一、我国学者率先发现人体表皮细胞存在逆分化现象（论文文献综述）
陈润开[1]（2020）在《基于工程化汗腺类器官实现创面功能性修复的初步研究》文中研究表明目的（1）探究肾上腺素受体（β2-adrenergic receptor,β2-AR）信号通路提高表皮角质细胞干性潜能（2）实现人表皮角质细胞谱系重编程为汗腺样细胞（3）探究汗腺类器官的体外构建与维持方法（4）建立裸鼠烫伤模型进行体内移植实验,验证汗腺类器官促进汗腺再生以及加速皮肤创面愈合的作用方法（1）选用人表皮角质细胞（human epidermal keratinocyte,HEK）和人永生化表皮细胞（human immortalized keratinocyte,Ha Ca T）系进行体外细胞实验。使用异丙肾上腺素（isoproterenol）在体外激活β2-AR信号通路,通过高通量测序筛选出HEK细胞干性相关基因并进行转录组学分析。进一步的,使用isoproterenol和β2-AR选择性抑制剂ICI-118,551在体外激活或抑制β2-AR的表达水平,通过蛋白免疫印迹法（Western blot）和逆转录定量聚合酶链反应（RT-PCR）等方法分别从蛋白和RNA水平验证已筛选出的重点基因在HEK、Ha Ca T细胞中的表达,验证β2-AR信号通路提高HEK、Ha Ca T细胞干性的作用。（2）构建过表达EDA基因质粒,通过慢病毒转染方式获得过表达EDA基因HEK细胞系,并命名为HEK-E;再设计含人外胚层发育不良（ectodysplasin,EDA）基因的启动子序列,借助CRISPR/d Cas9技术,获得内源性上调EDA基因的Ha Ca T细胞系,并命名为Ha Ca T-E;RT-PCR、Western blot免疫荧光染色检测鉴定汗腺细胞标记物的表达,透射电镜观察细胞超微结构。（3）将HEK-E和Ha Ca T-E细胞种植于基质胶（Matrigel）中使用汗腺专用培养基诱导,进行体外三维环境培养,待细胞增殖发育形成圆形囊状结构（cluster）后进行固定,免疫荧光染色鉴定汗腺细胞标记物。将cluster移植至微型流体控制系统（微流控芯片）中在具有小分子浓度梯度的汗腺专用培养基中诱导培养后进行固定,免疫荧光染色鉴定汗腺细胞标记物。（4）建立BALB/c Nude小鼠脚掌烫伤模型,分别给予汗腺培养基（Sw G-specific medium,m Sw G-M）、汗腺样细胞（induced Sw G cells,i Sw G）以及汗腺类器官（i Sw G-derived spheroids,i Sw GO）注射移植。对移植后第3、7、14天残余创面面积进行测量计算并绘制创面愈合曲线图。移植试验3周后进行碘-淀粉发汗试验检测发汗情况。对发汗试验阳性的鼠掌进行组织HE染色和免疫荧光染色,观察汗腺再生情况。结果（1）对RNA-seq结果进行转录组学分析发现,经isoproterenol激动后HEK细胞干性基因上调明显,并且能够促进HEK细胞向腺体发育分化。进一步的,HEK、Ha Ca T细胞重点干性基因SOX9、OCT4、LGR5、LGR6经过RT-PCR和Western blot双重验证在显示相较于对照组上调明显,且isoproterenol作用可被β2-AR选择性抑制剂ICI-118,551抑制。结果表明,β2-AR激动剂isoproterenol具有提高HEK、Ha Ca T细胞干性潜能的作用。（2）慢病毒包装EDA质粒后转染HEK细胞,筛选后获得HEK-E细胞GFP表达阳性。经过RT-PCR和Western blot的验证证实EDA表达明显升高;慢病毒分别包装sg RNA质粒和d Cas9质粒依次转染Ha Ca T细胞,筛选获得的阳性细胞Ha Ca T-E表达绿色荧光蛋白（GFP）且具有G418抗性;经过汗腺培养基诱导后CK18、CK19、α-SMA等汗腺标记物表达阳性。透射电镜可见微绒毛结构。结果表明HEK和Ha Ca T成功重编程汗腺为样细胞。（3）HEK-E和Ha Ca T-E细胞在含有汗腺培养基的基质胶中诱导后发育形成汗腺类器官,免疫荧光染色显示CK18、CK19、α-SMA、APQ5、NA-K-ATPase表达阳性。将汗腺类器官移植到微流控芯片中继续培养,其形态由圆形囊状结构发育为具有长轴的管腔结构,免疫荧光染色显示CK19、α-SMA表达阳性。结果表明经过基质胶三维培养后已形成具有水盐代谢功能的汗腺类器官,再通过微流控提供的具有小分子梯度的培养基中被定向诱导成了更加接近原生汗腺的汗腺样结构。（4）裸鼠烫伤模型证实i Sw GO相较于m Sw G-M和i Sw G能够加速脚掌烫伤创面愈合。移植试验3周后进行碘-淀粉发汗试验显示i Sw GO组出现阳性表现。而另外两组无阳性表现。对三组鼠掌进行HE染色,结构显示i Sw GO组出现汗腺样结构,进一步的组织免疫荧光染色显示汗腺样组织GFP阳性,同时表达CK18和α-SMA。结论本研究对isoproterenol影响表皮角质细胞干性潜能进行了初步探索,发现isoproterenol具有提升表皮角质细胞干性的作用。以此为基础利用表皮角质细胞重编程为汗腺样细胞降低了跨谱系难度,提高了重编程效率。此外,我们利用重编程来源的汗腺样细胞进行体外汗腺类器官培养,并借助微流控芯片定向诱导实现了汗腺再生。为今后汗腺再生的研究与治疗提供了新的思路。
孙碧韶[2]（2019）在《尿源干细胞及其外泌体在化疗药物导致的泌尿系损伤中的应用研究》文中认为背景及目的:化疗药物的临床应用常伴随着一系列的不良反应,造成多器官、多系统损伤,严重影响患者的化疗疗效和预后。在泌尿系统,化疗药物导致的损伤主要表现为急性肾损伤（acute kidney injury,AKI）和出血性膀胱炎（hemorrhagic cystitis,HC）,具有代表性的化疗药物分别是顺铂和环磷酰胺。目前临床上针对AKI和HC的治疗手段疗效有限,以间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）应用为代表的干细胞技术为其治疗带来了希望,然而MSCs在泌尿系统的应用仍存在障碍。尿源干细胞（urine-derived stem cells,USCs）是相比于MSCs更适用于泌尿系疾病的种子细胞,USCs及USCs分泌的外泌体（exosomes secreted from urine-derived stem cells,USCs-Exo）在多种泌尿系疾病中具有治疗作用,而在化疗药物导致的AKI、HC等泌尿系损伤中的应用尚缺乏探索。本研究旨在探索USCs及USCs-Exo在化疗药物导致的泌尿系损伤中的应用效果,并初步探讨其机制,为临床治疗这类疾病提供新的思路与参考。方法:第一部分:探索USCs在顺铂诱导的大鼠AKI模型中的治疗作用并初步探讨其机制收集6名健康男性的无菌尿液用于USCs的提取及培养。CCK-8实验检测USCs的生长曲线;流式细胞术、免疫荧光检测USCs的表面标志物表达;诱导分化实验检测USCs的多向分化能力;绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）慢病毒转染USCs用于示踪。取30只野生型雌性Sprague-Dawley大鼠随机分为对照组、模型组及治疗组,通过单次腹腔注射顺铂（5 mg/kg）的方式诱导大鼠AKI模型,模型建立后第1天通过尾静脉注射应用2×106 USCs作为治疗。第2、4天各处死1只大鼠,共聚焦显微镜下检测肾组织中GFP标记的USCs,第4天处死所有大鼠,摘眼球取血,取肾组织。血生化检测大鼠血清（serum creatinine,SCr）及尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）的水平;HE及PAS染色观察大鼠肾组织学损伤变化,采用肾小管损伤评分、肾小球损伤计数、PAS阳性面积比评估大鼠肾组织学损伤程度;透射电镜观察大鼠肾脏超微结构的改变;Ki67免疫组化、TUNEL染色观察大鼠肾组织增殖及凋亡的变化;Western Blot实验检测大鼠肾组织TNF-α、IL-6、NF-κB、BCL-2、BAX、cleaved caspase-3的表达变化。采用梯度浓度的顺铂诱导大鼠肾上皮NRK-52E细胞损伤,CCK-8实验检测顺铂的细胞毒性,流式细胞术检测细胞周期,选取合适的浓度诱导后续细胞损伤模型;细胞模型构建后与USCs共培养,CCK-8实验检测损伤细胞增殖活性的变化、流式细胞术检测细胞周期及凋亡的变化。第二部分:探索USCs-Exo在环磷酰胺诱导的小鼠膀胱炎模型中的治疗作用并初步探讨其机制用去除外泌体的胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）的培养基培养USCs,2天后收集上清,超速离心法提取USCs-Exo,透射电镜观察外泌体形态;粒径分析检测外泌体粒径分布;Western Blot实验检测外泌体标志蛋白。取45只野生型雌性C57BL/6小鼠随机分为对照组、模型组及治疗组,通过隔日注射1次,共4次的方式腹腔注射80 mg/kg的环磷酰胺诱导小鼠膀胱炎模型。模型建立后的第1天,通过尾静脉注射含100μg总蛋白的USCs-Exo悬液作为治疗,第4天处死所有小鼠取膀胱。HE染色观察膀胱组织学损伤变化,软件测量膀胱上皮厚度及黏膜下层的距离;甲苯胺蓝染色观察膀胱组织肥大细胞浸润变化;Ki67免疫组化观察膀胱黏膜增殖的变化;TUNEL染色观察膀胱黏膜凋亡的变化;扫描电镜观察膀胱黏膜管腔面上皮超微结构改变;Western Blot实验检测膀胱组织中TNF-α、IL-6、IL-10、NOX2、cleaved caspase-3的表达变化;尿动力学实验检测膀胱排尿功能变化。用100 ng/mL的脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）诱导人膀胱上皮SV-HUC-1细胞的炎症模型,用PKH67染色的USCs-Exo与SV-HUC-1共培养,激光共聚焦显微镜下观察LPS诱导的SV-HUC-1对USCs-Exo的吸收;CCK-8实验检测SV-HUC-1细胞增殖活性的变化,划痕实验检测SV-HUC-1细胞迁移能力的变化。提取USCs-Exo及相应USCs中的RNA,small RNA测序探讨可能的机制。结果:1.我们提取的USCs呈指数生长,可快速增殖;表达与MSCs类似的表面标志物CD44、CD73、CD105、CD133;不表达造血干细胞表面标志物CD31、CD34、CD45;表达胚胎干细胞表面标志物SSEA4;表达肾周细胞表面标志物CD146、PDGFRB、NG2;能向平滑肌和上皮细胞分化。在USCs治疗后,大鼠血清BUN、SCr水平显着降低;肾小管损伤评分、肾小球损伤计数、PAS阳性面积比明显降低;大鼠肾脏超微结构明显改善;肾小管上皮细胞增殖增加、凋亡减少;在第2、第4天均可在肾组织中发现GFP标记的USCs;TNF-α、IL-6、NF-κB、BAX、cleaved caspase-3的表达水平明显降低,BCL-2的表达水平明显升高。梯度浓度的顺铂均可导致NRK-52E细胞增殖活性降低、细胞周期阻滞。选择10μM、20μM诱导体外模型,与USCs共培养后,诱导的NRK-52E细胞增殖活性显着升高、细胞周期阻滞改善,细胞凋亡率显着下降。2.我们提取的USCs-Exo电镜下呈典型的“杯盘状”形态;粒径分布在80200 nm;表达外泌体标志蛋白CD9、CD63。在USCs-Exo治疗后,小鼠膀胱黏膜上皮厚度减少、黏膜下层距离明显降低;肥大细胞浸润明显减少;黏膜上皮增殖率降低、凋亡率减少;膀胱上皮管腔面的超微结构明显改善;TNF-α、IL-6、cleaved caspase-3及NOX2的表达水平均下降、而IL-10的表达水平升高;小鼠排尿间隔延长、最大排尿压下降。LPS诱导的SV-HUC-1细胞可吸收USCs-Exo,与USCs-Exo共培养后,增殖活性增强、迁移能力增强。small RNA测序提示USCs-Exo中的microRNA可能是其发挥治疗作用的机制所在。结论:1.USCs可通过减轻炎症反应,抑制肾小管上皮细胞凋亡,促进肾小管上皮细胞增殖,从而在体内和体外减轻顺铂诱导的AKI大鼠模型的肾损伤;2.USCs对AKI大鼠模型的治疗作用可能是通过USCs直接向肾组织归巢分化或通过旁分泌方式发挥作用;3.USCs-Exo可通过减轻炎症反应及氧化应激、抑制膀胱上皮细胞的病理性增生及凋亡、及促进膀胱上皮细胞的迁移及分化,从而减轻环磷酰胺诱导的小鼠膀胱炎,促进其排尿功能的恢复;4.USCs-Exo对膀胱炎小鼠模型的治疗作用很可能与其所含有的microRNA有关。
