行FVEP检查后处死大鼠,取实验眼及正常眼的视神经做病理切片,进行HE染色。(3)取中度损伤对照组、重度损伤对照组、中度损伤治疗组、重度损伤治疗组的视神经及正常视神经的病理切片,进行免疫组化染色,观察视神经Caspase-3、GAP-43、Mbp的表达,并做半定量分析及组间的比较。结果:(1)FVEP:对照组与正常大鼠FVEP的潜伏期及波幅相比较,各时间点P﹥0.05,无统计学意义。与对照组相比,各组损伤后1h,P2波潜伏期明显延长,波幅明显降低,差别有统计学意义(P<0.05)。除轻度和中度损伤组损伤后1小时潜伏期无差异外,在损伤后1h和1d各不同程度损伤组组间的潜伏期及波幅均有明显差异(P<0.05),随损伤程度的加重,潜伏期延长,波幅降低。轻度损伤组于损伤后第1天基本恢复正常;中度损伤组在14天内随时间增加潜伏期继续延长,波幅继续降低,于14天后趋于稳定。重度损伤组于第4天波形熄灭。视神经HE染色:在纵切面上,正常与对照组视神经纤维平行排列,密集规则,染色均匀,散在少量神经胶质细胞。轻度损伤组损伤后第1天视神经纤维排列规则,染色均匀,轻度水肿,胶质细胞胞浆均质,形态大小均一。4天,仍有轻度的水肿,较第1天改变不明显。第7天较第1天及第4天明显减轻,第14、28天形态基本正常。中度损伤组损伤后第1天视神经纤维水肿,散在空泡样变性,可见炎性细胞浸润。第4天神经纤维排列紊乱,结构疏松,空泡样变性扩大,第7天可见炎性细胞浸润增多,14天至28天可见坏死灶,少部分纤维断裂不连续,细胞核碎裂甚至细胞溶解、消失,并可见胶质细胞增生。重度损伤组损伤后第1天即出现纤维排列紊乱,纤维束不连续,部分纤维断裂坏死,大量炎性细胞浸润,随病程进展逐渐加重,并出现坏死灶,部分神经纤维束结构消失,28天基本无正常结构。视网膜HE染色:正常与对照组大鼠视网膜结构清晰,视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)单层排列、大小不一、较整齐,呈圆形或椭圆形,细胞密集、胞核清晰、较大,染色较浓。轻度损伤组损伤后1天及4天,视网膜轻度水肿,改变轻微,各层清晰,RGCs排列整齐,7天、14天、28天与对照组视网膜几乎无差异。中度损伤组损伤后1天即出现视网膜水肿增厚,RGCs排列不规则,细胞染色不均,随病程进展逐渐加重,细胞核碎裂固缩,至28天时RGCs明显减少,内外核细胞数量明显减少。重度损伤组较中度损伤病变更明显,至损伤后28天时视网膜明显萎缩变薄,失去正常结构。(2)FVEP:中度损伤对照组与中度损伤组相比,P2波潜伏期和波幅在4天、7天、14天、28天无明显差别,差异无统计学意义(P>0.05)。中度损伤治疗组FVEP的P2波潜伏期在4天、7天、14天、28天均较中度损伤对照组缩短,波幅升高,差异有统计学意义(P﹤0.05)。重度损伤治疗组与重度损伤对照组、重度损伤对照组与重度损伤组之间均无变化,4天、7天、14天、28天均引不出波形。视神经HE染色:中度损伤对照组与中度损伤组无明显差别。中度损伤治疗组的视神经与中度损伤对照组相比,治疗组4天及7天仍然有神经纤维的水肿,炎性细胞的浸润,但14天和28天,坏死灶及神经纤维断裂减少。重度损伤对照组与重度损伤组无明显差别。重度损伤治疗组与重度损伤对照组相比,治疗组4天、7天、14天、28天均无无明显变化。(3)Caspase-3在损伤视神经的表达:Caspase-3在正常视神经无明显表达,中度和重度损伤对照组视神经在第4天表达增强,第7天达高峰,之后逐渐回落,至14天、28天仍高于正常水平。Caspase-3在重度损伤对照组各时间点表达明显高于中度损伤对照组,差异有统计学意义(P﹤0.05)。GAP-43在损伤视神经的表达:GAP-43在正常视神经几乎无表达,中度和重度损伤对照组的视神经第4天表达明显,在第7天达高峰,之后逐渐回落,至28天仍高于正常水平。中重度损伤对照组各时间点视神经GAP-43阳性细胞数未见明显差异(P>0.05)。Mbp在损伤视神经的表达:Mbp在正常视神经高度表达,中度损伤对照组在第4天无明显减少,第7天Mbp开始表达减少,14天更少,之后趋于平稳;重度损伤对照组第4天至14天,Mbp表达逐渐减少,之后趋于平稳。各时间点重度损伤对照组的Mbp明显少于中度损伤对照组,差异有统计学意义(P﹤0.05)。(4)rhEPO对损伤视神经Caspase-3表达的影响:中度、重度损伤治疗组的视神经与中度、重度损伤对照组相比,在4天、7天、14天、28天Caspase-3的表达明显降低,半定量分析阳性细胞数明显减少,差异有统计学意义(P﹤0.05)。rhEPO对损伤视神经GAP-43表达的影响:中度损伤治疗组的视神经与中度损伤对照组相比,在4天、7天、14天、28天GAP-43的表达明显升高,半定量分析阳性细胞数明显升高,差异有统计学意义(P﹤0.05)。重度损伤治疗组的视神经与重度损伤对照组相比,在4天、7天、14天、28天GAP-43的表达无明显变化,半定量分析阳性细胞数与损伤对照组无差异(P>0.05)。rhEPO对损伤视神经Mbp表达的影响:中度损伤治疗组的视神经与中度损伤对照组相比,在4天时表达无明显变化,半定量分析阳性细胞数无明显差异(P>0.05)。7天、14天、28天Mbp的表达明显升高,半定量分析阳性细胞数明显增多,差异有统计学意义(P﹤0.05)。重度损伤治疗组的视神经与重度损伤对照组相比,4天、7天、14天、28天Mbp的表达无明显变化,半定量分析阳性细胞数无明显差异(P>0.05)。结论:(1)轻度视神经损伤可自行修复,中度以上损伤如不及时干预可能会发展为不可逆病变。(2)凋亡蛋白酶Caspase-3的表达水平与损伤程度密切相关,损伤程度越重其表达越高;视神经损伤后神经生长相关蛋白GAP-43表达升高来促进机体的自我修复,但不能随着损伤强度的增加无限制的表达升高;Mbp的表达水平与损伤程度密切相关,损伤程度越重其表达越少,在一定程度上反应病情的轻重及预后。(3)rhEPO对中度损伤视神经的修复有促进作用,能改善其视功能,可能的机制是抑制Caspase-3的表达并提高GAP-43、Mbp的表达,促进轴突和髓鞘的再生。(4)rhEPO对重度损伤的视神经修复作用不明显。
