一、内部核糖体进入位点控制人癌胚抗原与共刺激分子B7-1的表达（论文文献综述）
陈秦俊杰[1]（2021）在《环状RNA ACTN4促进肝内胆管癌进展的机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景和目的肝内胆管癌（Intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC）是发病率仅次于肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）的一种高度恶性的肝脏恶性肿瘤,其特点是发病隐匿,侵袭性高,患者就诊时往往已处于疾病的中晚期阶段,此时绝大多数患者已经失去手术治疗的机会,故ICC患者整体预后极差。近几十年来,ICC的发病率在全球范围内逐渐升高,其常见的主要危险因素包括:肝内胆管结石、原发性硬化性胆管炎、肝血吸虫病、肝硬化、胆管囊肿、Caroli病、乙肝病毒感染、丙肝病毒感染、肥胖和吸烟等。ICC目前仍缺乏有效的治疗手段,手术切除是最有效的治疗方法,但由于ICC患者接受手术治疗的比例较低加之术后高复发率,导致ICC患者5年总体生存率低于10%。环状RNA（CircRNAs）是生物体内一类含量丰富、多样且保守的新型非编码RNA分子,它们是由前体m RNA通过直接的反向拼接或由外显子跳跃环化产生。目前绝大多数circRNAs被认为可以充当分子海绵,即通过吸附细胞内的mi RNAs来实现对下游基因的调控。另外,还有少部分circRNAs可以与RNA结合蛋白（RNA-binding protein,RBP）相互作用,从而改变下游基因的转录水平。甚至有极少一部分circRNAs可以作为蛋白质翻译的模板产生小分子多肽和蛋白。越来越多的研究表明circRNA分子在人类疾病中起着重要的调控作用,人们已经发现异常表达的circRNA分子与多种癌症的进展和预后都有着密切的关系。然而,目前鲜有研究详细地报道circRNA分子在ICC疾病的发生、发展过程中的作用和机制。鉴于此,本研究基于基因芯片测序技术寻找在ICC中发生显着性上调的circRNA分子,并通过一系列分子生物学实验技术探索circRNA分子在ICC发生、发展中的作用。方法1.病人的临床资料和组织样本本研究回归性收集了从2016年3月至2017年8月在上海东方肝胆外科医院接受肝脏切除手术的67例ICC患者的临床病理资料,同时也获取这67例患者术中的新鲜冰冻癌组织及其对应的邻近正常肝脏组织。2.寻找ICC中显着性高表达的环状RNA分子随机选取上述标本中的7对组织按照Arraystar公司的Human circRNA Array（v2版本）指南对癌与癌旁组织之间的circRNAs进行差异表达分析,并最终筛选出在ICC肿瘤中显着性高表达的目标分子,即circACTN4。3.探索circACTN4的表达水平与ICC患者预后的关系通过受试者工作特征曲线（Receiver operating characteristic curve,ROC）确定剩余60个ICC患者中circACTN4表达量的最佳临界值,并把这些患者分为circACTN4高和低表达两组。生存曲线分析采用Kaplan-Meier（KM）法和对数秩（log-rank）检验。Cox风险比例回归模型用于探索影响患者预后的危险因素。4.功能实验验证circACTN4对肝内胆管癌细胞的增殖和侵袭能力的影响通过CCK-8实验、克隆形成实验、Transwell实验以及内皮小管形成实验来测定circACTN4对肝内胆管癌细胞的增殖和侵袭能力的影响。通过向雄性BALB/c裸鼠（4-6周龄）皮下注射FRH0201细胞建立皮下成瘤模型,还通过向6周大的雄性BALB/c裸鼠的鼠尾静脉注射FRH0201细胞建立小鼠的肝内胆管癌肺转移模型,借此判断circACTN4在体内对胆管癌细胞增殖和转移能力的影响。5.CircACTN4过表达后进行测序寻找ICC中发生显着性变化的基因通过过表达质粒实现RBE细胞中circACTN4的高表达,然后通过过表达基因测序获得癌细胞中发生显着性差异表达的基因谱,随后通过GO和KEGG分析进一步缩小范围,寻找目标基因。最后通过q RT-PCR,Western blot实验以及Ch IRP（Chromatin isolation by RNA purification）实验等进一步探索上述显着性变化的目标基因与circACTN4的关系。