一、细胞分泌的分子机制研究进展（论文文献综述）
谈钰蒙[1]（2021）在《半夏泻心汤治疗2型糖尿病寒热错杂证疗效观察及GLP-1相关机制探讨》文中研究表明我国糖尿病形势严峻,患病率正持续快速攀升。临床上我们发现,单纯用西药控制血糖存在一定局限性,而中医在治疗该病时立足于整体,标本兼顾,在缓解症状的同时还具有保护胰岛细胞功能,改善胰岛素敏感性等优势。糖尿病属于中医的“消渴病”,病机以阴虚燥热为主,但很多T2DM患者没有多饮、多食、多尿、体重下降的消渴病症状,且肥胖超重者居多,在中医证型分类上寒热错杂证占有一定比例,其中以中焦寒热错杂证居多,治疗上首选半夏泻心汤。该方体现了调和胃肠的中医治法,在临床实践中表现出了降糖作用,但其中的作用机理尚不明确。我们的前期研究也证实半夏泻心汤具有抑制胰岛细胞凋亡,降低细胞内氧化应激的作用。但目前尚缺乏关于半夏泻心汤调节胃肠激素,尤其是GLP-1方面的研究。因此,本研究依托于国家自然科学基金项目（No.81373594）,总结2型糖尿病寒热错杂证患者的诊疗特征,明确调和胃肠法干预T2DM的临床疗效,探索半夏泻心汤治疗T2DM的相关作用机制,在中医药治疗T2DM领域具有重要意义。目的1.分析应用中医临床路径模式治疗的2型糖尿病寒热错杂证患者的数据,总结中医诊疗特征。2.评价半夏泻心汤调节2型糖尿病患者血清GLP-1水平和胰岛β细胞功能的临床疗效及安全性。3.探究并预测半夏泻心汤治疗2型糖尿病的潜在药理作用机制,为进一步半夏泻心汤相关机制的实验研究提供参考依据。方法第一部分2型糖尿病寒热错杂证的中医诊疗特征探讨通过结构化住院病历系统,采集近六年纳入中医临床路径治疗的2型糖尿病寒热错杂证患者的临床数据,包括性别、民族、年龄、吸烟饮酒史、T2DM病程、变异情况、主要症状体征、诊断、中医治疗方案、相关理化指标,进行统计性描述、关联分析、聚类分析、因子分析和疗效评价。第二部分半夏泻心汤调节2型糖尿病患者血清GLP-1水平和胰岛β细胞功能的临床研究采用开放性完全随机对照试验,纳入符合条件的初诊2型糖尿病受试者82人,随机均分为2组。试验组和对照组的干预措施分别为半夏泻心汤颗粒和格列美脲,疗程12周。观察两组间受试者基线指标（性别、年龄、腰围、腰臀比）的均衡性。比较受试者的主要疗效指标,包括中医证候疗效和GLP－1水平,其中中医证候疗效根据实验前后寒热错杂证证候积分的变化来评价。比较受试者的次要疗效指标包括血糖代谢水平（HbA1c、FPG、2hPG）、胰岛β细胞功能（HOMA-β）、胰岛素抵抗水平（HOMA-IR）、胃肠激素指标（GIP、Gas、MLT、SS）、血脂、血压、BMI。此外,分别统计两组受试者呼吸,心率,血、尿、便常规,肝、肾功能,不良事件/反应等安全性指标。第三部分基于网络药理学研究半夏泻心汤干预2型糖尿病的分子作用机制通过TCMSP数据库分别查找筛选出半夏泻心汤中各味中药的主要活性成分。借助TCMSP和Pharmmapper获取上述活性成分关联的靶标,按照整方和亚组进行中药靶标的整合。同时,在TTD、Genecards、HPO数据库查找T2DM的作用靶标。分别取半夏泻心汤整方和各亚组中药靶标与T2DM靶标的交集。再运用String平台形成PPI网络,用Cytoscape建立网络图（活性成分-疾病-靶标）。最后用Bioconductor和R project对各组靶标交集进行富集分析,以完成生物功能注释,包括GO和KEGG通路两部分内容。结果第一部分2型糖尿病寒热错杂证的中医诊疗特征探讨1.流行病学资料:纳入研究的150例患者男女比例相当（1:1.14）,汉族人为主,以45岁以上中老年人为主。其中有吸烟史者共52人,有饮酒史者共43人。患者平均体重指数为26.528±4.629kg/m2,68%的患者体重指数≥24kg/m2。T2DM病程以十年以上者居多,占38.7%。16名患者由于各种变异退出路径。各项并发症中DPN的患病率最高,合并病中高脂血症的患病率最高。患者的平均糖化血红蛋白水平为8.797±1.787%,主要集中在7%-9%范围内,且大部分患者都存在血脂异常。2.T2DM寒热错杂证的证治特征如下:（1）证候特征:中医兼证证型统计显示瘀证出现频率最高。在寒热错杂证的相关症状中乏力、胃脘痞满、反酸嘈杂出现频率最高。舌象上,多见暗红舌,薄白苔,黄、白腻苔。脉象上,弦滑脉出现频率最高。（2）中医治疗特征:中医临床路径诊疗方案中使用频率最高的方剂为半夏泻心汤。中药功效的频数统计显示,补益药和清热药分别位列前两位;中药的性味统计表明,药性以寒、温、平为主;药味以苦、甘、辛为主。关联分析发现了 16条关联性较强,可信度高的中药组合规律,“半夏=>干姜”、“半夏=>干姜-黄芩”、“半夏=>干姜-黄芩-黄连”等。聚类分析将高频中药聚为5类,其中第1类半夏、黄芩、黄连、干姜的中药组合,结合关联分析可将其作为T2DM寒热错杂证治疗的主方。因子分析共得到了 9对高频中药组合,分别体现了针对T2DM寒热错杂证及相关兼证的对应治法。此外,中成药和中医外治法也是临床路径治疗方案的重要组成部分。3.疗效评价:完成路径治疗的134名患者,经自身前后对照,空腹血糖、血压、证候积分水平均有改善,且差异显着。第二部分半夏泻心汤调节2型糖尿病患者血清GLP-1水平和胰岛β细胞功能的临床研究1.在中医证候疗效上,半夏泻心汤能降低患者证候积分,中医证候总有效率达到77.78%,显着优于对照组。2.在GLP-1水平上,半夏泻心汤在改善早时相的GLP-1分泌上优于对照组。3.在血糖代谢方面,半夏泻心汤治疗能降低血糖,但在血糖疗效的有效率上格列美脲组更高。4.在胰岛功能方面,半夏泻心汤治疗后HOMA-β水平未发生显着性变化,但HOMA-IR水平出现下降趋势。5.在其他胃肠激素方面,半夏泻心汤能降低Gas和MTL水平,GIP和SS水平在治疗后呈升高趋势。6.在血脂血压和BMI方面,半夏泻心汤能纠正血脂紊乱、减低体重,且作用优于格列美脲,但不具有显着改善血压的作用。7.各项安全性指标均未见明显异常,无受试者发生严重不良事件。第三部分基于网络药理学研究半夏泻心汤干预2型糖尿病的分子作用机制1.靶标预测:分别得到BXXXT全方活性成分的靶标386个,辛开组靶标130个,苦降组257个,甘和组333个,T2DM相关靶标351个。药物与疾病靶标映射后,得到BXXXT和T2DM交集靶标58个,三个亚组药物与T2DM的交集靶标分别为:辛开组20个、苦降组46个、甘和组57个。2.网络预测:BXXXT治疗T2DM主要活性成分有槲皮素等;潜在作用靶基因有 PTGS2、AR、PTGS1、NOS2、PPARG、DPP4。PPI 网络预测的核心靶蛋白主要有IL-6、AKT1等。3.富集分析结果:靶标在GO功能上集中在核受体活动等方面。KEGG富集结果显示BXXXT全方的交集靶标主要富集于AGE-RAGE信号通路,该通路富集了 16个靶基因,BXXXT可通过Akt调节NFκB,参与细胞凋亡。而抑制AGE-RAGE通路可减少L细胞凋亡,促进GLP-1分泌,降低血糖。辛开组靶标富集程度最高通路为松弛素通路。苦降组、甘和组靶标富集程度最高通路为AGE-RAGE 通路。结论1.T2DM寒热错杂证治疗主方为半夏泻心汤,基本中药组成为半夏、黄连、黄芩、干姜,同时可配伍使用益气健脾、疏肝理气、燥湿运脾、滋阴清热、活血益气等治法的中药组合。2.半夏泻心汤治疗T2DM安全有效,不仅能改善2型糖尿病患者的血糖状态,还有利于GLP-1的分泌,改善中医证候,缓解胰岛素抵抗,调节胃肠激素（GIP、Gas、MLT、SS）的紊乱,增强胃动力,纠正脂代谢的异常、减轻体重,为中医调和胃肠法治疗T2DM提供客观依据。3.网络药理学预测得到BXXXT治疗T2DM涉及潜在作用靶标之一为DDP4,主要信号通路为AGE-RAGE,推测BXXXT可作用于PI3K/Akt/NFκB抑制L细胞凋亡,促进GLP-1分泌,从而发挥降糖作用。
韩东旭[2]（2021）在《lncRNA-m433s1作为miR-433分子海绵调控雄性大鼠腺垂体FSH分泌机制的研究》文中认为生殖激素的作用贯穿于哺乳动物生殖的各个环节,下丘脑-垂体-性腺轴构成的生殖内分泌系统精细地调控动物的繁殖过程。由下丘脑分泌的促性腺激素释放激素（Gonadotropin-releasing hormone,GnRH）能够调控下游垂体中促卵泡素（Follicle-stimulating hormone,FSH）的分泌,对于调控动物的繁殖进程至关重要。FSH在雌性和雄性哺乳动物生殖中均发挥着重要的作用。因此,明确调控腺垂体FSH分泌的分子机制对丰富生殖内分泌学基础理论,并进而实现动物繁殖的人工调控具有重要的借鉴意义。微小RNA（mircoRNA,miRNA）和长链非编码RNA（long non-codingRNA,lncRNA）是非编码RNA家族成员,二者均能够参与调控多种生物进程,包括表观遗传、细胞分化、转录调控、发育和疾病等,因而受到了广泛关注。最近的研究表明lncRNA能够作为miRNA的分子海绵,通过ceRNA机制来调控miRNA靶基因的表达变化。然而,目前有关非编码RNA调控动物生殖方面的研究尚少,尤其是其调控FSH分泌的机制方面鲜有报道。为阐明miRNA如何参与调控大鼠腺垂体FSH的分泌,我们通过Target Scan网站预测了可能与Fshβ靶向结合的miRNA。并通过双荧光素酶报告系统筛选了可能作用于Fshβ基因的miRNA,随机挑选3个miRNA（miR-21-3p、miR-433和miR-186-5p）进行功能验证。分别过表达及敲降候选miRNA后,检测靶基因mRNA和蛋白水平的变化。结果表明miR-21-3p、miR-433和miR-186-5p能够靶向作用于Fshβ3’UTR区来抑制Fshβ的表达,进而降低FSH的分泌。接下来,为了全方位地揭示lncRNA在调控哺乳动物生殖发育中所发挥的作用,我们对GnRH处理后的大鼠腺垂体进行了lncRNA测序。最终鉴定出23742个lncRNA,并明确了其在染色体上的分布情况;比较mRNA和lncRNA在外显子数、转录本长度、表达水平等方面的差异。筛选到差异表达的lncRNA共704个,其中338个下调,366个上调。并对lncRNA顺式调控的靶基因进行KEGG pathway富集和GO分类分析。荧光定量验证测序结果的准确性。使用lncRNATargets软件预测能够和Fshβ相互作用的lncRNA,构建Fshβ和lncRNA的互作网格。为了进一步探究lncRNA是否能够通过ceRNA机制调控FSH的分泌,我们基于lncRNA测序结果预测能够和上述3个miRNA相互作用的lncRNA。根据lncRNA的长度和编码能力,最终确认一个新的lncRNA（lncRNA-m433s1）进行后续实验,lncRNA-m433s1是位于细胞质中的基因间lncRNA。MS2-RIP实验证明lncRNA-m433s1与miR-433能够相互作用。过表达和敲降lncRNA-m433s1后,检测lncRNA-m433s1、miR-433和Fshβ的表达变化,FSH浓度变化和细胞凋亡情况。结果表明lncRNA-m433s1能够上调Fshβ的表达水平。挽救实验表明lncRNA-m433s1能够降低miR-433对Fshβ的抑制作用,并进一步调控FSH的分泌。综上所述,本研究构建了GnRH处理后大鼠腺垂体中lncRNA的差异表达谱,解析了miRNA通过靶向作用于Fshβ基因来调控FSH分泌的分子机理,并探明了lncRNA-m433s1作为miR-433的分子海绵调控大鼠腺垂体FSH分泌的分子机制。研究结果将为揭示FSH分泌调控的分子机理提供理论基础。