崔昌萌[8](2017)在《骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脑出血及调控自噬流和轴突再生的机制研究》文中研究指明脑出血(intracerebral hematoma,ICH)作为神经外科最常见的疾病之一,是现代社会严重威胁人类健康的杀手。虽然神经外科血肿清除手术可以作为挽救ICH患者生命的一项主要的治疗措施,但是患者术后仍然会保留严重的神经功能障碍,让其最终难以回归社会。ICH后受损脑组织内皮质脊髓束的修复和重塑是促进患者肢体运动障碍恢复的解剖病理学基础,而轴突的断裂和损伤会直接影响皮质脊髓束的功能。虽然受损死亡后的神经元几乎不能再生,但是神经元轴突却可以表现出一定的再生能力。骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)是从骨髓中分离出的一种中胚层来源的多潜能干细胞,其具备体外扩增的能力,不仅能够分化成为中胚层起源的脂肪、骨和软骨等组织,而且亦可以分化为内外胚层来源的血管内皮及神经等组织。BMSCs具有较好的增殖能力,易于分离培养,自体移植无免疫源性,不受伦理学限制,越来越多的被应用于急性脑损伤相关疾病治疗相关的实验中。目前体外模型和动物实验中已有BMSCs移植能够促进轴突再生的报道。自噬是指通过对蛋白质聚集体及受损细胞器的降解以维持内环境稳定细胞代谢过程,目前已证实了ICH能够导致自噬的激活。近期有研究发现皮质神经元自噬水平的增强促进了轴突的再生,减少了轴缩球的形成。在全面检索文献和前期工作基础上,我们推测BMSCs移植能够有效改善ICH大鼠的神经功能障碍,促进轴突再生,机制可能与PI3K-Akt-m TOR通路介导的自噬流增强有关。为证明此假说,本课题将分以下三部分进行详细阐述。第一部分骨髓间充质干细胞移植对脑出血大鼠的神经保护作用目的:证实大鼠ICH后BMSCs移植能够发挥神经保护作用,改善神经功能障碍。方法:将98只成年雌性SD大鼠随机分为三组:1)假手术组(Sham group);2)脑出血组(ICH group);3)脑出血+BMSCs移植组(BMSCs group)。分离和培养3周龄雄性SD大鼠BMSCs至第三代,流式细胞仪对BMSCs表面标记物进行鉴定。采用注血法复制SD雌性大鼠ICH模型,将2μL浓度为1×108/m L的BMSCs悬液于造模后1小时经脑室注入,检测如下指标:1)HE染色观察术后3天不同组别受损脑组织的病理变化和细胞存活状态;2)免疫荧光检测造模手术前及术后12小时-7天Sry阳性细胞在血肿周围受损脑组织内的分布;3)TUNEL染色显示术后1-7天不同组别受损脑组织细胞凋亡;4)脑组织含水量测定显示1-7天受损脑组织水肿情况;5)于造模手术前及术后12小时-7天进行前置放置实验、转角实验和NSS评分,检测大鼠神经功能障碍的变化。应用Image Lab5.1及Image J等分析系统对实验结果进行测定分析。实验结果写成均数±标准差的形式,用统计软件SPSS 17.0分析,P<0.05则差异具有统计意义。结果:1 BMSCs形态学观察:接种后一天,原代BMSCs慢慢贴壁。BMSCs核居中,胞体较小,形状为均和的圆形或者梭形,折光性比较强,增殖方式为散在的克隆增殖。待生长抑制期度过后,细胞平行排列呈现快速的漩涡状聚集生长。之后细胞形态随着传代变的更加均匀,形状多为梭形;2流式细胞仪对BMSCs表面标记物的鉴定结果:我们将第三代BMSCs进行表面标记物的鉴定,流式细胞仪结果显示BMSCs的CD106阳性表达率为74.56%,CD29阳性表达率为76.11%,CD106和CD29呈阳性表达。CD54阳性表达率为5.05%,CD45阳性表达率为3.88%,CD54和CD45呈阴性表达;3大鼠ICH模型的制备情况:大体观察ICH大鼠脑组织可见造模手术的注射点,位于尾状核正上方。选择注射点所在平面横切大鼠脑组织,能够观察到血肿位于基底节区,周围有局部脑组织损伤,脑室内出血及蛛网膜下腔出血亦可见。HE染色显示Sham组大鼠脑组织具有正常的组织形态,细胞间隙正常,神经细胞呈现有序的排列,胞核形状均匀规则。ICH组细胞间隙增加,血肿周边受损脑组织可见明显水肿,神经细胞胞体皱缩,胞浆嗜酸性减弱,细胞核固缩。BMSCs组受损脑组织形态改变基本如同ICH组,但周边组织水肿较轻,变性、坏死的神经细胞明显较少;4 BMSCs在血肿周围受损脑组织内的分布:BMSCs移植前,免疫荧光结果显示无雄鼠来源的Sry阳性细胞。12小时,Sry蛋白在BMSCs胞核中呈颗粒状表达。之后阳性细胞数呈逐渐增多的趋势,于移植后3天达到峰值。直至14天时血肿周围受损脑组织内仍可见Sry阳性细胞;5 TUNEL染色检测结果:Sham组间或可见TUNEL阳性细胞的表达,零星分布,着色浅淡。ICH组1-7天TUNEL阳性细胞簇状出现,其阳性细胞积分光密度值高于Sham组,差异显着(P<0.05)。BMSCs组TUNEL阳性细胞表达趋势与ICH组类似,但积分光密度值与ICH组相比显着降低(P<0.05)。6脑组织含水量测定:Sham组脑组织含水量无明显变化。ICH组与Sham组相比,在造模术后1,3和7天的脑组织含水量均显着升高(P<0.05)。BMSCs组大鼠1,3和7天的脑组织含水量均低于ICH组,差异显着(P<0.05)。7 ICH后神经功能障碍的评估:ICH导致了大鼠严重的神经功能障碍。BMSCs组大鼠在术后第3,7和14天的前肢放置率、转角率均显着高于ICH组(P<0.05),而NSS评分则显着低于ICH组(P<0.05)。小结:BMSCs的原代培养、传代和鉴定;采用注血法成功建立了大鼠ICH模型;大鼠ICH后血肿周围脑组织受损,导致ICH大鼠神经功能障碍;给予BMSCs移植治疗后,可以发挥一定神经保护作用,减轻血肿周围脑组织受损程度,改善脑水肿和ICH大鼠神经功能障碍情况。第二部分骨髓间充质干细胞移植通过PI3K-Akt-m TOR通路对脑出血大鼠自噬和轴突再生的影响目的:通过PI3K-Akt-m TOR通路抑制剂LY294002的干预,探讨大鼠ICH后BMSCs移植能否通过PI3K-Akt-m TOR通路影响受损脑组织内的自噬和轴突再生。方法:102只雌性SD大鼠被随机分为四组:1)假手术组(Sham group);2)脑出血组(ICH group);3)脑出血+BMSCs移植组(BMSCs group);4)脑出血+BMSCs移植+LY294002干预组(LY294002 group)。动物模型制作及BMSCs移植同第一部分,取术后12小时、1天、3天、7天、14天5个时间对下列指标进行检测:1)透射电镜观察大鼠ICH后受损脑组织超微结构,检测自噬体;2)Western-blot检测ICH后受损脑组织轴突再生相关蛋白GAP-43和SCG10,自噬相关蛋白LC3和p62,通路蛋白p-Akt的表达;3)免疫组化检测受损脑组织内GAP-43的表达及定位;4)免疫荧光观察受损脑组织内p-Akt和m TOR的共聚焦结果。实验结果的测定记录及统计分析同第一部分。结果:1透射电镜结果:ICH造模术后3天,在皱缩的神经细胞的胞核四周可以观察到许多肿胀及变形的线粒体,此时亦有受损的线粒体及其他细胞结构被双层膜样结构所环绕,它们进入溶酶体中并与之融合,最终形成了自噬溶酶体;2 p-Akt的免疫印迹分析结果:Sham组p-Akt蛋白低表达。ICH组大鼠受损脑组织内p-Akt在造模手术后12小时升高,至3天达到峰值,之后逐渐降低,在各时间点p-Akt与Akt的比值都高于Sham组(P<0.05)。BMSCs组p-Akt变化趋势与ICH组类似,但各时间点p-Akt与Akt的比值进一步升高(P<0.05)。