6.CircACTN4与RBP互作在circACTN4的下拉实验（Pull down）中,我们将肝内胆管癌细胞裂解物与提前合成的生物素标记探针共同孵育,然后通过与链霉亲和素磁珠结合沉淀上述细胞裂解物中的相应蛋白。随后,我们对沉淀下来的蛋白质分别进行液相色谱-质谱（Liquid chromatograph-mass spectrometer,LC-MS）/（Mass spectrometer,MS）质谱分析,以及后续的免疫共沉淀实验、RNA免疫沉淀（RNA immunoprecipitation,RIP）实验、RNA的凝胶迁移或电泳迁移率实验（Electrophoretic mobility shift assay,EMSA）等并最终筛选出目标RBP分子。7.寻找CircACTN4与RBP共同作用的下游基因通过Ch IP-seq技术寻找目标RBP结合的下游靶基因谱,然后将上述circACTN4过表达测序结果与Ch IP-seq测序的结果取交集获得CircACTN4与RBP共同作用的下游基因。8.CircACTN4充当mi RNA的分子海绵为了寻找能与circACTN4结合的mi RNA分子,我们通过使用Circular RNA interactome数据库（https://circinteractome.nia.nih.gov/index.html）,Starbase数据库（http://starbase.sysu.edu.cn/index.php）和Circbase数据库（http://circbase.org/）进行预测。随后经过RT-PCR,Western blot,RIP和荧光素酶报告基因实验,我们最终确定与circACTN4结合的mi RNA分子。结果1.根据circRNA基因芯片测序的结果,我们共获得202个在ICC癌组织中显着性上调（Fold change≥2.0,P value≤0.05）的circRNA分子。我们选取log2（Fold change）值最大的前7个circRNA分子,接着通过细胞的功能验证以及数据库的比对,最终确定hsa＿circ＿0050898作为我们的目标RNA分子,因为hsa＿circ＿0050898来源于其母基因ACTN4,因此我们命名它为circACTN4。2.ICC患者中,circACTN4的高表达是影响ICC患者预后的独立危险因素,KM曲线分析结果显示ICC患者中高表达的circACTN4与更差的总体生存（Overall survival,OS）和更高的术后肿瘤复发率均显着性相关。3.体外功能实验,如平板克隆实验、Transwell实验和小管形成实验的结果表明ICC细胞中circACTN4的高表达能够显着性增强肿瘤细胞的增殖、转移和侵袭的能力。体内动物实验模型结果也发现敲降circACTN4的表达能够显着性地缩小皮下肿瘤的体积及小鼠肺组织转移癌灶的数目。4.CircACTN4的三次过表达测序结果发现在RBE细胞中共计103个基因出现显着性差异表达,这些基因的GO分析发现在分子功能中参与“转录因子活性、结合（Transcription factor activity,protein binding）”的基因数目和比例较高;另外,KEGG分析发现Hippo通路和Wnt通路相关的部分基因在circACTN4过表达后都出现明显的变化。我们对其中的FZD7基因十分感兴趣,并通过PCR和Western blot实验证实FZD7确实在circACTN4过表达后发生显着性上调。随后的Ch IRP实验证明circACTN4能够富集在FZD7上游启动子区域,说明circACTN4与FZD7的起始转录密切相关。5.下拉实验结果发现19种蛋白能够与circACTN4发生特异性结合,随后的蛋白质互作分析（Protein-protein interaction,PPI）发现YBX1因其高度中心性并且与其他基因直接互作而成为我们关注的焦点。随后的一系列细胞功能及组织样本验证最终确认circACTN4能够与YBX1蛋白互作。6.通过Ch IP-seq实验,我们发现YBX1可结合在上游启动子区域的靶基因数目为631个。随后,我们将Ch IP-seq实验结果和上述过表达测序的103个基因取交集最终只得到FZD7和LRP1。接着,通过Ch IP-q PCR实验再次确认在ICC细胞中,YBX1的下游靶基因是FZD7,因为YBX1可以在FZD7上游启动子区域被富集,且这一区域与circACTN4的结果一致。