一、两种靶细胞在ADCC检测中的比较（论文文献综述）
李月飞[1]（2021）在《HIV-1长期不进展者接受ART治疗后免疫特征研究》文中认为目的:少数HIV-1感染者可长期自发控制病毒感染和临床进展,不发展为艾滋病病人,称为长期不进展者。抗逆转录病毒疗法（Antiretroviral therapy,ART）可以控制病毒复制,但不能根除感染的病毒并恢复患者的免疫反应。了解HIV-1（human immunodeficiency virus-1）长期不进展者（long term non-progressors,LTNPs）的长期结果、免疫、相关分子机制情况,探讨接受抗逆转录病毒治疗（Antiretroviral therapy,ART）的HIV-1长期不进展者的生存情况,宿主免疫特征的改变,及其维持HIV-1长期不进展的分子机制,为进一步研究艾滋病功能性治愈及HIV疫苗的进一步研发提供新思路。方法:于2011年在新疆伊犁哈萨克自治州伊宁市招募HIV-1长期不进展者80名,该人群至2019年12月31日因死亡或失访,造成删失42人,现存活38人。存活38人均接受抗逆转录病毒治疗。以年龄、抗病毒治疗时间和抗逆转录病毒治疗方案为匹配条件,对病例组进行1:1匹配,以HIV进展者+ART为对照组。取LTNPs+ART及HIV进展者+ART的外周血,用流式细胞术检测CD3/CD16/CD56/CD69各表型的自然杀伤（natural killer,NK）细胞比例和CD4/CD25/CD127/foxp3/CD69/CD39各亚组的Treg细胞（regulatory T cells,Tregs）比例,使用微量样本多指标流式蛋白定量技术、酶联免疫吸附试验试剂盒检测评估NK和Treg细胞功能的细胞因子水平。使用多重细胞因子试剂盒检测评估20种炎性细胞因子的表达。以及,从GSE108297获得全血,PBMC,CD4+和CD8+T细胞的基因表达谱。进行了共表达分析以评估强和弱应答的HIV控制者（HIV Controllers,HICs）之间的差异表达基因（Screening of differentially expressed genes,DEGs）。富集分析被用来探索DEGs的生物学功能。使用Lasso Cox模型筛选具有常见DEGs的关键基因。然后,通过富集分析计算HICs和HAART的免疫评分。通过流式细胞仪,RT-PCR和Western blot分析验证了CD4+和CD8+T细胞关键基因的含量。结果:1、纳入LTNPs+ART和HIV进展者+ART各38名。LTNPs+ART组CD3-CD56+和CD3-CD16+NK细胞亚组表达频率低于对照组（P=0.024、0.035）;LTNPs+ART组NK细胞细胞因子（干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α和白介素-18）水平高于HIV进展者+ART组（P<0.001）。2、LTNPs+ART组Treg细胞亚组表达频率高于HIV进展者+ART组;LTNPs+ART组Tregs细胞因子（转化生长因子-β、白细胞介素-10、白细胞介素-35、白细胞介素-6和干扰素-γ,和趋化因子C-C-基元配体-17和CC-基元配体-21）水平高于HIV进展者+ART组。3、绝大部分细胞因子和趋化因子在两组间显示出显着差异,且LTNP-EC+c ART组显示出等高水平,除白介素35和C-C-基元配体-3差异不明显。除白介素18与CD4+T细胞计数呈现负相关以外,其它细胞因子与病毒载量和CD4+T细胞计数均为显示出线性关系。4、DEGs聚集成24个共表达模块。与一般免疫反应相关的DEGs与强反应的HICs相关性最高,而主要与凋亡过程相关的DEG与弱反应的HICs相关性最高。中心基因CD8A和CCT2以及关键基因TMEM132C和S100A9是HICs和HARRT中的DEGs。免疫评分和流式细胞仪检测显示,全血中HICs的CD4+和CD8+T细胞低于HAATR。实验证实了关键基因在HICs和HAART中的表达。结论:接受治疗的LTNPs表现出较低的细胞毒性,但相对比接受治疗的HIV进展者NK细胞产生的细胞因子水平较高;接受治疗的LTNPs拥有较高比例的Tregs,且相对比接受治疗的HIV进展者Tregs表现出较好的免疫抑制作用;经联合抗逆转录病毒治疗后,相对比于HIV-1进展者,LTNPs显现出更高的炎性细胞因子的表达提示更强烈的持续性的慢性免疫激活和免疫抑制,提示对HIV-1长期非进展性精英控制者进行联合抗逆转录病毒治疗对其自身免疫重建并无害处;这项研究中确定的关键基因突出了HICs的强应答能力,可帮助免疫系统控制HIV-1感染。这些结果对于开发治疗靶标将是有用的。
曹韪凡[2]（2020）在《靶向CD19抗原的新型嵌合抗原受体NK细胞的优化构建和功能研究》文中指出近年来,嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptor,CAR）修饰的T细胞为代表的靶向免疫细胞治疗方案受到广泛关注。该技术通过在T细胞中转染并表达人工CAR,促使T细胞可以特异性靶向结合肿瘤表面抗原。同时,利用人工CAR胞内段结构域提供T细胞活化信号,使其成为具有精准靶向性、并持续维持杀伤活性的新一代细胞治疗技术,在多种肿瘤治疗领域特别是血液系统肿瘤的治疗中表现出良好的治疗效果。目前,大多数关于CAR的研究主要集中在T细胞,然而伴随而来的细胞因子风暴、脱靶效应等副作用已成为限制CAR-T细胞临床应用的重要因素。针对这些副作用或缺陷,促使我们将注意力转移到以自然杀伤（natural killer,NK）细胞与因子诱导杀伤细胞为代表的非特异性免疫细胞的人工CAR的改造研究中。NK细胞属于先天固有免疫系统中的重要组成部分,是机体天然免疫屏障中的主要承担者。NK细胞在肿瘤的免疫治疗中具有特殊优势。首先,NK细胞不受主要组织相容性复合体识别限制,并且无需抗原提呈细胞就可以激活自身免疫应答反应;其次,NK细胞在过继性细胞回输疗法中,体内存活周期短,不会诱发抗移植物宿主反应,相较于T细胞,NK细胞诱发因子风暴反应可控。然而人体肿瘤细胞可以通过多种免疫逃逸机制逃避NK细胞非特异杀伤作用,使得NK细胞在肿瘤免疫治疗中的作用受到了制约。基于以上因素和前期我们在CAR-CIK细胞研究工作中的基础与策略,本次在NK细胞中引入CAR的修饰改造,引导NK细胞对血液肿瘤细胞靶向杀伤,同时利用CAR胞内段细胞活化信号结构域的表达来增强免疫细胞自身的活性。以B淋巴细胞白血病的特异性靶标CD19为靶点,针对不同来源的NK细胞生物学特点,开展了人工CAR胞内段和跨膜区的改造工作。在胞内段优化过程中,将具有NK细胞活化功能的含有IL-15分子、4-1BB细胞共刺激信号分子、CD3 ζ链胞内区分子、CD8引导链和Kozak序列等胞内段活化结构域相关分子序列进行串联整合,融入到CAR结构中,制备特性化针对NK细胞的人工CAR重组质粒,然后通过病毒载体,在体外进行转导,成功构建出带有靶向识别杀伤功能的人工CAR修饰的NK细胞。同时,优化了 NK细胞体外培养与活化体系,为后续大剂量的细胞制备,开展体外、体内试验以及未来临床试验和应用奠定了基础。在此基础上,为了进一步检验人工CAR修饰细胞的靶向杀伤能力,采用乳酸脱氢酶法、杀伤因子检测和流式细胞检测等多种方法,对构建的CAR-CIK、CAR-NK-92、CAR-NK细胞杀伤效果进行了验证与分析评估。利用药效学,研究分析了我们构建的人工CAR修饰细胞在小鼠急性B淋巴细胞白血病模型中的靶向杀伤作用以及安全性。结果表明,构建的人工CAR修饰细胞具有明显的靶向杀伤能力和可靠的生物安全性。此外,利用单细胞转录组测序技术和基因表达水平以及生物信息学分析,研究脐血NK细胞分别在人工CAR载体转导前后以及增殖过程中基因的表达谱变化。结果显示,以CX3CR1为代表的功能成熟的NK细胞基因高表达,而且具有独特的转录特性,探讨了 NK细胞的发育生物学的分子机制,并针对CD19-CAR-NK细胞技术的临床应用研究进行了再设计与评估。本项研究的创新点在于尝试突破人工CAR细胞方法改造非特异性细胞的技术瓶颈,构建出一套创新优化的CAR-NK制备体系,为拓展人工CAR细胞治疗方案提供技术支撑;改造了 CAR胞内段细胞活化信号分子,以及验证了 CD19-CAR-NK细胞的成药性、有效性以及安全性;这将有利于CAR相关技术在免疫治疗过程中发挥更重要的作用,并为进一步的临床应用研究提供新方法和新思路。主要结果:1.构建了基于CAR-T技术的靶向CD19的CAR-CIK细胞、CAR-NK-92细胞制备体系。2.构建了基于脐血来源的NK细胞靶向CD19的新型CAR-NK细胞技术体系。3.体外实验验证了 CD19-CAR-NK具有显着的靶向细胞杀伤功能,并呈现剂量依赖性特点,特异性杀伤效果明显。4.探索了 CAR-NK细胞最佳NK细胞转导方法,可使用慢病毒载体或逆转录病毒载体对NK细胞进行转导。通过优化的培养体系培养的NK细胞可以获得更好的转导效率。5.利用单细胞测序技术,探讨了脐血NK细胞分别在CAR转导前后以及增殖过程中基因表达谱变化,以CX3CR1为代表的功能成熟NK细胞基因高表达转录特性。6.B淋巴细胞白血病小鼠模型研究结果表明,CD19-CAR-NK细胞在回输后第7天抑瘤率为61%,远高于对照组抑瘤率12%。未产生相关毒性以及致瘤致畸等不良情况,验证了 CD19-CAR-NK细胞具有良好的生物安全性及有效性。
王慧[3]（2020）在《食管癌肿瘤微环境中多核巨细胞和IgG4阳性B细胞的研究》文中研究指明背景和目的:目前肿瘤微环境中的免疫细胞种类及功能受到越来越多的关注,基于T细胞研究发现的肿瘤免疫检测靶点阻断治疗给肿瘤的治疗带来了革新。但对其中的两种细胞即多核巨细胞（multinucleated giant cells,MGC）和B细胞却研究甚少。多核巨细胞反应常见于肉芽肿性炎症,在多种上皮类肿瘤中也有过报道,目前对于肿瘤中多核巨细胞的病理特征和生物学特点研究尚不清楚。本研究中,我们在食管癌中研究多核巨细胞的生物学特点和临床意义。B细胞介导的体液免疫是人体免疫重要组成部分。IgG4是体内含量最少的免疫球蛋白G亚类,是由成熟的B细胞分泌而来。在临床中IgG4阳性浆细胞的浸润增加主要见于IgG4相关性疾病,肿瘤组织IgG4阳性细胞的增加在胃癌,肝外胆管癌,恶性黑色素瘤中有过少量报道。目前关于食管癌中IgG4表达尚无相关研究,食管癌中IgG4相关免疫病理特征和临床特点亟待解答。材料方法:第一部分多核巨细胞的研究中运用免疫组化的方法在107例食管癌组织中检测了多核巨细胞的表达和分布,多核巨细胞的出现可以通过CD68染色结果和细胞的形态鉴别。并且通过用免疫荧光双重染色的方法鉴定了多核巨细胞的极化谱、细胞表面标志物、自分泌的酶,其中检测的指标有CD11c、HLA-DR、CD163、CD206、CD11b、CD64、CD32、CD16和MMP9等。我们联合多核巨细胞的表达情况和食管癌患者相关临床资料进行统计分析,通过Kaplan-Miere生存分析的方法,讨论多核巨细胞的表达与生存期的关系;通过单因素和多因素COX回归分析食管癌患者生存预后影响的因素,讨论多核巨细胞对生存预后是否有决定性的影响。第二部分B细胞相关的研究中,运用免疫组化和免疫荧光双重染色的方法对食管癌组织、癌旁组织、正常组织中Ig G亚类的浸润程度进行了分析统计,并且通过酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）的方法检测癌组织,正常组织和淋巴结中总Ig G、Ig G1、IgG4亚类含量。利用6色免疫荧光检测IgG4高表达样本中的免疫细胞分布特点。利用Ig G亚类亲和层析的方法提取患者血清中的Ig G1和IgG4亚类,并且将提取到的Ig G1,IgG4进行生物素标记,与同一患者的肿瘤组织进行反应,以检测Ig G1,IgG4 Fab段与肿瘤抗原反应性。通过生物标记的Ig G1和IgG4与外周血提取的单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells,PBMC）进行反应,检测Ig G1,IgG4的Fc段与PBMC的结合能力。通过蛋白质免疫印迹检测生物素化IgG4与其他亚类Ig G和其他种属Ig G之间的反应能力。利用木瓜蛋白酶酶切技术,将Ig G切割为Fab和Fc片段,检测IgG4 Fab和Fc片段的结构特点。通过分别加入Ig G1和IgG4对单核细胞进行体外培养,对比探讨Ig G1和IgG4的对单核巨噬细胞的极化功能。结果:第一部分:多核巨细胞在免疫组化的染色上均表现为CD68（+）,我们在107例食管癌组织中检测到34（31.7%）例样本有阳性表达。在免疫荧光双重染色中发现多核巨细胞表达的CD11c（+）、HLA-DR（+）、CD163（-）、CD206（-）、CD11b（+）、CD64（-）、CD32（+）、CD16（+）和MMP9（+）,提示多核巨细胞具有向M1型巨噬细胞分化的趋势,并且在其细胞表面有较多的Fc R和补体受体的表达,同时有较多基质金属蛋白酶的分泌。通过对食管癌患者的临床信息分析,我们发现多核巨细胞的表达与淋巴结转移（p=0.011）、p TNM分期（p=0.044）呈负相关,与生存期（p=0.04）呈正相关,与鳞状细胞癌的类型（p=0.020）和高组织分化（p=0.063）相关。第二部分:本课题组前期研究发现IgG4在食管癌患者的血清中有显着的增加（p<0.0001）,并且癌组织中IgG4的浓度和IgG4+浆细胞密度也是显着高于同一患者的正常组织（p<0.01,p<0.001）。