田博仁[3]（2019）在《基质刚度对肝癌细胞癌干细胞表型的影响及分子机制初探》文中提出癌症是严重危害人类生命的恶性疾病,每年导致的死亡人数仅次于心脑血管疾病。肝癌恶性程度高,预后差,致死率高。在中国,肝癌的发病率和死亡率远远高于世界平均水平。肝癌干细胞（Liver cancer stem cells,LCSCs）是肝癌细胞中数量极少的一群细胞,具有自我更新能力和转移潜能,对药物和放射治疗不敏感,在肝癌的转移和复发中起关键作用。研究表明,癌干细胞（Cancer stem cells,CSCs）具有表型可塑性,即癌细胞可以在一定条件下转换为CSCs,而CSCs也可以分化为癌细胞。这两者表型之间如何转换,在什么条件下相互转换?目前的研究仍存在争议。以往的研究表明力学因素能够影响干细胞的分化,例如不同的基质刚度能够诱导间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）分化为不同类型的细胞。由于癌干细胞和正常干细胞具有类似性,研究者们也发现了力学因素能够诱导CSCs分化为癌细胞或者诱导癌细胞向CSCs方向逆转化。例如流体剪切力可以诱导LCSCs分化为肝癌细胞,流体剪切力可以诱导肺癌细胞获得癌干细胞表型。这些结果都表明力学因素能够引起癌细胞/CSCs表型的变化。肝癌组织具有力学异质性,即肝癌组织的基质刚度分布并不是均一性的。在一个肿瘤组织中,肿瘤组织边缘和内部位置的基质刚度具有明显的差异,同时CSCs在一个组织内部的分布也是不均匀的。此外,肝纤维或肝硬化引起的肝基质刚度增加往往会引起肝脏组织癌变,肝癌组织的刚度远远高于正常肝组织。两方面的原因都提示肝癌的发生发展与基质刚度有直接联系。而在这其中基质刚度是否能够影响肝癌细胞的癌干细胞表型,目前的研究报道仍很少。整合素β1（Integrin-β1）是一种跨膜蛋白,在以往的研究中被认为是一种力敏感分子,能够调节细胞的迁移、增殖、粘附能力等。Integrin-β1在近年来的研究中被发现在癌症的发生发展中起到了重要的作用。同时也有部分文献显示Integrin-β1能够调控癌细胞的癌干细胞表型。基于此,本文考察了基质刚度对肝癌细胞癌干细胞表型的影响,对其中的分子机制进行了探索。主要的研究内容和结果如下:（1）不同刚度基质细胞培养模型的构建本文采用聚丙稀酰胺（Polyacrylamide,PA）水凝胶构建实验模型。通过调节配方中丙烯酰胺（Acrylamide）和双丙烯酰胺（Bis-acrylamide,Bis）的配比来构建不同刚度的水凝胶。本文构建的聚丙烯酰胺水凝胶的刚度可控,能够模拟正常肝脏（5.9 kPa）或病变肝脏（24.8 kPa、48.1 kPa）的基质刚度。在刚度可控的同时为细胞提供良好的生长界面。为研究肝脏病变力学机制提供了一个新的体外研究平台。（2）基质刚度对肝癌细胞癌干细胞表型的影响为探究基质刚度能否影响肝癌细胞癌干细胞表型,本文通过形态学、细胞骨架、干细胞相关基因、肝癌干细胞表面标志分子、侧群细胞（Side population cells,SP）、细胞周期、成球能力、克隆形成能力、耐药性、裸鼠成瘤能力等多个方面来综合考察癌干细胞表型是否发生变化。结果发现,5.9 kPa的基质刚度能够使细胞铺展减少、骨架聚合减少,增加细胞的癌干细胞相关基因Oct-4、Sox-2、CXCR4的表达和肝癌干细胞表面标志分子CD133和CD90阳性细胞数量,聚集更多的SP细胞。细胞在5.9 kPa的基质上具有更缓慢的细胞周期、更强的成球能力和克隆形成能力。5.9 kPa的基质刚度能够使细胞在药物索拉菲尼和5-氟尿嘧啶的处理下保持较强的克隆形成能力。最后研究从动物模型上证明了在5.9 kPa基质刚度上培养的肝癌细胞具有更强的致瘤能力。实验结果表明,较软的（5.9 kPa）基质刚度能够诱导肝癌细胞MHCC97H的癌干细胞表型的增加。（3）基质刚度诱导肝癌细胞癌干细胞表型的机制本文通过检测发现随着基质刚度的增加Integrin-β1的表达逐渐降低,提示到Integrin-β1可能与癌干细胞表型的变化有联系。实验通过siRNA干扰技术成功敲减Integrin-β1的表达,干扰了Integrin-β1的表达之后,5.9 kPa的基质刚度增加干细胞相关基因表达和肝癌干细胞表面标志物阳性数量增高的现象受到了抑制。实验结果提示,较软的（5.9 kPa）基质刚度可能是通过介导Integrin-β1的表达增加上调肝癌干细胞标志物CD90、CD133的表达。本文的结果表明,较软的（5.9 kPa）基质刚度能够诱导肝癌细胞的癌干细胞表型的增加,其中可能是通过介导Integrin-β1表达的增加上调肝癌干细胞标志物CD90、CD133的表达。
周春雷[4]（2015）在《日本血吸虫感染小鼠肝星状细胞功能分化的研究》文中研究表明日本血吸虫病（Schistosomiasis japonica）严重危害人体健康,截止到2012年底,我国大约还有24万的血吸虫病患者。血吸虫的生活史复杂,其在体内发育的各个阶段的排泄分泌抗原都可以引起的宿主免疫病理反应,其中Th1/Th2型细胞应答在感染过程中发挥重要作用。肝脏虫卵肉芽肿反应以及继发的肝纤维化是血吸虫病的主要病理损伤。HSCs（hepatic stellate cells,肝星状细胞）的活化是肝纤维化发生的中心环节。除了已经被证实具有储存脂滴和参与纤维化的功能外,HSCs还有其他重要的功能如参与肝脏免疫反应等。近来的研究发现,HSCs在肝脏中具有异质性和可塑性,存在不同细胞表型和功能的亚群。因此,研究在日本血吸虫感染过程中,不同亚群的HSCs发挥的功能作用,有助于加深对肝纤维化发病机制的认识。吡喹酮（Praziquantel）作为首选的抗血吸虫药物,具有高效、低毒、副作用少的特点。除对吸虫、绦虫等蠕虫具有杀虫作用外,近年来有研究者提出吡喹酮可以直接作用于宿主组织和细胞发挥药效。本实验室前期研究发现,在日本血吸虫感染小鼠模型中,吡喹酮长疗程治疗可以抑制肝脏纤维化的发展。本研究将从不同亚群的HSCs入手,研究吡喹酮对其功能的影响,进一步揭示吡喹酮发挥抗纤维化作用的机制。miRNA（microRNA,小RNA）是一类高度保守的非编码小RNA,通过其种子序列与靶基因的3’UTR端互补序列结合,抑制靶基因的转录后翻译过程,从而调控一系列生理和病理过程。miRNA在多种因素引起的肝病及肝纤维化的发生发展中发挥重要的调控作用。研究发现,miRNA-454在日本血吸虫感染过程中表达下降,通过与靶基因smad4的3’UTR端互补,可以抑制HSCs的活化。我们通过观察日本血吸虫感染过程中HSCs miRNA的动态变化,分析参与HSCs活化的miRNA,及其在不同HSCs亚群中可能发挥的调控作用。本课题以HSCs为研究对象,研究其在日本血吸虫感染过程中的功能特征。首先,我们建立了日本血吸虫感染小鼠模型,观察感染过程中HSCs的功能亚群分化特征及其可能机制;接着,我们建立日本血吸虫病慢性期小鼠模型,给予吡喹酮长疗程治疗,观察其对不同HSCs亚群功能的影响;最后,我们利用miRNA表达谱芯片,研究感染过程中HSCs miRNA的动态变化,寻找与功能分化相关的miRNA。本研究获得如下主要结果:1.日本血吸虫感染过程中活化的HSCs具有功能可塑性本研究发现,感染过程中HSCs表面MHC II类分子及免疫共刺激分子CD80、CD86、B7-H1表达明显上调,提示活化的HSCs具有免疫细胞的功能,参与肝脏免疫应答;同时,感染过程中HSCs的α-SMA、Col1a1的基因表达水平也明显上升,提示活化的HSCs具有肌成纤维样细胞的功能,发挥促纤维化作用。以上结果提示,日本血吸虫感染过程中活化的HSCs功能具有可塑性。2.日本血吸虫感染过程中活化的HSCs功能分化,可以分为MHC II+/-两群HSCs文献报道,HSCs在肝脏不同位置、正常或肝损伤时存在功能差异,其结构和功能具有异质性。我们推测在日本血吸虫感染过程中活化的HSCs功能分化,存在不同的细胞亚群。我们利用磁珠分选的方法,以MHC II类分子为标记,将日本血吸虫感染小鼠HSCs分为MHC II+/-两群HSCs。研究发现,MHC II+/-两群HSCs的LRAT、维生素A表达的水平无统计学差异,提示在日本血吸虫感染过程中MHC II+/-两群HSCs都是来源于静息态HSCs,参与维生素A的储存和代谢功能。而MHC II-HSCs表达α-SMA的水平明显高于MHC II+HSC,提示两群细胞活化后的状态存在异质性,MHC II-HSCs具有肌成纤维样细胞的特征。进一步研究MHC II+/-两群HSCs功能,我们发现在感染过程中MHC II+HSCs表面CD80、CD86、B7-H1表达水平明显高于MHC II-HSCs,而MHC II-HSCs的α-SMA、Col1a1、TIMP1表达水平明显高于MHC II+HSC。上述研究结果提示,在日本血吸虫感染过程中存在细胞表型和功能异质性的MHC II+/-两群HSCs,MHC II+HSCs具有免疫学功能,参与T淋巴细胞应答,MHC II-HSCs具有肌成纤维样细胞功能,发挥促纤维化作用。3.血吸虫感染过程中MHC II+/-两群HSCs的功能分化可能受IFN-γ调控本研究发现,在日本血吸虫感染过程中,IFN-γ在感染早期表达水平开始上升,与HSCs MHC II类分子的表达具有时间一致性,推测HSCs的功能分化可能与IFN-γ有关。体外用IFN-γ刺激各种不同状态的HSCs,均可以上调MHC II和CIITA的表达水平,下调纤维化相关Col1a1基因的表达水平;IFN-γ-/-小鼠感染血吸虫后相比于野生型小鼠HSCs MHC II的表达水平明显下降。以上结果表明,IFN-γ可以诱导HSCs细胞表型改变,促进MHC II-HSCs向MHC II+HSCs的转化,提示日本血吸虫感染过程中HSCs的功能分化可能受IFN-γ调控。4.吡喹酮通过作用于MHC II-HSCs,发挥抗纤维化功能最近有学者认为,吡喹酮可以直接作用于宿主的组织和细胞发挥药效。本实验室前期研究发现,在日本血吸虫感染小鼠模型中,吡喹酮长疗程治疗可以抑制肝纤维化的发展。我们通过对感染慢性期（12W）小鼠进行持续4W的吡喹酮长疗程治疗,观察吡喹酮对不同亚群的HSCs影响。结果发现,吡喹酮可以抑制HSCs MHC II类分子和CD86的表达。结合前期的研究结果推测,吡喹酮可以通过抑制Th1类细胞因子IFN-γ的分泌,下调MHC II类分子的表达。