最终,通过一系列的实验我们证实circACTN4通过招募YBX1共同作用于下游的FZD7基因并促进其转录。7.CircACTN4过表达测序结果已经提示Hippo通路中YAP1基因在ICC中发生显着性上调。因此,我们想探索circACTN4作为分子海绵调控相关mi RNA分子及其相应的下游YAP1基因的可能性。于是我们进一步通过Starbase和Circbase数据库预测得到12个既能与circACTN4又能与YAP1相互作用的候选mi RNA分子。经过TCGA数据库和功能验证实验的筛选,我们最终发现只有mi R-424-5p可以同时和circACTN4以及YAP1发生结合。荧光素酶报告基因和RIP实验结果也证实circACTN4在ICC中可以通过吸附mi R-424-5p上调YAP1基因的表达。结论CircACTN4在ICC中显着性高表达并且与患者术后长期预后差密切相关。体内、外功能实验结果表明circACTN4能够促进癌细胞的增殖、转移和侵袭。机制研究发现circACTN4通过招募YBX1共同启动FZD7的转录,进而促进ICC的进展和恶化,另外,circACTN4还可以充当mi R-424-5p的分子海绵上调YAP1的表达,进而促进肿瘤的发展。我们的结果提示circACTN4可以作为ICC的一个潜在的预后指标和治疗靶点。
彭妍钰[2]（2021）在《Hsa＿circ＿0005230/miR-1299/RHOT1轴对胃癌病理生物学行为的影响及机制研究》文中研究表明背景与目的环状RNA（circular RNA,circRNA）是一种闭合呈环状特殊结构的非编码RNA。研究发现它具有多种生物学功能。作为ce RNA之一,它可吸附miRNA继而影响mRNA的转录;结合RBPs（RNA结合蛋白）参与转录表达或翻译。miRNA是一类长度约为22个核苷酸组成,广泛参与基因转录后调控的非编码小RNA。miRNA本身不具备编码功能,它主要通过与靶基因完全或不完全配对结合,从而发挥调控功能。mRNA作为信使RNA在肿瘤的发生发展中发挥着多重作用。RBPs可参与circRNA的形成,对circRNA的生物发生、定位、拼接和折叠、促进表达稳定中发挥作用。EMT是肿瘤细胞侵袭转移造成扩散的根源之一。在EMT（Epithelial-Mesenchymal Transition上皮间质转化）表型转化中,非编码RNA可以通过表观遗传学控制肿瘤相关基因的表达而影响肿瘤细胞增殖和转移生物学行为。本研究旨在发现并探讨肿瘤相关基因及其对胃癌病理生物学行为的影响。通过对胃癌发生和侵袭转移等机制的深入研究,为胃癌早期诊断及预后评估提供理论依据支持;为寻求个性化的精准治疗靶点提供理论基础。研究方法:1、常规培养人永生化正常胃粘膜上皮细胞系GES-1及人胃癌细胞系SGC-7901、BGC-823、AGS、HGC-27和MKN-45,手术切除的新鲜胃癌组织及配对远癌正常胃粘膜组织共130例均收集自中国医科大学附属第一医院胃肠肿瘤外科,提取total RNA后反转录cDNA,应用qRT-PCR法检测胃癌细胞和组织中hsa＿circ＿0005230的相对表达。分析胃癌组织中hsa＿circ＿0005230的表达与各临床病理因素间的关系。2、合成siRNA,在AGS和HGC-27胃癌细胞系中构建沉默hsa＿circ＿0005230表达的功能细胞系。采用CCK-8实验和平板克隆形成实验评估沉默hsa＿circ＿0005230对胃癌细胞的增殖能力影响;采用流式细胞术评估沉默hsa＿circ＿0005230对胃癌细胞的细胞周期变化的影响;采用划痕愈合实验及transwell迁移实验评估沉默hsa＿circ＿0005230对胃癌细胞迁移能力的影响;采用transwell侵袭实验评估沉默hsa＿circ＿0005230对胃癌细胞的侵袭能力的影响。采用Western Blotting检测沉默hsa＿circ＿0005230后胃癌细胞中EMT相关蛋白的表达变化。3、通过生信网站Circinteractome预测hsa＿circ＿0005230可海绵吸附miR-1299,应用qRT-PCR检测GES-1及五大胃癌细胞系和33例胃癌组织及其配对正常胃粘膜组织中miR-1299的表达情况,通过相关性分析明确hsa＿circ＿0005230与miR-1299在胃癌组织中的表达关系。