而LY294002组与BMSCs组相比p-Akt与Akt的比值降低,差异显着(P<0.05);3 p-Akt(红色荧光)和m TOR(绿色荧光)的免疫荧光共聚焦结果:Sham组红色和绿色荧光表达较少,重叠后可见少量的黄色聚集。ICH组造模后3天血肿周围受损脑组织内可见比Sham组中略强的红色及绿色荧光,重叠后呈橘黄色。BMSCs组红色及绿色荧光比ICH组更强,重叠后橘黄色加重。而经PI3K-Akt-m TOR通路抑制剂LY294002干预后,红色及绿色荧光较BMSCs组明显减弱,重叠后的橘黄色荧光亦减弱;4 LC3的免疫印迹分析结果:Sham组LC3II蛋白低表达。ICH组受损脑组织内LC3II与LC3I的比值于术后12小时升高,3天达到峰值,之后降低但仍高于Sham组(P<0.05)。BMSCs组LC3II与LC3I比值的变化趋势与ICH组类似,但其表达量与ICH组相比较有进一步升高,差异显着(P<0.05)。而与BMSCs组相比,LY294002干预能明显降低LC3II与LC3I的比值(P<0.05);5 p62的免疫印迹分析结果:Sham组p62的蛋白表达未见明显差异。ICH组术后1天受损脑组织内p62表达降低,3天达到最低值,虽然之后表达稍有升高,但仍低于Sham组,差异显着(P<0.05)。BMSCs组p62表达的趋势类似ICH组,但其在各时间点的表达量均明显低于ICH组(P<0.05)。但LY294002干预后,p62的表达强度与BMSCs组相比明显升高(P<0.05);6 GAP-43免疫组化检测结果:Sham组间或可见零星分布GAP-43的阳性细胞的表达。ICH组在术后1-7天可见GAP-43阳性细胞明显增加,免疫反应性与Sham组相比显着增强(P<0.05)。BMSCs组3-7天GAP-43阳性细胞的免疫反应性与ICH组比较进一步增强,差异显着(P<0.05)。而LY294002干预导致GAP-43阳性细胞的免疫反应性与BMSCs组相比明显降低(P<0.05);7 GAP-43的免疫印迹分析结果:Sham组GAP-43的蛋白表达未见明显差异。ICH组造模术后3天受损脑组织GAP-43表达升高,虽然7天和14天GAP-43稍有降低,但仍高于Sham组,差异显着(P<0.05)。BMSCs组GAP-43的表达趋势类似ICH组,但其在各时间点的表达量均进一步升高(P<0.05)。而LY294002干预后,GAP-43的表达强度与BMSCs组相比明显降低(P<0.05);8 SCG10的免疫印迹分析结果:Sham组SCG10的蛋白表达未见明显差异。ICH组受损脑组织内SCG10于造模术后12小时升高,3天达峰值,之后逐渐降低但仍高于Sham组(P<0.05)。BMSCs组SCG10的表达趋势与ICH组类似,但其在各时间点的表达量均降低,差异显着(P<0.05)。而LY294002干预后与BMSCs组相比能明显提高SCG10的表达强度(P<0.05)。小结:ICH后血肿周围受损脑组织内的神经细胞存在自噬和PI3K-Akt-m TOR通路的激活;给予BMSCs移植治疗后,PI3K-Akt-m TOR通路进一步激活,血肿周围受损脑组织内的自噬流增加,同时轴突再生增强;而BMSCs移植对自噬流强度和轴突再生相关蛋白的表达均受PI3K-Akt-m TOR信号通路的调控。第三部分大鼠脑出血后骨髓间充质干细胞移植通过自噬流介导轴突再生的机制研究目的:通过自噬抑制剂3MA和自噬激活剂雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)的干预,明确大鼠ICH后BMSCs移植是否通过促进血肿周围受损脑组织内的自噬流介导了轴突再生。方法:45只雌性SD大鼠被随机分为五组:1)假手术组(Sham group);2)脑出血组(ICH group);3)脑出血+BMSCs移植组(BMSCs group);4)脑出血+BMSCs移植+3-MA干预组(3MA group);5)脑出血+BMSCs移植+RAPA干预组(RAPA group)。在术后3天对下列指标进行检测:1)免疫荧光观察受损脑组织内LC3和不同细胞标记物的共聚焦情况;2)Western-blot检测ICH后受损脑组织轴突再生相关蛋白GAP-43和SCG10,自噬相关蛋白LC3和p62,通路蛋白p-Akt的表达;3)免疫组化检测受损脑组织内GAP-43的表达及定位。实验结果的测定记录及统计分析同第一部分。结果:1 LC3和细胞标记物的免疫荧光共聚焦结果:红色荧光标记LC3,绿色荧光标记神经元,洋红色荧光标记星形胶质细胞,蓝色荧光标记细胞核。Sham组红色荧光表达较少,能与绿色荧光重叠,可见少量的橘黄色聚集。ICH组受损脑组织内胞浆中可见比Sham组多的红色荧光,而绿色荧光明显减少,重叠后呈橘黄色,提示ICH后神经细胞自噬。同时洋红色荧光要多于Sham组,提示ICH后星形胶质细胞增生。BMSCs组红色及绿色荧光均比ICH组更多,重叠后橘黄色加重,提示BMSCs移植治疗进一步激活了神经细胞自噬,也减少了神经细胞的死亡。同时洋红色荧光少于ICH组,提示BMSCs能抑制ICH后的星形胶质细胞增生。经自噬抑制剂3MA干预后,与BMSCs组相比红色荧光减少,而绿色荧光略减少,重叠后橘黄色亦减弱,洋红色荧光无显着变化。经自噬激活剂RAPA干预后,与BMSCs组相比红色荧光显着增强,而绿色荧光无显着变化,重叠后橘黄色加重明显,洋红色荧光亦无显着变化;2自噬相关蛋白LC3和p62的免疫印迹分析结果:ICH大鼠受损脑组织内LC3II与LC3I比值显着高于Sham组(P<0.05),而p62表达显着低于Sham组(P<0.05),提示ICH后自噬流的激活。BMSCs移植治疗能够进一步升高LC3II与LC3I比值(P<0.05),而p62表达量进一步降低(P<0.05),提示BMSCs能够增强自噬流。当给予自噬抑制剂3MA干预后,自噬被抑制,LC3II与LC3I比值降低(P<0.05),而p62表达增强(P<0.05)。自噬激活剂RAPA具有相反的作用,导致了LC3II与LC3I比值再一次升高(P<0.05),p62表达则再一次降低(P<0.05);3轴突再生相关蛋白GAP-43和SCG10的免疫印迹分析结果:ICH大鼠受损脑组织内GAP-43和SCG10表达均高于Sham组(P<0.05)。BMSCs移植治疗能够进一步升高GAP-43的表达(P<0.05),而SCG10表达降低(P<0.05)。当给予自噬抑制剂3MA干预后,GAP-43的表达降低(P<0.05),而SCG10表达增强(P<0.05)。自噬激活剂RAPA具有相反的作用,导致了GAP-43表达再次升高(P<0.05),而SCG10表达则进一步降低(P<0.05);4 GAP-43的免疫组化检测结果:Sham组可见零星分布的阳性细胞的表达,着色很淡。ICH大鼠受损脑组织内可见GAP-43阳性细胞明显增加,着色亦加深,免疫反应性与Sham组相比显着增强(P<0.05)。经BMSCs移植治疗后GAP-43阳性细胞进一步增加,免疫反应性进一步增强,差异显着(P<0.05)。自噬抑制剂3MA干预后,与BMSCs组比较GAP-43阳性细胞免疫性降低(P<0.05),而自噬激活剂RAPA对GAP-43阳性细胞无显着影响;5 p-Akt的免疫印迹分析结果:造模术后3天,ICH组p-Akt与Akt的比值显着高于Sham组(P<0.05),而BMSCs移植治疗能够进一步升高p-Akt与Akt的比值(P<0.05)。然而,自噬抑制剂3MA和自噬激活剂RAPA对p-Akt与Akt的比值无显着影响。小结:大鼠ICH后BMSCs移植可通过增强受损脑组织内神经细胞的自噬流强度促进轴突再生。结论:ICH后BMSCs移植能够发挥神经保护作用,改善神经功能障碍,其分子机制或许与激活的PI3K-Akt-m TOR通路促进了受损脑组织内自噬流介导的轴突再生有关。