奚婷[3]（2021）在《培元补肾安胎方治疗RSA的临床研究及基于内膜衰老的药物机制研究》文中提出目的1 探究培元补肾安胎方治疗黄体功能不足（LPD）型复发性流产（RSA）的临床疗效和安全性。2 通过网络药理学和分子对接学探讨培元补肾安胎方治疗RSA的作用机制。3 探究孕酮诱导“种植窗期”子宫内膜急性衰老对胚胎着床的影响。4 以“种植窗期”子宫内膜急性衰老为切入点,探究培元补肾安胎方治疗RSA的分子机制,并对上述网络药理学预测机制进行验证。方法1 采用临床随机对照研究方法,收集脾肾两虚型LPD型RSA患者60例,随机分为两组:治疗组30例和对照组30例。治疗组予培元补肾安胎方和西药地屈孕酮片治疗,对照组予西药地屈孕酮片治疗。观察对比两组患者的一般情况、孕12周妊娠结局、治疗前后中医证候积分、血清E2、P和β-HCG、盆腔B超,及治疗前后肝肾功、血常规等安全性指标。2 采用网络药理学方法对培元补肾安胎方治疗RSA的作用机制进行分析,并运用分子对接学对结果进行初步验证,具体方法如下:通过检索TCM、TCMSP数据库得到培元补肾安胎方的化合物;通过TCMSP、Pubchem、CHEMBL得到化合物对应的靶点;利用Genecards和OMIM数据库收集RSA相关基因;利用R语言得到培元补肾安胎方治疗RSA的潜在靶点;string数据库构建PPI网络图;应用clusterProfiler包对共同靶点完成GO和KEGG富集分析;最后采用MOE软件分子对接评估培元补肾安胎方重要活性成分与关键靶点的结合活性。3 采用体内和体外实验相结合方法,体内实验:将ICR雌鼠随机分为PD0-PD9组、除衰组、对照组①、米非司酮（RU486）组、对照组②。PD0-PD9组分别于PD0-9天下午取材,除衰组、对照组①、RU486组、对照组②分别于PD5和PD9下午取材,观察对比胚胎着床数目,应用SA-β-gal染色、IHC、WB检测子宫内膜组织衰老标志物（SA-β-gal活性、P16蛋白）的表达。体外实验:不同浓度、时间点的甲羟孕酮（MPA）对2BS细胞进行干预,应用WB检测各组2BS衰老标志蛋白P53、P21、P16表达量,SA-β-gal染色检测2BS SA-β-al活性,光学显微镜观察2BS形态的改变,EdU检测2BS增殖功能,RT-PCR检测2BS SASP、PRL mRNA表达量。收集MPA诱导2BS的衰老上清液与HTR-8/SVneo共培养,应用CCK8、EdU、划痕及Transwell实验分别检测HTR-8/SVneo的增殖、迁移和侵袭功能。4采用Clark经典复发性流产模型鼠造模方法造模,将CBA/J雌鼠随机分为12组。正常组B、模型组B、西药组B、中药低剂量组B、中药中剂量组B、中药高剂量组B在PD14取材计算胚胎丢失率;正常组A、模型组A、西药组A、中药低剂量组A、中药中剂量组A、中药高剂量组A在PD5下午取材,应用HE染色观察小鼠卵巢黄体面积,Elisa检测血清P水平,SA-β-gal染色检测内膜的SA-β-gal活性,WB和RT-PCR检测子宫内膜P16、P53、P21蛋白和mRNA表达,IHC检测子宫P16蛋白定位分布及表达。结果1培元补肾安胎方对LPD型RSA临床疗效1.1保胎结局:治疗组保胎成功率93.33%高于对照组70%（p<0.05）。1.2中医证候疗效:治疗组总有效率96.67%高于对照组60.00%（p<0.01）。1.3中医证候积分:治疗后两组患者脾肾两虚型中医证候总积分均明显低于治疗前（p<0.01）。治疗组改善LPD型RSA患者脾肾两虚型证候优于对照组（p<0.05）。1.4止血时间:治疗组平均止血时间4.29±0.46天短于对照组6.48±0.54天（p<0.05）。1.5腹痛消失时间:治疗组平均腹痛消失时间5.48±0.35天短于对照组8.63±0.84天（p<0.05）。1.6血清激素水平:治疗组在孕9、11、12周血清E2值高于对照组（p<0.05）;治疗组孕6、7、9、11、12周血清P值高于对照组（p<0.05）;治疗组孕8、9、10、11、12周血清β-HCG值高于对照组（p<0.01）。1.7 B超检查:治疗组胚胎发育与孕周相符22例,小于孕周6例,胎停育2例;对照组胚胎发育与孕周相符14例,小于孕周7例,停育9例。1.8不良反应:治疗组肝功异常1例,对照组肝功异常3例、皮疹1例,两组在安全性方面无差异（p>0.05）。2网络药理学和分子对接探讨培元补肾安胎方治疗复发性流产的作用机制2.1培元补肾安胎方潜在化合物及作用靶点:潜在化合物186个,作用靶点136个。2.2 RSA疾病靶点:经过筛选去重共得到RSA靶点1658个。2.3共同靶点筛选及互作网络构建:共同靶标65个,潜在靶点分别至少与两个化合物相连接。2.4 PPI网络的构建和关键靶点的提取:PPI网络中有65个节点,其中VEGFA、IL6、EGFR、MPAK8、ESR1等是关键靶点。2.5 GO和KEGG富集:GO主要涉及转录因子活性、单加氧酶活性等。KEGG主要涉及 PI3K-Akt、MPAK、P53 等。2.6分子对接:核心化合物和潜在靶点分子对接得分均≤-5.0 kcal/mol。3孕酮诱导“种植窗期”内膜细胞衰老在胚胎着床中的作用研究3.1“种植窗期”内膜存在急性衰老的生理表现:IHC结果显示,P16蛋白在子宫内膜间质成纤维细胞、上皮细胞胞核呈阳性表达,PD0-PD5组随着怀孕天数的增加P16蛋白表达量逐渐增多,于PD5达到最大值,PD6-PD9组P16表达量逐渐减少。WB和β-gal染色也得出相同结果。3.2“种植窗期”内膜衰老有利于胚胎着床:清除衰老细胞后胚胎着床数目、SA-β-gal活性、内膜P16蛋白表达量少于对照组（p<0.01）。3.3孕酮可诱导成纤维细胞衰老:与空白组相比,各组MPA干预后2BS细胞SA-β-gal活性和衰老标志蛋白P16、P21、P53表达量增多（p<0.01）,细胞形态不规则、细胞核增大,其中MPA（8μM）作用16天,各指标变化显着（p<0.01）。EDU结果显示MPA干预后2BS增殖减慢（;p<0.01）。RT-PCR实验结果显示,MPA组CXCL-2、CXCL-1 等 SASP、PRL mRNA 表达高于空白组（p<0.01）。3.4孕酮诱导细胞衰老是胚胎着床的重要条件:RU486阻断孕酮作用后胚胎着床数目、内膜P16蛋白表达量及SA-β-gal活性小于对照组（p<0.01）。3.5孕酮诱导形成的衰老微环境有利于滋养细胞功能:Senescent CM共培养的HTR-8/SVneo细胞水平和垂直迁移、侵袭功能强于Young CM组（p<0.01）。4基于“种植窗期”内膜衰老探讨培元补肾安胎方治疗RSA的作用研究4.1胚胎丢失率:模型组胚胎丢失率高于正常组（p<0.01）,提示造模成功。中药各剂量组和西药组均低于模型组（p<0.05）。4.2血清P水平:模型组血清P水平低于正常组（p<0.05）。中药中剂量组和西药组血清P水平高于模型组（p<0.05）。4.3卵巢黄体面积:模型组黄体面积少于正常组（p<0.05）。中药中剂量组和西药组卵巢黄体面积多于模型组（p<0.05）。4.4 SA-β-gal染色:模型组内膜SA-β-gal活性少于正常组（p<0.01）。中药中、高剂量组和西药组内膜组织SA-β-gal活性多于模型组（p<0.01）。4.5内膜组织P16、P53、P21蛋白和mRNA表达:模型组P16、P53、P21蛋白和mRNA表达低于正常组（p<0.05）。中药低、中剂量组、西药组P16、P53、P21蛋白和mRNA表达高于模型组（p<0.05）。4.6免疫组化:P16蛋白在内膜成纤维细胞、上皮细胞的胞核中呈阳性表达,模型组内膜P16蛋白表达量低于正常组（p<0.01）,中药低、中剂量组、西药组内膜P16蛋白表达量高于模型组（p<0.01）。结论1培元补肾安胎方能明显改善脾肾两虚证候,减轻阴道流血、腹痛症状,提高血清E2、P、β-HCG水平,促进胚胎发育,提高LPD型RSA的保胎成功率。2通过网络药理学初步明确培元补肾安胎方治疗RSA的分子机制可能是通过调控P53信号通路,调节细胞衰老,从而治疗RSA。3“种植窗期”内膜急性衰老是胚胎着床的必要条件之一,其中足量足时间的孕酮是诱导内膜衰老的重要因素。4 P不足、“种植窗期”内膜急性衰老不足可能是LPD型RSA发病机制。培元补肾安胎方可能通过提高血清P和卵巢黄体面积,增加“种植窗期”内膜P53、P21、P16表达,促进“种植窗期”内膜衰老从而发挥保胎作用。
林杉[4]（2021）在《肿瘤代谢物乳酸诱导B细胞分化为Breg样细胞的分子机制》文中认为研究背景与目的:调节性B细胞（regulatory B cells,Bregs）是一群具有免疫调节功能的B细胞的统称,近年来的研究发现Breg细胞在自身免疫性疾病、感染、肿瘤等多种疾病参与免疫调节反应。Breg细胞通过多种机制发挥促肿瘤作用,而肿瘤微环境中Breg细胞的分化机制尚不明确。乳酸是肿瘤细胞的代谢产物之一,乳酸影响多种免疫细胞的分化及功能,在肿瘤免疫耐受、免疫逃逸等方面发挥重要作用。而乳酸对B细胞分化及功能影响的研究较少,尚不明确。本课题通过对体外乳酸处理后B细胞免疫表型和功能的变化及其机制的研究,结合小鼠体内LDHA敲低D121细胞肺腺癌模型中B细胞及CD8+T细胞等其他免疫细胞的比率及活性研究,阐释了乳酸诱导B细胞向Breg样细胞分化及促进肿瘤进展的作用及其机制。研究方法:（1）磁珠分选小鼠脾脏B细胞,使用BAFF,BAFF联合乳酸分别培养B细胞2天,流式检测乳酸对B细胞中Bregs相关表型分子表达的影响。磁珠分选小鼠脾脏CD4+和CD8+T细胞,将上述两组B细胞分别与CFSE标记的CD3、CD28刺激的CD4+和CD8+T细胞共培养2-3天,流式评估乳酸处理的B细胞对T细胞增殖的影响。（2）使用BAFF,BAFF联合乳酸分别培养小鼠脾脏B细胞2天,荧光定量PCR检测两组B细胞内IL-10等免疫抑制分子以及PPARα、NADPH氧化酶相关亚基m RNA的表达差异。流式检测两组B细胞内IL-10、TGFβ、PD-L1以及ROS等分子的表达差异。蛋白免疫印迹检测两组B细胞内p40phox和p47phox蛋白表达差异。（3）磁珠分选小鼠脾脏B细胞体外培养2天,分为BAFF,BAFF+乳酸,BAFF+GPR81激动剂,BAFF+乳酸+GPR81抑制剂,BAFF+乳酸+PPARα抑制剂处理组,比较不同处理方法对B细胞免疫抑制功能的影响。此外,在体外乳酸诱导的B细胞与T细胞共培养体系中,分别加入anti-IL-10抗体,anti-TGFβ抗体,anti-PD-L1抗体,iNOS拮抗剂,arg-1拮抗剂或过氧化氢酶,流式评估上述分子对乳酸诱导Breg样细胞免疫调节功能的影响。明确乳酸诱导Breg样细胞免疫抑制功能的分子机制。（4）应用慢病毒CRISPR/cas9技术敲低小鼠肺腺癌细胞系D121细胞内LDHA基因,分别给予B6小鼠接种NC组D121细胞和LDHA KD D121细胞得到肺腺癌小鼠模型。记录两组荷瘤鼠肿瘤大小,绘制肿瘤增长曲线,以此评估LDHA敲低对小鼠肿瘤增长的影响。第20天处死小鼠,流式检测两组荷瘤小鼠脾脏、肿瘤内CD8+INFγ+T细胞、CD8+GrB+T细胞、CD25+CD81+B细胞、IL-10+B细胞、Treg细胞和MDSCs的比例,以及B细胞内ROS表达水平,磁珠分选两组肿瘤内B细胞,荧光定量PCR比较两组B细胞中NADPH氧化酶相关亚基m RNA的表达水平,明确乳酸对Breg样细胞分化的影响及其促进肿瘤增长的机制。（5）流式细胞分析法测定肺癌患者及健康对照组外周血中CD24hiCD38hiB细胞和IL-10+B细胞的比例,磁珠分选健康人外周血中T和B细胞,乳酸培养B细胞2天,B细胞与CFSE标记的CD3、CD28刺激的T细胞共培养3-5天,流式评估乳酸对B细胞IL-10、ROS及CD24、CD38表达的影响,流式评估乳酸诱导的Breg样细胞对T细胞增殖的影响。通过免疫荧光染色明确肺腺癌组织及癌旁组织内LDHA与ROS+CD19+B细胞的共定位关系,明确乳酸对表达ROS的Breg样细胞分化的影响。研究结果:（1）乳酸上调小鼠B细胞CD25和CD81的表达,使B细胞具有Breg样表型。（2）乳酸诱导的Breg样细胞显着抑制T细胞增殖。乳酸诱导Breg样细胞免疫抑制功能与IL-10、TGFβ、PD-L1、arg-1、i NOS、IDO等效应分子无关。（3）乳酸通过NADPH氧化酶上调小鼠B细胞ROS的表达,乳酸诱导的Breg样细胞通过ROS发挥抑制T细胞增殖的免疫调节功能。（4）乳酸促进小鼠B细胞中GPR81 m RNA的表达,GPR81激动剂3,5-DHBA处理的B细胞高表达ROS,并抑制T细胞增殖,而GPR81阻断剂3-OBA可逆转乳酸诱导的Breg样细胞的免疫抑制功能,乳酸通过结合并激活GPR81受体诱导小鼠B细胞发挥免疫抑制功能。（5）乳酸通过结合小鼠B细胞表面GPR81受体,促进小鼠B细胞中PPARα的表达,诱导B细胞内ROS表达水平增高,PPARα阻断剂逆转乳酸诱导B细胞ROS的表达和免疫抑制功能的发挥,乳酸通过GPR81-PPARα-ROS通路诱导Breg样细胞分化并发挥免疫抑制功能。（6）LDHA敲低使荷瘤小鼠肿瘤体积减少,肿瘤组织内Ki-67表达降低,脾脏及肿瘤内CD25+CD81+B细胞和MDSCs比例降低,肿瘤组织内B细胞中NADPH氧化酶相关亚基m RNA及ROS表达水平降低,同时,肿瘤引流淋巴结、脾脏及肿瘤内CD8+INF-γ+T细胞及CD8+Gr B+T细胞比例增多,而肿瘤内Treg细胞比例降低。（7）肺腺癌患者外周血乳酸含量、CD24hiCD38hiBreg细胞和IL-10+Breg细胞比例高于健康对照组,乳酸上调B细胞CD24、CD38及IL-10的表达,并促进B细胞内NADPH氧化酶相关亚基m RNA及ROS表达水平,乳酸培养的B细胞通过ROS抑制T细胞增殖。人肺腺癌肿瘤组织内LDHA表达水平高于癌旁组织,并与表达ROS的CD19+B细胞共定位。结论:乳酸通过GPR81/PPARα/NADPH氧化酶信号诱导B细胞分化为Breg样细胞,Breg样细胞通过ROS抑制T细胞增殖,促进肿瘤进展,敲低肿瘤细胞内LDHA减少Breg样细胞的产生及其ROS的表达,提示靶向降低肿瘤微环境内乳酸含量,可以减少Breg样细胞的分化,进而起到抗肿瘤的治疗作用。这为肿瘤内Breg细胞的致病作用提供新的理论依据,为临床治疗肿瘤提供新的思路。