同时,吡喹酮还能抑制MHC II-HSCs纤维化相关基因α-SMA、Col1a1、Timp1的表达,提示吡喹酮抗纤维化功能与MHC II-HSCs有关。进一步研究吡喹酮对MHC II+/-两群HSCs功能影响的可能机制,我们观察了吡喹酮治疗后两群细胞的凋亡情况,结果发现MHC II+/-两群HSCs不存在凋亡率升高或降低现象。以上结果提示,吡喹酮发挥抗纤维化作用是通过作用于MHC II-HSCs,下调其纤维化相关基因表达,并不影响HSCs的凋亡。5.感染过程中HSCs的miRNA动态表达谱及与功能分化相关的miRNA为了研究在日本血吸虫感染过程中HSCs miRNA的动态变化,以及差异miRNA在不同HSCs亚群中可能发挥的调控作用,我们利用miRNA表达谱芯片检测,结果发现日本血吸虫感染早期,HSCs miRNA表达已发生明显变化,其中17个miRNA表达上调、22个miRNA表达下调。进一步利用pathway分析差异miRNA,发现富集度高的信号通路包括MAPK信号通路、调节肌动蛋白细胞骨架信号通路、PI3K-AKT信号通路等。在日本血吸虫感染过程中,可能与HSCs促纤维化功能和免疫功能相关的差异miRNA包括miR-21a-3p、miR-21a-5p、miR-146b-5p、miR-29c-3p、以及miR-217-3p。靶基因预测发现miR-21a-5p与smad7的3’UTR端结合互补,抑制smad7的翻译;而miR-217-3p可以与STAT1的3’UTR端结合互补,抑制STAT1的翻译。qRT-PCR检测miRNA的表达水平,结果发现miR-21a-5p在感染过程中持续升高,且在MHC II-HSCs中表达水平明显高于MHC II+HSCs,提示miR-21a-5p可能通过活化TGF-β/Smad信号通路,促进HSCs向MHC II-HSCs转化;miR-217-3p在感染过程中表达下降,且在MHC II+HSCs中表达水平低于MHC II-HSCs,提示miR-217-3p可能通过活化IFN-γ/STAT1信号通路,促进HSCs向MHC II+HSCs转化。miRNA可能通过调控转录后翻译水平,参与调控MHC II+/-两群HSCs功能分化。综上所述,本研究发现,在日本血吸虫感染过程中活化的HSCs存在异质性,可以分为MHC II+/-两群HSCs,且在感染过程中的功能分化可能受IFN-γ调控;利用吡喹酮长疗程治疗模型,发现吡喹酮主要通过作用于MHC II-HSCs,通过下调纤维化相关基因表达从而发挥抗纤维化作用;同时,利用miRNA芯片分析感染过程中HSCs的动态表达谱,初步揭示了可能调控分化的miRNA。研究结果有助于我们从一个新的角度认识日本血吸虫感染过程中HSCs的功能,为抗纤维化治疗提供新的理论基础和实验依据。
王瑶[5]（2013）在《毛囊干细胞的多分化潜能及其向汗腺细胞分化的实验研究》文中指出干细胞（stem cells）维持着生命体组织器官的发生发展以及损伤的修复与再生,随着近年来再生医学的迅猛发展,干细胞治疗在临床中的应用日益广泛,疗效显着,已成为很多难治性疾病的终极治疗手段,干细胞的研究已经成为全国乃至全世界的研究热点。在下文中我们将以毛囊干细胞这一成体干细胞为研究主体,对其生物学特性及其在再生医学中的应用进行研究实验,以期证明毛囊干细胞为再生医学干细胞治疗的理想干细胞源。实验目的：1.体外分离培养并扩增毛囊干细胞（hair follicle stem cells,HFSCs）,建立一种快速高效的细胞培养体系,为后续试验奠定基础；2.通过体外诱导实验,将HFSCs定向诱导为皮脂腺细胞及表皮角质形成细胞,验证HFSCs的多分化潜能；3.证实HFSCs经过特殊共培养体系诱导后,可以分化为汗腺样细胞（sweat gland cells,SGCs）,并可参与汗腺（sweat gland,SG）的修复与再生；4.以HFSCs为种子细胞构建结构和功能更趋于完整的组织工程全层皮肤。实验方法：1.分别用“酶消化-毛囊剥离-直接种植法”及“酶消化-毛囊剥离-酶消化”两种方法体外分离HFSCs,并将毛囊组织或细胞植入铺有IV型胶原,以丝裂霉素C处理过的成纤维细胞为饲养层的transwell双层细胞培养板中,观察对比两组中细胞的形态、生长特性、及体外扩增能力的异同,并通过CD200、CD29、CK15等HFSCs特异性标记物的免疫细胞化学染色、免疫细胞荧光染色及流式细胞技术,分析、鉴定分离培养的HFSCs;2.分别建立两种不同的体外细胞诱导体系,将HFSCs分别诱导分化为皮脂腺细胞、表皮细胞,并通过皮脂腺细胞及表皮细胞特异性标记物的免疫细胞化学、免疫细胞荧光染色及脂质的油红O染色,对诱导后细胞进行表型分析与鉴定；3.体外分离培养人手掌或脚掌来源的SGCs及真皮间充质干细胞（dermal mesenchymal stem cells,d-MSCs）,利用transwell细胞培养板建立了一种特殊的HFSCs共培养体系,主要由热休克的SGCs及一种仿真皮结构的间质组织构成,我们又称之为间质饲养层（mesenchymal feeder layer, M-FL）主要包括d-MSCs、 Matrigel基质胶以及一定比例的优质胎牛血清（FBS）,同时设立两个对照组,对照组1中不包含热休克SGCs,对照组2中不包含M-FL；细胞经过诱导后,应用免疫细胞化学,免疫细胞荧光染色及流式细胞技术对诱导后细胞进行SGCs表型鉴定,对比实验组、对照组1、对照组2中细胞的表型变化情况,同时,通过台盼蓝拒染实验观察各组细胞的生长活性,Edu（5’-ethynyl-2’-deoxyuridine）标记技术对比分析各组中细胞的增殖能力；4.体外建立裸鼠脚掌烫伤模型,将HFSCs诱导来源的汗腺样细胞（induced-sweat gland cells, i-SGCs）移植到裸鼠脚掌的烫伤部观察,并以等量Nacl注射作为对照组,4周后,愈合创面全层皮肤取材,汗腺特异性标记物癌胚抗原（carcino-embryonic antigen,CEA）、细胞角蛋白14（cytokeratin14, CK14）的免疫组化及免疫荧光染色分析判断,观察接受细胞移植的创面皮肤中是否有新生的汗腺结构存在；5.蛋白印迹法（western bolt）、反转录聚合酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR）及实时荧光定量PCR （real-time fluorescent quantitative PCR）检测分析HFSCs诱导前、后的外胚层发育不良（ectodermal dysplasia,EDA）基因及其受体（ectodermal dysplasia receptor,EDAR）的基因及蛋白表达的变化,以进一步探索HFSCs分化为SGCs的分子机制；6.分别以HFSCs （A组）,表皮干细胞（epidermal stem cells,ESCs）（B组）为种子细胞体外建立组织工程学全层皮肤,通过伊红-苏木素（hematoxylin-eosin staining, HE）染色分析两组标本形态结构的异同,观察A组标本中是否有毛囊样结构形成；两组标本分别进行integrin β1（CD29）、细胞角蛋白19（cytokeratin19, CK19）免疫组织化学染色,观察阳性细胞分布多少及分布区域。实验结果：1.“酶消化-毛囊剥离-直接种植法”及“酶消化-毛囊剥离-酶消化”两种细胞分离方法对比结果显示：应用前一种方法培养的第一代细胞生长至80-90%融合的时间为13～14天,而后一种方法为8～9天,但是传代后,从第二代细胞开始,两组细胞的生长速度及增殖能力无明显差异,无统计学意义（p>0.05）2.经过特异性微环境的诱导,HFSCs分别被诱导分化为上皮膜抗原（EMA）及油红染色阳性的皮脂腺细胞,以及细胞角蛋白10（cytokeratin10, CK10）阳性的角质形成细胞；3.在HFSCs汗腺化诱导实验中,实验组中,有一部分HFSCs最终被定向诱导分化成为具有汗腺表型的细胞,对比之下,对照组1中没有细胞分化为SGCs.对照组2中只有极少部分细胞发生了向SGCs的转化；我们利用细胞的特异性标记物,通过免疫荧光染色及流式细胞技术鉴定诱导后细胞,发现在这些细胞中HFSCs特异性标记物CD200、CD29及CK15的表达变弱了,而汗腺细胞特异性标记物CEA和CK14的表达却增强了,这说明HFSCs在设计的共培养微环境中可以实现向SGCs的分化；4. western blot结果显示分化而来的SGCs高表达EDA和EDAR,RT-PCR及实时荧光定量PCR分析显示EDA基因及EDAR基因在诱导后SGCs中呈高表达状态；而CD29、CD200等HFSCs特异性抗原基因在汗腺化诱导后表达降低；5.在随后的细胞移植实验中,接受了细胞注射的裸鼠烫伤脚掌的愈合创面,我们发现了类似SG的新生结构,进而行SGCs特异性标记物的免疫组织化学染色及免疫荧光染色,结果显示这些类似汗腺的结构对CEA、CK14呈阳性表达,而在Nacl注射组的创面标本中,没有发现这种类汗腺结构的存在。6.在以HFSCs为种子细胞的A组及以ESCs为种子细胞的B组标本中,HE染色结果显示,两组标本均由表皮和真皮组成,二者之间以基底层相连接,基底层细胞排列较为整齐,细胞偏大,有CK19+和CD29+细胞散在分布；两组间标本对比显示：A组标本中,表皮层相对于B组较厚,分层较多,而且部分标本在基底层下方有毛囊样结构形成,表皮与真皮结合较紧密；B组标本对比A组来说,表皮层较薄,分层较少,表皮真皮易分离,基底层附近CK19+和CD29+阳性细胞较A组标本少,基底层下浅真皮层中无毛囊样结构形成实验结论：1. HFSCs可以在体外适宜的微环境中被分离、培养、扩增；其中“酶消化-毛囊剥离-酶消化”法较“酶消化-毛囊剥离-直接种植”法缩短了原代细胞的培养时间,在实验中更具优势；2. HFSCs具有多分化潜能,可以在体外被诱导分化为皮脂腺细胞及表皮角质形成细胞；3. HFSCs可以在适宜的微环境中,被诱导分化为SGCs; HFSCs作为一种成体干细胞,有用于治疗汗腺缺失的潜能；我们建立的共培养诱导体系可以有效的将HFSCs定向诱导分化为SGCs,其分子机制与EDA/EDAR基因的激活有关；诱导分化而来的汗腺细胞是有功能的,可以参与皮肤创面中汗腺的再生；4.以HFSCs为种子细胞有望构建出富含皮肤附属器的,形态、结构、功能更趋于完善的组织工程全层皮肤。