利用Kaplan-Meier Plotter网站中胃癌数据库对miR-1299做生存分析。利用miRWalk和Target Scan网站对miR-1299结合的下游mRNA做预测。应用qRT-PCR检测GES-1及五大胃癌细胞系和51例胃癌及其配对正常胃粘膜组织RHOT1 mRNA表达量,分析胃癌组织RHOT1 mRNA表达水平与临床病理因素间的关系。基于hsa＿circ＿0005230、miR-1299和RHOT1 mRNA在胃癌组织中的表达水平分析三者之间的相关性;qRT-PCR检测沉默hsa＿circ＿0005230后miR-1299和RHOT1 mRNA表达水平的变化。利用双荧光素酶报告基因实验验证miR-1299与RHOT1之间是否有结合位点特异性结合。应用Western Blotting检测49例新鲜胃癌及其配对正常胃粘膜组织RHOT1蛋白表达水平;应用免疫组化染色法检测155例胃癌组织的RHOT1蛋白表达并分析其与临床病理因素之间的关系。4、通过Starbase网站预测与hsa＿circ＿0005230有潜在结合位点的RBP FUS。应用qRT-PCR检测GES-1及五大胃癌细胞系和32例人胃癌组织及其配对正常胃粘膜中FUS mRNA的表达水平。分析FUS mRNA与hsa＿circ＿0005230和RHOT1mRNA之间的表达相关性。分析胃癌组织中FUS mRNA表达水平与各临床病理因素间的关系。5、实验数据应用SPSS 22.0和Graph Pad Prism 8.0.2软件进行统计分析和作图。计量资料以mean士SD表示,两组间比较采用配对t检验;计数资料采用卡方检验,生存分析采用Kaplan-Meier分析并进行Log-rank检验,相关性分析采用spearman相关性检验,P<0.05时差异有统计学意义。结果:1、qRT-PCR法检测结果显示,与GES-1细胞系相比,hsa＿circ＿0005230在五大人胃癌细胞系中表达显着上调;与配对正常胃粘膜组织相比,hsa＿circ＿0005230在130例胃癌组织中表达上调（P=0.0477）。胃癌组织中hsa＿circ＿0005230表达水平与临床病理因素中胃癌的组织学分级（X2=4.186,P=0.014）、淋巴结转移（X2=7.754,P=0.021）和pTNM分期密切相关（X2=7.486,P=0.006）;其中在淋巴结转移因素亚组分析中,淋巴结转移数量较多亚组（N2-3）高表达率显着高于无淋巴结转移组（N0）（X2=4.873,P=0.027）。其他临床病理因素如性别、年龄、肿瘤大小、大体分型、WHO分型、Lauren分型、浸润深度、远处转移以及发病部位等与hsa＿circ＿0005230表达无关。2、本研究合成的siRNA片段可有效沉默hsa＿circ＿0005230。沉默hsa＿circ＿0005230后CCK-8实验结果显示胃癌细胞的增殖能力明显受到抑制;沉默hsa＿circ＿0005230后平板克隆形成实验结果显示胃癌细胞克隆形成能力明显减弱;沉默hsa＿circ＿0005230后流式细胞术实验显示胃癌细胞的细胞周期阻滞在G0/G1期。沉默hsa＿circ＿0005230后划痕愈合实验结果显示胃癌细胞迁移能力减弱,细胞划痕愈合率降低。Transwell迁移实验结果显示,沉默hsa＿circ＿0005230后胃癌细胞的迁移能力明显减弱。Transwell侵袭实验结果显示,沉默hsa＿circ＿0005230后胃癌细胞的侵袭能力明显减弱。沉默hsa＿circ＿0005230后Western blotting检测EMT通路主要蛋白的表达变化结果可见:与si-NC组相比,转染si-hsa-circ5230后上皮表型蛋白E-cadherin表达上调,同时间质表型的蛋白N-cadherin、Vimentin、Snail表达均下调。3、与正常胃粘膜上皮细胞GES-1相比,miR-1299在胃癌细胞系中表达显着下调;RHOT1 mRNA在胃癌细胞系中表达显着上调。与配对正常胃粘膜组织相比,miR-1299在33例胃癌组织中表达下调（P=0.0179）,RHOT1 mRNA在51例胃癌组织中表达上调（P=0.045）。胃癌细胞中沉默hsa＿circ＿0005230后miR-1299表达上调,RHOT1 mRNA表达下调。