贾文玉[5]（2021）在《基于巨噬细胞亚型分析探讨猪苓多糖对膀胱癌肿瘤微环境的作用》文中认为目的:在临床样本中探讨膀胱癌肿瘤微环境中M2亚型巨噬细胞与肿瘤分期及恶性程度的关系,通过动物实验及细胞实验探究均一猪苓多糖（HPP）调节肿瘤微环境中肿瘤相关巨噬细胞从而发挥抗膀胱癌作用,在巨噬细胞亚型分析的基础上进一步明确猪苓均一多糖活化巨噬细胞抗肿瘤的免疫分子机制。方法:第一节:膀胱癌组织中M2亚型巨噬细胞浸润与膀胱癌恶性程度的关系研究收集29例确诊为尿路上皮癌患者的基本临床资料（年龄、性别、临床诊断、病理分级）和膀胱病理组织切片,进行免疫组化染色,检测膀胱组织中M2亚型巨噬细胞膜表面分子CD163、CD206及细胞增殖指标Ki-67的表达,分析M2亚型巨噬细胞的浸润程度与膀胱癌的分级、肿瘤细胞恶性程度的关系。第二节:均一猪苓多糖对BBN模型膀胱癌大鼠肿瘤微环境中巨噬细胞的影响收集课题组前期采用BBN膀胱癌模型大鼠进行HPP药效研究的膀胱癌组织石蜡块,取空白组、模型组、HPP处理组及卡介苗处理组,将石蜡组织切片后进行免疫组化染色,检测膀胱癌大鼠肿瘤微环境中巨噬细胞膜表面分子CD163、CD206、CD16、CD86及细胞增殖指标Ki-67的表达情况,探讨HPP干预的膀胱癌大鼠肿瘤微环境中巨噬细胞亚型的变化情况。第三节:均一猪苓多糖活化的巨噬细胞对膀胱癌细胞的直接作用研究将人急性单核细胞白血病细胞THP-1用不同浓度（0,10,20,50,100,200 ng/mL）的佛波酯诱导为巨噬细胞,通过细胞形态、细胞黏附能力的变化及细胞膜表面分子CD14、CD68的表达情况判断出最佳的诱导浓度作为后续实验中的巨噬细胞模型。提取的均一猪苓多糖（HPP）对THP-1来源的巨噬细胞进行干预,采用RT-PCR法研究HPP对巨噬细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α以及INOS mRNA表达情况的影响,流式细胞术检测巨噬细胞膜表面分子CD86、CD16、CD40和CD23的表达,ELISA法检测细胞因子IL-1β、TNF-α的表达。HPP干预THP-1来源的巨噬细胞72 H后,更换新鲜培养基,继续培养24H,收集活化的巨噬细胞上清,按照巨噬细胞上清:新鲜培养基1:1的比例处理人膀胱癌细胞系T24及EJ,采用MTT法检测肿瘤细胞24 H和48 H的细胞活力变化,EDU增殖实验检测膀胱癌细胞48 H的增殖情况变化,克隆形成实验检测癌细胞增殖能力和成球能力,流式细胞术检测48 H的细胞周期和细胞凋亡的变化情况。Transwell实验检测细胞迁移能力的改变,Western Blot检测凋亡蛋白、上皮间质转化（EMT）相关蛋白以及通路分子JAK2-STAT5/NF-κB蛋白的表达。JAK2抑制剂AZD1480给予膀胱癌细胞系T24及EJ处理后,检测P-JAK2的表达情况及膀胱癌细胞细胞活力、细胞凋亡的变化情况。第四节:基于亚型分析对HPP活化的巨噬细胞及肿瘤相关巨噬细胞的探讨用THP-1来源的巨噬细胞作为研究对象,给予均一猪苓多糖10 μ g/mL、T24肿瘤细胞上清:新鲜培养基1:1进行处理,培养72 H后收集细胞检测细胞膜表面分子CD209、CD301、CD172 α、CD36、CD163、CD16、CD23 及 CD206 的表达情况。细胞因子的检测是在刺激剂活化巨噬细胞72 H后更换新鲜培养基继续培养24 H,收集细胞上清,采用液相悬浮芯片技术检测 TNF-α、IL-6、IL-10、CCL2、IL-1 β、CCL18、CCL24、CCL22、CXCL9、CCL17、IL-23p40的含量,采用ELISA法检测TGF-β的表达情况。整理数据,根据上述细胞因子及细胞膜分子的表达情况,分析HPP活化巨噬细胞的抗肿瘤作用及肿瘤相关巨噬细胞促进肿瘤进展的机制。结果:第一节:患者的基础资料（年龄、性别）与膀胱癌的浸润程度以及病理分级之间无明显相关性（P>0.05）;M2亚型巨噬细胞表面分子CD163、CD206及细胞增殖指标Ki-67在浸润性膀胱癌中的表达均高于非浸润性膀胱癌（P<0.05）,在高级别膀胱癌中的表达均高于低级别膀胱癌（P<0.05）。CD163、CD206在膀胱癌组织中的浸润程度均与Ki-67的表达呈正相关（rs>0）,与CD206相比较,CD163和Ki-67表现出了更强的相关性（P<0.001）。第二节:与空白组大鼠相比较,BBN膀胱癌模型大鼠肿瘤组织内CD163和CD206的表达明显升高（P<0.05）,CD16和CD86显示出升高的趋势,但无统计学意义。与模型组相比较,BCG组和HPP组的CD163和CD206的表达量均呈现下降趋势,但只在CD163表现出显着性（P<0.05）,CD86和CD16的表达量均表现出来升高的趋势,但未表现出来明显的统计学意义（P>0.05）。模型组BBN膀胱癌大鼠的肿瘤组织中Ki-67的表达量明显高于正常大鼠（P<0.05）,与模型组相比较,BCG和HPP干预后肿瘤组织中Ki-67明显减少（P<0.05）。第三节:HPP在0-100 μg/mL浓度范围内对人单核细胞系THP-1未表现出细胞毒性（P>0.05）;50 ng/mL PMA是THP-1诱导为巨噬细胞的最佳浓度;HPP能诱导THP-1来源的巨噬细胞IL-1 β、IL-6、INOS、TNF-α mRNA的表达升高（P<0.05）、上调细胞表面分子CD86、CD23、CD40、CD16（P<0.05）。HPP活化的巨噬细胞能够抑制人膀胱癌细胞系T24及EJ的细胞活力,并伴有时间依赖性（P<0.05）;抑制人膀胱癌细胞系T24及EJ的克隆形成能力,阻断细胞周期进程,使得细胞周期停滞在G0/G1期,减少肿瘤细胞向S期过度,从而抑制肿瘤增殖（P<0.05）;促进人膀胱癌细胞系T24及EJ细胞凋亡,主要表现为促进晚期凋亡,细胞凋亡时伴有细胞体积的皱缩,并伴有凋亡抑制蛋白Bcl-2水平下降（P<0.05）;抑制人膀胱癌细胞系T24及EJ细胞迁移能力,抑制肿瘤细胞的上皮间质转化相关蛋白N-cadherin、Vimentin,上调E-cadherin的表达。HPP活化的巨噬细胞能够下调人膀胱癌细胞系EJ、T24细胞中通路分子 JAK2-STAT5/NF-κB 的表达（P<0.05）;JAK2 抑制剂 AZD1480 能够抑制 JAK2磷酸化蛋白P-JAK2的表达（P<0.05）、抑制人膀胱癌细胞系T24及EJ的细胞活力,促进细胞凋亡（P<0.05）。第四节:HPP上调细胞因子TNF-α、IL-1 β、IL-23 P40、IL-10及细胞膜受体CD16、CD86、CD23、CD40、CD36 的表达,下调了 CCL2、CCL24 及 CD209、CD301、SIRPα 的表达,对于 TGF-β、IL-6、CCL22、CCL17、CCL18、CXCL9、CD163、CD206 无明显影响;肿瘤细胞上清能够上调巨噬细胞中细胞因子TGF-β、IL-6、IL-10、CCL2、IL-1 β、CCL18、CCL22、CCL24 及细胞膜表面受体 SIRP α、CD36、CD16、CD86、CD209、CD163、CD23 的表达,下调 TNF-α 表达,对于 IL-23、CXCL9、CCL17、CD40、CD206、CD301的表达无明显影响。结论:1、膀胱癌患者肿瘤微环境中M2亚型巨噬细胞的浸润程度与肿瘤的肌层浸润程度、病理分级及恶性程度有关。2、HPP能够下调膀胱癌大鼠肿瘤微环境中M2亚型巨噬细胞的表达,上调M1亚型巨噬细胞的表达,促进肿瘤微环境中M2亚型巨噬细胞向M1亚型极化,并抑制肿瘤细胞的增殖。3、均一猪苓多糖活化的巨噬细胞能够抑制人膀胱癌细胞系T24、EJ的细胞活力及增殖能力,阻断细胞周期,促进细胞凋亡,抑制细胞迁移能力及上皮间质转化,HPP活化的巨噬细胞发挥抗肿瘤作用是通过JAK2-STAT5/NF-κB通路实现的。4、均一猪苓多糖活化的巨噬细胞通过分泌炎症因子杀伤肿瘤细胞,并通过减轻肿瘤微环境中的免疫抑制来发挥抗膀胱癌作用;肿瘤细胞通过诱导TAMs分泌炎症抑制因子及免疫抑制分子诱导免疫系统的失活,从而促进肿瘤的进展。
陈晨[6]（2021）在《溃疡性结肠炎“以痈论治”策略的临床疗效及机制研究》文中认为目 的:首先,通过理论研究,总结姜树民教授“以痈论治”UC的学术思想及经验。然后,通过临床试验,观察消痈止痢汤治疗活动期大肠湿热型UC患者的有效性及安全性。最后,通过动物实验,分析消痈止痢汤疗效的可能作用机制。为“以痈论治”UC提供新的治疗思路和科学依据。资料与方法:首先,通过理论研究,梳理姜树民教授“以痈论治”UC学术思想的师脉传承,总结姜师对UC祖国传统医学病因、病机的认识,挖掘其对本病的治疗特色及经验,并对消痈止痢汤的配伍特点、组方原则、方药功效进行分析。其次,通过临床研究,对符合纳入标准的48例UC患者,随机分为对照组和治疗组,对照组予美沙拉嗪缓释颗粒治疗,治疗组在此基础上联合消痈止痢汤颗粒剂治疗,疗程为2个月,疗程结束后对两组患者的临床疗效、中医证候疗效、中医主要证候总积分、改良Mayo评分、Baron内镜评分、IBDQ评分及血常规、肝肾功等安全性指标进行评价。最后,通过动物实验研究,先将51只SD大鼠随机分为空白组和造模组,对造模大鼠通过自由饮用4%DSS溶液,7天建立UC大鼠模型。造模成功后,再将造模大鼠随机分为模型组、消痈止痢汤低、中、高剂量组和柳氮磺吡啶组,并将全部大鼠连续7天灌胃治疗,空白组与模型组灌等量的生理盐水,中药组及西药组分别灌不同浓度的消痈止痢汤水煎液和柳氮磺吡啶混悬液。实验期间,每天观察大鼠的一般状态、体质量、便潜血等情况。疗程后,对大鼠麻醉、取材,腹主动脉取血,分离结肠组织。最后,观察各组大鼠的一般状态、体质量、结肠长度、DAI评分的变化情况;观察病理下组织形态,并对组织学评分;ELISA法对血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和MPO含量进行检测;免疫组化法对结肠组织中磷酸化的ERK、JNK、p38MAPK、NF-κ Bp65蛋白进行检测,并测定平均光密度值;Western blot法对结肠组织中ERK、JNK、p38MAPK、NF-κ Bp65蛋白及磷酸化蛋白检测,并测定灰度值。结果:一 理论研究姜树民教授认为UC“脾虚为发病之本”,“湿热、毒、瘀”为关键病理因素,“毒热致痈”为发病特点,认为UC的病机为:湿热壅滞,凝滞气血,热极成毒,浊毒相互胶结,下结肠腑,脂络受损,血肉腐败,酿化成痈。临证善用托法,采用“消痈去腐”的治疗原则,创立“消痈止痢汤”。二 临床研究1.临床疗效比较:治疗组总有效率90.9%,对照组78.3%,治疗组高于对照组,但无统计学差异（P>0.05）。2.中医证候疗效比较:治疗组总有效率高于对照组（P<0.05）。3.中医主要证候总积分比较:两组中医证候积分较治疗前比较,均下降（P<0.05）;且治疗组积分低于对照组（P<0.05）。4.改良Mayo评分比较:两组较治疗前比较,Mayo评分均下降（P<0.05）;且治疗组评分低于对照组（P<0.05）。5.Baron内镜评分比较:两组较治疗前比较,Baron内镜评分均下降（P<0.05）;且治疗组评分低于对照组（P<0.05）。6.IBDQ评分比较:经过治疗,两组较治疗前比较,IBDQ评分均升高（P<0.05）;且治疗组评分高于对照组（P<0.05）。7.安全性指标检测:两组患者在疗程后,血常规、肝肾功检测均正常,全部病例未出现不良反应。三 实验研究1.UC模型成功的复制①大鼠在造模期间,从第3天便隐血试验开始呈现阳性（+）;从第4-5天逐渐出现体质量下降、大便变稀,便隐血试验呈强阳性（+++）;从第6-7天开始,大便中混有鲜血。②结肠组织肉眼和病理学观察结果:肉眼可见结肠黏膜表面充血、糜烂,距肛门口4-6cm处最为明显;病理下可见黏膜上皮破坏明显、隐窝结构消失、杯状细胞大量减少、黏膜层及下层大量炎性细胞浸润。2.消痈止痢汤对UC大鼠一般状态变化的影响疗程后,空白组大鼠状态活跃、皮毛光泽、进食正常、大便正常。与空白组相比,模型组大鼠皮毛缺乏光泽,食量下降,活动量减少,精神萎靡,大便中混有鲜血。与模型组比较,各剂量中药组及西药组对大鼠的一般状态均有不同程度的改善。3.消痈止痢汤对UC大鼠体质量变化的影响实验期间内,空白组大鼠体质量逐渐增加,并在实验第14天达到最大值;而模型组大鼠从第3天开始,体质量逐渐下降,在实验第14天下降到最低值,与空白组比较有统计学差异（P<0.01）;各剂量中药组及西药组,在第1周时间内,体质量下降程度同模型组相同（P>0.05）;实验结束后,各中药剂量组及西药组大鼠的体质量同模型组比较均增加（均P<0.01）。4.消痈止痢汤对UC大鼠DAI评分变化的影响与空白组比较,模型组DAI评分显着增高（P<0.01）;与模型组比较,各剂量中药组和西药组评分均降低（P<0.05,P<0.01）。5.消痈止痢汤对UC大鼠结肠长度变化的影响与空白组比较,模型组结肠显着缩短（P<0.01）,与模型组比较,各剂量中药组及西药组显着变长（P<0.01）。