吴舒[6]（2013）在《模拟皮肤发育构建含附件组织工程皮肤的初步研究》文中进行了进一步梳理目的：应用刀片刮取法及酶消化法获取胎鼠和小鼠表皮细胞和成纤维细胞，对获得的表皮细胞和成纤维细胞进行培养、鉴定，并应用获得的表皮细胞作为种子细胞，PGA作为支架，初步构建含附件组织工程皮肤，为胎鼠表皮细胞的多向分化潜能提供良好的实验模型，并力求获得生物学性能更完整的组织工程皮肤，为临床应用提供更理想的生物修复材料。方法：对刀片刮取法及酶消化法获取的胎鼠和小鼠表皮细胞，以角质细胞无血清培养基（K-SFM）进行培养，观察细胞生长状况及克隆形成情况，选择Pan-CK多克隆抗体对细胞进行鉴定；对酶消化法获取的胎鼠和小鼠成纤维细胞，以DMEM进行培养，观察细胞生长状况及克隆形成情况，选择vimentin单克隆抗体对细胞进行鉴定；应用培养的表皮细胞、成纤维细胞及PGA支架初步构建组织工程皮肤，观察形成皮肤及附件的情况。结果：1.不同发育阶段胎鼠和小鼠皮肤组织结构观察揭示了皮肤附件的生长发育规律，即在胚胎14.5天（embryo14.5天, E14.5天）时，虽然表皮细胞仅为1-2层，但皮肤附件发育已经开始，E16.5天时是皮肤附件发育最为旺盛的时期，E18.5天皮肤附件发育基本完成，生后7天（postnatal7,P7）时皮肤附件发育成熟。2.应用刀片刮取法能成功获取E14.5天的胎鼠表皮细胞，并能建立稳定的表皮细胞系。3应用酶消化法能分别获取E16.5天，E18.5天，生后7天的胎鼠和小鼠表皮细胞及成纤维细胞，并能建立稳定的细胞系。4.经培养出的E14.5天胎鼠表皮细胞、成纤维细胞和PGA支架构建的组织工程皮肤，组织切片可见人造皮肤大体形态比较接近正常皮肤，表皮分层分化较完善，可见基底层、棘细胞层及角化层。结论：1.通过对不同发育阶段胎鼠和小鼠皮肤组织结构的观察，我们初步掌握了皮肤附件的生长发育规律。2.刀片刮取法是一种获取E14.5天的胎鼠表皮细胞较好的方法，可以得到数量较多，细胞活力较好的E14.5天的胎鼠表皮干细胞。3.消化法是一种获得E16.5天，E18.5天，生后7天的胎鼠和小鼠表皮细胞及成纤维细胞的稳定的细胞培养技术。4.用E14.5天胎鼠表皮细胞、成纤维细胞和PGA支架构建的组织工程皮肤，表皮结构较好，基本形态比较接近正常皮肤。本实验以PGA为支架，通过胚胎小鼠来提供表皮细胞和真皮成纤维细胞，从而首次构建含附件的组织工程皮肤的模型，为以后构建真正意义上的含附件的组织工程皮肤提供了可靠的理论和实验依据。
盛卸晃[7]（2012）在《刺参多糖对神经细胞作用的研究》文中认为研究背景：神经系统疾病是全球首位致残疾病和第3位主要致死因素。如脑中风会引起大脑损伤区域神经元和神经元连接广泛缺失,导致长期的神经功能障碍。目前药物干预主要局限在急性期的脑损伤保护,如重组组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）仅适合于急性期恢复脑供血等。尚不能对中风引起的长期神经功能障碍起到有效的治疗和恢复作用。因此,寻找能有效恢复损伤后亚急性其和慢性期神经功能的治疗方法,药物或保健食品意义都非常重大在我国,海参一向被视为药食两用的海产佳品,其中尤以剌参为佳。刺参广泛应用于年老体弱者,记忆力减退着,中风患者术后以及神经退行性疾病患者的保健和恢复。可见刺参对预防神经衰退,增强和恢复神经组织功能发挥积极作用,且食用刺参没有副作用。所以,深入研究刺参活性成分的药理作用对发挥刺参在维护人民身体健康方面具有重要的意义,同时也为刺参产业的发展起积极的作用。本研究从刺参体壁中分离获得具有药理活性的刺参多糖,探讨其对神经细胞的作用方式及其作用机制。实验方法：1.刺参多糖的分离纯化、活性筛选和理化性质鉴定实验采用为蛋白酶/胰蛋白酶双酶解法,乙醇沉淀获得粗多糖,大孔吸附树脂脱色,用DEAE-sepharose阴离子交换柱分离,获得A、B、C、D四个多糖组分,用Sephacryl S-200凝胶进一步春华并脱盐。将分离获得的组分分别用神经干细胞球迁移实验（HS-3活性最好）和星形胶质细胞活化进行活性筛选（HS-4活性最好）。选取有活性的单一糖组分进行理化性质鉴定，采用HPLC法做纯度检查，自动旋光仪检测比旋光度，苯酚硫酸法检测总糖含量，硫酸咔唑法检测糖醛酸含量,明胶BaCl2法检测硫酸根含量, Bradford法检测蛋白质含量,凝胶色谱法检测多糖分子量。2、HS-3促进神经干细胞球迁移作用研究。本实验从孕14.5天胎鼠大脑皮层分离神经干细胞,培养在含EGF、FGF-2的培养基中。相差显微镜测量HS-3在基础培养基中（无EGF/FGF-2）促进神经干细胞球迁移的距离,用Hoechst/PI双染法检测细胞存活情况,用BrdU labeling法检测细胞的增殖状态,免疫荧光法观察神经干细胞在含HS-3的培养基中的分化状态,用信号通路抑制剂（P13K抑制剂LY294002, ERK抑制剂PD98059,BMP抑制剂noggin）、Western blotting和RT-PCR技术检测HS-3诱导细胞粘附和迁移可能的作用机制。3、HS-4与FGF-2协同诱导星形胶质细胞活化作用研究星形胶质细胞活化主要包括三个方面：1)细胞形态变化；2)细胞由静息期进入细胞分裂期,细胞增殖；3)细胞发生迁移。本实验从新生大鼠大脑中经胰酶消化分离,机械振荡法纯化获得星形胶质细胞。首先通过MTT法检测HS-4对细胞的毒性作用以确定后续试验的使用浓度和作用时间。用伊红染色和免疫荧光染色法观察HS/FGF-2诱导细胞的形态变化,western blotting检测星形胶质细胞特征蛋白GFAP的表达情况。BrdU插入法检测细胞增叭,流式细胞术检测细胞周期变化情况,Western blotting检测细胞周期调控蛋白ICyc D1农达水平Transwell法检测HS-4/FGF-2促进细胞迁移作用。用细胞通路各抑制剂（Rho通路抑制剂Y27632, PI3K抑制剂LY294002, ERK抑制剂PD98059,P38抑制剂SB203580, JNK抑制剂SP600125）、免疫荧光和Western blotting技术检测HS-4/FGF-2诱导细胞形态变化可能的作用机制。实验结果：l、刺参多糖的分离纯化与理化性质鉴定本实验通过离子交换色谱分离获得四个多糖组分,经细胞活性检测确定HS-3具有促进神经干细胞球迁移和分化作用：HS-4对诱导星形胶质细胞活化的作用效果最为显着经鉴定,HS-3的理化性质为：HPLC检测确定其为均一物质,分子量约为1.79×102Da,旋光度为[α]D20-48.62°（c0.1, H2O）,总糖含量为57.18%,酸性多糖含量为12.39%,SO42-含量为29.75%。HS-4的理化性质为：分子量为4.23×105Da,总糖含量为38.12%,酸性多糖含量为16.52%,硫酸根含量为32.64%,单糖组分主要以岩藻糖为主,还含有小部分半乳糖,不含蛋白质和核酸。2、HS-3促进神经干细胞球迁移作用研究。从胎龄为E14.5d胚胎大脑皮层中提取的神经干细胞,在含有外源性生长因子bFGF和EGF存在的条件下细胞会分裂增殖,聚集成团,即神经细胞球。经鉴定提取的神经干细胞BrdU染色呈阳性,Nestin荧光染色呈阳性,经含.2%胎牛血清诱导后可以分化为星形胶质细胞（GFAP阳性）和神经元细胞（TUJ1阳性）。HS-3能诱导神经球在末铺P-L-L的培养板中粘附和迁移,迁移距离呈现浓度依赖性,在80μg/mL HS-3作用72h后,神经球的迁移距离为438μm。HS-3还能有效维持神经球在撤离生长因子后细胞的存活。在HS-3的刺激下，神经干细胞能分化为神经元和星形胶质细胞,浓度增加,分化为神经元的比例增大；且更有意义的是分化的神经元细胞能沿着神经球轴线向外迁移,而分化的星形胶质细胞滞留在神经球中,。PD98059和Noggin对HS-3介导的细胞迁移没有影响,而LY294002能有效抑制神经球的迁移（P<0.01），且LY294002的预处理能有效抑制HS-3诱导的Akt （ser-473）蛋白磷酸化水平的升高及N-cadherin蛋白表达水平的升高。因此,HS-3诱导神经球迁移可能的作用机制是通过N-cadherin蛋白介导的,PI3K/Akt活化的信号通路。3、HS-4与FGF-2协同诱导星形胶质细胞活化作用研究从新生大鼠大脑中分离的星形胶质细胞经机械振荡法纯化后,GFAP染色鉴定阳性率在97%以上,体外培养的细胞在体外传代2次以后,细胞骨架发生变化,形态转变为多角形,边界模糊,细胞计入G0/G1期,处于细胞静息状态。HS-4联合FGF-2共同作用后胶质细胞形态发生转变,由静息状态的多角兴,边界模糊,无明显突触突起转变为有多个突触突起,细胞呈星形,边界清晰,细胞染色变亮。Western blotting检测GFAP蛋白表达水平显着提高。表明HS/FGF-2刺激后细胞骨架蛋白发生重组,形态改变。细胞BrdU阳性率显着上升,山对照组的13.047增加剂到55.29%,表明经HS-4诱导后大部分细胞进入细胞分裂期。流式细胞术检测细胞周期显示,经HS/FGF-2处理后,大量细胞由G0/G1进入S期,细胞周期素Cyc D1表达水平明显升高。静息态细胞不能穿过Transwell膜,即无迁移活性,经HS/FGF-2诱导活化后的星形胶质细胞具有迁移活性,能穿过Transwell膜。上述结果证实HS-4能诱导星形胶质细胞活化。PI3K抑制剂能轻微抑制HS-4/FGF-2诱导的胶质细胞活化作用,ERK抑制剂能完全抑制星形胶质细胞的活化,JNK抑制剂几乎没有任何抑制作用,而P38抑制剂反而在一定程度上能促进HS-4/FGF-2诱导的活化作用。培养液加入EGTA通过结合Ca2+可以抑制细胞的活化。Rho-Rock抑制剂能迅速促进星形胶质细胞活化。结论：本实验从刺参体壁中获得了两种富含硫酸基的酸性多糖且对神经细胞具有不同的活性作用。其中HS-3促进神经十细胞球的粘附和迁移,维持神经球的存活,诱导细胞分化为神经元和星形胶质细胞,作用机制可能是通过N-cadherin蛋白介导的,激活PI3K/Akt信号通路完成。HS-4与FGF-2能协同诱导星形胶质细胞的活化,由静息态转变为活化态。具体表现为细胞形态变化,细胞增殖和迁移作用。HS-4诱导星形胶质细胞活化可能足通过活化ERK激酶,抑制Rho活性,使细胞骨架蛋白重组,细胞形态发生变化；ERK激酶活化核内的转录因子,如Cyc D1,细胞由G0/G1期向S期转变，促进细胞增殖。
梁黎明[8]（2007）在《激光微孔异种（猪）脱细胞真皮基质的研制与应用》文中研究表明目的：探讨不同波长激光器用于猪脱细胞真皮基质（porcine acellular dermis matrix，PADM）打孔的可行性，确定打孔用的最佳激光器及其作用参数；制备不同规格激光微孔PADM并确定其最佳规格，以提高创面修复质量；探讨激光微孔PADM接种成纤维细胞构建活性真皮基质的可行性。方法：1．采用胰蛋白酶／Triton X-100的方法制备PADM，选择三倍频Nd∶YAG激光器、光纤激光器及CO2激光器，分别采用复制法及轮廓迂回法，对干燥及湿润的PADM进行打孔，观察各组真皮基质微孔形成情况，计算真皮基质皱缩率和热损伤率；在三倍频Nd∶YAG激光器输出功率、频率等参数固定的前提下，调整激光束扫描速度，测量微孔孔径并计算热损伤率。2．根据孔间距不同，制备4种不同规格的激光微孔PADM。将144只SD大鼠背部制作全层皮肤缺损创面，随机分为6组，每组24只：微孔组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ分别移植孔间距为0.8mm、1.0mm、1.2mm和1.5mm的激光微孔PADM+自体刃厚皮；网状组移植网状PADM+自体刃厚皮；对照组采用单纯自体刃厚皮移植。术后2、4、6周观察各组创面愈合情况，计算移植物成活率和创面收缩率，并行组织学观察。临床上采用激光微孔PADM、网状PADM与自体刃厚皮复合移植，修复瘢痕切除后继发创面9例。3．将人成纤维细胞种植于干燥组及湿润组激光微孔PADM表面，培养后第2、4、6、8、10、12天采用ELISA法测定培养液中TGF-β1和bFGF的含量。结果：1．复制法打孔的真皮基质内微孔呈圆形或椭圆形，大小不一致，轮廓迂回法的微孔均为规则圆形，大小较一致。打孔后干燥组真皮基质皱缩不明显；湿润组真皮基质发生不同程度的皱缩，复制法打孔时，光纤激光器组真皮基质的皱缩率明显高于CO2激光器组（P＜0.05），轮廓迂回法打孔时，三倍频Nd∶YAG激光器组真皮基质的皱缩率明显高于光纤激光器组和CO2激光器组（P＜0.05）。复制法打孔时，光纤激光器对湿润组真皮基质的热损伤率明显高于CO2激光器（P＜0.05），而对干燥组真皮基质的热损伤率两者差异无统计学意义（P＞0.05）。