通过分析高表达IgG4的组织样本发现肿瘤相关的淋巴滤泡中心高表达IL-10细胞因子,IL-10在组织样本上的表达和IgG4有一致的趋势,部分IgG4（+）IL-10（+）细胞可能属于调节性B细胞。将Ig G1和IgG4从患者血清中分离后,发现来源于自身血清提取的Ig G1能够和冰冻肿瘤组织切片发生反应,而IgG4不能反应。Ig G1反应的部位和肿瘤细胞的位置一致。说明B细胞经过类别转换后,产生的IgG4其Fab抗原识别端发生了改变,表现出和Ig G1不同的特点。经过蛋白质的凝集素层析后电泳发现:与Ig G1相比,IgG4有高水平的甘露糖化和唾液酸化糖基化修饰。IgG4的糖基化修饰发生在重链上,导致其中一条重链的分子量比另一条高2-3k Da,随后的酶切实验证明这一修饰位点在重链的Fab段。IgG4的Fab段高水平糖基化可能是IgG4和Ig G1抗原识别能力存在差别的原因之一。在IgG4和Ig G1竞争PBMC结合位点的实验中,发现IgG4可以与Ig G1竞争和PBMC的结合,说明尽管IgG4的Fc段与Fc R结合能力不如Ig G1,却能够与Ig G1竞争结合位点。另外,研究中还发现IgG4能够和Ig G1发生反应,这种反应是通过Fc-Fc反应进行的。在细胞实验中,初步将Ig G1和IgG4用于单核细胞的分化培养,发现Ig G1和IgG4具有促进单核细胞分别向M1型和M2型巨噬细胞极化的作用。讨论和结论:本研究发现多核巨细胞是一类向M1型分化的巨噬细胞,在肿瘤微环境中能够吞噬消化肿瘤细胞,清除鳞癌组织中的角化珠,有利于恶性肿瘤细胞及其相关成分的降解,有益于肿瘤患者的生存预后。多核巨细胞的出现可作为食管鳞状细胞癌的一类特征,可能作为肿瘤生物学行为和生存预后的一类判断指标,为肿瘤的治疗提供新的思路。本研究发现IgG4在食管癌患者的组织和血清中增加,并且IgG4的增加和肿瘤病理分期相关。同一患者的来源的Ig G1具有针对肿瘤组织的抗原特异性,而IgG4抗肿瘤特异性弱于Ig G1。在结构上IgG4的重链Fab段具有高水平的糖基化修饰,修饰后的IgG4的Fab段和Ig G1的Fab段相比出现了结构上的差别。在患者血液中能够检测到小片段的IgG4 Fc片段,同时IgG4的Fc段具备和其他亚类、其他种属（鼠,兔,羊）反应的能力。高浓度的IgG4还能够降低Ig G1和PBMC的结合水平。与含量最大的Ig G1相比,IgG4的Fab段和Fc段的特点是IgG4与Ig G1发挥不同的生理功能的基础,也带给我们更多关于肿瘤免疫的思考和认识,当机体内的免疫分子IgG4逐渐增加时,预示着肿瘤内B细胞功能向局部免疫抑制方向转变。这些特点也为肿瘤的免疫治疗和单克隆抗体的研发提供更多的思路和启发。
杨若恒[4]（2020）在《寨卡病毒重组亚单位疫苗在非人灵长类水平的评估及其保护机制研究》文中认为寨卡病毒（Zika virus,ZIKV）是属于黄病毒科黄病毒属的虫媒病毒。该病毒在世界范围内广泛分布,且其感染会对人类健康造成威胁。ZIKV能通过虫媒传播,母婴传播和性传播等多种途径在人群中扩散,提示安全有效的ZIKV疫苗是预防该病毒的必要手段。截至2020年4月,世界范围内仍未有对ZIKV特效的药物和疫苗上市,在研发阶段的产品包括减活疫苗,灭活疫苗、与DNA、m RNA、以及蛋白等形式的亚单位疫苗等。病毒的性质和其他黄病毒属疫苗的研发工作为ZIKV疫苗设计提供了理论依据和宝贵经验。在登革病毒研究中,人们发现病毒感染和减活疫苗诱导的部分抗体有通过抗体依赖的增强作用增加病毒感染,加重感染症状的副作用。寨卡病毒和登革病毒有相同的病毒结构,相似的氨基酸序列,重叠的分布区域,且二者产生的抗体能相互增强另一种病毒的感染。以上现象提示一个优秀的ZIKV疫苗不仅需要有效地抑制该病毒本身,还应避免因抗体依赖的增强作用带来的风险。本团队致力于重组亚单位ZIKV疫苗的研究工作。该类疫苗不仅安全性高,而且还是研究免疫原优化策略的良好形式。在前期研究中,我们设计了包含ZIKV包膜蛋第三结构域的EDⅢ蛋白和包含包膜蛋白全部胞外域的E80蛋白。小鼠水平的评估结果显示,两种免疫原均能小鼠体内诱导中和抗体反应和抗原特异性的T细胞反应,并能在小鼠保护模型中有效抑制ZIKV的复制,减轻ZIKV感染造成的病症。在本课题中,我们进一步在非人灵长类动物模型中评估了EDⅢ和E80蛋白的免疫原性和保护性,并对其提供保护的机制进行了深入研究。免疫原性检测的结果显示,EDⅢ和E80在猴体内皆能诱导抗原特异性的抗体反应和T细胞反应,且两种免疫原诱导的抗体均能结合ZIKV病毒颗粒并在体外空斑减少中和试验中抑制ZIKV对细胞的感染。这些结果提示EDⅢ和E80免疫有在猴体内抑制ZIKV感染的潜能。基于此,我们通过攻毒实验及后续的病毒载量检测等实验评估了两种免疫原在体内的保护效价。而该实验结果的显示EDⅢ和E80在猴体内有截然不同的保护效果,即EDⅢ免疫猴体内的病毒载量并不低于PBS对照组猴,而E80免疫猴血液和组织中ZIKV的病毒载量均被有效抑制。为了探究造成上述结果的原因,我们全面比较了非保护性的EDⅢ蛋白和保护性的E80蛋白诱导的抗体反应的性质。我们通过对病毒血症数据的统计分析进一步验证了E80免疫抑制了ZIKV在猴体内的复制,而EDⅢ免疫增强了ZIKV造成的病毒血症的现象。在体外ADE实验中,我们发现EDⅢ和E80诱导的抗体在下降到一定浓度时均有造成ADE的可能。考虑到攻毒实验和免疫反应检测间有2周的间隔,我们比较了两个时间点各组猴抗原特异性抗体、病毒结合性抗体、抗体中和滴度的变化幅度。结果显示,虽然二者诱导的抗原特异性抗体的变化幅度相同,但EDⅢ诱导的病毒结合性抗体反应的可持续性低于E80蛋白诱导相应抗体,导致在攻毒实验开始时EDⅢ组猴血清对ZIKV的抑制能力显着低于E80猴血清,且处于和PBS对照组猴无显着性差别的水平。这些结果揭示了两种亚单位免疫原保护效价不同的主要原因,强调了疫苗诱导的中和抗体的数量、质量、可持续性的重要性。EDⅢ诱导抗体对抗原本身的强结合能力和对病毒颗粒的弱结合能力提示其诱导的免疫反应由不在病毒表面暴露的表位所主导。我们对抗体结合位点的进行了鉴定以确认该表位的位置。结果显示,EDⅢ诱导的抗体识别的表位覆盖了该蛋白的大部分区域,且大多不在病毒表面充分暴露。该结果表明EDⅢ蛋白的效价被其在病毒表面较低的暴露程度所限制。我们对E80免疫原诱导抗体识别的区域也进行了检测,其结果显示该蛋白诱导的抗体反应由EDI/II区域主导。在基于肽段的表位鉴定实验中,E80血清主要结合位于EDI/II区域中在病毒表面充分暴露的表位,而对EDⅢ区域仅有微量的结合且主要针对非中和抗体表位。这些结果提示E80蛋白中的EDI/II区域是在恒河猴体内诱导保护性免疫反应的关键组分。本课题还研究了EDⅢ和E80诱导的抗体与DENV交叉作用的能力。实验结果显示,仅有E80蛋白诱导的抗体能交叉结合DENV病毒颗粒,且相应抗体在体外实验中既能抑制DENV也有增强其感染的能力。该现象揭示了E80免疫原的潜在优势和风险,提示进一步优化E80免疫原以研发ZIKV/DENV广谱疫苗的可行性。综上,本研究显示E80是一个更有前景的疫苗候选者;提示疫苗诱导的病毒结合性抗体的数量,中和效价以及可持续性对疫苗的保护效价都至关重要;提示免疫原在病毒表面暴露的程度对疫苗设计有辅助性作用。这些结果对ZIKV疫苗研发,ZIKV疫苗评估指标的选择,以及亚单位疫苗的设计等多个层面都具有重要意义。
陈聪[5]（2020）在《c-Met CAR-T及PD1/CD28融合受体CAR-T在胃癌中的研究》文中研究说明目的:设计靶向c-Met的嵌合抗原受体T细胞（Chimeric antigen receptor T cell,CAR-T）,验证其在胃癌中的有效性及安全性,并对c-Met CAR进行PD1/CD28融合受体优化以改善免疫抑制,提高抗肿瘤效果。方法:使用生物信息学的方法分析TCGA中胃癌数据的c-Met表达情况及其与生存预后的关系。收集手术患者的胃癌肿瘤及癌旁组织标本,用免疫组化的方法检测c-Met的表达。并用PCR、WB、流式细胞计数等方法检测6种不同胃癌细胞系c-Met、PD-L1的基因和蛋白表达情况。构建c-Met CAR和cMet-PD1/CD28 CAR质粒,包装慢病毒、感染T细胞,制备对应的CAR-T。在体外细胞实验中,检测CAR-T细胞不同亚群和表型的变化,及靶细胞刺激对CAR-T激活和PD-1表达的影响。检测CAR-T的细胞因子分泌水平,并通过乳酸脱氢酶释放实验、7-AAD染色、CD107a脱颗粒反应等方法反映c-Met CAR-T、cMet-PD1/CD28 CAR-T对靶细胞的杀伤能力。在体内动物模型中,通过活体小动物成像等方法观测两种CAR-T对小鼠胃癌皮下移植肿瘤的作用,并通过HE染色的方法检测两种靶向c-Met的CAR-T对小鼠正常器官的脱靶毒性。结果:TCGA数据库和胃癌标本免疫组化结果均显示胃癌组织高表达c-Met,c-Met表达较高的胃癌患者的预后较差。通过PCR、WB、FCM等方法筛选出c-Met表达最高的胃癌细胞系MKN-45和最低的细胞系HGC-27,作为实验细胞,并使HGC-27过表达c-Met构建HGC27-OE作为阳性对照。相对于转染空载体质粒的Mock T,c-Met CAR-T细胞的CD3+CD8+亚群和CD62L+CCR7+中央记忆表型增多,PD1/CD28融合受体结构能够进一步增加CAR-T的CD62L+CCR7+中央记忆细胞的比例,但却未明显改变CD4+、CD8+T细胞亚群。靶细胞的刺激可以使c-Met CAR-T的PD-1表达升高,CD69+、CD71+激活表型增多。相对于Mock T,c-Met CAR-T与靶细胞共培养后能够分泌更多的IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-10等细胞因子,CD107a脱颗粒反应和对靶细胞的杀伤能力均明显提高,且其杀伤活性依赖于靶细胞c-Met的表达。PD1/CD28融合受体结构能够进一步增强c-Met CAR-T对c-Met阳性胃癌细胞的杀伤能力,此外,还可以降低炎性因子IL-6的释放水平。c-Met CAR-T对小鼠皮下移植胃癌模型肿瘤的生长具有明显的抑制作用,并且对小鼠正常的胃、小肠、心、肝、脾、肺、肾等重要器官没有明显的脱靶毒性。PD1/CD28融合受体结构还能进一步增强c-Met CAR-T的远期抗肿瘤效果。结论:c-Met CAR-T对高表达c-Met的胃癌细胞具有良好的杀伤活性,能够明显抑制c-Met阳性胃癌肿瘤的生长,且对正常器官没有严重的脱靶毒性。PD1/CD28融合受体结构能够通过逆转PD-1免疫抑制信号,进一步增强c-Met CAR-T的抗肿瘤能力,并且可以减少c-Met CAR-T炎性因子IL-6的分泌,降低细胞因子释放综合征的发生率,具有更高的安全性。
廖春香[6]（2020）在《溶瘤呼肠孤病毒活化NK细胞的分子机制研究》文中提出目的:探究溶瘤呼肠孤病毒（reovirus）活化体外扩增的NK细胞,促进NK细胞抗肿瘤效应的相关分子机制,为NK细胞联合reovirus进行肿瘤治疗提供理论依据并奠定实验基础。方法:1.分离健康献血者外周血单个核细胞（PBMC）,以灭活的K562细胞作为饲养细胞,在IL-2作用下体外诱导培养14天左右收集细胞并通过流式细胞术检测细胞纯度;2.Reovirus处理NK细胞（Reo-NK）,以ds RNA类似物Poly（I:C）作对照处理NK细胞（Poly-NK）,流式细胞术检测NK细胞表面活化标志物CD69的表达情况,CCK-8法检测结直肠癌细胞株DLD-1细胞死亡率;ELISA检查穿孔素（perforin）及干扰素-γ（IFN-γ）的分泌水平;3.TLR3/ds RNA复合物阻断剂及TBK1/IKK?抑制剂BX795处理Reo-NK和Poly-NK后,流式细胞术检测NK细胞活化标志物CD69的表达,CCK-8法检测DLD-1细胞死亡率,ELISA检测Reo-NK和Poly-NK的perforin、IFN-γ、TNF-α的分泌水平。结果:1.体外扩增的NK细胞纯度可达90%左右,存活率在95%以上;2.TLR3/ds RNA复合物抑制剂抑制reovirus对NK细胞的活化,降低CD69+NK细胞的阳性率,抑制NK细胞杀伤DLD-1细胞,降低IFN-γ及TNF-α的分泌。（1）DLD-1细胞的死亡率降低:Reo-NK经10mM的TLR3/ds RNA复合物抑制剂处理后(Reo-NKinhibit.),DLD-1细胞死亡率相对未经处理的Reo-NK下降[（49.58±2.1）%vs（65.58±1.3）%],**P<0.01;Poly-NK经10mM的TLR3/ds RNA复合物抑制剂处理后(Poly-NKinhibit.),DLD-1细胞死亡率相对未经处理的Poly-NK下降[（42.4±2.6）%vs（69.28±2.5）%],***P<0.001;（2）TLR3/ds RNA复合物抑制剂抑制降低NK细胞CD69的阳性率;（3）TNF-α及IFN-γ分泌水平下降:经10mM的TLR3/ds RNA复合物抑制剂处理的Reo-NK(Reo-NKinhibit.)相比未经处理的Reo-NK,TNF-α分泌水平降低[（201.3±3.2）vs（268.3±2.1）pg/m L pg/m L],*P<0.05,处理的Poly-NK(Poly-NKinhibit.)相比未经处理的Poly-NK,TNF-α分泌水平降低[（189.3±2.2）vs（231.2±2.1）pg/m L],*P<0.05;同样,IFN-γ的分泌在TLR3/ds RNA复合物抑制剂的作用下也相对未经抑制剂处理时降低。3.TBK1/IKK?激酶复合体抑制剂BX795降低ds RNA对NK细胞的活化,降低CD69+NK细胞的阳性率,抑制NK细胞杀伤DLD-1细胞,降低IFN-γ及perforin的分泌。