6.消痈止痢汤对UC大鼠组织病理学变化的影响①显微镜下:空白组,大鼠结肠黏膜表面组织完整,隐窝结构正常,排列规整,可见大量杯状细胞,无炎性细胞浸润;模型组,黏膜上皮损伤严重,隐窝结构消失,杯状细胞大量减少,组织中大量炎性细胞浸润;与模型组比较,高剂量组和西药组黏膜上皮完整,隐窝结构排列规则,杯状细胞明显增多,少量炎性细胞浸润;中剂量组黏膜上皮较完整,隐窝结构排列欠规则,可见隐窝萎缩、分支,炎症细胞浸润减轻;低剂量组,黏膜上皮完整性略有改善,炎性细胞浸润略有减轻,隐窝结构仍破损明显。②病理组织学评分:与空白组比较,模型组评分明显增加（P<0.01）;与模型组比较,各剂量中药组和西药组均明显降低（P<0.05,P<0.01）。7.消痈止痢汤对大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和MPO含量的影响与空白组比较,模型组血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和MPO含量明显升高（P<0.01）;与模型组比较,各剂量中药组及西药组血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和MPO含量明显降低（P<0.05,P<0.01）。8.免疫组化法对组织中磷酸化的ERK、JNK、p38MAPK、NF-κ Bp65蛋白含量进行检测①光镜下结果:p-ERK、p-JNK、p-p38MAPK、p-NF-κ Bp65蛋白主要表达于细胞浆,在结肠黏膜层和黏膜下层均有不用程度的表达,均呈棕色或棕黄色。②p-ERK含量:与空白组比较,模型组显着升高（P<0.01）;与模型组比较,各剂量中药组及西药组显着降低（P<0.05,P<0.01）。③p-JNK含量:与空白组比较,模型组显着升高（P<0.01）;与模型组比较,中剂量、高剂量组、西药组显着降低（P<0.01）,低剂量组无差异（P>0.05）。④p-p38含量:与空白组比较,模型组显着升高（P<0.01）;与模型组比较,中剂量、高剂量组、西药组显着降低（P<0.01）,低剂量组无差异（P>0.05）。⑤p-NF-κ Bp65含量:与空白组比较,模型组显着升高（P<0.01）;与模型组相比,各剂量中药组及西药组显着降低（均P<0.01）。9.Western blot对大鼠结肠组织中ERK、JNK、p38MAPK、NF-κ Bp65及磷酸化蛋白检测与空白组比较,模型组大鼠结肠组织中ERK、JNK、p38MAPK、NF-κ Bp65及其磷酸化的蛋白水平显着升高（P<0.01）。与模型组比较,除了低剂量组在p-JNK蛋白含量上与模型组无明显差异外（P>0.05）,各不同剂量中药组及西药组大鼠结肠组织中ERK、JNK、p38MAPK、NF-κ Bp65及其磷酸化蛋白水平显着降低（P<0.05,P<0.01）。结 论:1.姜树民教授“以痈论治”UC理论渊源明确、学术特色鲜明,创立“消痈止痢汤”,为临床治疗本病提供新的治疗思路。2.消痈止痢汤联合西药,与单纯西药对比,可明显提高活动期大肠湿热型轻中度UC患者的中医证候疗效、降低中医主要证候总积分、改善主要临床症状、降低内镜下黏膜评分、促进肠道黏膜溃疡的愈合以及提高患者的生存质量。3.在临床试验中,患者各安全性指标未出现变化、未出现不良反应,消痈止痢汤安全有效,无毒副作用,可在临床上推广。4.消痈止痢汤对DSS诱导的UC模型大鼠的一般状态有明显改善作用,并可抑制结肠黏膜组织病理学损伤。5.UC模型大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α炎性细胞因子和MPO的含量明显增高,且其含量水平与疾病严重程度呈正相关。6.消痈止痢汤能通过抑制UC模型大鼠血清中L-1 β、IL-6、TNF-α炎性细胞因子和MPO的含量,来改善肠道炎症反应、降低黏膜组织损伤。7.消痈止痢汤治疗UC模型大鼠的作用机制,可能是通过抑制MAPK信号通路的活化,下调NF-κB转录因子的表达,阻止NF-κB的核移位,降低促炎性细胞因子的转录和释放,从而发挥抗炎疗效。
韩宜芯[7]（2021）在《氨来呫诺通过靶向抑制脂多糖活化巨噬细胞中的磷酸二酯酶4B发挥抗炎作用》文中研究说明研究背景:1996年,氨来呫诺经美国FDA批准成为第一个治疗口腔溃疡的处方药。世界上迄今已有20多个国家和地区将它用作治疗口腔溃疡的一线药物。然而,作为一个能改善经典炎症（以“红、肿、热、痛”为特征的炎症,亦称为“热炎症”）的老药,其精确的分子机制及作用靶点尚不明确。反而近年来关于氨来呫诺在代谢性炎症（相对于热炎症称其为“冷炎症”）方面的作用备受关注。现有研究证明,氨来呫诺对于二型糖尿病、非酒精性脂肪肝的肥胖患者有确切的治疗效果,此作用是通过抑制冷炎症靶点IKKε/TBK1 同源激酶来实现的。但在脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）介导的热炎症中,IKKε的敲除不仅未造成促炎因子表达减少反致其增加。同时也正是在这一炎症模型中,IKKε/TBK1抑制剂氨来呫诺却展现出明确的抗炎效果,这表明IKKε/TBK1一定不是氨来呫诺对抗热炎症的作用靶点。目的:本研究旨在考察氨来呫诺在热炎症中的作用及其分子机制。方法:静脉注射LPS引起小鼠内毒素血症作为热炎症体内模型、LPS处理RAW264.7巨噬细胞作为体外模型,分别以Griess法和ELISA法测定氨来呫诺对热炎症相关因子的效果。以全波长酶标仪扫描氨来呫诺的激发-发射3D扫描图谱以获得其最佳激发和发射波长,并使用激光共聚焦荧光显微镜确定其在巨噬细胞中的分布特征。在巨噬细胞中,通过RT-qPCR、报告基因、Western Blotting等方法研究氨来呫诺对LPS活化的NF-κB和MAPK/AP-1通路中关键信号事件的作用。最后,利用分子对接、荧光偏振、无细胞体系酶活实验、基因静默等技术确定氨来呫诺在热炎症中的作用靶点。结果:LPS致内毒素血症小鼠血清中的IL-6及TNF-α浓度显着上升,氨来呫诺能显着降低这两种炎症因子的水平,并压制该模型小鼠腹腔灌流液中TNF-α增高。在LPS活化巨噬细胞体外模型中,氨来呫诺不仅能抑制TNF-α的分泌,还能减少NO的释放以及其合成酶iNOS的活性和表达,并且促进抗炎因子IL-10分泌。机制研究表明,氨来呫诺能减少IκBα磷酸化并阻止其降解,抑制了随后的NF-κB p65亚单位易位入核及转录因子NF-κB的活性;另一方面,可阻止ERK1/2磷酸化及下游的AP-1活化;同时,氨来呫诺可持续增高LPS刺激的巨噬细胞内cAMP的水平、活化其效应蛋白PKA,并影响cAMP/PKA信号调控的胞内氯离子水平和尼日利亚菌素介导的IL-1β释放。而cAMP对抗剂可抵消氨来呫诺对炎症介质NO、TNF-α的抑制作用。我们还发现氨来呫诺自身具有荧光,其最佳激发/发射波长为352nm/398nm。利用其荧光特性,我们检测到氨来呫诺孵育巨噬细胞十分钟即可完成入胞、主要分布区域为细胞质。分子对接预测,在细胞质中它可能通过π-π堆积和离子键结合到PDE4B水解cAMP的活性口袋中。荧光偏振实验显示,PDE4B可使氨来呫诺的荧光偏振值单向、持续变大,意味着氨来呫诺的确可直接与人PDE4B酶结合;而加入另一种非选择性PDE抑制剂IBMX可部分对抗该结合。在无细胞体系酶活抑制实验中,氨来呫诺不仅可直接抑制PDE4B活性（IC50=11 μM）,也对PDE1A、PDE3A、PDE3B 有效,IC50 分别为 18μM、3 μM、18μM,因此氨来呫诺对PDE的抑制作用是非选择性的。但在RAW264.7细胞中,PDE3选择性抑制剂并不影响LPS诱导的炎症因子分泌,而敲低PDE4B后氨来呫诺的抗炎作用全部消失。结论:本研究首次证实氨来呫诺是一种非选择性PDE抑制剂。在LPS活化的巨噬细胞中,氨来呫诺能靶向抑制PDE4B减少其底物cAMP水解,进而激活cAMP的效应激酶PKA。活化的PKA不仅能够通过阻止IκBα的降解及随后的p65转位入核来减少转录因子NF-κB活化,还通过减少ERK1/2的磷酸化来抑制AP-1的转录活性。而对NF-κB及ERK/AP-1两条信号通路的抑制最终会表现为促炎因子iNOS和TNF-α表达水平的降低,从而缓解热炎症。
刘佳[8]（2021）在《女贞子免疫增强活性成分分离鉴定及作用机制研究》文中研究说明女贞子Ligustri Lucidi Fructus系木犀科植物女贞Ligustrum lucidum Ail.的干燥成熟果实,性味甘、苦,凉;归肝、肾经;功能补肝肾,强筋骨,明目;主治阴虚内热,腰肢无力,肾虚滑精,视力减退等。研究表明,女贞子主要含有齐墩果酸、熊果酸、特女贞苷、女贞子苷等化学成分,具有免疫调节、保肝、抗炎、抗菌和抗病毒等作用。已有文献证明女贞子可以提高家畜的生产性能和免疫功能,然而目前的研究未能阐释女贞子发挥免疫增强活性的化学成分,对其作用机制的研究更是少见。本研究进行了女贞子免疫增强活性部位筛选、活性成分分离鉴定、活性成分增强巨噬细胞和淋巴细胞免疫活性的作用及机制研究,取得以下主要结果:（1）女贞子免疫增强活性部位的筛选通过乙醇提取法和液-液萃取法制备女贞子五个极性部位,通过巨噬细胞吞噬试验和淋巴细胞增殖试验检测五部位萃取物的免疫活性。结果表明,女贞子石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水部位萃取物得率分别为1.64%、1.28%、1.13%、11.15%和26.96%;女贞子石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水部位萃取物均可不同程度地提高RAW264.7巨噬细胞吞噬中性红的能力,且正丁醇和乙酸乙酯部位萃取物的增强效果较好;女贞子乙酸乙酯、正丁醇和水部位萃取物均可不同程度地促进淋巴细胞增殖,其中正丁醇和乙酸乙酯萃取物的促增殖效果较好。说明正丁醇和乙酸乙酯部位为女贞子的主要免疫增强活性部位。（2）女贞子免疫增强活性成分的分离纯化与结构鉴定通过大孔树脂、硅胶和Sephadex LH-20柱色谱法及制备薄层色谱法,对女贞子正丁醇部位萃取物进行分离纯化,并运用1H-NMR、13C-NMR和HR-ESI-MS对单体化合物进行结构鉴定;通过巨噬细胞吞噬试验和淋巴细胞增殖试验检测大孔树脂乙醇洗脱段和单体化合物的免疫活性。结果表明,女贞子正丁醇部位萃取物的大孔树脂水洗脱段、30%、50%、70%和90%乙醇洗脱段得率分别为8.54%、25.62%、58.34%、1.42%和1.07%,其中30%乙醇洗脱段的免疫活性较强;对30%乙醇洗脱段进行分离纯化得到10个单体化合物,结构鉴定为:橄榄苦苷酸（oleuropeinic acid）、女贞子苷（nuezhenide）、异女贞子苷（isonuezhenide）、红景天苷（salidroside）、异女贞苷酸（isoligustrosidic acid）、ligulucidumoside A、8（E）-女贞子苷（8（E）-nuezhenide）、羟基酪醇（hydroxytyrosol）、橄榄苦苷（oleuropein）和p-hydroxyphenethyl 7-β-D-glucosideelenolic acid eater,其中橄榄苦苷酸、红景天苷、羟基酪醇、橄榄苦苷和p-hydroxyphenethyl7-β-D-glucosideelenolic acid eater有不同程度增强免疫细胞活性的作用,且羟基酪醇的作用最强。说明羟基酪醇等是女贞子的主要免疫增强活性成分。（3）女贞子活性成分羟基酪醇增强巨噬细胞免疫活性的作用及机制通过荧光显微镜观察羟基酪醇作用于RAW264.7巨噬细胞后细胞抗原摄取能力,ELISA检测细胞因子分泌,Griess法检测一氧化氮（NO）释放,荧光显微镜和流式细胞术检测活性氧（ROS）产生,流式细胞术检测细胞表面分子和共激活分子的表达,并通过Western blot检测NF-κB和TLR4信号通路相关靶点蛋白的表达。结果表明,羟基酪醇能显着增强巨噬细胞对FITC-OVA的摄取能力,提高肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素1β（IL-1β）等分泌,促进NO释放和ROS产生,并显着上调细胞表面分子MHC-Ⅱ和共激活分子CD80和CD86的表达;进一步研究表明,羟基酪醇可以显着上调细胞核NF-κB p65表达,下调细胞浆IκB-α表达,同时还能显着上调TLR4,My D88,TRIF和IKKβ的表达,说明羟基酪醇对RAW264.7巨噬细胞的活化可以通过TLR4/My D88（TRIF）/IKKβ介导的信号反应激活细胞内NF-κB信号通路实现。（4）女贞子活性成分羟基酪醇增强淋巴细胞免疫活性的作用及机制通过ELISA检测细胞因子和免疫球蛋白分泌,流式细胞术检测细胞亚群比例,荧光显微镜和流式细胞术检测细胞内Ca2+浓度,微板法检测细胞中钙调神经磷酸酶（Calcineurin）活力,并通过Western blot检测核转录因子NFAT和NF-κB信号通路相关靶点蛋白表达。结果表明,羟基酪醇可显着增加白细胞介素4（IL-4）、γ干扰素（IFN-γ）和TNF-α分泌,提高淋巴细胞亚群CD3+和CD4+/CD8+比例;进一步研究表明,羟基酪醇可以显着增加细胞内Ca2+浓度,提高Calcineurin活力,并且显着上调细胞核NFAT和NF-κB p65表达,同时下调细胞浆NFAT和IκB-α表达,说明羟基酪醇可以通过促进Ca2+/Calcineurin/NFAT和NF-κB信号通路的级联反应,激活脾淋巴细胞。综上所述,本研究发现女贞子正丁醇和乙酸乙酯部位萃取物为其主要免疫增强活性部位,并分离和筛选得到多个具有免疫增强活性的单体化合物,其中羟基酪醇活性最好;进一步研究阐释了羟基酪醇可以通过影响细胞信号通路的传递,引起NF-κB p65和NFAT的入核来增强巨噬细胞和淋巴细胞的免疫活性。本论文研究结果为今后将女贞子开发为免疫增强剂提供了理论依据,为发展可以替代抗生素的中兽药饲料添加剂提供思路。