郭光金,张坤,蒋登金,左艳芳[9](2007)在《移植脾组织血管神经生成规律的动态观察》文中研究指明目的:观察自体脾组织大网膜内移植后,移植脾组织血管神经再生过程中血管内皮细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子受体及神经肽Y表达的动态变化,分析自体移植脾组织血管神经生成规律。方法:实验于2004-09/2006-10在解放军第三军医大学基础部外科应用解剖与手术学教研室实验室完成。①选用Wistar大鼠70只,按随机数字表法分为7个时相组,每组10只。②行脾切除自体脾组织大网膜内移植,分别于术后7,14,30,60,90,120,180d,采用免疫组化血管内皮细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子受体、神经肽Y阳性神经纤维抗体染色方法,应用光镜、电镜、图像分析观测自体移植脾组织。结果:70只大鼠全部进入结果分析,无脱失。①自体脾组织移植术后7d即有血管长入移植脾组织,180d再生血管接近正常;术后30d神经开始再生,180d趋于正常。②术后7,14d血管内皮细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子受体阳性染色细胞密度迅速升高,60d达高峰,随后逐渐降低;术后30d出现神经肽Y阳性神经纤维。术后180d血管内皮细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子受体阳性染色细胞密度趋于正常;术后120,180d神经肽Y阳性神经纤维广泛分布。结论:自体移植脾组织再生过程中移植脾组织再生血管神经来源于大网膜内的神经。自体移植再生脾组织内血管内皮细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子受体表达量早期开始升高,移植脾组织先出现血管再生,后出现神经再生。
刘敬霞[10](2007)在《脑脉通联合骨髓间充质干细胞移植对脑缺血再灌注大鼠神经细胞再生的影响》文中研究表明背景与目的缺血性脑血管疾病的高致残率严重影响患者的生存质量,脑缺血损伤引起的神经元结构破坏和缺失是引起功能障碍的病理关键。针对脑缺血损伤引起的生化、代谢改变,保护神经元免于受损,或促进脑缺血损伤后神经细胞再生成为干预损伤、恢复功能的重要策略。目前药物性的神经保护研究和临床应用仍欠理想。骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal stem cells,BMSCs)具有较强的增殖能力和多向分化潜能,可以分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等神经细胞,成为脑缺血损伤后神经细胞再生理想的种子来源。鉴于骨髓间充质干细胞体外诱导剂的毒副作用和体外分化后移植脑内较弱的存活能力,近年来,对体外纯化、扩增培养的骨髓间充质干细胞移植脑内以治疗脑缺血损伤成为研究的热点。因此,开展骨髓间充质干细胞移植在神经细胞再生和神经功能修复方面的研究对脑缺血损伤具有重要意义。近年来渐有中医药在骨髓间充质干细胞移植治疗脑缺血损伤的报道,但研究多集中于对其体外的诱导分化方面,所选药物以单味中药或提取物为主,而中药复方对BMSCs移植后在活体内影响其存活、分化方面的研究少见。脑梗死属中医“中风”范畴,其病机复杂,以浊毒、血瘀和气虚表现尤为突出:气虚血瘀、毒损脑络为脑梗死的主要病机。解毒降浊、益气化瘀为脑梗死的主要治法。据此研制的中药复方脑脉通(大黄川芎人参葛根)具有解毒降浊、益气活血通络功效,可对脑缺血损伤发挥保护作用。动物实验和临床观察表明,脑脉通治疗脑梗死的效果肯定,可显着改善患者的生存质量。鉴于上述,开展中医药联合骨髓间充质干细胞移植治疗脑缺血损伤研究具有重要意义。本研究从脑缺血再灌注大鼠神经细胞再生方面评价脑脉通、BMSCs移植及其联合的脑保护作用,并从脑脉通对BMSCs移植后脑组织神经营养因子水平、向神经细胞分化的比率及对促神经元突触重建的生长相关蛋白表达的影响方面探讨其可能的作用机制。方法本研究以SD大鼠为研究对象,体外全骨髓贴壁筛选培养法获取骨髓间充质干细胞;移植前48 h用Brdu对骨髓间充质干细胞进行体外标记;栓线阻塞大鼠大脑中动脉制备局灶性脑缺血再灌注动物模型;脑缺血3 h再灌注24 h由颈内动脉移植骨髓间充质干细胞悬液。动态观察移植后早期(7 d)、中期(14 d)、后期(28 d)大鼠的神经功能和生存状况变化;采用病理形态学、免疫组织化学法以及免疫组织化学双标法,从神经功能综合评分、脑组织含水量、脑梗塞灶、神经细胞超微结构变化方面观察脑脉通对骨髓间充质干细胞移植保护脑缺血损伤的影响;从神经元和神经胶质细胞特异性标志蛋白以及与之相关的神经营养因子表达的变化方面探讨脑脉通联合骨髓间充质干细胞移植对神经细胞的保护作用及可能的作用机制;观察骨髓间充质干细胞移植后在脑内的存活、迁移和分化特点以及脑脉通对其的影响;进一步从神经元突触标志性蛋白表达的变化方面观察骨髓间充质干细胞移植后对神经元突触重建的作用以及脑脉通对其作用的影响。主要研究结果如下:结果1.脑脉通联合骨髓间充质干细胞移植对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用1.1体外全骨髓贴壁筛选培养法纯化骨髓的效果理想,可在短期内获取移植所需的骨髓间充质干细胞;颈动脉移植骨髓间充质干细胞操作易行,细胞悬液少有外漏,移植途径可取。1.2脑缺血再灌注损伤后大鼠体重变化呈现由减轻到增加的趋势,且体重的变化与大鼠全身状况一致;大鼠神经功能随脑缺血再灌注时间的延长逐渐恢复;脑组织水肿程度、梗塞灶的大小及神经细胞超微结构的改变随脑缺血再灌注时间的延长出现由加重到减轻的改变。