轮廓迂回法打孔时，三倍频Nd∶YAG激光器对湿润组真皮基质的热损伤率最高，光纤激光器次之，CO2激光器最低；而三倍频Nd∶YAG激光器对干燥组真皮基质的热损伤率最低，光纤激光器次之，CO2激光器最高。三倍频Nd∶YAG激光器扫描速度小于或等于80mm／s，热损伤率较低，微孔孔径变化不明显；随着扫描速度的加快，热损伤率增大，孔径随之增大；当扫描速度加快至500mm／s，孔径开始缩小，当扫描速度为600mm／s，激光束不能穿透真皮基质形成微孔。2．术后2、4周微孔组Ⅰ、Ⅱ移植物成活率低于对照组（P＜0.05），但与网状组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；术后6周，微孔组Ⅰ、Ⅱ移植物成活率与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），但明显高于网状组（P＜0.05）。微孔组Ⅰ、Ⅱ术后4、6周创面收缩率明显低于对照组（P＜0.05），且术后6周明显低于网状组（P＜0.05）。组织学观察显示各复合皮组上皮化良好，胶原纤维排列整齐，基底膜结构完整。临床上9名患者中，8例激光微孔PADM移植区成活良好。3．干燥组培养液中TGF-β1和bFGF的含量在各时间点均高于湿润组（P＜0.05）。结论：1．采用三倍频Nd∶YAG激光器对干燥的PADM进行轮廓迂回法打孔，不仅效率高、热损伤小，而且微孔形状规则、大小均匀一致，孔径调节方便；80mm／s为最适宜的扫描速度。2．孔间距为0.8mm或1.0mm的激光微孔PADM与自体刃厚皮复合移植可提高创面修复质量，其中孔间距为1.0mm者是最佳规格的激光微孔PADM。3．激光微孔PADM接种成纤维细胞可构建活性真皮基质，PADM冷冻干燥后更有利于成纤维细胞的粘附与生长。
史明艳[9]（2006）在《山羊毛囊干细胞及组织工程皮肤构建研究》文中研究表明组织工程皮肤自发展20多年来取得了很大的进展,目前已有数种组织工程皮肤应用于临床,为大面积烧伤以及和各种原因引起的皮肤大面积溃烂患者带来了福音。但是,已有的组织工程皮肤只是在结构上具有了皮肤的屏障功能,而不能形成毛囊、汗腺和皮脂腺等皮肤附属器官。临床移植后发现,创面干燥、皴裂、缺乏韧性和弹性等,给患者造成一定的痛苦。因此,构建具有毛囊、汗腺等皮肤附属器官的组织工程皮肤是未来组织工程发展的方向。研究发现,皮肤中的干细胞主要位于毛囊外根鞘隆突部位,毛囊干细胞具有多能性,它们在相关信号的作用下,可向上迁移参与皮脂腺和表皮的形成,向下迁移参与毛囊的形成。因此,以毛囊干细胞为种子细胞构建具有毛囊的组织工程皮肤,是一个理想的方案。但是由于毛囊干细胞存在部位隐蔽,缺乏特异性表面标志,从而限制了毛囊干细胞的体外研究和应用。本研究从山羊毛囊干细胞分离、培养、生物学特性以及分化潜能等方面进行了研究,并以毛囊干细胞和毛囊真皮细胞为种子细胞构建组织工程皮肤。主要内容包括:1.山羊毛囊干细胞分离培养体系的建立（1）将关中奶山羊耳部皮肤样本清洗干净剪碎后,用0.5%的胶原酶I,37℃消化1.5～2h,在体视显微镜下分离、挑选出完整毛囊,用0.25 %胰酶消化毛囊,37℃消化20～30min,获得单个细胞。将细胞以5×105/mL的密度分别接种与20μg/mL IV胶原包被的6孔板中,20min后,吸出未贴附细胞,加入无血清培养液培养（DMEM/F12 +2%BSA+5μg/mLInsulin+0.5μg/mLHydrocortisone+10ng/mLEGF+10 ng/mL IGF +10%条件培养基）,5d后消化传代。（2）对比了DMEM/F12和F12基础培养体系以及不同浓度的EGF、IGF-1以及条件培养液对山羊毛囊干细胞增殖的影响,筛选出以DMEM/F12 +2%BSA +5μg/mLInsulin+0.5μg/mLHydrocortison+15ng/mLEGF+10ng/mLIGF-1+20%条件培养液为山羊毛囊干细胞的优化培养体系。在此培养体系中,山羊毛囊干细胞可连续传至19代。2.山羊毛囊干细胞生物学特性研究（1）本研究所分离的毛囊干细胞为上皮细胞形态,在体外呈克隆性生长;电镜观察显示,细胞表现出原始细胞特征:细胞体积小,直径≤10μm;细胞表面微绒毛发达;核质比高;核内以常染色质为主,异染色质少,细胞器不发达等。（2）细胞生长曲线显示,前13代细胞生长良好,至16代,增值能力有所下降。这可能是随着细胞传代的增加,体外培养条件不能维持其未分化状态。分离的山羊毛囊干细胞液氮冷冻保存2×108,解冻成活率≥95%。
刘大勇[10]（2006）在《山羊皮肤干细胞及绿色荧光蛋白基因转染研究》文中研究指明表皮干细胞在创伤愈合过程中扮演着重要角色,目前利用表皮干细胞进行组织重建和转基因研究成为生物医学领域的重要方向。绿色荧光蛋白（GFP）是细胞生物学研究中应用最广泛的标记性蛋白质之一,不用加外源底物就能在活细胞中直接观察基因是否表达。本试验从山羊皮肤干细胞分离培养、生物学性特性鉴定、可塑性及GFP基因转染四个方面进行研究,为皮肤干细胞的临床应用提供基础资料。1.山羊皮肤干细胞的分离培养组织块培养法:浸洗、抗菌处理后,将皮肤切成0.1 cm×0.1cm左右的小块,表皮面朝上贴于铺有0.1%明胶的培养皿中,加少量培养液浸润, 2 h后用HDMEM/F12（3:1）+20%血清+5μg/mL胰岛素+0.5μg/mL氢化可的松+100单位双抗培养液培养,3日换液一次。有细胞脱出后把血清体积分数换为10%进行培养。DispaseII酶消化法:浸洗、抗菌处理后将皮肤块切割成0.5 cm×1 cm左右的条状,在含4 mg/mL DispaseII酶的小瓶中4 0C冷消化16 h。分离表皮与真皮,将表皮剪成糜状,0.25%胰酶37℃消化5-7 min后中和,过滤,离心,接种。用HDMEM/F12（3:1）+10%血清+5μg/mL胰岛素+0.5μg/mL氢化可的松+10ng/mL EGF+双抗100μg/mL培养液培养。胰酶消化法:浸洗、抗菌处理后将皮肤块切割成0.5 cm×1 cm左右的条状,用0.25%胰酶4 0C冷消化12 h。分离表皮与真皮。将表皮剪成糜状,过滤,接种。组织块培养法简单易行,组织块可重复利用,但原代细胞脱出时间较长,平均8 d,需15 d以上才能传代,原代传代通常采用差别消化法。季节对细胞脱出时间、原代传代时间、传代数有显着影响。春夏季细胞迁出时间（4.9±1.4 d）和原代细胞传代时间（10.3±2.5 d）比秋冬季短（10±1.5 d,20.3±1.7d）,传代数（7.4±3.5代）比秋冬季多（4.5±1.5代）;DispaseII酶消化法周期短,8d左右即可传代,细胞平均传代次数为6.5代。不同季节所得细胞无显着差异。但处理麻烦。用本法最高传14代仍无明显分化。胰酶消化法分离细胞数量远活力很差,难以长期传代,平均仅传3.2代。与组织块培养法、DispaseII酶消化法在传代数上均差异极显着（p<0.01）。2.山羊皮肤干细胞的生物学特性显微镜下观察可见细胞胞体透亮、体积小、球形、致密,核质比高,数日后呈镶嵌多角形,铺路石样生长,存在典型克隆团,有时出现PGCs样集落。分离培养的细胞体外增殖能力强,增殖能力下降。目前已传至第14代。细胞贴壁能力对黏附底物依赖性强,有无底物细胞贴壁率差异显着,细胞在不同底物上生长贴壁
二、我国学者率先发现人体表皮细胞存在逆分化现象（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、我国学者率先发现人体表皮细胞存在逆分化现象（论文提纲范文）
（1）基于工程化汗腺类器官实现创面功能性修复的初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、β2-AR信号通路提高表皮角质细胞干性潜能 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验对象 |
| 1.1.2 实验试剂 |
| 1.1.3 实验仪器 |
| 1.1.4 实验试剂配制 |
| 1.1.5 HEK、HaCaT 细胞的培养 |
| 1.1.6 用于 RNA-seq 的细胞培养与处理 |
| 1.1.7 RT-PCR法验证重点基因 |
| 1.1.8 Western blot法验证重点基因 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 RNA-seq数据分析 |
| 1.2.2 isoproterenol提升表皮角质细胞干性潜能重点基因验证 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、表皮角质细胞谱系重编程为汗腺样细胞 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验对象 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 实验试剂配制 |
| 2.1.5 质粒的构建与获取 |
| 2.1.6 慢病毒包装与收集 |
| 2.1.7 稳定过表达EDA基因的细胞转染与筛选 |
| 2.1.8 稳定过表达EDA基因的验证 |
| 2.1.9 诱导 HEK-E、HaCaT-E 细胞向汗腺样细胞转化 |
| 2.1.10 高通量基因芯片测定汗腺样细胞转录组学变化 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 dCas9 质粒与sgRAN质粒结构示意图 |
| 2.2.2 HEK-E、HaCaT-E细胞稳定过表达EDA基因 |
| 2.2.3 HEK-E、HaCaT-E细胞转分化为汗腺样细胞 |
| 2.2.4 高通量基因芯片测定汗腺样细胞转录组学变化 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小节 |
| 三、汗腺类器官的体外构建与维持 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验对象 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.1.4 汗腺类器官的构建 |
| 3.1.5 汗腺类器官的鉴定 |
| 3.1.6 微型流量控制芯片诱导汗腺类器官发育 |
| 3.1.7 微型流量控制芯片内汗腺类器官免疫荧光染色 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 成功利用HEK-E和HaCaT-E细胞构建汗腺类器官 |
| 3.2.2 微流控芯片原理介绍与应用展示 |
| 3.2.4 微流控芯片成功诱导类器官发育出管腔结构 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小节 |
| 四、汗腺类器官促进汗腺体内再生以及加速皮肤创面愈合 |
| 4.1 对象和方法 |
| 4.1.1 实验对象 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.1.4 实验试剂配制 |
| 4.1.5 裸鼠的饲养 |
| 4.1.6 烫伤模型建立 |
| 4.1.7 细胞/类器官移植 |
| 4.1.8 创面愈合速度测定 |
| 4.1.9 碘-淀粉发汗试验 |
| 4.1.10 小鼠掌垫组织 HE 染色 |