杨兆娜[9]（2021）在《TRIB3调控急性早幼粒细胞白血病脂代谢异常及促进MYC驱动淋巴瘤进展的作用及机制研究》文中认为肿瘤是威胁全人类健康的重大问题,尽管目前治疗已取得一定进展,但肿瘤复发、转移和耐药仍然是目前临床治疗面临的重大问题和待攻克的难关。压力应激蛋白TRIB3（Tribbles Homologue 3）包含Ser/Thr激酶结构域却无激酶的催化活性,其生物学功能通常主要依靠蛋白质-蛋白质相互作用实现。我们前期探索TRIB3在多种实体肿瘤和白血病中的作用和机制,发现在不同肿瘤中该蛋白通过与多种重要促癌蛋白相互作用,进而影响肿瘤细胞的代谢、增殖、干性等生物学功能。更为重要的是,这些蛋白相互作用参与或决定肿瘤细胞的恶性程度,促进包括白血病、结直肠癌、黑色素瘤、肝癌、肺癌、三阴性乳腺癌等多种肿瘤的发生发展。急性早幼粒细胞白血病（APL）属于急性髓系白血病（AML）的M3型,该疾病主要由融合蛋白PML-RARα诱发。我们前期研究发现,TRIB3在APL样本中表达升高,高表达的TRIB3通过与PML-RARα相互作用,抑制其泛素化及降解,维持PML-RARα的稳定性来介导APL的发生和疾病进展。尽管在APL治疗中,使用全反式维甲酸（ATRA）与三氧化二砷（As2O3）联合治疗能显着提高其治愈率,但是一线药物在治疗过程中也会引发耐药、复发以及脂质代谢异常等问题。虽然APL患者在一线治疗过程中常出现脂代谢紊乱,但其脂代谢异常机制及初诊病人的脂质水平并不清楚。本论文第一部分基于APL治疗存在的临床问题,探索APL患者治疗前后脂质代谢异常的具体生物学机制。通过回顾性临床数据分析,我们发现APL患者治疗前后脂质代谢异常。进一步我们发现APL患者在治疗前后均出现TRIB3的高表达,TRIB3通过与PML-RARα相互作用,妨碍脂代谢受体PPARγ与其配基RXR结合,促进PPARy降解,抑制PPARγ转录活性来介导APL原发和治疗过程后的脂质代谢异常。而联用降脂药PPAR的激动剂（非诺贝特）,ATRA/As2O3可增强抗白血病效果并缓解病人血脂异常。该研究为临床使用降脂药与ATRA/As2O3联用治疗APL提供了重要的理论依据和潜在治疗策略。淋巴瘤是由病毒、放射线等因素诱发的不同于白血病的血液系统恶性肿瘤。我国淋巴瘤患者大部分为非霍奇金氏淋巴瘤（NHL）,随着年龄增加其发病率明显提升。NHL的复发是临床治疗的难点,而肿瘤干细胞的存在是导致淋巴瘤复发的重要原因之一。靶向肿瘤起始细胞或肿瘤干细胞已经成为淋巴瘤治疗的首要目标,而降低关键原癌蛋白的表达则被认为是清除淋巴瘤干细胞的新型策略。本论文第二部分主要集中于假性激酶TRIB3在淋巴瘤发生发展中的作用及机制探究,我们发现TRIB3在淋巴瘤组织中高表达,高表达的TRIB3与淋巴瘤疾病进程密切相关。自发淋巴瘤转基因小鼠中敲除TRIB3能够明显抑制小鼠淋巴瘤的发生发展。机制上,我们发现TRIB3通过与致癌蛋白MYC相互作用,妨碍E3泛素连接酶UBE3B介导的MYC泛素化及降解,维持MYC蛋白的稳定性来维持淋巴瘤细胞的增殖活性和干性,从而促进淋巴瘤的发生发展。本研究首次发现假性激酶TRIB3促进淋巴瘤发生发展的作用,从分子、细胞、动物水平结合PDX模型验证TRIB3促进淋巴瘤发生发展的关键调控机制,同时发现干预措施并提供淋巴瘤的治疗新策略。本论文围绕假性激酶TRIB3参与APL脂质代谢异常和淋巴瘤发生发展的生物学机制开展了广泛深入的研究。论文第一部分详细阐述TRIB3介导初诊和治疗后APL脂代谢异常的机制,为临床使用降脂药与ATRA/As2O3联用治疗APL提供了重要的理论支持。论文第二部分基于TRIB3促进MYC驱动淋巴瘤进展的机制,鉴定出介导MYC泛素化降解的E3泛素连接酶UBE3B,并提出阻断TRIB3/MYC相互作用治疗淋巴瘤的新策略。上述研究为血液肿瘤的治疗提供新策略和新靶点,亦为抗肿瘤多肽药物研发奠定理论基础。
张佳佳[10]（2021）在《H2O2诱导HT22细胞损伤后的分泌蛋白和外泌体介导的分子防御机制》文中进行了进一步梳理背景:随着世界人口老龄化进程的到来,神经退行性疾病的发病率越来越高,已经成为增加人类（尤其是老年人）死亡的重要原因。氧化应激被认为是神经退行性疾病,尤其是阿尔茨海默氏病（Alzheimer’s disease,AD）等老年变性病发病的主要原因,而且此类人群神经元更易受氧化应激的影响。分泌蛋白和外泌体作为细胞间重要的通讯形式,已有多项研究表明H2O2损伤条件下细胞释放的分泌蛋白和外泌体可以提高受体细胞的氧化耐受性以及抵抗细胞凋亡的能力。但是,氧化应激损伤胁迫下神经元释放的分泌蛋白和外泌体是否参与介导细胞防御机制仍然是未知的。目的:H2O2作用于小鼠海马神经元HT22细胞诱导建立神经元氧化应激损伤模型,探讨H2O2作用于HT22细胞损伤后蛋白分泌谱的变化;明确H2O2诱导HT22细胞损伤后释放的分泌蛋白和外泌体对正常神经元的影响,以探讨神经元氧化应激损伤级联反应中潜在的分子靶点。方法:选择100μM H2O2作用于HT22细胞24h,倒置相差显微镜观察细胞形态,CCK-8检测细胞活力,Western Blot检测细胞凋亡。分别收集两组细胞的条件培养基,超滤管浓缩提取分泌蛋白以及SBI试剂盒提取外泌体。在外泌体鉴定（Western Blot鉴定CD81表达情况、电镜以及纳米粒径分析）成功的基础上,将分泌蛋白和外泌体分别与正常神经元共培养24h,CCK-8检测细胞活力,Western Blot检测凋亡相关蛋白Bcl2/Bax以及电压依赖性阴离子通道（Voltage-dependent anion channel 1,VDAC1）蛋白表达水平。双向电泳技术分析H2O2作用下HT22细胞分泌蛋白表达谱的变化,经LC-MS/MS质谱鉴定分析,通过生物信息学方法进行GO和KEGG功能富集。结果:实验结果显示HT22细胞活力随着H2O2浓度的增加逐渐降低（P<0.01）,用100μM H2O2作用于HT22细胞24h建立神经元氧化应激损伤模型,可以观察到细胞形态发生明显改变（收缩和凝结）,Western Blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax的表达下调（P<0.01）,H2O2可诱导HT22细胞损伤。收集条件培养基,超滤管提取分泌蛋白,双向电泳结合质谱分析表明,H2O2处理HT22细胞后释放的分泌蛋白中热休克蛋白90β（HSP90β）表达上调,而蛋白酶体（Psma6）和波形蛋白（Vim）表达下调。同时将所有的差异蛋白进行整合,GO功能注释,发现分泌蛋白主要来源于轴突（GO:0150034）、生长锥（GO:0030426）以及核小体（GO:0000786）,而KEGG通路主要富集于内质网中的蛋白质加工（mmu04141）、帕金森病（mmu05012）以及细胞程序性死亡（mmu04217）通路。SBI试剂盒获取外泌体,与分泌蛋白质谱鉴定结果一致的是,Western Blot结果检测到HSP90β蛋白在外泌体中表达,而且H2O2刺激HT22细胞后释放的外泌体中HSP90β的表达水平更高（P<0.05）。将条件分泌蛋白和外泌体分别与HT22细胞共培养后,均显示出细胞活力增强,Bcl-2/Bax表达上调（P<0.01）,显示出抗凋亡作用,而且外泌体干预组中VDAC1表达下调（P<0.05）。结论:H2O2作用于HT22细胞后释放的分泌蛋白的表达谱发生改变,分泌蛋白大多数来源于轴突、生长锥以及核小体,大部分参与了内质网蛋白的正确折叠、细胞对刺激的反应以及细胞程序性死亡通路。H2O2组的分泌蛋白以及外泌体均表现为HSP90β表达上调,通过促进受体细胞的细胞活力以及抑制细胞凋亡过程发挥神经保护作用。
二、细胞分泌的分子机制研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、细胞分泌的分子机制研究进展（论文提纲范文）
（1）半夏泻心汤治疗2型糖尿病寒热错杂证疗效观察及GLP-1相关机制探讨（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语 |
| 文献综述 |
| 综述一 肠促胰素与2型糖尿病相关性的研究现状 |
| 1 肠促胰素在调节血糖稳态中的生理作用 |
| 2 T2DM患者肠促胰素效应的临床特点 |
| 3 肠促胰素类药物在T2DM中的应用 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 综述二 基于肠促胰素效应中药降糖机制的研究进展 |
| 1 中药有效成分 |
| 2 中药复方 |
| 3 小结 |
| 参考文献 |
| 综述三 半夏泻心汤治疗2型糖尿病的机制及临床研究进展 |
| 1 现代药理研究 |
| 2 现代临床应用 |
| 3 小结 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第一部分 2型糖尿病寒热错杂证的中医诊疗特征探讨 |
| 1 对象及方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 半夏泻心汤调节2型糖尿病患者血清GLP-1水平和胰岛β细胞功能的临床研究 |
| 1 对象及方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 基于网络药理学研究半夏泻心汤干预2型糖尿病的分子作用机制 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 附件 |
（2）lncRNA-m433s1作为miR-433分子海绵调控雄性大鼠腺垂体FSH分泌机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 FSH分泌调控的研究进展 |
| 1 垂体与生殖内分泌 |
| 2 FSH的结构、受体及生理功能 |
| 3 FSH分泌调控的机制 |
| 第2章 腺垂体miRNA及其功能的研究进展 |
| 1 miRNA调控生殖的研究进展 |
| 2 miR-433 的研究进展 |
| 第3章 ceRNA机制及lncRNA在垂体中的研究进展 |
| 1 lncRNA的概述 |
| 2 ceRNA机制 |
| 3 lncRNA在垂体中的研究进展 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 靶向作用于Fshβ基因的miRNA的筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第2章 GnRH处理后大鼠腺垂体lncRNA差异表达谱的构建及分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第3章 lncRNA-m433s1 作为miR-433 分子海绵对腺垂体FSH分泌的调控作用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（3）培元补肾安胎方治疗RSA的临床研究及基于内膜衰老的药物机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 综述一 复发性流产的西医研究进展 |
| 1 复发性流产的病因研究 |
| 2 复发性流产的治疗现状 |
| 3 小结 |
| 参考文献 |
| 综述二 中医药治疗复发性流产的研究进展 |
| 1 中医病因病机 |
| 2 复发性流产的中医证型分布状况 |
| 3 复发性流产的中医治疗现状 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 综述三 子宫细胞衰老与女性生殖功能 |
| 1 衰老细胞 |
| 2 子宫的生理解剖及功能 |
| 3 子宫衰老细胞对女性生殖功能的影响 |