1.3骨髓间充质干细胞由颈内动脉移植对脑缺血损伤的保护作用与其移植脑内后的时间相关,BMSCs移植后早期未显出明显的保护作用;移植中期的神经功能恢复,脑组织水肿、梗塞灶大小和神经细胞超微结构有改善趋势;移植后期的神经功能恢复和神经细胞超微结构的改善明显。1.4脑脉通对脑缺血再灌注损伤不同时间的均有不同程度的改善作用;BMSCs移植联合脑脉通对脑缺血再灌注损伤的保护作用较单纯BMSCs移植的作用提前,联合应用对神经功能的修复和对神经细胞病理损伤的改善作用明显增强,且随移植后BMSCs在脑内时间的延长,联合应用的保护作用更为显着。2脑脉通联合骨髓间充质干细胞移植对大鼠脑缺血再灌注损伤神经细胞再生及神经营养因子的影响2.1随着脑缺血再灌注时间的延长,脑组织神经元和神经胶质细胞特异性标志蛋白的表达减弱;神经生长因子和胶质源性神经营养因子的变化随脑缺血再灌注时间的延长呈现先增高再降低特点。2.2 BMSCs移植后早期神经元和神经胶质细胞特异性标志蛋白无明显增高;随BMSCs移植脑内时间的延长,神经元和神经胶质细胞特异性标志蛋白的表达增强,其中神经元特异性烯醇化酶的增强较胶质纤维酸性蛋白明显,以移植后期的增强更为显着。BMSCs移植后早期对神经生长因子和胶质源性神经营养因子的水平变化无明显影响,随移植后时间的延长,其上调神经营养因子的作用增强。2.3脑脉通联合BMSCs移植后早期神经元特异性烯醇化酶的表达较单纯移植组增强;联合组后期的神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白的表达均有增强。脑脉通联合BMSCs可明显提高移植中期胶质源性神经营养因子水平,并使移植后期神经生长因子的表达明显增强。3.脑脉通对脑缺血再灌注损伤大鼠骨髓间充质干细胞移植后向神经细胞分化的影响3.1 BMSCs移植后在脑实质内和血管腔内的分布比例随移植后时间的延长而增加。移植后早期,大多BMSCs位于血管腔内,黏附血管内皮呈丛簇样聚集,脑实质内有少量散在的BMSCs,分布未见明显规律;移植后中期,BMSCs大多从血管壁通过血脑屏障进入脑实质内,并向缺血侧部位迁移,血管腔内可见到少数标记的BMSCs;移植后期,血管腔内未见Brdu细胞,存活的BMSCs全部由血管进入脑实质,并迁移至缺血侧,对侧少有Brdu细胞;联合脑脉通可使OBMSCs移植后在脑实质内存活的数量明显增多,但脑实质和血管腔内BMSCs的比例及进入脑实质后的迁移方向未见明显改变。3.2 BMSCs移植后向神经细胞的分化随植入时间的延长出现分化率和分化方向的改变。BMSCs移植后早期在脑实质内的分化率低,未显示出分化方向的差异性;移植后中期的分化率明显增高,以向神经胶质细胞的分化明显;移植后期,BMSCs向神经元细胞的分化明显增强,而向神经胶质细胞的分化相对减弱;脑脉通对BMSCs移植后不同阶段在促进BMSCs向神经细胞分化方面的作用具有差异性,表现为在移植中期促进神经胶质细胞分化,而移植后期则使BMSCs向神经元方向的分化增强。4.脑脉通联合骨髓间充质干细胞移植对大鼠脑缺血再灌注损伤神经元突触重建的影响4.1脑缺血再灌注损伤后神经元结构破坏,神经丝排列紊乱,变短,数量减少,稀疏,分布不均匀,且随脑缺血再灌注时间的延长而加重;促进受损后神经元突触重建的生长相关蛋白-43和标志神经元突触重建的蛋白表达减弱,且随脑缺血再灌注时间的延长呈现递减趋势。脑脉通对脑缺血再灌注早期的神经元结构受损具有保护作用,神经元突触素蛋白的表达增强,但对生长相关蛋白-43的表达无显着影响。4.2 BMSCs移植后早期对神经元结构受损未显出明显的保护作用;移植后中期,神经元突触重建特异性标志蛋白显示增加趋势;移植后期神经丝蛋白、促突触重建的生长相关蛋白-43和神经元突触素蛋白的表达增强。BMSCs对脑缺血再灌注损伤神经元突触重建的促进作用与移植脑内存活的时间相关,该作用随移植后时间的延长而增强。4.3脑脉通联合BMSCs移植可使早期神经丝蛋白表达增强、神经元结构破坏减轻;神经生长相关蛋白-43的表达提前,并增强其后期的表达;移植后期神经元突触素蛋白的表达增强。结论综合上述研究,结果提示,①体外全骨髓贴壁筛选纯化、培养和扩增BMSCs的方法可行,Brdu标记BMSCs的效果理想,由颈内动脉移植BMSCs悬液易于操作,移植后的BMSCs可在脑内存活、迁移,对脑缺血再灌注损伤具有保护作用。②脑缺血再灌注损伤后神经功能、脑组织水肿、梗塞灶大小和神经细胞超微结构改变可随脑缺血再灌注时间延长有不同程度恢复;脑脉通对脑缺血再灌注损伤不同阶段具有不同程度的保护作用,以早期的作用明显;BMSCs对脑缺血再灌注损伤的保护作用与其移植后的时间相关,移植后早期未显出明显的脑保护作用,但随着BMSCs移植脑内时间的延长,其保护作用逐渐增强。③神经细胞随脑缺血再灌注损伤时间的延长持续受损、数量减少,神经营养因子出现先增高再降低特点,其在早期的升高对神经细胞受损具有保护作用,后期水平降低则不利于神经细胞的再生和修复;脑脉通对神经细胞的保护作用与其早期和中期上调胶质源性神经营养因子、后期上调神经生长因子表达有关;BMSCs移植对保护神经细胞和上调神经营养因子表达的作用随移植后时间的延长而增强;脑脉通联合BMSCs移植可使其对神经细胞的保护作用提前,并使后期的作用增强,以对神经元的作用尤为明显,这可能与脑脉通促进BMSCs移植后上调神经营养因子表达的作用有关。④随移植后时间的延长,BMSCs逐渐从血管壁通过血脑屏障进入脑实质内存活、向缺血侧迁移,出现神经细胞分化,但未显示出分化方向的差异性;脑脉通可使移植后BMSCs在脑内的存活增强,并在促进其向神经细胞分化方面显示出差异性,表现为促进中期BMSCs向神经胶质细胞分化和后期向神经元细胞分化。⑤神经元突触重塑是其结构重建与功能修复的基础,神经元突触重塑功能随脑缺血再灌注时间的延长有减弱趋势,这可能与促进神经元突触重建生长相关蛋白的表达下调有关;脑脉通在脑缺血再灌注早期可保护神经元结构受损,后期可增强神经元突触重建;BMSCs对神经元突触重建作用随移植后时间的延长逐渐增强;脑脉通联合BMSCs可使脑缺血再灌注损伤后早期神经元突触重建提前,并可增强中期与后期的神经元突触重建,其作用可能是通过上调促神经元突触重建的生长相关蛋白-43的表达实现。因此认为,脑脉通联合BMSCs移植对脑缺血再灌注神经细胞再生具有促进作用,其作用与脑脉通使BMSCs移植后上调神经营养因子、促进向神经细胞分化及增强促神经元突触重建的生长相关蛋白表达的作用在早期提前和在后期增强有关。研究可为BMSCs移植治疗脑缺血损伤以及相关领域中药的深入研究提供科学依据,并对进一步中医药学及其与细胞治疗学应用的研究具有重要价值。
二、自体移植脾组织内GAP-43神经的生成机制(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、自体移植脾组织内GAP-43神经的生成机制(论文提纲范文)