| 4.1.11 小鼠掌垫组织免疫荧光染色 |
| 4.1.12 裸鼠成瘤实验 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 汗腺类器官移植能缩短创面愈合时间 |
| 4.2.2 经重编程而来的汗腺类器官促进小鼠损伤汗腺修复 |
| 4.2.3 组织切片显示再生汗腺具有管腔结构 |
| 4.2.4 移植细胞后未见肿瘤组织形成 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 汗腺类器官—从简单再生向复杂再造的跨越 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）尿源干细胞及其外泌体在化疗药物导致的泌尿系损伤中的应用研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 USCs在顺铂诱导的大鼠AKI模型中的治疗作用及机制初探 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 USCs-Exo在环磷酰胺诱导的小鼠膀胱炎模型中的治疗作用及机制初探 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 尿源干细胞研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（3）基质刚度对肝癌细胞癌干细胞表型的影响及分子机制初探（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写及中文对照 |
| 1 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 肝癌的危害 |
| 1.1.2 癌干细胞和肝癌干细胞 |
| 1.1.3 力学微环境与癌细胞/CSCs可塑性 |
| 1.1.4 整合素β1 与力学信号传导 |
| 1.1.5 聚丙烯酰胺水凝胶 |
| 1.2 本文关心的内容 |
| 1.3 本文研究的主要目的和内容 |
| 1.3.1 本文研究的主要目的 |
| 1.3.2 本文研究的主要内容 |
| 2 聚丙烯酰胺水凝胶的制备及杨氏模量的测量 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 细胞 |
| 2.2.2 主要仪器、耗材 |
| 2.2.3 主要药品、试剂 |
| 2.2.4 主要实验试剂的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 不同配比聚丙烯酰胺水凝胶的制备 |
| 2.3.2 聚丙烯酰胺水凝胶刚度的测量 |
| 2.3.3 聚丙酰胺水凝胶的表面包被及细胞接种 |
| 2.3.4 数据统计 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 不同配比聚丙烯酰胺水凝胶的杨氏模量测量 |
| 2.4.2 不同刚度聚丙烯酰胺水凝胶上的细胞培养 |
| 2.5 结果讨论 |
| 2.6 小结 |
| 3 基质刚度对肝癌细胞癌干细胞表型的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 细胞 |
| 3.2.2 主要仪器、耗材 |
| 3.2.3 主要药品、试剂 |
| 3.2.4 主要实验试剂的配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.2 细胞铺展面积和骨架变化分析 |
| 3.3.3 RT-qPCR检测基因表达 |
| 3.3.4 流式细胞术检测细胞表面标志物 |
| 3.3.5 细胞成球能力分析 |
| 3.3.6 克隆形成能力分析 |
| 3.3.7 细胞周期分析 |
| 3.3.8 侧群细胞染色 |
| 3.3.9 细胞耐药性分析 |
| 3.3.10 在体成瘤能力分析 |
| 3.3.11 数据统计 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 基质刚度对细胞铺展的影响 |
| 3.4.2 硬基质增强肝癌细胞骨架聚合 |
| 3.4.3 软基质增强肝癌细胞干性基因表达 |
| 3.4.4 软基质增加肝癌细胞癌干细胞表面标志物的阳性细胞数量 |
| 3.4.5 软基质增强肝癌细胞成球能力 |
| 3.4.6 软基质增强肝癌细胞克隆形成能力 |
| 3.4.7 软基质减慢肝癌细胞细胞周期 |
| 3.4.8 软基质增加肝癌细胞侧群细胞数量 |
| 3.4.9 硬基质增加肝癌细胞耐药性 |
| 3.4.10 软基质增加肝癌细胞药物处理后克隆形成能力 |
| 3.4.11 软基底增加肝癌细胞裸鼠成瘤能力 |
| 3.5 结果讨论 |
| 3.6 小结 |
| 4 基质刚度影响肝癌细胞癌干细胞表型机理的探究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 主要仪器、耗材 |
| 4.2.2 主要药品、试剂 |
| 4.2.3 主要实验试剂的配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 RT-qPCR检测基因表达 |
| 4.3.2 WB检测蛋白质表达 |
| 4.3.3 RNAi干扰基因表达 |
| 4.3.4 癌干细胞表型检测 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 不同基质刚度条件下Integrin-β1 表达 |
| 4.4.2 siRNA干扰Integrin-β1 表达 |
| 4.4.3 干扰Integrin-β1 表达后干性基因表达 |
| 4.4.4 干扰Integrin-β1 表达后表面标志物表达 |
| 4.5 结果讨论 |
| 4.6 小结 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.2 后续工作展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| A 作者在攻读学位期间发表的论文目录 |
| B 学位论文数据集 |
| 致谢 |
（4）日本血吸虫感染小鼠肝星状细胞功能分化的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 主要英文缩写词 |
| 承担课题及发表文章情况 |
| 致谢 |
（5）毛囊干细胞的多分化潜能及其向汗腺细胞分化的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 文献回顾 |
| 第一节 毛囊干细胞的研究现状 |
| 第二节 汗腺研究概况 |
| 第三节 再生医学研究进展 |
| 第二章 研究内容 |
| 第一节 人毛囊干细胞的分离培养与鉴定 |
| 1. 材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 第二节 毛囊干细胞的多分化潜能 |
| 1. 材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 结论 |
| 5. 讨论 |
| 第三节 毛囊干细胞定向诱导分化为汗腺样细胞的实验研究 |
| 1. 材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 结论 |
| 5. 讨论 |
| 第四节 毛囊干细胞体外分化为汗腺样细胞的分子机制初探 |
| 1. 材料 |
| 2. 试验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 结论 |
| 5. 讨论 |
| 第五节 毛囊干细胞分化来源的汗腺样细胞在汗腺再生中的作用 |
| 1. 材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 结论 |
| 5. 讨论 |
| 第六节 毛囊干细胞在组织工程皮肤中的应用 |
| 1. 材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 结论 |
| 5. 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 在读期间发表的学术论文及研究成果 |
| 课题资助 |
（6）模拟皮肤发育构建含附件组织工程皮肤的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 引言 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 构建含附件组织工程皮肤的两个重要因素 |
| 1.2.1 多向分化潜能的种子细胞 |
| 1.2.2 适合的真皮来源的刺激信号 |
| 1.3 本研究的总体思路 |
| 第2章 基础材料、基础试剂及主要仪器 |
| 2.1 基础材料 |
| 2.2 基础试剂 |
| 2.3 主要仪器 |
| 2.4 其他试剂的配制 |
| 第3章 不同发育阶段胎鼠和小鼠皮肤组织结构观察 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 主要材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 不同发育阶段胎鼠和小鼠皮肤组织结构的变化 |
| 3.2.2 不同发育阶段的胎鼠和小鼠皮肤免疫荧光 |
| 3.3 讨论 |
| 第4章 不同发育阶段胎鼠和小鼠表皮细胞培养及鉴定 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 主要材料 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 第5章 不同发育阶段胎鼠和小鼠成纤维细胞培养及鉴定 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 主要材料 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 第6章 含附件组织工程皮肤模型的初步构建 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.1.1 主要材料 |
| 6.1.2 主要试剂 |
| 6.1.3 方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 离体的 E14.5 天的胚胎小鼠皮肤体外器官培养 |
| 6.2.2 PGA 支架材料的制备 |
| 6.2.3 用 E14.5 天胎鼠的表皮细胞构建复合皮肤 |
| 6.3 讨论 |
| 第7章 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（7）刺参多糖对神经细胞作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACTS |
| 符号说明 |
| 第一部分 前言 |
| 1 神经干细胞移植治疗神经系统疾病 |
| 1.1 神经干细胞的分布 |
| 1.2 神经干细胞的生物学特性 |