| 4 子宫衰老细胞的治疗现状 |
| 5 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 第二章 培元补肾安胎方治疗黄体功能不足型复发性流产临床疗效观察 |
| 前言 |
| 1 研究材料 |
| 2 研究方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 第三章 基于网络药理学和分子对接探讨培元补肾安胎方治疗复发性流产的作用机制 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 第四章 孕酮诱导“种植窗期”子宫内膜细胞衰老在胚胎着床中的作用研究 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 第五章 基于“种植窗期”内膜衰老探讨培元补肾安胎方对复发性流产作用机制的研究 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 1 研究总结 |
| 2 创新点 |
| 3 不足与展望 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 在学期间主要研究成果 |
（4）肿瘤代谢物乳酸诱导B细胞分化为Breg样细胞的分子机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 调节性B细胞概述 |
| 1.2 调节性B细胞与肿瘤 |
| 1.3 肿瘤微环境中调节性B细胞的来源 |
| 1.4 乳酸对肿瘤微环境免疫反应的影响 |
| 第2章 文献综述 |
| 2.1 调节性B细胞生物学特性 |
| 2.1.1 调节性B细胞分类及分子标志 |
| 2.1.2 调节性B细胞抑制功能机制 |
| 2.1.3 调节性B细胞的起源及分化 |
| 2.2 调节性B细胞在自身免疫性疾病、感染和肿瘤中的作用 |
| 2.2.1 Breg细胞在自身免疫性疾病中的作用 |
| 2.2.2 Breg细胞在感染性疾病中的作用 |
| 2.2.3 Breg细胞在肿瘤中的作用 |
| 2.3 ROS在B细胞中作为信号分子的作用 |
| 2.3.1 ROS在B细胞中的产生和降解 |
| 2.3.2 ROS调节B细胞的成熟、活化和增殖 |
| 2.3.3 ROS影响B细胞功能 |
| 2.4 乳酸促进肿瘤发生发展机制 |
| 2.4.1 乳酸的来源与代谢 |
| 2.4.2 乳酸在肿瘤发生发展中的作用 |
| 2.4.3 乳酸/GPR81 信号通路对肿瘤的影响 |
| 2.4.4 乳酸作为肿瘤治疗靶点 |
| 第3章 乳酸诱导小鼠B细胞分化为Breg样细胞的分子机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 材料和试剂 |
| 3.2.3 仪器设备 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 磁珠分选B6 小鼠B220~+B细胞 |
| 3.3.2 磁珠分选CD8~+T细胞 |
| 3.3.3 磁珠分选CD4~+T细胞 |
| 3.3.4 磁珠分选B6 小鼠na(?)ve CD4~+T细胞 |
| 3.3.5 CFSE染色 |
| 3.3.6 乳酸培养小鼠B220 细胞抑制功能实验 |
| 3.3.7 CFSE法检测细胞增殖 |
| 3.3.8 慢病毒CRISPR/Cas9 技术构建LDHA基因敲除D121 细胞混合克隆稳定株 |
| 3.3.9 小鼠肺腺癌模型的构建 |
| 3.3.10 小鼠肿瘤组织消化 |
| 3.3.11 肿瘤组织B淋巴细胞分选 |
| 3.3.12 组织染色 |
| 3.3.13 流式分析 |
| 3.3.14 qRT-PCR检测 |
| 3.3.15 Western blot |
| 3.3.16 统计分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 乳酸诱导B细胞具有CD25~+CD81~+Breg样细胞的表型 |
| 3.4.2 乳酸诱导的Breg样细胞具有免疫抑制功能 |
| 3.4.3 乳酸诱导的Breg样细胞不能诱导Treg细胞分化及CD4~+T细胞凋亡 |
| 3.4.4 乳酸诱导的Breg样细胞抑制T细胞增殖机制研究 |
| 3.4.5 乳酸激活B细胞表面GPR81 受体诱导ROS表达 |
| 3.4.6 乳酸激活B细胞内PPARα诱导ROS表达 |
| 3.4.7 乳酸通过结合GPR81 受体激活PPARα诱导ROS产生 |
| 3.4.8 降低肿瘤内乳酸浓度对B细胞及其他免疫细胞比例及功能的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 乳酸诱导人外周血B细胞分化为Breg样细胞 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和仪器 |
| 4.2.1 研究对象入组及排除标准 |
| 4.2.2 实验材料 |
| 4.2.3 仪器 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 密度梯度离心法分离外周血单个核细胞 |
| 4.3.2 磁珠分选人外周血CD3~+T/CD19~+B细胞 |
| 4.3.3 乳酸培养人CD19~+B细胞抑制功能试验 |
| 4.3.4 流式检测 |
| 4.3.5 qRT-PCR检测 |
| 4.3.6 人肺腺癌组织及癌旁组织免疫荧光染色 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 肺腺癌患者外周血乳酸含量及Breg细胞比率 |
| 4.4.2 乳酸诱导人外周血B细胞分化为Breg样细胞 |
| 4.4.3 人肺腺癌组织及癌旁组织内乳酸对 B 细胞 ROS 表达的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 结论 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（5）基于巨噬细胞亚型分析探讨猪苓多糖对膀胱癌肿瘤微环境的作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 膀胱癌免疫治疗的研究进展 |
| 一、卡介苗的研究进展 |
| 二、免疫检查点抑制剂 |
| 三、小结 |
| 第二节 巨噬细胞作为膀胱癌治疗靶点的研究进展 |
| 一、巨噬细胞的研究进展 |
| 二、巨噬细胞在肿瘤免疫中的作用 |
| 三、肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)对膀胱癌的作用 |
| 四、巨噬细胞作为治疗靶点的抗膀胱癌研究 |
| 五、小结 |
| 第三节 中药多糖免疫调节作用的研究进展 |
| 一、中药多糖的开发与中医理论的渊源 |
| 二、中药多糖的免疫调节作用 |
| 三、中药多糖的免疫调节功能在疾病中的研究进展 |
| 四、小结 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一节 膀胱癌组织中M2亚型巨噬细胞浸润程度与膀胱癌恶性程度的关系 |
| 一、材料与方法 |
| 二、统计学分析 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第二节 均一猪苓多糖对BBN模型膀胱癌大鼠肿瘤微环境中巨噬细胞的影响 |
| 一、材料与方法 |
| 二、统计学分析 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第三节 均一猪苓多糖活化的巨噬细胞对膀胱癌细胞的直接作用研究 |
| 一、THP-1来源巨噬细胞模型的建立及HPP对巨噬细胞的极化作用 |
| 二、HPP活化的巨噬细胞对于人膀胱癌细胞的直接作用及分子机制研究 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 第四节 基于亚型分析对HPP活化的巨噬细胞及肿瘤相关巨噬细胞的探讨 |
| 一、材料与方法 |
| 二、统计学分析 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况、参与课题与获奖情况 |
| 致谢 |
| 附件 |
（6）溃疡性结肠炎“以痈论治”策略的临床疗效及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 理论研究 姜树民教授“以痈论治”溃疡性结肠炎的学术思想及经验 |
| 1 “以痈论治”学术特色的师脉传承 |
| 2 “以痈论治”UC及“毒热致痈”的源流考析 |
| 3 UC的病因和病机 |
| 4 姜师治疗UC特色及经验 |
| 5 姜师治疗UC用药特色 |
| 6 消痈止痢汤的组方解析 |
| 第二部分 临床研究 “消痈止痢汤”治疗活动期大肠湿热型轻中度溃疡性结肠炎的临床疗效观察 |
| 前言 |
| 资料与方法 |
| 研究结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 实验研究 |
| 实验一 消痈止痢汤对溃疡性结肠炎大鼠的一般状态和黏膜组织形态的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 实验二 消痈止痢汤对溃疡性结肠炎大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和MPO含量的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 实验三 消痈止痢汤对溃疡性结肠炎大鼠MAPK信号通路和NF-κB蛋白表达的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 中医药治疗溃疡性结肠炎分子机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（7）氨来呫诺通过靶向抑制脂多糖活化巨噬细胞中的磷酸二酯酶4B发挥抗炎作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 引言 |
| 1. 氨来呫诺的研究现状 |
| 2. 本研究的切入点 |
| 3. 参考文献 |
| 实验流程图 |
| 第二章 氨来呫诺抑制LPS引起的经典炎症 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 细胞和实验动物 |
| 2.1.3 仪器设备及其他材料 |
| 2.1.4 溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 LPS引起的小鼠内毒素血症 |
| 2.2.2 以ELISA法测定炎症因子的水平 |
| 2.2.3 细胞毒作用的测定 |
| 2.2.4 细胞培养上清中NO水平的测定 |
| 2.2.5 胞内iNOS酶活的测定 |
| 2.2.6 iNOS蛋白表达水平的测定 |
| 2.2.7 细胞培养上清中炎症因子TNF-α和IL-6水平的测定 |
| 2.2.8 数据统计与分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 氨来呫诺在LPS引起的内毒素血症小鼠体内的抗炎作用 |
| 2.3.2 氨来呫诺对RAW264.7细胞的安全剂量考察 |
| 2.3.3 氨来呫诺对LPS活化的RAW264.7细胞分泌NO及iNOS活性、蛋白表达的作用 |
| 2.3.4 氨来呫诺对LPS刺激的RAW264.7细胞上清TNF-α和IL-6水平的作用 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 参考文献 |
| 第三章 氨来呫诺抑制LPS刺激的RAW264.7细胞中炎症因子的转录 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 细胞 |
| 3.1.3 仪器设备及其他材料 |
| 3.1.4 溶液配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞的处理 |
| 3.2.2 总RNA的抽提 |
| 3.2.3 总RNA的反转录 |
| 3.2.4 以RT-qPCR法检测炎症因子的转录水平 |
| 3.2.5 数据统计与分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 参考文献 |