(1)ADSCs通过调控神经细胞TGF-β1/Smad/PLOD2信号通路修复脊髓损伤的机制研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
Abstract |
符号说明 |
第一部分 ADSCs体外共培养对损伤神经细胞的修复作用 |
前言 |
一、材料与方法 |
二、实验结果 |
三、讨论 |
四、结论 |
附图 |
参考文献 |
第二部分 ADSCs通过调控神经细胞TGF-β1/Smad3/PLOD2信号通路促进损伤神经细胞的修复 |
前言 |
一、材料与方法 |
二、实验结果 |
三、讨论 |
四、结论 |
附图 |
参考文献 |
第三部分 ADSCs通过激活神经细胞TGF-β1/Smad3/PLOD2信号通路促进脊髓损伤大鼠功能恢复 |
前言 |
一、材料与方法 |
二、实验结果 |
三、讨论 |
四、结论 |
五、总论 |
附图 |
参考文献 |
文献综述 间充质干细胞治疗脊髓损伤的研究进展 |
参考文献 |
致谢 |
攻读学位期间发表的学术论文目录 |
学位论文评阅及答辩情况表 |
外文论文一 |
外文论文二 |
(2)人源干细胞联合有序胶原支架移植治疗完全性脊髓损伤的研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
abstract |
缩略词表 |
第1章 引言 |
1.1 学位论文的选题背景与研究意义 |
1.2 学位论文的研究思路与实验设计 |
第2章 文献综述 |
2.1 脊髓损伤后的病理生理变化 |
2.1.1 活性氧簇和脂质过氧化反应 |
2.1.2 细胞兴奋性毒性 |
2.1.3 缺血性改变 |
2.1.4 炎症反应 |
2.1.5 脱髓鞘和轴突变性 |
2.1.6 胶质瘢痕形成 |
2.2 干细胞移植治疗脊髓损伤 |
2.2.1 胚胎干细胞 |
2.2.2 诱导多能干细胞 |
2.2.3 间充质干细胞 |
2.2.4 神经干/祖细胞 |
2.2.5 细胞移植治疗脊髓损伤的机制 |
2.3 生物材料支架联合干细胞移植治疗脊髓损伤 |
2.3.1 天然生物材料 |
2.3.2 合成生物材料 |
第3章 材料与方法 |
3.1 实验材料 |
3.1.1 细胞 |
3.1.2 实验动物 |
3.1.3 生物材料支架 |
3.2 实验试剂 |
3.2.1 细胞培养与实验操作相关试剂 |
3.2.2 免疫荧光染色抗体 |
3.3 实验仪器和设备 |
3.4 实验方法 |
3.4.1 培养基配制 |
3.4.2 胶原蛋白材料支架的制备 |
3.4.3 扫描电镜观察 |
3.4.4 hMSCs的提取与培养 |
3.4.5 hNSPCs的提取与培养 |
3.4.6 细胞鉴定 |
3.4.7 用带有GFP的慢病毒感染目的细胞 |
3.4.8 细胞接种胶原蛋白材料支架 |
3.4.9 FDA染色 |
3.4.10 大鼠脊髓全横断损伤模型的制备和细胞-材料移植 |
3.4.11 组织灌注、取材及切片 |
3.4.12 组织免疫荧光染色 |
3.4.13 Basso,beattie,bresnahan(BBB)评分 |
3.4.14 电生理检测 |
3.4.15 斜面试验 |
3.4.16 统计学分析 |
第4章 人源间充质干细胞或神经干细胞联合胶原支架治疗完全性脊髓损伤 |
4.1 实验结果 |
4.1.1 hMSCs和hNSCs的鉴定 |
4.1.2 慢病毒感染hMSCs和hNSCs |
4.1.3 有序结构胶原支架的表征 |
4.1.4 hMSCs和hNSCs的三维培养 |
4.1.5 细胞移植 |
4.1.6 hNSCs移植促进大鼠的运动功能恢复 |
4.1.7 移植的hNSCs在脊髓损伤区的存活情况 |
4.1.8 hMSCs与 hNSCs移植均能有效控制损伤区的胶质瘢痕形成 |
4.1.9 移植细胞减少了募集到损伤区的CD68 阳性细胞的数量 |
4.1.10 hNSCs移植更能有效促进损伤区内的神经再生 |
4.2 讨论 |
4.3 小结 |
第5章 胎儿脊髓组织来源的神经干/祖细胞联合有序胶原支架促进完全性脊髓损伤后的功能修复 |
5.1 实验结果 |
5.1.1 hbNSPCs和hscNSPCs的提取与鉴定 |
5.1.2 慢病毒感染hbNSPCs和hscNSPCs |
5.1.3 hbNSPCs和hscNSPCs的三维培养 |
5.1.4 细胞-支架移植 |
5.1.5 移植细胞在损伤区内的存活情况 |
5.1.6 hscNSPCs+ACSS移植后损伤区内神经元的分化情况 |
5.1.7 hscNSPCs+ACSS移植后损伤区内神经元的成熟情况 |
5.1.8 hNSPCs的胶质细胞分化 |
5.1.9 hscNSPCs+ACSS有效降低了损伤区的炎症反应 |
5.1.10 hscNSPCs+ACSS促进了脊髓损伤区内NT-3 的释放 |
5.1.11 hscNSPCs+ACSS有效降低了损伤区的胶质瘢痕形成 |
5.1.12 hscNSPCs+ACSS移植能更好地促进大鼠的运动功能恢复 |
5.2 讨论 |
5.3 小结 |
第6章 总结与展望 |
创新点 |
参考文献 |
作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
致谢 |
(3)Fidgetin Like 2-siRNA调控视神经损伤后神经节细胞存活和轴突再生研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
中英文缩略词 |
前言 |
第一部分: Fidgetin Like 2-siRNA调控视网膜神经节细胞存活和轴突再生体外研究 |
研究背景 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
研究结论 |
第二部分: Fidgetin Like 2-siRNA调控视神经损伤后神经节细胞存活和轴突再生体内研究 |
研究背景 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
研究结论 |
参考文献 |
综述 视神经损伤后修复与再生研究论述 |
参考文献 |
个人简介 |
致谢 |
(4)基于DLP打印技术的组织工程牙髓重建及其生物学性能评估(论文提纲范文)
致谢 |
中文摘要 |
英文摘要 |
缩略词表 |
第一章 绪论 |
1 牙髓病损的治疗方法 |
2 牙髓组织工程学策略 |
3 生物制造技术 |
4 本研究内容及意义 |
第二章 牙髓间充质干细胞的获得与检测 |
1 材料和方法 |
2 结果 |
3 讨论 |
4 本章小结 |
第三章 GelMA的合成、评估及载hDPSC GelMA微球的构建与体外生物学性能评价 |
引言 |
1 材料和方法 |
2 结果 |
3 讨论 |
4 本章小结 |
第四章 基于DLP打印载hDPSC GelMA微球的牙髓再生及生物学效果评估 |
引言 |