| 1.3 神经干细胞移植 |
| 1.3.1 神经干细胞移植的细胞来源 |
| 1.3.2 神经干细胞移植途径 |
| 1.3.3 神经干细胞移植的应用 |
| 1.3.4 神经干细胞移植亟待解决的问题 |
| 2 星形胶质细胞在大脑神经损伤后的保护作用 |
| 2.1 星形胶质细胞的经典生物学功能 |
| 2.2 星形胶质细胞的内分泌及营养修复作用 |
| 2.3 反应性星形胶质细胞对神经细胞的保护作用 |
| 2.3.1 损伤缝合和组织重构 |
| 2.3.2 局部免疫反应调控 |
| 2.3.3 神经发生 |
| 2.4 星形胶质细胞的逆分化作用 |
| 3 海参多糖及其药理活性研究进展 |
| 3.1 海参多糖成分概况 |
| 3.2 海参多糖主要药理活性及临床应用 |
| 3.2.1 抗凝血和溶栓 |
| 3.2.2 抗病毒 |
| 3.2.3 其他作用 |
| 4 本课题研究的目的和意义 |
| 第二部分 刺参多糖促进神经球细胞迁移和分化作用的研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验仪器 |
| 1.2 实验耗材 |
| 1.3 实验材料 |
| 1.4 实验动物 |
| 1.5 试验试剂 |
| 1.6 引物序列 |
| 1.7 主要溶液及试剂配方 |
| 2 方法 |
| 2.1 刺参多糖的分离纯化和理化性质鉴定 |
| 2.1.1 刺参粗多糖的提取 |
| 2.1.2 粗多糖的脱色 |
| 2.1.3 刺参粗多糖的纯化和活性筛选实验 |
| 2.1.4 HS-3理化性质的鉴定 |
| 2.2 HS-3诱导神经球细胞迁移的作用及机制研究 |
| 2.2.1 神经干细胞的分离和培养 |
| 2.2.2 神经干细胞球的传代 |
| 2.2.3 神经干细胞多向分化潜能的鉴定 |
| 2.2.4 药物处理 |
| 2.2.5 神经球迁移距离的测定 |
| 2.2.6 免疫荧光染色 |
| 2.2.7 BrdU检测细胞增殖情况 |
| 2.2.8 Hoechst/PI双染 |
| 2.2.9 Western blotting |
| 2.2.10 RT-PCR |
| 2.2.11 数据统计 |
| 3 结果 |
| 3.1 刺参多糖的纯化、活性筛选和理化性质鉴定 |
| 3.1.1 刺参多糖的DEAE离子交换层析 |
| 3.1.2 刺参多糖组分的活性筛选 |
| 3.1.3 刺参多糖的凝胶层析分离 |
| 3.1.4 HS-3理化性质的鉴定 |
| 3.2 HS-3促进神经球细胞迁移和分化作用的研究 |
| 3.2.1 神经细胞球的培养 |
| 3.2.2 神经球干细胞特性鉴定 |
| 3.2.3 刺参多糖(HS-3)诱导神经球粘附和迁移 |
| 3.2.4 HS-3对神经球细胞增殖作用 |
| 3.2.5 HS-3维持神经球细胞存活的作用 |
| 3.2.6 HS-3诱导神经球细胞的分化作用 |
| 3.2.7 HS-3诱导神经球粘附迁移分化可能的作用机制 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第三部分 刺参多糖促进星形胶质细胞活化作用机制的研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验仪器 |
| 1.2 实验耗材 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 试验试剂 |
| 1.5 主要溶液及试剂配方 |
| 2 方法 |
| 2.1 星形胶质细胞的分离和培养 |
| 2.2 药物处理 |
| 2.3 MTT试验 |
| 2.4 伊红染色 |
| 2.5 流式细胞术检测细胞周期 |
| 2.6 Transwell实验 |
| 2.7 数据统计 |
| 3 结果 |
| 3.1 HS-4的理化性质 |
| 3.2 星形胶质细胞的培养 |
| 3.3 HS-4对星形胶质细胞存活的影响 |
| 3.4 HS-4诱导星形胶质细胞形态学的变化 |
| 3.5 HS-4促进星形细胞的增殖作用 |
| 3.6 HS-4诱导静止期星形胶质细胞进入S期 |
| 3.7 HS-4和FGF-2协同诱导细胞活化信号通路的筛选 |
| 3.8 HS-4和FGF-2通过ERK信号通路诱导星形胶质细胞活化 |
| 3.9 HS-4和FGF-2诱导星形胶质细胞的迁移作用 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 发表论文一 Morph ological transformation and proliferation of rat astrocytes asinduced by sulfated polysaccharides from the sea cucumber Stichopus japonicus |
| 发表论文二 Sulfated Polysaccharide isolated from the sea cucumber Stichopusjaponicus promotes Neurosphere migration and differentiation via up-regulationof N-cadherin |
| 致谢 |
| 博士期间发表的论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（8）激光微孔异种（猪）脱细胞真皮基质的研制与应用（论文提纲范文）
| 英文缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 激光微孔PADM的研制 |
| 实验一 不同波长激光器在PADM打孔中的比较研究 |
| 材料与方法 |
| 1主要试剂 |
| 2 主要仪器 |
| 3 PADM的制备与分组 |
| 4 激光打孔 |
| 5 PADM激光打孔后的处理 |
| 6 观察指标 |
| 7 统计学处理 |
| 结果 |
| 1 大体观察 |
| 2 真皮基质皱缩率 |
| 3 真皮基质热损伤率 |
| 讨论 |
| 实验二 三倍频Nd:YAG激光器不同扫描速度对PADM微孔孔径的影响 |
| 材料与方法 |
| 1 主要试剂和仪器 |
| 2 PADM的制备及干燥 |
| 3 激光器参数设定及打孔模式 |
| 4 观察指标 |
| 5 统计学处理 |
| 结果 |
| 1 大体观察 |
| 2 真皮基质微孔孔径 |
| 3 真皮基质热损伤率 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附录1:实验照片 |
| 第二部分 激光微孔PADM修复深度皮肤缺损创面的研究 |
| 一 激光微孔PADM修复深度皮肤缺损创面的动物实验 |
| 材料与方法 |
| 1 主要试剂 |
| 2 主要仪器 |
| 3 激光微孔PADM的制备 |
| 4 动物模型及分组 |
| 5 观察指标 |
| 6 统计学处理 |
| 结果 |
| 1 激光微孔PADM的物理及组织学特点 |
| 2 创面大体观察 |
| 3 组织学观察 |
| 二 激光微孔PADM修复深度皮肤缺损创面的临床初步应用 |
| 材料与方法 |
| 1 一般资料 |
| 2 移植方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附录2:实验照片 |
| 第三部分 激光微孔PADM构建活性真皮基质的研究 |
| 材料与方法 |
| 1 主要试剂 |
| 2 主要仪器和耗材 |
| 3 成纤维细胞库的分离与培养 |
| 4 激光微孔PADM的制备及分组 |
| 5 活性真皮基质的构建 |
| 6 培养液中细胞因子含量的检测 |
| 7 统计学处理 |
| 结果 |
| 1 成纤维细胞生长和增殖观察 |
| 2 培养液中细胞因子含量的检测 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 文献综述 |
| 综述一:脱细胞真皮基质的研究进展 |
| 综述二:永久性皮肤替代物的研究现状及展望 |
| 攻读学位期间发表文章及其他 |
| 致谢 |
（9）山羊毛囊干细胞及组织工程皮肤构建研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 皮肤结构与皮肤干细胞 |
| 1.1 皮肤的组成结构 |
| 1.2 毛囊、汗腺、皮脂腺关系 |
| 1.3 皮肤干细胞 |
| 1.4 表皮干细胞和毛囊干细胞 |
| 第二章 表皮干细胞研究概况 |
| 2.1 表皮干细胞分布模式学说 |
| 2.1.1 表皮增殖单位（Epidermal Proliferation unit. EPU）学说 |
| 2.1.2 网状嵴分布模式 |
| 2.2 表皮干细胞的特点 |
| 2.3 表皮干细胞表面标志 |
| 2.3.1 整合素家族 |
| 2.3.2 角蛋白（keratin） |
| 2.3.3 P63 转录因子 |
| 2.3.4 Connexi1143（Cx43）连接蛋白 |
| 2.4 表皮干细胞应用前景 |
| 第三章 毛囊及毛囊干细胞 |
| 3.1 毛囊的胚胎发生 |
| 3.2 毛囊组成结构 |
| 3.3 毛囊的生长周期 |
| 3.4 毛囊各种细胞生物学特性研究 |
| 3.4.1 毛乳头细胞 |
| 3.4.2 毛囊真皮鞘成纤维细胞 |
| 3.4.3 毛囊真皮细胞成分在皮肤创伤修复中的应用 |
| 3.4.4 毛囊干细胞研究 |
| 第四章 成体干细胞可塑性研究 |
| 4.1 成体干细胞可塑性概念的提出 |
| 4.2 成体干细胞可塑性研究概况 |
| 4.2.1 骨髓干细胞可塑性研究 |
| 4.2.2 神经干细胞可塑性研究 |
| 4.2.3 肝脏干细胞可塑性研究 |
| 4.2.4 皮肤干细胞可塑性 |
| 4.2.5 其他组织干细胞可塑性 |
| 4.3 成体干细胞可塑性分化机制 |
| 4.4 成体干细胞可塑性引发的争议 |
| 4.5 成体干细胞可塑性引发的思考 |
| 4.5.1 在不同组织中是否存在一种统一的干细胞（Universal Stem Cell） |
| 4.5.2 建立评价成体干细胞可塑性的标准 |
| 4.6 结论和前景 |
| 第五章 组织工程皮肤研究进展 |
| 5.1 组织工程学概念及原理 |
| 5.2 组织工程皮肤种类 |
| 5.2.1 表皮替代物 |
| 5.2.2 真皮替代物 |
| 5.2.3 人工全层皮肤 |
| 5.3 组织工程皮肤临床应用 |
| 5.3.1 Integra |
| 5.3.2 Apligraft |
| 5.3.3 Dermagraft |
| 5.3.4 AlloDerm |
| 5.4 存在问题及展望 |
| 5.4.1 种子细胞问题 |
| 5.4.2 支架材料 |
| 实验研究 |
| 第六章 山羊毛囊干细胞分离培养方法研究 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 不同浓度的IV 胶原对毛囊干细胞富集的影响 |
| 6.2.2 不同粘附时间对毛囊干细胞富集的影响 |
| 6.2.3 粘附法对毛囊干细胞富集的影响 |
| 6.2.4 毛囊干细胞在不同培养液中增殖特征 |
| 6.2.5 不同浓度的EGF 对毛囊干细胞克隆形成率的影响 |
| 6.2.6 不同浓度的IGF-1 对毛囊干细胞克隆形成率的影响 |