| 第四章 氨来呫诺抑制LPS活化巨噬细胞中NF-κB和AP-1信号通路关键蛋白事件 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 主要试剂 |
| 4.1.2 细胞与细菌 |
| 4.1.3 仪器设备及其他材料 |
| 4.1.4 溶液配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 NF-κB和AP-1转录活性的测定 |
| 4.2.2 IκBα磷酸化、降解及p65核转位作用的测定 |
| 4.2.3 JNK1/2、ERK1/2和p38磷酸化作用的测定 |
| 4.2.4 数据统计与分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 氨来呫诺可抑制LPS活化的NF-κB信号通路 |
| 4.3.2 氨来呫诺可抑制LPS活化的AP-1信号通路 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 参考文献 |
| 第五章 氨来呫诺增高LPS活化的巨噬细胞内cAMP水平及相关作用 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 主要试剂 |
| 5.1.2 细胞及动物 |
| 5.1.3 仪器设备及其他材料 |
| 5.1.4 溶液配制 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 cAMP对抗实验 |
| 5.2.2 胞内cAMP水平的测定 |
| 5.2.3 胞内PKA活性的测定 |
| 5.2.4 骨髓源巨噬细胞的分离、分化与培养 |
| 5.2.5 细胞培养上清中IL-10水平的测定 |
| 5.2.6 胞内NLRP3炎症小体活性的测定 |
| 5.2.7 胞内氯离子水平的测定 |
| 5.2.8 数据统计与分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 cAMP对抗剂对氨来呫诺抗炎作用的影响 |
| 5.3.2 氨来呫诺对LPS刺激的RAW264.7细胞内cAMP水平的作用 |
| 5.3.3 氨来呫诺通过增高胞内cAMP产生的其他效果 |
| 5.3.3.1 氨来呫诺对LPS刺激的RAW264.7细胞内PKA活性的作用 |
| 5.3.3.2 氨来呫诺对LPS刺激的BMDMs分泌IL-10的作用 |
| 5.3.3.3 氨来呫诺对LPS刺激的BMDMs中NLRP3炎症小体活化的作用 |
| 5.3.3.4 氨来呫诺对LPS刺激的RAW264.7细胞内氯离子水平的作用 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 参考文献 |
| 第六章 氨来呫诺靶向抑制巨噬细胞内PDE4B发挥抗炎作用 |
| 6.1 实验材料及方法 |
| 6.1.1 主要试剂 |
| 6.1.2 细胞 |
| 6.1.3 仪器设备及其他材料 |
| 6.1.4 溶液配制 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 氨来呫诺的荧光特性及其入胞和胞内分布特征考察 |
| 6.2.2 以MOE软件进分子对接 |
| 6.2.3 荧光偏振实验 |
| 6.2.4 重组人PDE4B活性抑制实验 |
| 6.2.5 以siRNA静默巨噬细胞中PDE4B |
| 6.2.6 PDE4B(+)与PDE4B(-)RAW264.7细胞分泌炎症因子的水平的测定 |
| 6.2.7 数据统计与分析 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 利用氨来呫诺的荧光特性考察其入胞和胞内分布特征 |
| 6.3.1.1 氨来呫诺的激发-发射3D荧光图谱扫描 |
| 6.3.1.2 氨来呫诺入胞特征 |
| 6.3.1.3 氨来呫诺在巨噬细胞内分布特征的考察 |
| 6.3.2 以MOE软件进行氨来呫诺与PDE4B分子对接 |
| 6.3.3 荧光偏振法测定氨来呫诺与重组人PDE4B蛋白的直接结合 |
| 6.3.4 氨来呫诺对重组人PDE4B活性的作用 |
| 6.3.5 氨来呫诺对LPS刺激的PDE4B(-)RAW264.7细胞分泌炎症因子的作用. |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 参考文献 |
| 第七章 氨来呫诺对PDE的抑制不具选择性,但其抗炎作用与PDE3无关 |
| 7.1 实验材料 |
| 7.1.1 主要试剂 |
| 7.1.2 细胞 |
| 7.1.3 仪器设备及其他材料 |
| 7.1.4 溶液配制 |
| 7.2 实验方法 |
| 7.2.1 HPLC法测定自制PDE粗酶活性 |
| 7.2.2 重组人PDE1C,PDE3A,PDE3B活性抑制实验 |
| 7.3 实验结果 |
| 7.3.1 氨来呫诺对自制PDE粗酶活性的作用 |
| 7.3.2 氨来呫诺对重组人PDE1C,PDE3A,PDE3B活性的作用 |
| 7.3.3 选择性PDE3抑制剂对LPS刺激的RAW264.7细胞分泌炎症因子NO和TNF-α的作用 |
| 7.4 讨论 |
| 7.5 参考文献 |
| 第八章 总结与讨论 |
| 参考文献 |
| 本研究创新点 |
| 文献综述 氨来呫诺的药理学研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 参与发表的学术论文及专利申请 |
| 个人简历 |
（8）女贞子免疫增强活性成分分离鉴定及作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 中药增强免疫研究进展 |
| 1.1.1 中药促进免疫器官发育 |
| 1.1.2 中药增强免疫细胞功能 |
| 1.1.3 中药调节免疫分子生成 |
| 1.1.4 中药影响信号通路传递 |
| 1.2 女贞子研究进展 |
| 1.2.1 女贞子化学成分 |
| 1.2.2 女贞子药理作用 |
| 1.2.3 女贞子兽医临床应用 |
| 1.3 研究目的与意义 |
| 第二章 女贞子免疫增强活性部位的筛选 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 药材 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 女贞子五部位萃取物得率 |
| 2.2.2 女贞子不同部位萃取物对巨噬细胞活性的影响 |
| 2.2.3 女贞子不同部位萃取物对巨噬细胞吞噬功能的影响 |
| 2.2.4 女贞子不同部位萃取物对淋巴细胞增殖的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 女贞子五部位萃取物的制备 |
| 2.3.2 女贞子免疫增强活性部位的筛选 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 女贞子免疫增强活性成分的分离纯化与结构鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 药物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 大孔树脂吸附法分离女贞子正丁醇部位萃取物试验结果 |
| 3.2.2 不同乙醇洗脱段的免疫活性检测结果 |
| 3.2.3 分离纯化和结构鉴定结果 |
| 3.2.4 单体化合物的免疫活性检测结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 女贞子正丁醇部位萃取物的分离纯化 |
| 3.3.2 女贞子免疫增强活性化合物的筛选 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 女贞子活性成分羟基酪醇增强巨噬细胞免疫的作用机制 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 药物 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 羟基酪醇对巨噬细胞摄取FITC-OVA的影响 |
| 4.2.2 羟基酪醇对细胞因子TNF-α和IL-1β分泌的影响 |
| 4.2.3 羟基酪醇对NO释放的影响 |
| 4.2.4 羟基酪醇对ROS产生的影响 |
| 4.2.5 羟基酪醇对细胞表面分子MHC-Ⅱ及共激活分子CD80、CD86表达的影响 |
| 4.2.6 羟基酪醇对NF-κB信号通路关键蛋白表达的影响 |
| 4.2.7 羟基酪醇对TLR4/MyD88(TRIF)/IKKβ通路蛋白表达的影响 |
| 4.2.8 信号阻断试验 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 羟基酪醇增强巨噬细胞免疫活性 |
| 4.3.2 羟基酪醇活化巨噬细胞的分子机制 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 女贞子活性成分羟基酪醇增强淋巴细胞免疫的作用机制 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 药物 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.1.4 方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 羟基酪醇对细胞因子和免疫球蛋白分泌的影响 |
| 5.2.2 羟基酪醇对淋巴细胞亚群的影响 |
| 5.2.3 羟基酪醇对胞内Ca~(2+)浓度的影响 |
| 5.2.4 羟基酪醇对钙调神经磷酸酶的影响 |
| 5.2.5 羟基酪醇对核转录因子NFAT和NF-κB转运的影响 |
| 5.2.6 信号阻断试验 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 羟基酪醇增强淋巴细胞免疫活性 |
| 5.3.2 羟基酪醇激活淋巴细胞的分子机制 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）TRIB3调控急性早幼粒细胞白血病脂代谢异常及促进MYC驱动淋巴瘤进展的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 综述一: 白血病骨髓微环境的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二: 蛋白质质量控制及靶向蛋白质相互作用的药物研发进展 |
| 参考文献 |
| 第一部分: TRIB3调控急性早幼粒细胞白血病脂代谢异常的机制研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| A 实验材料 |
| 1.实验动物 |
| 2.细胞系 |
| 3.患者样本 |
| 4.质粒、siRNA、病毒 |
| 5.实验试剂 |
| 6.试剂盒 |
| 7.抗体 |
| 8.引物 |
| 9.药物 |
| 10.主要仪器 |
| B 实验方法 |
| 1.细胞的传代及冻存 |
| 2.稳定细胞株的建立 |
| 3.小鼠原代APL细胞分离 |
| 4.小鼠原代肝脏细胞分离 |
| 5.肝脏细胞与白血病细胞共培养 |
| 6.白血病小鼠转接模型 |
| 7.蛋白提取 |
| 8.Western Blotting |
| 9.免疫共沉淀 |
| 10.瞬时转染 |
| 11.免疫荧光 |
| 12.流式细胞术及分选 |
| 13.RNA提取 |
| 14.逆转录 |
| 15.实时定量PCR |
| 16.双荧光素酶报告基因检测 |
| 17.蛋白质-染色质免疫共沉淀(CHIP) |
| 18.肝脏细胞脂质检测样品制备 |
| 19.TC水平检测 |
| 20.TG水平检测 |
| 21.ELISA检测Leptin、Resistin、PCSK9水平 |
| 22.变量定义 |
| 23.统计方法 |
| 实验结果 |
| 1.APL患者易发生血脂异常 |
| 1.1 相比非APL患者,APL患者有更高脂代谢异常的发生率 |
| 1.2 APL细胞介导机体脂代谢异常 |
| 1.3 APL细胞在脂代谢异常中起重要作用 |
| 2.APL细胞能够诱导肝细胞脂质合成异常 |
| 2.1 APL细胞能够促进肝脏细胞脂质合成 |
| 2.2 PML-RARα融合蛋白在APL脂代谢异常起重要作用 |
| 3.PML-RARα抑制PPARγ转录活性和脂代谢信号通路 |
| 3.1 APL患者中脂代谢信号通路异常,脂代谢相关基因的异常表达 |