1 材料和方法 |
2 结果 |
3 讨论 |
4 本章小结 |
第五章 全文总结 |
参考文献 |
综述 基于DLP打印的组织工程技术:从概念、实现到展望 |
参考文献 |
个人简历及在学期间所取得的科研成果 |
(5)石墨烯导管促进周围神经长段缺损再生研究(论文提纲范文)
摘要 |
abstract |
中文部分 |
第一章 绪论 |
1.1 研究背景 |
1.2 研究现状 |
1.2.1 神经导管的种类和特点 |
1.2.2 神经导管的内外微环境 |
1.2.3 电刺激与导电神经导管 |
第二章 氧化石墨烯/聚己内酯神经导管的制备与表征 |
2.1 引言 |
2.2 材料与方法 |
2.2.1 氧化石墨烯/聚己内酯神经导管制备 |
2.2.2 氧化石墨烯/聚己内酯神经导管表征 |
2.2.3 数据统计分析 |
2.3 结果 |
2.4 讨论 |
2.5 本章小结 |
第三章 氧化石墨烯/聚己内酯神经导管的体外生物相容性实验 |
3.1 引言 |
3.2 材料与方法 |
3.2.1 神经导管支架材料准备与消毒 |
3.2.2 施旺细胞培养 |
3.2.3 施旺细胞增殖、毒性实验 |
3.2.4 施旺细胞微观形态扫描电镜实验 |
3.2.5 倒置荧光显微镜观察实验 |
3.2.6 蛋白质印迹法(Western Blot)、实时荧光定量核酸扩增检测(quantitative PCR) |
3.2.7 数据统计分析 |
3.3 结果 |
3.4 讨论 |
3.5 本章小结 |
第四章 氧化石墨烯/聚己内酯神经导管修复坐骨神经缺损实验 |
4.1 引言 |
4.2 材料与方法 |
4.2.1 建立大鼠坐骨神经缺损模型 |
4.2.2 大体观察 |
4.2.3 功能学检测——步态分析 |
4.2.4 电生理学检测 |
4.2.5 组织形态学检测 |
4.2.6 免疫组织化学染色检测 |
4.2.7 蛋白质印迹法(Western Blot) |
4.2.8 数据统计分析 |
4.3 结果 |
4.4 讨论 |
4.5 本章小结 |
第五章 全文总结 |
英文部分 |
Chapter 1 Introduction |
1.1 Background |
1.2 Research Status |
1.2.1 Types and Characteristics of Nerve Conduits |
1.2.2 Internal and External Microenvironment of Nerve Conduits |
1.2.3 Electrical Stimulation and Conductive Nerve Conduits |
Chapter 2 Preparation and Characterization of Graphene Oxide/Polycaprolactone Nerve Conduit |
2.1 Introduction |
2.2 Materials and Methods |
2.2.1 Preparation of GO/PCL Nerve Conduit |
2.2.2 Characterization of GO/PCL Nerve Conduit |
2.2.3 Statistical Analysis |
2.3 Results |
2.4 Discussion |
2.5 Conclusion |
Chapter 3 In Vitro Biocompatibility Studies of Graphene Oxide/Polycaprolactone Nerve Conduit |
3.1 Introduction |
3.2 Materials and Methods |
3.2.1 Preparation and Disinfection of Nerve Conduit Materials |
3.2.2 Schwann Cell Culture |
3.2.3 Schwann Cell Proliferation and Toxicity Assays |
3.2.4 Microscopic Morphology of Schwann Cells with SEM |
3.2.5 Cell Observation with Inverted Fluorescence Microscopy |
3.2.6 Western Blot and Real-time Quantitative PCR |
3.2.7 Statistical Analysis |
3.3 Results |
3.4 Discussion |
3.5 Conclusion |
Chapter 4 In Vivo Repair of Sciatic Nerve Defects by Graphene Oxide/Polycaprolactone Nerve Conduit |
4.1 Introduction |
4.2 Materials and Methods |
4.2.1 Rat Sciatic Nerve Defect Model |
4.2.2 General Observation |
4.2.3 Functional Evaluation-Gait Analysis |
4.2.4 Electrophysiological Tests |
4.2.5 Histomorphological Evaluation |
4.2.6 Immunohistochemical Staining Evaluation |
4.2.7 Western Blot |
4.2.8 Statistical Analysis |
4.3 Results |
4.4 Discussion |
4.5 Conclusion |
Chapter 5 Overall Conclusions |
参考文献 |
致谢 |
攻读博士学位期间已发表或录用的论文 |
八年制学位论文要求 |
(6)探讨小儿外伤性脾切除移植脾组织的手术方法及疗效分析(论文提纲范文)
符号说明 |
摘要 |
ABSTRACT |
前言 |
1 脾脏的解剖 |
2 脾脏生理功能以及组织结构 |
3 脾脏的外伤与手术 |
4 脾脏手术后的并发症 |
5 脾切除术后免疫系统的影响 |
6 国内外脾移植研究现状 |
第1章 资料与方法 |
1.1 资料 |
1.2 方法 |
1.2.1 文献研究法 |
1.2.2 手术方法 |
1.2.3 观察方法 |
1.2.4 统计学方法 |
第2章 结果 |
2.1 B超结果 |
2.2 血常规、免疫功能的数据结果 |
2.3 统计结果 |
第3章 讨论 |
3.1 脾移植手术的应用 |
3.2 B超、血常规、免疫功能结果的讨论 |
3.3 本研究在湘西地区的意义 |
结论 |
致谢 |
参考文献 |
作者在学期间取得的学术成果 |
(7)rhEPO对大鼠不同程度视神经损伤修复的实验研究(论文提纲范文)