（1）NK细胞表面活化标记物CD69的表达:Reo-NK与NK相比增加（63.1%vs 58.3%）,Reo-NK+Bx与Reo-NK相比降低:（46.1%vs63.1%）;Poly-NK与NK相比增加（70.5%vs 58.3%）,而Poly-NK+Bx与Poly-NK相比降低:（60.0%vs 70.5%）;（2）NK对DLD-1细胞的杀伤率:Reo-NK与NK相比显着提高[（69.6±1.3）%vs（46.0±2.2）%,(**P<0.01)],10mM的BX795阻断剂处理后（Reo-NK+Bx）对DLD-1细胞杀伤率受抑制[（69.6±1.3）%vs（60.2±2.1）%],（*P<0.05）;Poly-NK与NK相比,对DLD-1细胞的杀伤率有显着上升[（69.3±2.5）%vs（46.0±2.2）%],***P<0.001,10mM的BX795阻断剂处理后（Poly-NK+Bx）相比Poly-NK对DLD-1细胞杀伤率降低至（60.0±1.6）%;（3）NK细胞培养上清中perforin、IFN-γ、TNF-α的分泌水平:a.在perforin的检测中,Reo-NK与单独NK相比分泌水平显着上升[（1120.0±10.96）pg/m L vs（825.0±10.9）pg/m L],*P<0.05,10mM的BX795处理后（Reo-NK+Bx）分泌水平显着低于Reo-NK,[（838.1±8.3）pg/m L vs（1120.1±11.0）pg/m L],*P<0.05;poly-NK与单独NK相比分泌水平显着上升[（1008.5±5.3）pg/m L vs（825.0±10.9）pg/m L],*P<0.05,10mM的BX795处理后（Poly-NK+Bx）分泌水平显着低于Poly-NK[（740±10.58）pg/m L vs（1008.47±5.31）pg/m L];b.在IFN-γ检测中,Reo-NK与单独NK相比,分泌水平显着上升[（127.0±3.6）pg/m L vs（32.6±1.3）pg/m L],**P<0.01;Poly-NK与NK相比也显着上升[（147.0±2.7）pg/m L vs（32.6±1.3）pg/m L],**P<0.01;10mM的BX795处理Poly-NK后（Poly-NK+Bx）分泌水平显着低于Poly-NK[（52.2±4.6）pg/m L vs（147.0±2.7）pg/m L],**P<0.01。结论:1.Reovirus可以直接促进NK细胞的活化,且对NK细胞的活化方式与Poly（I:C）类似;2.Reovirus活化NK细胞的分子机制可能与TLR3信号通路有关。
马美晨[7]（2020）在《HIV感染者NK细胞亚群分布及调节作用的研究》文中进行了进一步梳理目的:NK细胞是固有免疫系统中一类大颗粒淋巴细胞,其主要表达CD56分子和/或CD16分子,不表达CD3分子,在抗肿瘤及抗病毒反应中均起到了重要的作用,是免疫系统的第一道防线。根据其表面的不同标志物可将NK细胞划分为不同的亚群,不同的亚群发挥着不同的功能,包括细胞因子分泌、杀伤靶细胞以及免疫调节作用。单细胞测序作为一项新兴的技术,主要被应用于细胞类型鉴定、细胞异质性、信号通路差异响应及分子调控网络等方面的研究。HIV的感染会导致NK细胞亚群分布及功能的改变,但利用单细胞测序技术研究健康对照及HIV感染者总NK细胞亚群变化还尚未见报道;针对人类CD56+NK细胞,出现了以CD11b、CD27分子划分的新的分群方式,而在对HIV感染的研究中,有关新的分群方式来定义CD56+NK细胞亚群及功能的研究仍未见报道;HIV感染导致NK细胞中CD56-CD16+亚群数量的增加,该亚群的杀伤功能及细胞因子分泌功能减弱,但CD56-CD16+亚群是否发挥着免疫调节功能未知。本研究探究了HIV感染者总NK细胞（CD56+NK细胞及CD56-NK细胞）通过单细胞测序技术来揭示NK细胞亚群特征及分布的改变（论文一）;探讨了HIV感染者CD56+NK细胞应用CD11bCD27定义后各个亚群的功能及其调节作用的研究（论文二）;并对HIV感染者CD56-NK细胞的变化及调节作用进行了较为深入的研究（论文三）,为HIV感染的机制研究和相关免疫治疗提供新的思路及方向。研究方法:1.研究对象本研究所使用的对象均来源于中国医科大学艾滋病研究所红丝带门诊的HIV感染者及男同队列的HIV阴性健康对照者。健康对照者为HIV抗体、乙肝、丙肝均为阴性的健康男性。研究中纳入了59名HIV未治疗感染者、ART治疗者28名及39名健康对照者为研究对象。所有入选者均为男性且年龄相匹配。入选对象签署了知情同意书,并获得了中国医科大学附属第一医院伦理委员会的批准。2.CD4+T细胞绝对计数EDTA抗凝负压真空采血管采集研究对象外周血,将TriTESA-CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PerCP染料与全血于流式管中混合,进行室温避光染色,再加入溶血素溶解红细胞,使用BD FACSCalibur流式细胞仪进行上机检测,应用MultiSET软件进行计算CD4+T细胞绝对数。3.外周血单个核细胞的提取应用PBS稀释混匀负压真空采血管中采集的全血,使用移液管缓慢匀速加入至Ficoll液面上,密度梯度离心后使用加样枪吸取细胞层后使用PBS洗涤细胞两次。4.多色流式细胞术检测细胞表面采用UltraComp eBeadsTM Compensation Beads进行补偿校准。CD3-PerCp-Cy5.5/FITC、CD56-PE-Cy7、CD16-BV510、CD11b-APC、CD27-PE、NKG2A-PE、NKG2D-PE、NKG2C-PE、CD11c-PE、CD57-PE、Tigit-PE、CCR7-Percp、CD8-APC-Cy7,CD279（PD-1）-BV421及各染料的isotype作为阴性对照。4℃避光染色30min后使用含有2%的FBS洗涤两次后应用使用LSR II流式细胞仪上样检测。5.NK表面代谢物质的检测CD3-PerCp-Cy5.5/FITC、CD56-PE-Cy7、CD27-BV510、CD11b-APC、Glut-1-PE、CD98-FITC、CD36-APC-Cy7进行4℃避光染色30min后使用含有2%的FBS洗涤两次后应用使用LSR II流式细胞仪上样检测。6.分选NK细胞及NK亚群提取PBMC后使用NK负选试剂盒（EasySep?Human NK Cell Enrichment Kit）富集PBMC中的NK细胞。NK亚群的分选:提前一天使用1-2ml R10放入流式管中,使R10充分湿润管壁后放入4℃冰箱中过夜。次日提取PBMC后,使用含有EDTA的PBS洗细胞两次,300g,10min,进行表面染色,CD3-PerCP-Cy5.5,CD56-PE-Cy7、CD16-APC、CD8-APC-Cy7、CD11b-APC、CD27-PE 4℃,30min,避光,染色结束后使用含有2%FBS的PBS洗细胞,350g,5min,重复两次。弃掉上清后使用含有EDTA的PBS重悬细胞至2-3ml,使用Aria II分选仪进行分选。7.多色流式细胞术检测胞内因子计数细胞后使用R10重悬后加入至U底96孔板中,保证每孔中含有0.2-0.5million个PBMC,在PBMC周围孔中补200ul PBS以保证目的孔湿度,在PBMC中加入10 ng/mL人重组IL-12、50 ng/m L rIL-15、100 ng/mL rIL-18刺激PBMC 24小时同时加入CD107a-APC-Cy7及isotype,在收细胞前的6小时,在每孔中加入1ul的Golgistop,收细胞时,使用加样枪吹打孔中细胞后收入标记好的流式管中,并用200ul PBS冲洗孔两次,保证PBMC全收入至流式管中。在流式管中加入2ml的PBS,350g,5min,洗细胞,重复两次。在最后一次洗细胞后,使用PBS将细胞重悬至200ul,使用振荡器混匀后进行表面染:CD3-PerCP-Cy5.5,CD56-PE-Cy7,CD16-BV510荧光抗体染色,避光染色30min,4℃,用2%FBS洗涤细胞,350g,5min,重复此步骤两次,洗去未结合染料。破膜及胞内染色:每管中加入250ul破膜剂,避光,室温进行破膜20min,20min后离心,500g,5min,使用1ml破膜洗液洗涤细胞以去除破膜剂,使用IL-10-APC、TGF-β-PE及IFN-γ-FITC染胞内,4℃,避光,30min染色,结束后使用1×破膜洗液1ml/管洗涤细胞,500g,5min,弃上清后重悬至200ul,使用LSR II流式细胞仪上样检测。8.NK细胞亚群胞内Granzyme B及Perforin的检测实验中使用K562细胞系刺激NK细胞,K562细胞系使用PBS洗涤后,按照2 ul/5million比例加入Cell-Trace-Violet用于标记K562细胞系,37℃,5%CO2,20min,避光染色。染色结束后使用含有FBS的R10终止染色5-10min,R10洗涤细胞,300g,10min,重复两次。计数细胞,调整细胞比例,效靶比（PBMC:K562=5:1）,使细胞数在0.2-0.5 million/200ul,种入96孔板中培养6h。培养结束后使用加样枪将培养板中的细胞移入标记好的流式管中,200ul PBS重复洗涤孔板。2ml 2%FBS洗涤细胞,300g,10min,重复两次,弃掉上清废液,加入7AAD,Vortex混匀细胞,15min内上机检测。9.CD4+T细胞增殖的抑制试验使用流式分选分选出CD4+T细胞及CD11b-CD27-NK亚群及CD11b-CD27+NK亚群,使用Cell-Trace-Violet用于标记CD4+T细胞,20min,37℃染色后按照NK:CD4+T细胞比例为1:1种入96孔板中,按照1million cells/25ul anti-CD3/28 beads刺激细胞,同时加入10 ng/m L r IL-12、r IL-15 50 ng/mL,100ng/mL r IL-18培养72h后将细胞收至流式管中,使用PBS洗涤细胞两次,弃上清后混匀细胞,按照1million cells/1ul live/dead染料。室温染色10min后,PBS洗涤两次,重悬细胞至200ul,上样检测。10.CD8+T细胞分泌IFN-γ的抑制试验将分选后的NK细胞及标记后的CD8+T细胞使用R10重悬,按照1:1的比例放入96孔板中,向其中加入10 ng/m L rIL-12、rIL-15 50 ng/m L,100 ng/m L r IL-18,5μg/mL phytohemagglutinin,及200 U/m L的rIL-2,培养24小时,在培养结束的前6小时,加入1ul的Golgistop,收细胞时,使用加样枪吹打细胞后移入标记好的流式管中,再使用200ul的PBS洗涤培养孔,重复两次。向流式管中加入PBS2ml,300g,10 min,洗涤两次。弃掉废液后使用振荡器混匀细胞,加入250ul的破膜剂,室温,20min,避光破膜。破膜结束后500g,5min离心,再使用1×的破膜洗液洗涤两次,500g,5min。弃掉上清后,使用振荡器混匀细胞,加入IFN-γ-FITC,4℃避光染色30min。染色结束后使用1×破膜洗液去除多余的染料,重悬细胞至200ul,使用流式细胞仪检测CD8+T细胞分泌IFN-γ情况。11.NK细胞IL-10、TGF-β及PD-L1的封闭试验提取新鲜PBMC后,进行表面染色,CD3-PerCP-Cy5.5,CD56-PE-Cy7,CD16-APC,CD8-APC-Cy7,4℃避光染色30min,使用含有2%FBS的PBS 2-3ml洗涤细胞,300g,10min,重复两次,去除未结合的染料。染色结束后使用含有EDTA的PBS 2-3ml重悬细胞,使用Aira II流式分选仪分选NK细胞。分选细胞后,使用PBS洗涤细胞两次,使用R10重悬细胞,将其放入96孔板中,在其中加入25ng/ml anti-IL-10 mAb,5ug/ml anti-TGF-βmAb,anti-PD-L1 mAb 0.25ug/106 cells及匹配的同型对照,孵育1-2h,孵育完成后加入IL-12/IL-15/IL-18及PHA、IL-2,刺激24h,在刺激完成的前6h加入Golgistop。12.统计学分析用GraphPad Prism 6软件及SPSS 20.0对实验结果进行统计学分析。两组间比较用Mann–Whitney U检验,配对比较用Wilcoxon signed-rank检验。p<0.05（双侧）被认为是具有统计学差异。结果:一、单细胞测序揭示HIV感染者总NK细胞亚群特征1.健康对照者NK细胞基因水平的亚群分布特征排除了T细胞及B细胞等非NK细胞干扰后,发现NK细胞在单细胞基因层面可被划分为更细致的10个亚群。