| 6.2.7 不同浓度的条件培养液对毛囊干细胞克隆形成率的影响 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 山羊毛囊干细胞分离方法探讨 |
| 6.3.2 山羊毛囊干细胞培养体系的筛选 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 山羊毛囊干细胞生物学特性 |
| 7.1 材料和方法 |
| 7.1.1 材料 |
| 7.1.2 方法 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 山羊毛囊干细胞形态特征 |
| 7.2.2 山羊毛囊干细胞扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）分析 |
| 7.2.3 山羊毛囊干细胞透射电镜（transmission electron microscope，TEM）分析 |
| 7.2.4 山羊毛囊干细胞生长曲线分析 |
| 7.2.5 山羊毛囊干细胞冷冻解冻效果 |
| 7.2.6 山羊毛囊干细胞表面标志的免疫组化检测 |
| 7.3 讨论 |
| 7.3.1 山羊毛囊干细胞形态特征 |
| 7.3.2 山羊毛囊干细胞生长曲线分析 |
| 7.3.3 山羊毛囊干细胞的细胞的冷冻与复苏 |
| 7.3.4 山羊毛囊干细胞表面标志检测 |
| 7.4 小结 |
| 第八章 山羊毛囊干细胞诱导分化 |
| 8.1 材料和方法 |
| 8.1.1 材料 |
| 8.1.2 方法 |
| 8.2 结果与分析 |
| 8.2.1 山羊毛囊干细胞向心肌细胞分化 |
| 8.2.2 山羊毛囊干细胞向成骨细胞分化 |
| 8.2.4 山羊毛囊干细胞向神经细胞分化 |
| 8.3 讨论 |
| 8.3.1 山羊毛囊干细胞向心肌诱导分化 |
| 8.3.2 山羊毛囊干细胞向成骨诱导分化 |
| 8.3.3 山羊毛囊干细胞向脂肪诱导分化 |
| 8.3.4 山羊毛囊干细胞向神经诱导分化 |
| 8.4 小结 |
| 第九章 山羊组织工程皮肤构建及移植效果检测 |
| 9.1 材料和方法 |
| 9.1.1 材料 |
| 9.1.2 方法 |
| 9.2 结果与分析 |
| 9.2.1 羊膜可有效地降低胶原凝胶的收缩 |
| 9.2.2 组织工程皮肤检测 |
| 9.2.3 组织工程皮肤移植及观察 |
| 9.3 讨论 |
| 9.3.1 真皮支架的制作 |
| 9.3.2 毛囊干细胞、毛囊真皮细胞在毛囊形成中的作用 |
| 9.4 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新点 |
| 下一步工作设想 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）山羊皮肤干细胞及绿色荧光蛋白基因转染研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 皮肤干细胞研究进展 |
| 1.1 皮肤干细胞的在体分布模式 |
| 1.1.1 表皮干细胞与表皮增殖单位 (Epidermal Proliferation unit. EPU)学说 |
| 1.1.2 网状嵴分布模式 |
| 1.1.3 毛囊干细胞与窿突激活假说(bulge-activation hypothesis) |
| 2.1 KSC 的概念与生物学特征 |
| 2.1.1 KSC 的概念 |
| 2.1.2 KSC 的慢周期性 |
| 2.1.3 KSC 的自我更新能力 |
| 2.1.4 KSC 的粘附特性 |
| 2.1.5 KSC 的其他特征 |
| 2.1.6 KSC 的分子标记 |
| 2.1.6.1 整合素 |
| 2.1.6.2 角蛋白 |
| 2.1.6.3 P63 转录因子 |
| 2.1.6.4 增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen ，PCNA) |
| 2.1.6.5 CD71 |
| 2.1.6.6 连接蛋白43 ( Connexin 43 ,Cx43) |
| 2.1.6.7 C8/ 144B |
| 2.1.6.8 CD34 |
| 3.1 KSC 的增殖分化的分子调控机制 |
| 3.1.1 整合素—丝裂原激活蛋白激酶(MAPK) 通路 |
| 3.1.2 Wnt—β-catenin—Lef/Tcf |
| 3.1.3 Notch 信号传导通路 |
| 3.1.4 C-MYC |
| 4.1 影响KSC 体外扩增的因素 |
| 4.1.1 血清 |
| 4.1.2 细胞因子 |
| 4.1.2.1 碱性成纤维细胞生长因子(basic-Fibroblast Growth Factor,bFGF) |
| 4.1.2.2 表皮生长因子(Epidermal Growth Factor,EGF) |
| 4.1.2.3 胰岛素样生长因子-1(Insulin-like Growth Factor-1,IGF-1) |
| 4.1.2.4 谷氨酰胺 |
| 4.1.2.5 β-巯基乙醇 |
| 4.1.3 细胞外基质（ECM） |
| 第二章 表皮干细胞的可塑性 |
| 1.1 成体干细胞的可塑性 |
| 2.1 干细胞可塑性的解释 |
| 2.1.1 细胞融合现象 |
| 2.1.2 横向分化现象 |
| 3.1 存在问题及展望 |
| 4.1 表皮干细胞的分化潜能与可塑性 |
| 第三章 绿色荧光蛋白（GFP）基因研究现状 |
| 1.1 GFP 基因的生物化学特性 |
| 2.1 转染技术研究方法 |
| 2.1.1 病毒载体 |
| 2.1.1.1 逆转录病毒载体 |
| 2.1.1.2 腺病毒载体 |
| 2.1.2 非病毒载体 |
| 2.1.2.1 脂质体转染 |
| 2.1.2.2 DNA 直接注射 |
| 2.1.2.3 颗粒介导的基因转移 |
| 2.1.2.4 电穿孔法 |
| 2.1.2.5 磷酸钙共沉淀法 |
| 2.1.2.6 阳离子聚合物法 |
| 第四章 KSC 的分离纯化及鉴定 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.1.1 试验动物 |
| 1.1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.1.3 主要仪器设备 |
| 1.1.2 方法 |
| 1.1.2.1 溶液配制与试剂分装 |
| 1.1.2.2 原代表皮干细胞的获得 |
| 1.1.2.2.1 组织块法 |
| 1.1.2.2.2 DispaseII 酶消化法 |
| 1.1.2.2.3 胰酶消化法 |
| 1.1.2.3 表皮干细胞的纯化与传代培养 |
| 1.1.2.4 冷冻与解冻 |
| 1.1.2.5 KSC 生长曲线测定 |
| 1.1.2.6 细胞贴壁率测定 |
| 1.1.2.7 KSC 细胞克隆形成试验 |
| 1.1.2.8 免疫组化染色 |
| 1.1.2.9 统计学处理 |
| 2.1 结果 |
| 2.1.1 组织块法分离的KSC 的生长情况 |
| 2.1.2 DISPASEII 酶消化法分离的KSC 的生长情况 |
| 2.1.3 胰酶消化法分离的KSC 的生长情况 |
| 2.1.4 传代KSC 生长状况 |
| 2.1.5 细胞解冻活力检测 |
| 2.1.6 KSC 生长曲线测定 |
| 2.1.7 细胞贴壁率测定 |
| 2.1.8 细胞克隆形成试验 |
| 2.1.9 免疫组化染色鉴定 |
| 3.1 讨论 |
| 3.1.1 KSC 的分离纯化方法 |
| 3.1.2 KSC 的鉴定 |
| 3.1.3 小结 |
| 第五章 KSC 的诱导分化研究 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.1.1 实验试剂 |
| 1.1.1.2 实验仪器 |
| 1.1.2 方法 |
| 1.1.2.1 主要溶液配制 |
| 1.1.2.2 向心肌细胞诱导分化 |
| 1.1.2.3 向神经细胞诱导分化 |
| 1.1.2.4 向成骨细胞诱导分化 |
| 1.1.2.5 诱导分化细胞免疫组织化学染色鉴定 |
| 1.1.2.6 成骨诱导细胞的茜素红染色 |
| 1.1.2.7 成骨诱导细胞的AKP 染色 |
| 2.1 结果 |
| 2.1.1 向心肌细胞诱导分化 |
| 2.1.2 向神经细胞诱导分化 |
| 2.1.3 向成骨细胞诱导分化 |
| 3.1 讨论 |
| 3.1.1 向心肌细胞诱导 |
| 3.1.2 向神经细胞诱导分化 |
| 3.1.3 向成骨细胞诱导分化 |
| 4.1 小结 |
| 第六章 KSC 的GFP 基因转染研究 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.1.1 实验试剂 |
| 1.1.1.2 实验仪器 |
| 1.1.2 方法 |
| 1.1.2.1 溶液配制 |
| 1.1.2.2 G418 最小致死浓度筛选试验 |
| 1.1.2.3 PEGFP-C1 转染KSC |
| 1.1.2.4 转染效率及荧光蛋白阳性表达率的测定 |
| 1.1.2.5 未转染细胞及转染细胞的比较 |
| 1.1.2.5.1 细胞形态 |
| 1.1.2.5.2 MTT 比色法测定细胞活性 |
| 2.1 结果 |
| 2.1.1 G418 对KSC 最小致死浓度 |
| 2.1.2 GFP 转染KSC 细胞 |
| 2.1.3 未转染细胞及转染细胞的比较 |
| 2.1.3.1 显微镜观察 |
| 2.1.3.2 MTT 比色法测定细胞活性 |
| 3.1 讨论 |
| 4.1 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致 谢 |
| 作者简介 |
四、我国学者率先发现人体表皮细胞存在逆分化现象（论文参考文献）
- [1]基于工程化汗腺类器官实现创面功能性修复的初步研究[D]. 陈润开. 天津医科大学, 2020(06)
- [2]尿源干细胞及其外泌体在化疗药物导致的泌尿系损伤中的应用研究[D]. 孙碧韶. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)
- [3]基质刚度对肝癌细胞癌干细胞表型的影响及分子机制初探[D]. 田博仁. 重庆大学, 2019(01)
- [4]日本血吸虫感染小鼠肝星状细胞功能分化的研究[D]. 周春雷. 南京医科大学, 2015(01)
- [5]毛囊干细胞的多分化潜能及其向汗腺细胞分化的实验研究[D]. 王瑶. 南开大学, 2013(06)
- [6]模拟皮肤发育构建含附件组织工程皮肤的初步研究[D]. 吴舒. 南昌大学, 2013(04)
- [7]刺参多糖对神经细胞作用的研究[D]. 盛卸晃. 山东大学, 2012(12)
- [8]激光微孔异种（猪）脱细胞真皮基质的研制与应用[D]. 梁黎明. 中国人民解放军军医进修学院, 2007(02)
- [9]山羊毛囊干细胞及组织工程皮肤构建研究[D]. 史明艳. 西北农林科技大学, 2006(05)
- [10]山羊皮肤干细胞及绿色荧光蛋白基因转染研究[D]. 刘大勇. 西北农林科技大学, 2006(05)