摘要 |
abstract |
引言 |
第一部分 不同程度视神经损伤动物模型的建立及自然转归过程 |
材料与方法 |
1 实验动物及饲养环境 |
2 实验试剂、药品 |
3 重要试剂的配置 |
4 实验仪器及设备 |
5 实验方法 |
6 统计学处理 |
结果 |
1 大鼠死亡情况 |
2 电生理检查结果 |
3 组织病理学结果 |
讨论 |
第二部分 rhEPO对大鼠中重度视神经损伤修复的研究 |
材料与方法 |
1 实验动物与饲养环境 |
2 实验药品、试剂 |
3 重要试剂的配置 |
4 实验仪器及设备 |
5 实验方法 |
6 统计学处理 |
结果 |
1 大鼠死亡情况 |
2 电生理检查结果 |
3 组织病理学结果 |
讨论 |
第三部分 rhEPO对大鼠中重度视神经损伤修复机制的研究 |
材料与方法 |
1 实验药品、试剂 |
2 实验方法 |
3 统计学处理 |
结果 |
1 正常视神经Caspase-3、GAP- 43、Mbp的表达 |
2 中重度视神经损伤后Caspase-3、GAP-43、Mbp的表达 |
3 rhEPO对中度视神经损伤后Caspase-3、GAP-43、Mbp表达的影响 |
4 rhEPO对重度视神经损伤后Caspase-3、GAP-43、Mbp表达的影响 |
讨论 |
结论 |
参考文献 |
综述 |
综述参考文献 |
攻读学位期间的研究成果 |
附录 |
致谢 |
(8)骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脑出血及调控自噬流和轴突再生的机制研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
英文摘要 |
英文缩写 |
引言 |
第一部分 骨髓间充质干细胞移植对脑出血大鼠的神经保护作用 |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
附图 |
附表 |
讨论 |
小结 |
参考文献 |
第二部分 骨髓间充质干细胞移植通过PI3K-Akt-mTOR通路对脑出血大鼠自噬和轴突再生的影响 |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
附图 |
附表 |
讨论 |
小结 |
参考文献 |
第三部分 大鼠脑出血后骨髓间充质干细胞移植通过自噬流介导轴突再生的机制研究 |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
附图 |
附表 |
讨论 |
小结 |
参考文献 |
结论 |
综述 自噬与脑出血治疗的研究进展 |
参考文献 |
致谢 |
个人简历 |
(9)移植脾组织血管神经生成规律的动态观察(论文提纲范文)
0 引言 |
1 材料和方法 |
2 结果 |
2.1 实验动物数量分析 |
2.2 移植脾组织病理学观察结果 |
2.3 神经肽Y阳性神经纤维再生及VEGF, KDR表达的检测结果 |
2.3.1 神经肽Y阳性神经纤维 |
2.3.2 VEGF阳性表达 |
2.3.3 KDR阳性表达 |
2.4 图像分析结果 |
2.4.1 神经肽Y阳性神经纤维密度 |
2.4.2 VEGF+细胞密度 |
2.4.3 KDR+细胞密度 |
3 讨论 |
(10)脑脉通联合骨髓间充质干细胞移植对脑缺血再灌注大鼠神经细胞再生的影响(论文提纲范文)
中文摘要 |
英文摘要 |
英文缩略语 |
第一部分 文献综述 |
1 干细胞治疗脑缺血损伤的研究进展 |
2 骨髓间充质干细胞移植治疗脑缺血损伤的研究概况 |
3 中医药影响骨髓间充质干细胞移植治疗脑缺血损伤的研究述评 |
4 中医药促进脑缺血损伤神经元重塑的研究 |
第二部分 研究思路 |
中医药联合骨髓间充质干细胞移植治疗脑缺血再灌注损伤研究的思路与策略 |
第三部分 实验研究 |
前言 |
1 流行病学概况 |
2 脑缺血神经细胞损伤的级联反应机制 |
3 脑缺血损伤后神经细胞保护与修复策略 |
4 骨髓间充质干细胞移植保护神经细胞的基础和潜能 |
5 中医药保护脑缺血神经细胞损伤的优势 |
6 中医药对骨髓间充质干细胞移植治疗脑缺血损伤的影响 |
7 脑脉通对脑缺血神经细胞损伤保护作用的探索 |
参考文献 |
实验一 脑脉通联合骨髓间充质干细胞移植对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用 |
1 材料与方法 |
2 结果 |
3 讨论 |
4 结论 |
参考文献 |
实验二 脑脉通联合骨髓间充质干细胞移植对脑缺血再灌注大鼠神经细胞及神经营养因子的影响 |
1 材料与方法 |
2 结果 |
3 讨论 |
4 结论 |
参考文献 |
实验三 脑脉通对脑缺血再灌注损伤大鼠骨髓间充质干细胞移植后向神经细胞分化的影响 |
1 材料与方法 |
2 结果 |
3 讨论 |
4 结论 |
参考文献 |
实验四 脑脉通联合骨髓间充质干细胞移植对大鼠脑缺血再灌注损伤神经元突触重建的影响 |
1 材料与方法 |
2 结果 |
3 讨论 |
4 结论 |
参考文献 |
第四部分 结语 |
结语 |
第五部分 附录 |
病理照片 |
致谢 |
个人简历 |
四、自体移植脾组织内GAP-43神经的生成机制(论文参考文献)
- [1]ADSCs通过调控神经细胞TGF-β1/Smad/PLOD2信号通路修复脊髓损伤的机制研究[D]. 李芳. 山东大学, 2021(11)
- [2]人源干细胞联合有序胶原支架移植治疗完全性脊髓损伤的研究[D]. 邹云龙. 吉林大学, 2020(08)
- [3]Fidgetin Like 2-siRNA调控视神经损伤后神经节细胞存活和轴突再生研究[D]. 韩卫. 郑州大学, 2020(02)
- [4]基于DLP打印技术的组织工程牙髓重建及其生物学性能评估[D]. 龚佳幸. 浙江大学, 2020(01)
- [5]石墨烯导管促进周围神经长段缺损再生研究[D]. 钱运. 上海交通大学, 2019(06)
- [6]探讨小儿外伤性脾切除移植脾组织的手术方法及疗效分析[D]. 马纯灿. 吉首大学, 2018(02)
- [7]rhEPO对大鼠不同程度视神经损伤修复的实验研究[D]. 张晓雯. 青岛大学, 2017(06)
- [8]骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脑出血及调控自噬流和轴突再生的机制研究[D]. 崔昌萌. 河北医科大学, 2017(08)
- [9]移植脾组织血管神经生成规律的动态观察[J]. 郭光金,张坤,蒋登金,左艳芳. 中国组织工程研究与临床康复, 2007(38)
- [10]脑脉通联合骨髓间充质干细胞移植对脑缺血再灌注大鼠神经细胞再生的影响[D]. 刘敬霞. 北京中医药大学, 2007(04)