C0亚群高表达的基因分别是COL6A2,CD3G,CD3D,PTGDS,CD3E,IL32,KLRC2,PRDX2,GZMH;C1亚群高表达的前10个基因为FCER1G,CMC1,KLRC1,CD7,KLRB1,AKR1C3,CD160,SPON2,CLIC3,C1orf162;C2亚群为CD3E,LAG3,TNFRSF18,CLIC3,IL32 CD52,GZMH,KLRC2,GTF3C1,TRG-AS1;C3亚群为S100B,SELL,CD2,CLECL1,CD3D,PRSS57,CD3G,CLEC2D,CD3E,CD52;C4亚群为IGFBP7,ALOX5AP,KIR2DL1,GZMH,MIAT,KLRC2,FGFBP2,LAG3,PFKP,ADGRG1;C5亚群为ZFP36,FOS,CD69,PPP1R15A,NFKB1A,DUSP1,CCL3,JUN,JUNB,ZNF331;C6亚群为JUN,NFKB1A,CD69,IER3,TNF,PPP1R15A,CCL4,NFKBIZ,BTG2,ZC3H12A;C7亚群FOS,DUSP1,ZFP36,GZMK,CMC1,XCL1,JUN,PPP1R15A,CD69,LTB;C8亚群C1orf56,HNRNPH1,MDM4,TMEM120B,CDC42SE1,C16orf54,B4GALT1,APOBEC3C,PHKG1,B3GNT7;C9亚群STMN1,PCNA,MCM7,TYMS,DUT,TUBA1B,PCLAF,MCM5,MCM3,GINS2,每个亚群基因富集到的功能各不相同。2.健康对照者及HIV感染者NK细胞相关性分析健康对照者与HIV感染者NK细胞数量及亚群分布均有显着差异,两例样本合并后的典型相关性分析可将NK细胞共划分为0-11,共12个亚群（CC0-CC11）。在对两个样本在每个亚群占比分析中,CC0、CC3及CC5这三个亚群中HIV感染者的细胞要明显多于健康对照者,而CC1-2、CC4、CC8-9群中,健康对照者的细胞显着高于HIV感染者。3.HIV感染导致NK细胞功能改变在HIV感染样本细胞数量占比较多的亚群进行分析中发现,CC0中HIV感染者下调的基因多集中于I型干扰素信号通路、对病毒的反应及调节免疫反应中。而在CC3中,下调基因集中于I型干扰素信号通路、T细胞共刺激、调节免疫反应等等,CC5亚群中下调基因也富集于I型干扰素信号通路、对病毒反应及调节免疫反应。而在那些HIV感染者细胞比例减少的亚群中发现CC1富集到的基因还参与IFN-γ介导的信号通路,CC2、CC4的基因还涉及到了病毒的转录,CC8-CC9下调基因参与了病毒防御反应。二、HIV感染者CD11b CD27定义的CD56+NK细胞各个亚群功能及其调节作用的研究1.HIV感染者CD11bCD27定义的CD56+NK细胞各个亚群的变化未治疗HIV感染者CD11bCD27定义的CD56+NK细胞各个亚群与健康对照者相比出现明显的差异,未治疗HIV感染者的CD11b+CD27-亚群百分比显着降低,而CD11b-CD27-亚群百分比显着升高。2.HIV感染者CD11bCD27定义的CD56+NK细胞活化性受体增高HIV感染者活化性受体NKp44及NKp46在CD11bCD27定义的NK细胞各个亚群中的表达均高于健康对照者,且四个亚群中CD11b-CD27-亚群的活化性受体表达最低。说明HIV感染后NK细胞表现出高活化的状态。3.CD11b-CD27-亚群呈现幼稚的表型特征在对各个亚群成熟度的研究当中,无论是HIV感染者或是健康对照者CD11b-CD27-亚群低表达成熟marker——CD11c,同时HIV感染者的CD11c在四个亚群中的表达均高于健康对照者;HIV感染者CD11b-CD27-亚群低表达衰老marker——CD57,CD11b-CD27-亚群幼稚marker——CCR7高于CD11b+CD27-亚群。4.CD11bCD27定义的NK细胞亚群checkpoint点的表达水平在HIV感染者中显着升高HIV感染者各个亚群Tigit的表达均显着高于健康对照者,四个亚群中Tigit表达最高的是CD11b+CD27-亚群;而PD-1的配体PD-L1在HIV感染者中CD11b-CD27-亚群的表达最低。5.CD11bCD27定义的NK细胞亚群代谢特征HIV感染者CD11b-CD27-亚群低表达葡萄糖转运体Glut-1,两组人群的比较无显着性差异;CD11b-CD27-亚群低表达脂质受体CD36,而氨基酸受体CD98的表达仅高于CD11b+CD27-亚群。6.CD11b-CD27-亚群分泌IFN-γ及CD107a的脱颗粒功能不良细胞因子刺激NK细胞后检测各个亚群分泌IFN-γ及CD107a脱颗粒的情况,四个亚群中CD11b+CD27+亚群高表达IFN-γ及CD107a,其次是CD11b-CD27+亚群,CD11b+CD27-亚群低于前两个亚群,CD11b-CD27-亚群最低。7.CD11b-CD27-NK亚群颗粒霉及穿孔素储存能力良好,释放能力受损未经刺激时HIV感染者四个亚群中CD11b-CD27-NK亚群的Granzyme B及Perforin最高,而经过刺激后CD11b-CD27-NK亚群储存的Perforin则显着下降。8.CD11b-CD27-NK亚群分泌负向调节因子分选各个亚群经过细胞因子刺激后收集培养上清进行ELISA检测IL-10及TGF-β发现CD11b-CD27-亚群能分泌大量的IL-10及TGF-β。9.CD11b-CD27-亚群抑制CD4+T细胞增殖分选HIV感染者CD11b-CD27-亚群及CD11b+CD27-亚群,分别将其与CD4+T细胞进行共培养,经过TCR刺激后发现CD11b-CD27-亚群具有能够抑制CD4+T细胞的增殖的趋势。三、HIV感染者CD56-NK细胞的变化及调节作用的研究1.HIV感染者CD56-CD16+NK细胞百分比显着升高HIV感染者CD56-CD16+NK细胞的百分比较健康对照者相比显着升高,经过ART治疗后百分比虽有所下降,但未降至正常水平;HIV感染者CD56dimCD16+NK细胞百分比明显低于健康对照者,ART组的CD56dimCD16+NK细胞百分比有所回升但仍未达到健康对照者的水平。2.HIV感染者CD56-CD16+NK细胞分泌高水平的IL-10及TGF-β对比HIV感染者CD56-CD16+NK细胞及CD56dimCD16+NK细胞表达的IL-10及TGF-β发现CD56-CD16+NK细胞高表达IL-10及TGF-β,且未治疗HIV感染者与ART患者CD56-CD16+NK细胞表达的IL-10及TGF-β无差异。3.HIV感染者CD56-CD16+NK细胞亚群抑制CD8+T细胞功能分别将CD56-CD16+NK细胞及CD56dimCD16+NK细胞与自体的CD8+T细胞进行共培养后发现CD56-CD16+NK细胞能够抑制CD8+T细胞的IFN-γ分泌,且抑制率与CD56-CD16+NK细胞的比例呈正相关。4.阻断CD56-CD16+NK细胞分泌的IL-10及TGF-β可部分恢复CD8+T细胞的功能培养体系中加入IL-10及TGF-β相应的抗体后,CD8+T细胞分泌的IFN-γ得到了部分的恢复,抑制率明显下降。5.CD56-CD16+NK细胞通过直接接触的方式抑制CD8+T细胞功能分离培养实验证实CD56-CD16+NK细胞除了间接接触的方式抑制自体的CD8+T细胞功能外还能够通过直接接触的方式抑制CD8+T细胞分泌IFN-γ。6.HIV感染者CD8+T细胞高表达PD-1,CD56-CD16+NK细胞高表达其配体PD-L1HIV感染者CD8+T细胞较健康对照者的CD8+T细胞相比,高表达抑制性分子PD-1,同时HIV感染者的CD56-CD16+NK细胞上的PD-L1较CD56dimCD16+NK细胞相比表达增高,说明CD56-CD16+NK细胞可能通过高表达的PD-1/PD-L1来发挥抑制作用。7.封闭PD-L1后可部分恢复CD8+T细胞的功能对CD56-CD16+NK细胞高表达的PD-L1进行了抗体封闭试验后,该亚群对自体CD8+T细胞的抑制作用明显减弱。结论:1.总NK细胞根据单细胞测序可分为10个亚群,HIV感染者NK细胞I型干扰素信号通路基因下调,影响NK细胞抗病毒作用。2.CD56+CD11b-CD27-NK亚群在HIV感染中显着升高,该亚群展现低活化,幼稚的表型,葡萄糖转运能力低,脂质及氨基酸受体高于CD56+CD11b+CD27-NK亚群,同时该亚群细胞功能不良,能够分泌负向细胞因子,抑制CD4+T细胞增殖。3.CD56-CD16+NK亚群增高,抑制自体CD8+T细胞功能,CD56-CD16+NK细胞的分泌大量IL-10及TGF-β,高表达抑制性受体的配体PD-L1,并通过直接接触（PD-1/PD-L1）及间接接触（IL-10及TGF-β的分泌）的方式抑制CD8+T细胞分泌IFN-γ,阻断PD-L1的表达或封闭IL-10及TGF-β能够恢复CD8+T细胞功能。
李俊鑫[8]（2019）在《中和H7N9禽流感病毒全人源单克隆抗体的快速筛选及抗病毒机制研究》文中指出H7N9禽流感病毒是一种甲型流感病毒,可以通过禽类感染人。人感染H7N9禽流感是一种急性呼吸道传染病,可以迅速发展为重症肺炎和急性呼吸窘迫综合征,死亡率高达40%,至今仍然缺乏有效的药物和疫苗。目前,高致病性H7N9禽流感病毒的出现已经对家禽养殖业、畜牧业以及人类健康构成严重的威胁,亟需卫生部门采取有效的控制措施。全人源单克隆抗体能够中和和清除禽流感病毒,在防治禽流感上具有显着的疗效,因此,快速筛选靶向病毒保守中和表位的人源抗体对控制H7N9禽流感疫情具有重大意义。在本研究中,我们利用单个记忆B细胞PCR技术和微量中和H7N9病毒实验,两周内快速地从康复病人的可转化记忆B细胞（switched memory B cells）中鉴定和克隆全人源单克隆抗体3L11和5J13,并分别研究两种全新的人源抗体的抗病毒机制。3L11抗体的重链可变区基因和轻链可变区基因分别由罕见的VH1-8*01/D2-15*01/JH5*02和VL2-13*01/JL3*02家族基因组成,而且分别带有8.87%和5.55%的体细胞突变,使3L11抗体能够结合H7N9病毒的血凝素（Hemagglutinin,HA）,亲和力KD为5.32×10-9M。我们构建的稳转CHO细胞能够生产250.12mg/L的3L11,抗体纯度达99%。在体外,3L11能够广谱中和A/Anhui/1/2013（AH1）、A/Shanghai/2/2013（SH2）、A/Shenzhen/Th004/2017（SZ4）、A/Shanghai/1/2013（SH1）等H7N9禽流感病毒,也可以介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC）清除感染病毒的细胞。对3L11的H7N9逃逸病毒株测序发现,病毒的HA蛋白发生了G151R(Gly151→Arg151)和S152P(Ser152→Pro152)的氨基酸替换,这表明3L11的中和表位是在HA头部受体结合位点（receptor binding site,RBS）附近的抗原位点A（RRSGSS）。而且通过序列比对的结果发现,流行的H7N9野生型病毒都没有这两个氨基酸突变。因此,3L11有极大潜力能够中和所有出现过的H7N9流行毒株。更重要的是,无论是预防实验还是治疗实验,3L11都可以完全地保护小鼠免受H7N9病毒的致命攻击。5J13抗体的重链可变区基因和轻链可变区基因分别由VH3-30*03/D2-2*01/JH6*02和Vκ4-1*01/Jκ4*01组成,并且分别带有15.25%和4.42%的体细胞突变。5J13特异地高亲和力结合H7N9病毒的HA蛋白,KD值为1.95×10-10M。稳转5J13抗体基因的CHO细胞能够生产84.48mg/L的5J13,抗体纯度达99%。在体外,5J13能够抑制病毒的血凝作用和膜融合作用,从而高效地中和了H7N9病毒;在体内,5J13能够预防和治疗致命的H7N9病毒感染小鼠。更重要的是,通过氢氘交换质谱、逃逸病毒株测序和竞争结合实验等结果发现,5J13的表位在HA蛋白头部RBS的对面,是一个之前国内外从未报道过的全新的中和表位,其中一个氨基酸E89K(Glu89→Lys89)的突变能够导致5J13失去结合病毒的活性。我们把这个全新的中和表位命名为抗原位点J。综上所述,本项研究工作证明了记忆B细胞PCR技术快速鉴定、克隆抗流感病毒人源抗体的可行性,对迅速控制严峻的特别是未来新出现的流感疫情具有重大的指导意义。我们获得了两个新的中和H7N9病毒的人源抗体,为预防和治疗H7N9禽流感提供了优质的候选抗体药物。另外,两个人源抗体的抗病毒机制以及全新中和表位的发现,将有力地促进通用型禽流感疫苗及广谱性中和抗体的研究和发展。