| 3.2 RETN,LEP,PPARγ和TRIB3是介导脂代谢异常的关键基因 |
| 3.3 APL细胞中TRIB3和Resistin蛋白表达升高,PPARγ蛋白表达降低 |
| 3.4 PPARγ通过调控Leptin和Resistin的分泌介导脂代谢异常 |
| 3.5 APL细胞能够诱导小鼠血清中Resistin和PCSK9分泌 |
| 3.6 Resistin能够诱导肝脏细胞分泌PCSK9 |
| 3.7 Resistin调控肝脏细胞脂质代谢 |
| 4.APL细胞中PPARγ活性降低导致脂质代谢异常 |
| 4.1 PML-RARα能够抑制PPARγ的活性 |
| 4.2 APL细胞中敲除PPARγ诱导小鼠血脂异常 |
| 5.TRIB3通过维持PML-RARα稳定性,抑制PPARγ/RXR异源二聚体形成 |
| 5.1 PML-RARα抑制PPARy/RXR异源二聚体的形成 |
| 5.2 TRIB3抑制PPARy/RXR异源二聚体的形成 |
| 5.3 TRIB3进一步增强PML-RARα对PPARγ降解的促进作用 |
| 5.4 TRIB3增强PML-RARα介导的PPARγ泛素化 |
| 6.ATRA/As_2O_3治疗后依然存在脂代谢异常 |
| 6.1 ATRA/As_2O_3治疗恢复PPARγ蛋白表达水平 |
| 6.2 ATRA/As_2O_3诱导Resistin的表达上调和Leptin的表达下调 |
| 6.3 ATRA/As_2O_3处理后APL细胞能诱导肝脏细胞脂代谢异常 |
| 6.4 ATRA/As_2O_3治疗导致APL患者血清TG水平升高 |
| 7.ATRA/As_2O_3治疗诱导TRIB3表达水平升高,介导治疗引发的血脂异常 |
| 7.1 TRIB3抑制PPARγ转录活性 |
| 7.2 TRIB3是介导ATRA/As_2O_3治疗后APL患者血脂异常的关键蛋白 |
| 7.3 敲低TRIB3能明显抑制APL细胞介导的脂质代谢异常 |
| 7.4 小鼠体内敲除TRIB3能缓解ATRA/As_2O_3诱发的脂代谢异常 |
| 8.PPAR激动剂与ATRA/As_2O_3协同治疗APL,改善脂代谢异常 |
| 8.1 PPAR激动剂与ATRA/As_2O_3联用可协同促进APL细胞分化和凋亡 |
| 8.2 PPAR激动剂可抑制砷剂诱导的TRIB3转录活性的升高 |
| 8.3 FN抑制ATRA/As_2O_3诱导的血脂异常 |
| 8.4 ATRA/As_2O_3与FN联合用药可改善APL治疗效果 |
| 9.总结 |
| 讨论 |
| 缩略词 |
| 参考文献 |
| 第二部分: TRIB3调控MYC驱动淋巴瘤进展的机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| A 实验材料 |
| 1.实验动物 |
| 2.细胞系 |
| 3.质粒 |
| 4.抗体 |
| 5.病毒 |
| 6.主要试剂及试剂盒 |
| 7.转基因小鼠基因型鉴定引物 |
| 8.分析软件及网站 |
| 9.统计分析 |
| 10.患者样本信息 |
| B 实验方法 |
| 1.克隆形成实验(CFU) |
| 2.细胞增殖 |
| 3.免疫组化 |
| 4.体外泛素化 |
| 5.PLA邻位连接检测 |
| 6.蛋白纯化 |
| 7.E3泛素连接酶筛选 |
| 8.MYC-K427和MYC-T58突变体Raji细胞株构建 |
| 9.Biacore技术 |
| 实验结果 |
| 1.TRIB3在淋巴瘤组织高表达 |
| 1.1 TRIB3在淋巴瘤组织中表达升高 |
| 1.2 Q84R突变导致TRIB3稳定性增强 |
| 1.3 TRIB3敲除不影响正常淋巴细胞发育 |
| 2.敲除TRIB3抑制淋巴瘤的发生和进展 |
| 2.1 B细胞敲除TRIB3抑制淋巴瘤的发生 |
| 2.2 B细胞敲除TRIB3抑制淋巴瘤的发展 |
| 3.TRIB3促进B淋巴瘤细胞增殖,维持干性 |
| 3.1 TRIB3维持小鼠淋巴瘤细胞的增殖活性和干性 |
| 3.2 TRIB3维持病人原代淋巴瘤细胞的增殖活性和干性 |
| 4.TRIB3调节MYC等关键促肿瘤因子的转录和表达 |
| 4.1 敲除TRIB3抑制MYC的转录活性 |
| 4.2 敲除TRIB3下调MYC的表达水平 |
| 5.TRIB3通过泛素蛋白酶体途径维持MYC的稳定性 |
| 5.1 TRIB3抑制MYC的降解 |
| 5.2 TRIB3通过调控MYC-T58位磷酸化影响MYC降解 |
| 6.UBE3B是介导MYC降解的E3泛素连接酶 |
| 6.1 TRIB3抑制MYC的泛素化修饰 |
| 6.2 TRIB3调控MYC泛素化不依赖于已报道的E3 |
| 6.3 UBE3B是MYC潜在的E3泛素连接酶 |
| 6.4 UBE3B介导MYC泛素化并促进其降解 |
| 7.UBCH3是UBE3B介导MYC泛素化降解的E2泛素偶联酶 |
| 7.1 E2偶联酶UBCH3可以诱导MYC的泛素化 |
| 7.2 UBE3B发挥活性依赖于1036位半胱氨酸 |
| 7.3 鉴定MYC与UBE3B相互作用的结构域 |
| 7.4 淋巴瘤患者易伴随UBE3B-R346Q突变患者 |
| 7.5 UBE3B-R346Q突变抑制MYC的泛素化 |
| 8.K427是UBE3B介导MYC泛素化的位点 |
| 8.1 突变K427R和K443/445R导致MYC泛素化降低 |
| 8.2 MYC-K427R是UBE3B介导MYC泛素化的位点 |
| 9.TRIB3调控淋巴瘤细胞增殖和干性依赖于MYC-T58位磷酸化 |
| 9.1 MYC-T58突变抑制淋巴瘤细胞增殖和干性 |
| 9.2 MYC-T58突变影响MYC靶基因的富集 |
| 10.UBE3B抑制MYC转录及淋巴瘤细胞的增殖和干性 |
| 10.1 MYC-K427R突变增强MYC的转录活性 |
| 10.2 过表达UBE3B抑制MYC的转录活性 |
| 10.3 UBE3B抑制MYC/Max复合物的形成 |
| 10.4 过表达UBE3B抑制淋巴瘤细胞的增殖和干性 |
| 11.TRIB3解除UBE3B对MYC驱动淋巴瘤的抑制作用 |
| 11.1 TRIB3解除UBE3B对小鼠淋巴瘤进展的抑制作用 |
| 11.2 TRIB3解除UBE3B的淋巴瘤细胞干性的维持 |
| 12.TRIB3妨碍UBE3B-MYC的相互作用并促进MYC-Max复合物形成 |
| 12.1 TRIB3抑制UBE3B与MYC的相互作用 |
| 12.2 MYC与TRIB3的KDC结构域结合 |
| 12.3 TRIB3与MYC的C端和N端存在相互作用 |
| 12.4 UBE3B与MYC的C端和N端结合 |
| 12.5 TRIB3抑制MYC-UBE3B的结合并增强MYC-Max的相互作用 |
| 13.总结 |
| 讨论 |
| 附录1: CRISPR-Cas9技术构建Raji突变体细胞测序结果 |
| 附录2: 患者UBE3B和TRIB3突变位点 |
| 缩略词 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（10）H2O2诱导HT22细胞损伤后的分泌蛋白和外泌体介导的分子防御机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 神经退行性疾病的发病现状 |
| 1.2 神经退行性疾病中神经细胞损伤的分子机制 |
| 1.3 神经退行性疾病中的氧化应激 |
| 1.4 神经退行性疾病的病理学播散机制 |
| 1.5 分泌蛋白 |
| 1.5.1 分泌蛋白概述 |
| 1.5.2 分泌蛋白介导中枢神经细胞间的串扰 |
| 1.6 外泌体 |
| 1.6.1 外泌体概述 |
| 1.6.2 外泌体介导中枢神经细胞间的串扰 |
| 1.6.3 神经退行性疾病中的外泌体 |
| 1.6.4 细胞应激状态下的外泌体 |
| 1.7 HT22 细胞在神经退行性疾病体外研究中的应用 |
| 1.8 本研究的目的与意义 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验用细胞株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器与设备 |
| 2.1.4 实验用主要溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养、传代及冻存 |
| 2.2.2 CCK-8 细胞活力测定 |
| 2.2.3 细胞蛋白的获取 |
| 2.2.4 条件培养基以及分泌蛋白的获取 |
| 2.2.5 蛋白浓度测定 |
| 2.2.6 蛋白免疫印迹(Western blot) |
| 2.2.7 双向电泳 |
| 2.2.8 外泌体的分离提取 |
| 2.2.9 外泌体的鉴定 |
| 2.2.10 生物信息学分析 |
| 2.2.11 统计学处理 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 不同浓度H_2O_2对HT22细胞活力的影响 |
| 3.2 H_2O_2对HT22细胞形态的影响 |
| 3.3 H_2O_2对HT22细胞中凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax表达的影响 |
| 3.4 HT22 细胞分泌蛋白浓度 |
| 3.5 H_2O_2作用于HT22细胞后释放的分泌蛋白对HT22 细胞活力的影响 |
| 3.6 H_2O_2作用于HT22细胞后释放的分泌蛋白对HT22 细胞凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax表达的影响 |
| 3.7 H_2O_2作用于HT22细胞后分泌蛋白表达谱的建立 |
| 3.8 液相色谱串联质谱对差异蛋白的鉴定 |
| 3.9 H_2O_2处理HT22细胞后分泌蛋白中差异蛋白的生物信息学分析 |
| 3.9.1 蛋白质互作网络分析 |
| 3.9.2 GO功能注释 |
| 3.9.3 KEGG通路富集分析 |
| 3.10 HT22 细胞外泌体的鉴定与表征 |
| 3.10.1 HT22细胞外泌体蛋白浓度 |
| 3.10.2 HT22细胞外泌体的鉴定与表征 |
| 3.11 H_2O_2作用于HT22细胞释放的外泌体对HT22 细胞活力的影响 |
| 3.12 H_2O_2作用于HT22细胞后释放的外泌体对HT22 细胞中凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax以及VDAC1 表达的影响 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论和展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 综述 缺氧条件下中枢神经系统外泌体作用机制 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词表 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
四、细胞分泌的分子机制研究进展（论文参考文献）
- [1]半夏泻心汤治疗2型糖尿病寒热错杂证疗效观察及GLP-1相关机制探讨[D]. 谈钰蒙. 中国中医科学院, 2021(02)
- [2]lncRNA-m433s1作为miR-433分子海绵调控雄性大鼠腺垂体FSH分泌机制的研究[D]. 韩东旭. 吉林大学, 2021(01)
- [3]培元补肾安胎方治疗RSA的临床研究及基于内膜衰老的药物机制研究[D]. 奚婷. 北京中医药大学, 2021(01)
- [4]肿瘤代谢物乳酸诱导B细胞分化为Breg样细胞的分子机制[D]. 林杉. 吉林大学, 2021(01)
- [5]基于巨噬细胞亚型分析探讨猪苓多糖对膀胱癌肿瘤微环境的作用[D]. 贾文玉. 广州中医药大学, 2021(02)
- [6]溃疡性结肠炎“以痈论治”策略的临床疗效及机制研究[D]. 陈晨. 辽宁中医药大学, 2021(02)
- [7]氨来呫诺通过靶向抑制脂多糖活化巨噬细胞中的磷酸二酯酶4B发挥抗炎作用[D]. 韩宜芯. 北京协和医学院, 2021(02)
- [8]女贞子免疫增强活性成分分离鉴定及作用机制研究[D]. 刘佳. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [9]TRIB3调控急性早幼粒细胞白血病脂代谢异常及促进MYC驱动淋巴瘤进展的作用及机制研究[D]. 杨兆娜. 北京协和医学院, 2021(02)
- [10]H2O2诱导HT22细胞损伤后的分泌蛋白和外泌体介导的分子防御机制[D]. 张佳佳. 兰州大学, 2021(12)