石妍妍[9]（2019）在《BRBP1-Fc肽体的表达纯化及生物学特性初步研究》文中指出抗体类药物是指含有抗体功能区的蛋白药物,其中肽体在生物医学研究及应用领域取得了显着成效。肽体是将具有生物活性的多肽与IgG的铰链区和Fc片段进行基因重组而表达的融合蛋白。因此肽体不仅呈现出所融合多肽的生物学活性,而且还具有IgG-Fc段的功能特点,包括显着延长其血浆半衰期以及结合、活化巨噬细胞、NK细胞等固有免疫细胞发挥免疫效应等。自从1989年第一个功能性IgG-Fc融合蛋白-CD4-Fc问世以来,几种应用于不同领域的治疗性肽体已成功进入市场由于融合了具有生物学功能的多肽以及IgG抗体的Fc区,因此肽体具有增强稳定性、亲和力、便于纯化、发挥ADCC/CDC作用等优势。本实验室前期利用噬菌体展示技术筛选获得了乳腺癌专一脑转移细胞系靶向结合多肽BRBP1,并分别在细胞与组织水平证实其具有高结合特异性。BRBP1肽可以与人乳腺癌原发灶肿瘤细胞特异性结合。综合肽体与BRBP1肽的优势,前期我们利用哺乳动物细胞表达系统通过瞬时转染表达了BRBP1-Fc肽体,但此种表达方式存在不足,BRBP1-Fc肽体的生物学功能并未达到预期。因此,本课题的主要研究内容如下:1.哺乳动物细胞表达系统BRBP1-Fc肽体的表达及结合能力鉴定目的:本实验室前期利用哺乳动物细胞表达系统瞬时转染的方法成功表达了的BRBP1-Fc肽体并进行了结合能力验证。此方法表达的肽体得率、纯度及稳定性均存在不足,导致其结合能力不佳。通过哺乳动物细胞表达系统表达的蛋白具有糖基化修饰位点,肽体的Fc段可发挥ADCC/CDC等治疗作用,因此本章我们继续选择哺乳动物细胞表达系统利用构建稳转细胞系的方法表达BRBP1-Fc肽体,提高其得率、纯度及表达稳定性,并对其结合231-BR细胞的能力进行鉴定。方法:将前期构建的pFUSE-hIgG2-Fc2-BRBP1真核表达载体经单酶切回收、测序分析后转染至工具细胞CHO中,在初步验证转染成功后利用博来霉素加压筛选约二十天,利用有限稀释法或极限稀释法获得单克隆细胞。Western blot鉴定单克隆细胞BRBP1-Fc肽体表达情况。提取阳性单克隆细胞胞内DNA进行PCR扩增并送测序分析pFUSE-hIgG2-Fc2-BRBP1是否正确整合至宿主基因组中,最终获得稳转pFUSE-hIgG2-Fc2-BRBP1的CHO细胞。选取表达量最高的一株进行扩大培养,收集细胞培养上清浓缩,利用Protien G柱纯化,获得BRBP1-Fc肽体。利用细胞ELISA与流式细胞术验证BRBP1-Fc肽体与231-BR细胞结合特异性。结果:经过Western blot、PCR扩增、测序鉴定后,我们共获得五株稳转pFUSE-hIgG2-Fc2-BRBP1 CHO细胞,其中4号细胞表达量最高。因此我们选取了4号细胞进行贴壁扩大培养,最终获得总量约0.64mg的BRBP1-Fc肽体。细胞ELISA与流式细胞术的结果显示,通过构建稳转细胞系所表达的BRBP1-Fc肽体尽管保留了BRBP1肽的结合特性,其结合231-BR细胞的能力不及前期荧光肽的结果。结论:成功构建了稳转pFUSE-hIgG2-Fc2-BRBP1 CHO细胞系并表达了总量约为0.64mg且纯度尚可的BRBP1-Fc肽体。在保证各实验条件合理的情况下,BRBP1-Fc肽体与231-BR细胞的结合能力不及前期荧光肽的结果。因此,后续需要针对BRBP1-Fc肽体的空间构象进行优化与改造。2、大肠杆菌表达系统BRBP1-Fc肽体的表达及结合能力鉴定目的:相关文献提示,Fc融合蛋白中多肽与Fc段之间linker的长度影响其亲和力,因此我们探究延长BRBP1与Fc之间的linker长度,表达分别带有两组与三组重复linker（GGGGS）的BRBP1-Fc肽体以解决其结合能力不佳的问题。已知人IgG1较其他亚型相比应用价值更高,我们转换策略选择人IgG1的Fc段作为肽体的组成部分。由于本研究旨在探究BRBP1-Fc肽体在临床标本检测中的应用,不涉及其治疗应用,并且前期结果表明非糖基化不影响BRBP1的结合能力,因此我们利用无糖基化修饰但产量高、耗时短的大肠杆菌表达系统进行肽体的表达并验证其生物学功能。方法:为获取构建肽体所必需的人IgG1的Fc段,首先构建pFUSE-hIgG1-Fc2-BRBP1-Fc真核表达载体,随后利用PCR反应以该真核表达载体为模板扩增BRBP1-Fc片段,最后将其与pET-16b原核表达载体连接,构建pET-16b-BRBP1-Fc（L2）、pET-16b-BRBP1-Fc（L3）原核表达载体。随后将各载体转化至表达菌株中,并利用诱导剂IPTG诱导表达,Protien G柱纯化肽体,最后选择流式细胞术再次验证经改造后的带有不同长度linker的BRBP1-Fc肽体的生物学特性。结果:成功构建了pET-16b-BRBP1-Fc（L2）、pET-16b-BRBP1-Fc（L3）原核表达载体,经诱导表达、Protien G纯化后获得了浓度约为200μg/mL的BRBP1-Fc（L2）、BRBP1-Fc（L3）肽体。通过流式细胞术的检测,BRBP1-Fc（L2）、BRBP1-Fc（L3）肽体均显示出了与231-BR细胞的较高结合能力,其结合率分别达到了64%与87%。竞争抑制试验的结果同样表明随着linker长度增加,BRBP1-Fc肽体的亲和力也逐步增强。结论:通过改造成功得到了结合能力与亲和力均提高的BRBP1-Fc（L3）肽体,为下一步BRBP1-Fc肽体的临床应用奠定了重要的基础。3、BRBP1-Fc肽体与人乳腺癌病理组织结合性能鉴定目的:本实验室前期实验结果显示,BRBP1肽可与人部分乳腺浸润性导管癌石蜡组织标本特异性结合,具有临床应用潜能。本章中我们选择了BRBP1-Fc（L3）来验证其与人乳腺癌病理组织标本的结合特异性以探究BRBP1-Fc（L3）临床应用的潜能。方法:收集东南大学附属中大医院20132014年乳腺浸润性导管癌手术切除组织石蜡包埋标本27例,经脱蜡、抗原修复后孵育BRBP1-Fc（L3）肽体、Fc对照,洗涤后孵育HRP标记的兔抗人IgG抗体,经DAB法显色后观察BRBP1-Fc（L3）肽体结合情况。结果:BRBP1-Fc（L3）肽体可与人乳腺癌原发灶肿瘤细胞特异性结合,而对照Fc蛋白不与人乳腺癌原发灶肿瘤细胞结合,说明BRBP1-Fc（L3）肽体与人乳腺癌原发灶肿瘤细胞特异性结合。并且在收集到的部分病例中,BRBP1-Fc（L3）肽体与人乳腺癌原发灶肿瘤细胞特异性结合的同时,与淋巴结转移灶肿瘤细胞同样结合。结论:与本实验室前期结果类似,BRBP1-Fc（L3）肽体在结合人乳腺癌原发灶肿瘤细胞的同时也与淋巴结转移灶肿瘤细胞结合。由于肽体比多肽稳定性更强、检测方法更实用于临床,因此可在条件优化后扩大临床样本量进一步探究BRBP1-Fc（L3）临床应用的潜能。综上所述,本研究成功利用大肠杆菌表达系统表达、纯化出与乳腺癌脑转移细胞系231-BR细胞结合能力较强的BRBP1-Fc（L3）肽体。初步的临床病理组织样本检测结果发现BRBP1-Fc（L3）肽体在结合人乳腺癌原发灶肿瘤细胞的同时也与淋巴结转移灶肿瘤细胞结合。本研究为BRBP1-Fc（L3）肽体的表达与应用奠定了重要的实验基础。
郭猛[10]（2019）在《靶向GPC3的CAR-NK细胞在肝细胞肝癌免疫治疗中的研究》文中认为肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）在世界范围内是排名第二位的癌症死因,中国肝癌发病人数和因病致死人数占全世界的50%以上,病死率居第三位。尽管目前HCC治疗方案呈现多样化、联合化的趋势,但实际上近10年来HCC患者的长期生存已很难再获得更进一步改善。因此,迫切需要找到一种全新的有效安全的治疗手段。近年来,嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptor,CAR）修饰的T细胞是最受关注的肿瘤免疫疗法之一,该技术通过在T细胞中转染嵌合抗原受体,使T细胞可以特异性靶向肿瘤表面抗原,同时胞内段结构域可以提供第一和第二信号活化T细胞,使其成为具有精确靶向性、并持续维持杀伤活性的新一代细胞治疗技术,在多种肿瘤中特别是血液系统肿瘤的治疗中表现出了极佳的疗效。但与此同时,安全性也成为困扰CAR-T临床应用的一大难题:细胞因子风暴、脱靶效应、严重的过敏反应和神经毒性,以及病毒载体带来的安全隐患严重限制了CAR-T的进一步推广。NK细胞是固有免疫系统中重要的效应细胞。NK细胞不需要抗原预先致敏即可发挥极高的细胞杀伤活性,且不受MHC限制性;成熟的NK细胞不分泌IL-6,体内存活周期短,不引起GVHD反应。骨髓移植中的研究表明,血液系统肿瘤可有效被同种异体的NK细胞识别和杀伤,NK治疗可显着增加疾病控制并降低复发率。但许多肿瘤细胞常通过表达非经典HLA I类分子、表达免疫抑制性配体、分泌免疫抑制性因子等方式获得免疫逃逸的能力,NK过继性治疗的临床表现不佳。所以在NK细胞中引入嵌合抗原受体修饰,引导NK细胞对肿瘤细胞靶向杀伤成为改进NK过继性治疗的重要策略。基于此,我们在本课题研究中采用TCGA数据揭示了肝癌特异性抗原GPC3,通过噬菌体抗体展示技术筛选获得了GPC3的高亲和力的特异性抗体;基于NK细胞的活化信号对CAR进一步优化,筛选获得了适用于NK的CAR结构;最后对CAR-NK临床研究应用中的重要技术进行了探索,建立了提高NK细胞扩增能力和细胞毒活性的脂质体feeder,并建立了基于HCC患者循环肿瘤细胞的PDX模型。第一部分:肝细胞肝癌肿瘤抗原的筛选、表达与抗体筛选首先我们对TCGA数据库中的肝癌样本进行差异分析,结果表明有多个基因在肝癌中显着上调,其中GPC3是最显着的一个。结合Human protein atlas数据库中的数据,GPC3在其他正常组织中几乎不表达,说明GPC3是一个HCC治疗的良好靶点,在靶向治疗过程中几乎不会引起其他正常组织的损伤。随后我们对GPC3的理化性质进行分析,结果表明GPC3羧基端亚基分布了更多的β转角和无规则卷曲,适合作为抗原免疫动物。我们在CHO系统中表达纯化了GPC3羧基端亚基△GPC3,并免疫动物后构建了噬菌体抗体展示文库,通过淘洗该文库我们共获得3株抗体:QX6.3F、QX1.11A、QX2.6C,其中亲和力最高的QX6.3F抗体Kd约为20nM,且具有良好的特异性。随后,我们分析了GPC3在HCC细胞系中的表达情况,经过分析公共数据库中的测序/芯片数据并结合qPCR/Western-Blot验证,我们筛选到HepG2和Hep3B典型的GPC3阳性细胞,SMMC-7721与QYG-7703为典型的GPC3阴性细胞。此外我们通过FACS分选和CRISPR/Cas9系统分别构建了对应的GPC3敲除细胞系或过表达细胞系,以及相应的Luciferase稳转细胞系。第二部分:自然杀伤细胞中CAR结构的优化目前临床中所使用的CAR-NK中嵌合抗原受体结构主要沿用了第二代和第三代CAR-T结构,并未针对NK细胞特有的活化信号进行优化。在本部分中我们开展了CAR的胞内段和跨膜区的优化工作,并将GC33、YP7和QX6.3F序列作为scFv结构域整合到嵌合抗原受体结构中,对其杀伤效果进行了验证。在胞内段优化过程中,我们选取了CD137、2B4、DNAM1、CD3ζ、DAP10、DAP12的胞内段活化结构域串联,作为CAR的胞内段结构域(CARMax)。建系后,将其杀伤效率与T-CAR进行比较。结果表明CARMax可以显着提高NK-92对HepG2、Hep3B细胞以及过表达GPC3后SMMC-7721、QYG-7703细胞的杀伤活性。然后逐一缺失上述结构域,结果表明CD137结构域对CAR的活性影响较小,可以去除。在跨膜区优化过程中,我们选取了具有活化NK作用的NKp44和NKG2D跨膜区序列对嵌合抗原受体进行优化。NKp44跨膜区富含带有正电荷的赖氨酸,可与胞浆区带有负电荷的DAP12结合,而NKG2D可与DAP10分子结合传递活化信号。将不同的CAR建系后检测其对HepG2的杀伤活性,结果表明使用NKp44跨膜区可以进一步提高CAR-NK的杀伤活性。鉴于NKp44跨膜区可以介导DAP12的信号活化,之后我们探讨了是否可以在胞内段结构域中去除DAP12结构,结果表明跨膜区替换为NKp44后,胞内段是否含有DAP12结构对CAR的杀伤活性无显着影响。最后我们根绝斯隆-凯特琳癌症中心Michel Sadelain团队的研究结论对CAR结构进一步简化。结果表明ITAM基序靠近跨膜区可以进一步提高NK细胞活化比例与IFN-γ分泌。此外CD3ζ中的3个ITAM非NK细胞活化所必须,只保留第一个ITAM即可很好的维持CAR的生理功能。至此,通过三轮筛选我们获得了NK细胞中最佳的CAR结构:scFv-NKP44TM-CD3ζ△1-2B4-DNAM1-DAP10。我们研究了该结构相比于T-CAR在信号转导中的优点,结果表明相比T-CAR,CARopti中激酶Fyn的磷酸化水平显着上调,进而介导了PLC-γ1和PLC-γ2的活化;CARopti可上调Syk磷酸化水平,介导更强的Vav和ERK1/2的活化;CARopti可促进了IKKα/β的活化,进而激活IκB,从而促进了p65的磷酸化;CARopti也可轻度促进了PI-3K p85亚基的活化,进而介导了AKT途径的活化增强。我们验证了第三方GPC3抗体GC33、YP7和自研抗体QX6.3F对HepG2的杀伤活力差异,结果表明基于QX6.3F与GC33构建的CAR-NK杀伤活性无显着差异。为了进一步提高细胞的安全性,在细胞中转入了AP1903诱导的自杀基因,该细胞系经pmol/L数量级的AP1903即可显着诱导凋亡,且在小鼠体内高剂量（5.0×107cell/小鼠）细胞注入小鼠体内是安全的。第三部分:提高NK细胞增殖及杀伤能力的新方案探索与基于循环肿瘤细胞PDX模型的建立提高并在体内维持免疫治疗中回输细胞的活力是目前过继性免疫治疗的一大难题。AR-NK进入机体后周围环境细胞因子匮乏,其活性会发生显着下降。在低浓度细胞因子状态下维持CAR-NK的活力最有效的办法是使用Feeder细胞。但目前常见的饲养细胞K562是悬浮生长的肿瘤细胞,进入人体有潜在的成瘤风险。基于此,我们根据NK的K562 Feeder细胞开发出了Feeder脂质体。我们在脂质体中掺入了神经节苷脂GM2,使用链霉亲和素偶联的GM2单链抗体连接至脂质体表面形成挂载中心。随后将生物素化偶联的IL-21、IL-15和4-1BBL与脂质体共孵育即可形成Feeder脂质体。CAR-NK临床应用中的另一大问题是如何选择合适的病人。因此我们建立了一种基于温敏型生物凝胶悬滴培养肝癌循环肿瘤细胞,进而体内种植成瘤的PDX模型,通过该培养体系,可以体外对肝癌患者的循环肿瘤细胞进行扩增,并形成多细胞克隆,挑取该克隆接种裸鼠可以在皮下、肝内即可形成肿瘤,建成异种移植瘤模型。结合上述三部分的研究,我们从肿瘤抗原筛选、抗体研发开始建立了完整的靶向GPC3的CAR-NK体系,并根据NK细胞的生物学特性构建了NK专用的CAR结构,最后通过转染自杀基因保证临床安全、构建Feeder脂质体提高NK体内活性、建立HCC-PDX模型用于适应症筛选,组成了完整的CAR-NK细胞治疗系统,为进一步研究靶向GPC3的CAR-NK细胞治疗肿瘤提供了实验基础及数据。
二、两种靶细胞在ADCC检测中的比较（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、两种靶细胞在ADCC检测中的比较（论文提纲范文）
（1）HIV-1长期不进展者接受ART治疗后免疫特征研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 研究内容与方法 |
| 1 研究对象 |
| 1.1 纳入标准 |
| 1.2 排除标准 |
| 2 研究内容 |
| 3 研究方法 |
| 3.1 样本采集 |
| 3.2 实验室检测 |
| 4 数据处理 |
| 5 伦理声明 |
| 6 质量控制 |
| 7 技术路线图 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 感染 HIV-1 长期不进展者免疫学研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文 |
| 导师评阅表 |
（2）靶向CD19抗原的新型嵌合抗原受体NK细胞的优化构建和功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 CAR-T的抗肿瘤研究和构建策略 |
| 1.2 人工CAR的结构 |
| 1.2.1 胞外抗原结合区 |
| 1.2.2 胞内细胞信号传导区与跨膜链接区 |
| 1.2.3 CAR-T的抗肿瘤机制及进展 |
| 1.3 CAR-T技术研究和临床应用的瓶颈 |
| 1.3.1 细胞因子风暴 |
| 1.3.2 脱靶效应 |
| 1.3.3 实体瘤应用瓶颈 |
| 1.3.4 转染载体的缺陷 |
| 1.3.5 移植物抗宿主反应与免疫细胞活性维持 |
| 1.3.6 免疫抑制作用 |
| 1.3.7 CAR-T细胞来源的限制 |
| 1.4 NK细胞为代表的非特异性免疫细胞研究 |
| 1.4.1 NK细胞的生物学特性研究 |
| 1.4.2 NK细胞对肿瘤的杀伤机理 |
| 1.5 NK细胞在治疗中的研究进展 |
| 1.5.1 针对血液肿瘤的NK细胞过继性免疫治疗研究 |
| 1.5.2 针对实体瘤的NK细胞相关免疫研究 |
| 1.6 人工CAR修饰的NK细胞构建与研究进展 |
| 1.6.1 CAR-NK分子靶点 |
| 1.6.2 CAR改造NK细胞的临床应用 |
| 1.7 CAR-NK相关的细胞因子介导的内源性NK细胞活化 |
| 1.8 非特异性免疫细胞的选择 |
| 1.8.1 CIK细胞的生物学特性和抗瘤特点研究 |
| 1.8.2 NK细胞来源与筛选 |
| 1.9 特异性分子靶点的研究与选择 |
| 1.10 本研究的目的和意义 |
| 2 CIK细胞人工CAR改造研究 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.1.1 实验细胞株与质粒 |
| 2.1.2 主要仪器与设备 |
| 2.1.3 主要实验试剂及耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 外周血单个核细胞的分离和培养 |
| 2.2.2 CAR-T细胞与CAR-CIK细胞的体外制备和体外扩增培养 |
| 2.2.3 CAR表达载体的构建及转化 |
| 2.2.4 病毒转导与检测 |
| 2.2.5 CAR-T细胞体外扩增 |
| 2.2.6 CAR-CIK细胞体外扩增 |
| 2.2.7 细胞计数及细胞形态增殖情况观察 |
| 2.2.8 CAR-CIK和CAR-T细胞免疫表型的检测 |
| 2.2.9 CAR-CIK和CAR-T细胞体外抗肿瘤活性的研究 |
| 2.2.10 统计学方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 CAR-T细胞和CAR-CIK细胞体外制备和扩大培养 |
| 2.3.2 设计并构建Psb1576-CD19-CAR重组载体 |
| 2.3.3 扩增CD19片段重组质粒构建和慢病毒的制备 |
| 2.3.4 CD19抗原过表达靶细胞稳定株构建 |
| 2.3.5 CD19-CAR在T细胞中的转导效率和免疫表型 |
| 2.3.6 CD19-CAR在CIK细胞中的转导效率和免疫表型 |
| 2.3.7 杀伤后细胞因子释放能力检测 |
| 2.3.8 CIK和CAR-T细胞体外靶向细胞杀伤能力分析比较 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 NK细胞系的人工CAR改造研究 |
| 3.1 实验细胞株与材料试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 目的片段的PCR扩增和胶回收 |
| 3.2.3 表达GFP、IL-15和4-1BB基因的重组载体的构建及转化 |
| 3.2.4 病毒转导 |
| 3.2.5 流式细胞技术检测CAR阳性细胞比例以及表型分析 |
| 3.2.6 乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测CAR-NK-92细胞杀伤活性 |
| 3.2.7 细胞因子释放能力检测 |
| 3.2.8 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 CAR-NK-92重组质粒的设计 |
| 3.3.2 CAR-NK-92重组质粒的载体构建 |
| 3.3.3 CAR-NK-92重组质粒的筛选验证与载体包装和滴度测定 |
| 3.3.4 CAR-NK-92细胞的构建与免疫表型检测 |
| 3.3.5 不同浓度条件培养基对NK细胞扩增倍数的影响 |
| 3.3.6 不同浓度的条件培养基对NK细胞扩增以及活化表型的影响 |
| 3.3.7 CD19-CAR-NK-92细胞体外靶向识别杀伤能力检测 |
| 3.3.8 杀伤后细胞因子释放能力检测 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 脐血来源的NK细胞人工CAR改造研究 |
| 4.1 实验用细胞材料及试剂配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 脐血单个核细胞分离方法 |
| 4.2.2 脐血NK细胞分离方法 |
| 4.2.3 脐血NK细胞体外扩增培养 |
| 4.2.4 CAR表达载体的改造 |
| 4.2.5 针对NK细胞改良的CD19-CAR载体转导 |
| 4.2.6 CAR-NK细胞体外优化培养 |
| 4.2.7 脐血CAR-NK细胞免疫表型及重要功能性分子表达检测 |
| 4.2.8 脐血CAR-NK细胞对靶细胞的细胞毒作用检测 |
| 4.2.9 细胞因子释放能力检测 |
| 4.2.10 体内动物实验 |
| 4.2.11 过氧化物酶染色法 |
| 4.2.12 细胞总RNA提取与qRT-PCR检测基因表达水平 |
| 4.2.13 免疫印迹实验 |
| 4.2.14 细胞单基因测序与生信分析 |
| 4.2.15 临床研究试验前期方案设计 |
| 4.2.16 统计学数据处理分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 CAR-NK重组质粒的构建 |
| 4.3.2 脐血来源的NK细胞筛选与扩增培养 |
| 4.3.3 重组CD19-CAR载体的转导及转导效率检测 |
| 4.3.4 CD19-CAR-NK细胞分子表达 |
| 4.3.5 NK细胞对靶细胞杀伤作用的测定 |
| 4.3.6 杀伤后细胞因子释放能力检测 |
| 4.3.7 CD19-CAR-NK细胞的动物体内药效检测 |
| 4.3.8 CD19-CAR-NK细胞的动物体内安全性检测 |
| 4.3.9 CD19-CAR-NK细胞的动物模型中药代动力学 |
| 4.3.10 CD19-CAR-NK细胞的高通量测序分析 |
| 4.3.11 CD19-CAR-NK细胞的基因功能分类分析 |
| 4.3.12 CD19-CAR-NK细胞的细胞生物学调控 |
| 4.3.13 临床试验样本病理学分析 |
| 4.3.14 CD19-CAR-NK细胞临床预实验研究 |
| 4.3.15 CD19-CAR-NK细胞临床研究前患者样本分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 讨论 |
| 5.1 非特异性免疫细胞人工CAR的构建及细胞生物学研究 |
| 5.2 体外非特异性细胞扩增活化体系的优化 |
| 5.3 非特异性免疫细胞的选择与理论依据 |
| 5.3.1 CIK细胞方案 |
| 5.3.2 NK-92细胞方案 |
| 5.3.3 脐血NK细胞方案 |
| 5.4 CAR-NK的体内药效和基因表达谱分析 |
| 5.5 超越CAR-T的新型CAR-NK的优势与发展 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
| 博士学位论文修改情况确认表 |
（3）食管癌肿瘤微环境中多核巨细胞和IgG4阳性B细胞的研究（论文提纲范文）
| 全文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 第一部分 食管癌中多核巨细胞的研究 |
| 第一章 食管癌组织中多核巨细胞的表达和极化类型研究 |
| 第二章 食管癌中多核巨细胞的表达与临床预后统计分析 |
| 第二部分 B细胞产生IgG4损伤机体的抗肿瘤免疫及对免疫治疗的启示 |
| 第一章 食管癌组织和血清中IgG4增加以及肿瘤相关免疫细胞的检测 |
| 第二章 IgG4亚类高表达病例免疫病理研究与探讨 |
| 第三章 IgG4亚类的结构和功能特点的研究 |
| 第四章 IgG4对单核巨噬细胞的极化影响的研究和探索 |
| 全文总结 |
| 综述:IgG4抑制肿瘤免疫的可能机制 |
| 参考文献 |
| 在读期间已发表的文章 |
（4）寨卡病毒重组亚单位疫苗在非人灵长类水平的评估及其保护机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 寨卡病毒及其对人类社会的危害 |
| 1.1.1 寨卡病毒的发现 |
| 1.1.2 寨卡病毒的分布 |
| 1.1.3 寨卡病毒感染的临床症状 |
| 1.1.4 寨卡病毒的传播方式 |
| 1.2 寨卡病毒及相关基础研究 |
| 1.2.1 寨卡病毒的组成及结构 |
| 1.2.2 寨卡病毒的复制周期 |
| 1.2.3 寨卡病毒在人体内的感染路线 |
| 1.2.4 寨卡病毒和其它黄病毒的相关性 |
| 1.2.5 抗体依赖的增强作用 |
| 1.3 寨卡病毒疫苗的研究进展 |
| 1.3.1 寨卡病毒疫苗的种类和研发进度 |
| 1.3.2 寨卡病毒疫苗的限制和潜在风险 |
| 1.4 寨卡病毒重组亚单位疫苗的设计策略 |
| 1.4.1 重组亚单位寨卡病毒疫苗研究的必要性和优势 |
| 1.4.2 寨卡病毒结构蛋白重点区域的功能分析 |
| 1.4.3 登革病毒疫苗研发的经验 |
| 1.4.4 寨卡病毒EDⅢ和 E80 蛋白在小鼠水平的评估结果 |
| 1.5 本研究的设计思路及实验内容 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 动物伦理声明 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 病毒培养与滴定 |
| 2.4 EDⅢ和 E80 免疫原的制备 |
| 2.4.1 蛋白表达及纯化及鉴定 |
| 2.4.2 EDⅢ和 E80 蛋白抗原性的鉴定 |
| 2.4.3 以EDⅢ和 E80 蛋白为主要免疫原的疫苗制备 |
| 2.5 EDⅢ和 E80 蛋白在恒河猴体内的免疫 |
| 2.5.1 用于疫苗评估的恒河猴筛选 |
| 2.5.2 恒河猴免疫方法流程和样本采集 |
| 2.6 EDⅢ和 E80 蛋白在恒河猴体内的免疫原性检测 |
| 2.6.1 抗原特异性抗体水平的检测 |
| 2.6.2 抗体对ZIKV的结合能力的检测 |
| 2.6.3 抗体对病毒的中和能力的检测 |
| 2.6.4 疫苗诱导的T细胞反应的检测 |
| 2.7 EDⅢ和 E80 蛋白在恒河猴体内的保护性检测 |
| 2.7.1 恒河猴内ZIKV攻毒实验及信息样本采集 |
| 2.7.2 病毒血症及组织中病毒载量的检测 |
| 2.8 EDⅢ和 E80 蛋白在恒河猴水平不同保护效果的机制研究 |
| 2.8.1 疫苗诱导的抗体在体外增强ZIKV感染能力的检测 |
| 2.8.2基于酵母展示的表位定位实验 |
| 2.8.3基于肽段的表位鉴定实验 |
| 2.9 EDⅢ和 E80 免疫原诱导抗体对登革病毒的交叉反应检测 |
| 2.9.1 EDⅢ和 E80 免疫原诱导的抗体对登革病毒的结合能力检测 |
| 2.9.2 EDⅢ和 E80 免疫原诱导的抗体对登革病毒的中和能力检测 |
| 2.9.3 EDⅢ和 E80 免疫原诱导的抗体在体外增强登革病毒感染能力的检测 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 EDⅢ和 E80 免疫原有在恒河猴体内诱导中和性抗体反应的潜能 |
| 3.1.1 EDⅢ和 E80 蛋白有正确的大小且能被标签抗体识别 |
| 3.1.2 EDⅢ和 E80 蛋白包含中和抗体表位 |
| 3.1.3 EDⅢ和 E80 蛋白能高效地吸附于铝佐剂表面 |
| 3.2 EDⅢ和 E80 免疫原在恒河猴体内具有免疫原性 |
| 3.2.1 免疫前恒河猴体内不含有寨卡及其他相关病毒的抗体 |
| 3.2.2 EDⅢ和E80在恒河猴体内诱导了抗原特异性的抗体 |
| 3.2.3 EDⅢ和 E80 诱导的抗体有结合ZIKV的能力 |
| 3.2.4 EDⅢ和E80 诱导的抗体有中和ZIKV的能力 |
| 3.2.5 EDⅢ和 E80 在恒河猴体内诱导了抗原特异性的T细胞反应 |
| 3.3 EDⅢ和 E80 免疫原在恒河猴体内具有不同的保护效价 |
| 3.3.1 寨卡病毒感染对恒河猴体温体重无明显影响 |
| 3.3.2 E80 免疫能有效抑制ZIKV在恒河猴体引起的病毒血症 |
| 3.3.3 E80 免疫能有效降低恒河猴组织中的ZIKV载量 |
| 3.4 中和抗体可持续性的差异是EDⅢ和 E80 蛋白保护性差异的主要原因 |
| 3.4.1 EDⅢ和 E80 诱导的抗体在体外ADE实验中均能增强寨卡病毒感染 |
| 3.4.2 EDⅢ和 E80 诱导的中和性抗体反应的可持续性有显着性差异 |
| 3.5 EDⅢ和 E80 免疫原诱导抗体识别的表位在病毒表面暴露的程度不同 |
| 3.5.1 酵母展示实验验证了EDⅢ和 E80 诱导的抗体对病毒蛋白的结合能力 |
| 3.5.2 EDⅢ诱导的抗原特异性抗体识别多种不在病毒表面暴露的表位 |
| 3.5.3 E80 诱导的抗体主要识别多种在病毒表面暴露的EDⅠ/Ⅱ区域的表位 |
| 3.6 EDⅢ和 E80 蛋白诱导的抗体与登革病毒相互作用的能力不同 |
| 第4章 结论与讨论 |
| 4.1 课题结论及意义总结 |
| 4.2 本课题对寨卡病毒亚单位疫苗研发的意义 |
| 4.2.1 EDⅢ免疫原在不同个体体内的免疫原性及保护效价不同 |
| 4.2.2 E80 免疫原在多种动物模型体内诱导了保护性免疫反应 |
| 4.2.3 E80 免疫原作为寨卡病毒重组亚单位疫苗的优势及前景 |
| 4.3 本课题对寨卡病毒疫苗评估指标选择的提示 |
| 4.3.1 中和抗体滴度是评估寨卡病毒疫苗的重要指标 |
| 4.3.2 中和抗体的数量检测在寨卡病毒疫苗评估中是必要的 |
| 4.3.3 中和抗体反应的可持续性应为寨卡病毒疫苗评估的主要指标之一 |
| 4.3.4 其他潜在的寨卡病毒疫苗评估指标 |
| 4.4 本课题强调不同动物模型在的疫苗评估各阶段的作用 |
| 4.4.1 小鼠模型在疫苗评估中的限制 |
| 4.4.2 非人灵长类动物模型在疫苗评估中的优势 |
| 4.5 本课题对亚单位疫苗设计的提示 |
| 4.5.1 EDⅢ蛋白携带的中和抗体表位未能在猴体内主导免疫反应 |
| 4.5.2 EDⅢ蛋白在病毒表面不充分暴露,且携带中和抗体表位种类较少 |
| 4.5.3 EDⅢ中和抗体对应胚系基因的研究 |
| 4.5.4 EDⅠ/Ⅱ区域在病毒表面充分暴露,且携带较多的中和抗体表位 |
| 4.6 未来展望 |
| 4.6.1 鉴定E80 蛋白携带的中和/非中和性抗体表位有助于疫苗优化 |
| 4.6.2 E80 蛋白有潜力被优化为寨卡病毒/登革病毒广谱疫苗 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位论文期间发表的学术论文与研究成果 |
| 专业综述 |
| 参考文献 |
（5）c-Met CAR-T及PD1/CD28融合受体CAR-T在胃癌中的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 胃癌CAR-T及c-Met CAR-T的研究现状 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 CAR-T在胃癌中的研究现状 |
| 1.2.1 胃癌CAR-T的基础研究 |
| 1.2.2 胃癌CAR-T的临床实验注册 |
| 1.3 c-Met CAR-T的研究现状 |
| 1.3.1 c-Met CAR-T的基础研究现状 |
| 1.3.2 c-Met CAR-T临床实验注册 |
| 1.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第二章 MET基因在胃癌中表达及功能的生物信息学分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 数据获取及分析方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 c-Met在胃癌组织及细胞系中表达的检测 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 胃癌组织c-Met免疫组化表达分析 |
| 3.1.2 胃癌细胞培养 |
| 3.1.3 提取细胞RNA |
| 3.1.4 PCR反应 |
| 3.1.5 提取细胞总蛋白 |
| 3.1.6 聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳 |
| 3.1.7 流式细胞计数检测胃癌细胞系c-Met、PD-L1 表达 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 c-Met在胃癌中的表达水平高于癌旁组织 |
| 3.2.2 qRT-PCR分析不同胃癌细胞系中MET、PD-L1 基因转录水平 |
| 3.2.3 WB分析不同胃癌细胞系中c-Met表达水平 |
| 3.2.4 FCM分析不同胃癌细胞系c-Met、PD-L1 的细胞膜表面表达水平 |
| 3.2.5 CCLE数据库中MET、PD-L1 表达验证 |
| 3.3 结论 |
| 第四章 MET过表达慢病毒及CAR慢病毒的制备 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 质粒构建 |
| 4.1.2 载体酶切 |
| 4.1.3 目的基因片段扩增 |
| 4.1.4 酶连重组 |
| 4.1.5 转化 |
| 4.1.6 质粒抽提 |
| 4.1.7 重组质粒基因测序 |
| 4.1.8 质粒转染与慢病毒收获 |
| 4.1.9 慢病毒感染293T |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 CAR序列结构 |
| 4.2.2 载体酶切、目的片段扩增、酶连重组验证 |
| 4.2.3 慢病毒的验证 |
| 4.3 结论 |
| 第五章 c-Met CAR-T及 cMet-PD1/CD28 CAR-T对胃癌效果的体外验证 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 MET-OE慢病毒感染HGC-27 细胞 |
| 5.1.2 CAR-T细胞制备 |
| 5.1.3 慢病毒CAR-T感染效率的检测 |
| 5.1.4 CAR-T细胞增殖检测 |
| 5.1.5 CAR-T细胞亚群及表型检测 |
| 5.1.6 靶细胞刺激对CAR-T激活的影响 |
| 5.1.7 靶细胞刺激对CAR-T中 PD-1 表达的影响 |
| 5.1.8 细胞因子分泌检测 |
| 5.1.9 LDH释放实验 |
| 5.1.10 7-AAD杀伤实验 |
| 5.1.11 CD107a脱颗粒反应 |
| 5.1.12 高内涵成像分析 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.2.1 MET-OE慢病毒感染可使HGC-27 细胞过表达c-Met |
| 5.2.2 c-Met CAR和 c Met-PD1/CD28 CAR慢病毒感染以成功构建对应的CAR-T |
| 5.2.3 CAR-T细胞中CD8~+T细胞、中央记忆T细胞的比例升高 |
| 5.2.4 靶细胞刺激后c-Met CAR-T中激活表型增多 |
| 5.2.5 靶细胞刺激后c-Met CAR-T中 PD-1 表达升高 |
| 5.2.6 PD1/CD28 融合受体能刺激CAR-T中 IFN-γ、TNF-α分泌,抑制IL-6分泌 |
| 5.2.7 PD1/CD28 融合受体能进一步增强c-Met CAR-T对靶细胞的杀伤 |
| 5.2.8 PD1/CD28 融合受体能进一步增强c-Met CAR-T的脱颗粒水平 |
| 5.2.9 高内涵成像显示CAR-T识别并杀伤肿瘤 |
| 5.3 结论 |
| 第六章 c-Met CAR-T及 cMet-PD1/CD28 CAR-T对胃癌效果的体内验证 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 主要试剂 |
| 6.1.2 主要仪器 |
| 6.1.3 实验动物 |
| 6.1.4 实验细胞 |
| 6.1.5 皮下成瘤及活体小动物成像 |
| 6.1.6 HE染色 |
| 6.2 试验结果 |
| 6.2.1 c-Met CAR-T及 c Met-PD1/CD28 CAR-T对 c-Met~+胃癌模型具有明显的抑制作用 |
| 6.2.2 c-Met CAR-T及 cMet-PD1/CD28 CAR-T对正常器官没有明显的脱靶毒性 |
| 6.3 结论 |
| 第七章 讨论、结论与展望 |
| 7.1 讨论 |
| 7.2 结论 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 嵌合抗原受体T细胞的新型设计方案 |
| 参考文献 |
| HGF/c-Met信号通路及其在胃和胃食管交界癌治疗中的应用 |
| 参考文献 |
| 附图 技术路线图 |
| 附表 |
| 附缩略词简表 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（6）溶瘤呼肠孤病毒活化NK细胞的分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 人NK细胞在实体瘤治疗中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
| 学位论文数据集 |
（7）HIV感染者NK细胞亚群分布及调节作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 :单细胞测序揭示HIV感染者总NK细胞亚群特征 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验对象 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验试剂与耗材 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 外周血中分选NK细胞 |
| 2.3.2 单细胞样本的制备及检测 |
| 2.3.3 单细胞测序结果的分析 |
| 2.3.4 GO及KEGG分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 样本的质量控制 |
| 3.2 健康人NK细胞基因水平的亚群分布特征 |
| 3.3 健康人及HIV感染者NK细胞相关性分析 |
| 3.4 HIV感染导致NK细胞功能改变 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 :HIV感染者CD56+NK细胞应用CD11b CD27定义的各个亚群功能及其调节作用的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验对象 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验试剂 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 NK细胞CD11b CD27亚群分群情况的检测 |
| 2.3.2 NK细胞CD11b CD27亚群表面受体表达情况检测 |
| 2.3.3 NK细胞CD11b CD27亚群分泌IFN-γ、CD107 脱颗粒的检测 |
| 2.3.4 NK细胞CD11b CD27亚群杀伤功能的检测 |
| 2.3.5 NK细胞CD11b CD27亚群分泌IL-10、TGF-β的检测 |
| 2.3.6 NK细胞CD11b CD27亚群Granzyme B及 Perforin存储情况的检测 |
| 2.3.7 NK细胞CD11b CD27亚群抑制CD4+T 细胞增殖的检测 |
| 2.3.8 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 HIV感染者CD11b~+CD27-亚群百分比降低,CD11b~-CD27~-亚群百分比显着升高 |
| 3.2 HIV感染者CD11b CD27定义的NK亚群活化性受体增高,但CD11b~-CD27~-NK亚群低表达活化性受体 |
| 3.3 CD11b~-CD27~-NK亚群呈现幼稚的表型特征 |
| 3.3.1 CD11b~-CD27~-NK亚群低表达成熟marker——CD11c |
| 3.3.2 CD11b~-CD27~-NK亚群低表达衰老marker——CD |
| 3.3.3 CD11b~-CD27~-NK亚群幼稚marker——CCR7表达高于CD11b~+CD27~-NK亚群 |
| 3.4 CD11b CD27定义的NK细胞亚群checkpoint点的表达水平在HIV感染者中显着升高 |
| 3.5 CD11b~-CD27-NK亚群细胞代谢特征 |
| 3.5.1 CD11b~-CD27~-NK亚群葡萄糖转运体表达较低 |
| 3.5.2 CD11b~-CD27~-NK亚群脂质受体高于CD11b~+CD27~-NK亚群 |
| 3.5.3 CD11b~-CD27~-NK亚群氨基酸受体高于CD11b~+CD27~-NK亚群 |
| 3.6 CD11b~-CD27~-NK亚群分泌IFN-γ及CD107a的脱颗粒功能不良 |
| 3.7 CD11b~-CD27~-NK亚群颗粒霉及穿孔素储存能力良好,释放能力受损 |
| 3.8 CD11b~-CD27~-NK亚群分泌负向调节因子 |
| 3.9 CD11b~-CD27~-NK亚群能够抑制CD4~+T 细胞增殖 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 :HIV感染者CD56~-NK细胞的变化及调节作用的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验试剂 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 NK细胞亚群及分泌IL-10及TGF-β检测 |
| 2.3.2 NK细胞、T细胞分选及IFN-γ的检测 |
| 2.3.3 NK细胞表面PD-L1表达情况的检测 |
| 2.3.4 CD8~+T细胞表面PD-1表达情况的检测 |
| 2.3.5 NK细胞IL-10及TGF-β封闭实验 |
| 2.3.6 NK细胞PD-L1封闭实验 |
| 2.3.7 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 HIV感染者CD56~-CD16~+NK细胞百分比显着增高 |
| 3.2 HIV感染者CD56~-CD16~+NK细胞分泌高水平IL-10及TGF-β |
| 3.3 HIV感染者CD56~-CD16~+NK亚群抑制CD8~+T细胞功能 |
| 3.4 阻断CD56~-CD16~+NK细胞分泌的IL-10及TGF-β可部分恢复CD8~+T 细胞功能 |
| 3.5 CD56~-CD16~+NK细胞通过直接接触抑制CD8~+T细胞功能 |
| 3.6 HIV感染未治疗患者CD56~-CD16~+NK细胞Tigit未升高 |
| 3.7 HIV感染者CD8~+T 细胞高表达PD-1,CD56~-CD16~+NK细胞高表达其配体PD-L1 |
| 3.8 封闭CD56~-CD16~+NK细胞高表达的PD-L1 可部分恢复CD8~+T 细胞分泌IFN-γ功能 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）中和H7N9禽流感病毒全人源单克隆抗体的快速筛选及抗病毒机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 abstract 第1章 引言 |
| 1.1 甲型流感病毒 |
| 1.1.1 甲型流感病毒的结构 |
| 1.1.2 血凝素HA |
| 1.1.3 H7N9 禽流感 |
| 1.2 全人源单克隆抗体 |
| 1.2.1 全人源单克隆抗体技术的研究进展 |
| 1.2.2 记忆B细胞PCR技术 |
| 1.3 中和流感病毒的全人源单克隆抗体 |
| 1.3.1 靶向HA杆部的中和抗体 |
| 1.3.2 靶向HA受体结合位点的中和抗体 |
| 1.3.3 靶向HA头部抗原位点A的中和抗体 |
| 1.3.4 没有中和活性的抗流感病毒人源抗体 |
| 1.4 本文选题及研究内容 第2章 材料与方法 |
| 2.1 伦理声明 |
| 2.2 耗材与试剂 |
| 2.3 病毒 |
| 2.4 重组蛋白的表达和多肽合成 |
| 2.5 稳定表达CD40 配体的细胞系构建 |
| 2.6 康复病人的血液收集 |
| 2.7 酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA) |
| 2.8 记忆B细胞法制备全人源单克隆抗体 |
| 2.8.1 分选CD19+ IgM–IgA–IgD–B 细胞 |
| 2.8.2 记忆B细胞的激活、分化和培养 |
| 2.9 微量中和实验 |
| 2.10 抗体基因的克隆 |
| 2.11 抗体基因的表达和纯化 |
| 2.12 血凝抑制(Hemagglutination inhibition,HAI或 HI)实验 |
| 2.12.1 血凝(Hemagglutination,HA)实验 |
| 2.12.2 血凝抑制实验 |
| 2.13 抗体的特异性和亲和力检测 |
| 2.13.1 抗体的特异性结合检测(间接免疫荧光实验,Indirect immunofluorescent assay,IFA;流式细胞技术,Flow Cytometry) |
| 2.13.2 抗体结合抗原的亲和力检测 |
| 2.14 稳转抗体基因细胞株的构建以及抗体生产 |
| 2.14.1 稳转抗体基因细胞株的构建 |
| 2.14.2 抗体生产 |
| 2.15 中和抗体预防和治疗H7N9 病毒感染小鼠 |
| 2.16 ADCC实验 |
| 2.17 利用质谱(mass spectroscopy,MS)技术分析抗体的表位多肽 |
| 2.18 利用氢氘交换质谱(hydrogen deuterium exchange mass spectrometry,HDX-MS)分析抗体的抗原表位 |
| 2.19 H7N9 病毒逃逸突变株的筛选 |
| 2.20 膜融合抑制实验 |
| 2.21 统计学分析 第3章 结果与分析 |
| 3.1 记忆B细胞PCR技术筛选中和人源单克隆抗体 |
| 3.1.1 构建稳定表达人CD40L的 NTH-3T3 饲养细胞 |
| 3.1.2 流式分选记忆B细胞 |
| 3.1.3 活化记忆B细胞 |
| 3.1.4 筛选中和H7N9 病毒抗体 |
| 3.1.5 PCR克隆抗体基因 |
| 3.1.6 抗体基因瞬时转染和表达 |
| 3.1.7 抗体基因的稳转株构建和生产 |
| 3.2 抗H7N9 病毒人源单克隆抗体的中和活性 |
| 3.3 抗H7N9 病毒人源单克隆抗体的血凝抑制活性 |
| 3.4 抗H7N9 病毒人源单克隆抗体的特异性结合检测 |
| 3.5 抗H7N9 病毒人源单克隆抗体的亲和力检测 |
| 3.6 人源单克隆抗体预防和治疗H7N9 病毒感染的小鼠 |
| 3.6.1 评估人源抗体预防H7N9 病毒感染小鼠的能力 |
| 3.6.2 评估人源抗体治疗H7N9 病毒感染小鼠的能力 |
| 3.7 人源单克隆抗体的抗原表位鉴定(Epitope mapping) |
| 3.7.1 3L11 抗体的抗原表位鉴定 |
| 3.7.2 5J13 抗体的全新的抗原表位 |
| 3.8 3L11 抗体的保护机制研究 |
| 3.9 5J13 抗体的中和机制研究 |
| 3.9.1 位阻效应的研究 |
| 3.9.2 膜融合抑制作用的研究 第4章 讨论 |
| 4.1 快速筛选抗禽流感病毒人源抗体及鉴定中和表位 |
| 4.2 记忆B细胞PCR技术是研究流感病毒致病及变异新机制的重要工具 |
| 4.3 人源单克隆抗体3L11 及其保守的表位 |
| 4.4 人源单克隆抗体5J13 及其全新的中和表位 第5章 总结与展望 |
| 5.1 全人源单克隆抗体3L11 的研究结果 |
| 5.2 全人源单克隆抗体5J13 的研究结果 |
| 5.3 不足及下一步研究计划 |
| 5.4 展望 参考文献 附录 致谢 作者简历 博士期间发表的论文 博士期间申请的发明专利 |
（9）BRBP1-Fc肽体的表达纯化及生物学特性初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 主要英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述Fc融合蛋白的研究进展 |
| 第二章 哺乳动物细胞表达系统BRBP1-Fc肽体的表达及结合能力鉴定 |
| 第一节 BRBP1-Fc肽体稳定表达细胞株的筛选与鉴定 |
| 1、材料与试剂 |
| 2、实验方法 |
| 3、实验结果 |
| 4、讨论 |
| 第二节 BRBP1-Fc肽体的真核表达、纯化及结合能力鉴定 |
| 1、材料与试剂 |
| 2、实验方法 |
| 3、实验结果 |
| 4、讨论 |
| 第三章 大肠杆菌表达系统BRBP1-Fc肽体的表达及结合能力鉴定 |
| 第一节 BRBP1-Fc肽体大肠杆菌表达载体的构建与鉴定 |
| 1、材料与试剂 |
| 2、实验方法 |
| 3、实验结果 |
| 4、讨论 |
| 第二节 BRBP1-Fc肽体的原核表达纯化及结合能力鉴定 |
| 1、材料与试剂 |
| 2、实验方法 |
| 3、实验结果 |
| 4、讨论 |
| 第四章 BRBP1-Fc(L3)肽体与人乳腺癌病理组织结合性能的鉴定 |
| 1、材料与试剂 |
| 2、实验方法 |
| 3、实验结果 |
| 4、讨论 |
| 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（10）靶向GPC3的CAR-NK细胞在肝细胞肝癌免疫治疗中的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 1.癌症患者的自然杀伤细胞 |
| 2.基于自然杀伤细胞特性的癌症免疫疗法 |
| 3.自然杀伤细胞过继性免疫治疗 |
| 第一部分：肝细胞肝癌肿瘤抗原的筛选、表达与抗体筛选 |
| 一、实验方法和材料 |
| 二、实验结果 |
| (一)肝细胞肝癌肿瘤特异性抗原的筛选 |
| (二)GPC3结构与理化性质分析 |
| (三)抗体亲和力与特异性分析 |
| (四)GPC3于HCC细胞系中的表达检测及相关敲除/过表达细胞系构建 |
| (五)干预GPC3表达对细胞生长的影响 |
| 第二部分：自然杀伤细胞中CAR结构的优化 |
| 一、实验方法和材料 |
| 二、实验结果 |
| (一)NK细胞CAR胞内结构域优化 |
| (二)NK细胞CAR跨膜区优化 |
| (三)CAR结构的进一步优化 |
| (四)CAR~(opti)介导的信号通路活化研究 |
| (五)GC33/YP7/QX6.3F-CAR~(opti)的杀伤活性比较 |
| (六)QX6.3F-CAR~(opti)-NK92 体内杀伤活性研究 |
| (七)QX6.3F-CAR~(opti)-NK92 稳转自杀基因建系 |
| 第三部分：提高NK细胞增殖、杀伤能力的新方案探索及基于循环肿瘤细胞PDX模型的建立 |
| 一、实验方法和材料 |
| 二、实验结果 |
| (一)NK-Feeder人工脂质体的制备 |
| (二)HCC-CTC体外悬滴培养与CTC-PDX模型建立 |
| 分析与讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述：磷脂酰肌醇蛋白聚糖3—肝癌诊断与治疗的新靶点 |
| 一、GPC3序列、结构与理化性质 |
| 二、GPC3的生物学功能 |
| 1.WNT信号通路 |
| 2.Hedgehog信号通路 |
| 3.其他信号通路 |
| 三、GPC3作为临床诊断靶点及其意义 |
| 1.GPC3在肝癌组织中的表达 |
| 2.GPC3在肝癌患者血清中的表达 |
| 3.GPC3表达对HCC患者的预后价值 |
| 4.GPC3在其他肿瘤组织中的表达 |
| 四、以 GPC3为靶点的肝癌治疗策略 |
| 1.GPC3抗体在肝癌治疗中的应用 |
| 2.基于GPC3抗体开发的抗体偶联药物和免疫毒素 |
| 3.基于嵌合抗原受体的治疗策略 |
| 4.GPC3肿瘤疫苗 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文和参加科研工作 情况说明 |
| 致谢 |
四、两种靶细胞在ADCC检测中的比较（论文参考文献）
- [1]HIV-1长期不进展者接受ART治疗后免疫特征研究[D]. 李月飞. 新疆医科大学, 2021
- [2]靶向CD19抗原的新型嵌合抗原受体NK细胞的优化构建和功能研究[D]. 曹韪凡. 东北林业大学, 2020
- [3]食管癌肿瘤微环境中多核巨细胞和IgG4阳性B细胞的研究[D]. 王慧. 汕头大学, 2020(01)
- [4]寨卡病毒重组亚单位疫苗在非人灵长类水平的评估及其保护机制研究[D]. 杨若恒. 中国科学院大学(中国科学院上海巴斯德研究所), 2020(08)
- [5]c-Met CAR-T及PD1/CD28融合受体CAR-T在胃癌中的研究[D]. 陈聪. 兰州大学, 2020(01)
- [6]溶瘤呼肠孤病毒活化NK细胞的分子机制研究[D]. 廖春香. 贵州医科大学, 2020(04)
- [7]HIV感染者NK细胞亚群分布及调节作用的研究[D]. 马美晨. 中国医科大学, 2020
- [8]中和H7N9禽流感病毒全人源单克隆抗体的快速筛选及抗病毒机制研究[D]. 李俊鑫. 中国科学院大学(中国科学院深圳先进技术研究院), 2019(02)
- [9]BRBP1-Fc肽体的表达纯化及生物学特性初步研究[D]. 石妍妍. 东南大学, 2019(05)
- [10]靶向GPC3的CAR-NK细胞在肝细胞肝癌免疫治疗中的研究[D]. 郭猛. 中国人民解放军海军军医大学, 2019(11)