胃癌组织中hsa＿circ＿0005230与miR-1299表达呈负相关（P=0.0228,r=-0.4078）;miR-1299与RHOT1表达呈负相关（P=0.0237,r=-0.4053）;hsa＿circ＿0005230与RHOT1 mRNA表达呈正相关（P=0.0044,r=0.4971）;hsa＿circ＿0005230/miR1299/RHOT1轴分子之间在表达相关性上成立。双荧光素酶报告基因实验证实RHOT1与miR-1299之间有特异性结合位点。4、胃癌组织中RHOT1 mRNA表达水平与胃癌临床病理因素中淋巴结转移（X2=6.708,P=0.035）和pTNM分期（X2=8.209,P=0.042）相关,其中在淋巴结转移亚组分析中,与无淋巴结转移亚组（N0）相比,淋巴结转移数量较多组（N3）RHOT1 mRNA高表达率显着增加（X2=4.297,P=0.038）。胃癌其他临床病理因素如性别、年龄、大体分型、组织学分级、WHO分型、Lauren分型、浸润深度、远处转移以及发病部位等与RHOT1 mRNA表达水平无关。5、RHOT1蛋白定位于胞质,在胃癌组织中表达上调;与正常胃粘膜相比,RHOT1蛋白在胃癌组织表达阳性率显着升高（P<0.01）。对155例胃癌组织RHOT1蛋白表达与临床病理因素分析中发现:胃癌中RHOT1蛋白表达与组织学分级（X2=7.045,P=0.03）、Lauren分型（X2=8.861,P=0.012）、浸润深度（T）（X2=6.534,P=0.038）、淋巴结转移（N）（X2=5.929,P=0.015）和pTNM分期（X2=14.74,P<0.01）等临床病理因素相关。在Lauren分型亚组中,弥漫型胃癌组织RHOT1蛋白高表达较肠型的显着增多（X2=5.397,P=0.02）;混合型胃癌组织的RHOT1蛋白高表达与肠型的相比也显着增多（X2=8.607,P=0.003）;浸润深度（T）亚组分析中,浸润深度T4的RHOT1蛋白高表达率比浸润深度T3的显着增多（X2=4.958,P=0.026）。而其他病理因素如性别、年龄、肿瘤大小、大体分型、WHO分型、远处转移以及发病部位等与胃癌RHOT1蛋白表达无关。6、胃癌患者miR-1299的生存分析提示:按最佳cutoff值将胃癌患者分为miR-1299低表达组和高表达组,当突变负荷低时,miR-1299高表达的胃癌患者总生存时间（38.43个月）较低表达组（17.77个月）延长（P=0.014）,患者预后较好;而突变负荷高时两组表达无明显差异。在GEO数据库的GSE29272数据集中进行RHOT1 mRNA预后生存分析,纳入592例有效病理资料,依据表达中位值分为RHOT1 mRNA高表达组和低表达组,结果显示:RHOT1 mRNA低表达组总生存时间（28.7个月）较高表达组生存时间（20.6个月）明显增多,预后较好（P=0.0035）。7、预测FUS作为hsa＿circ＿0005230的RBP可能通过影响hsa＿circ＿0005230/miR-1299/RHOT1轴调控EMT通路影响胃癌的病理生物学行为。结论:1、Hsa＿circ＿0005230在胃癌细胞系和组织中表达上调,与组织学分级、淋巴结转移和pTNM分期相关,提示hsa＿circ＿0005230有望成为潜在的肿瘤标记物,为提高胃癌诊断水平,准确评估预后,为寻找个性化治疗靶点提供理论基础。2、沉默hsa＿circ＿0005230后可显着抑制胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力,逆转EMT表型变化,提示胃癌中差异表达的hsa＿circ＿0005230可影响胃癌细胞的恶性生物学行为。3、胃癌组织和细胞中RHOT1在mRNA及蛋白水平上均表达上调,与淋巴结转移和pTNM分期相关;胃癌细胞中上调表达的hsa＿circ＿0005230可调控miR-1299/RHOT1轴通过EMT表型通路影响胃癌的侵袭转移行为。这提示RHOT1和miR-1299有望成为胃癌患者治疗的新靶标,为有效控制胃癌提供精准治疗。4、FUS mRNA在胃癌组织和细胞中表达上调,且与淋巴结转移和pTNM分期临床病理因素相关,患者预后生存差。FUS作为RBP可能在上游作用于hsa＿circ＿0005230,进而影响其对胃癌的病理生物学行为。
潘超虎[3]（2020）在《干扰素诱导基因BACH1缺失促进溶瘤病毒HSV-1抗肿瘤免疫应答的机制研究》文中进行了进一步梳理癌症是严重威胁世界人口健康的重大公共卫生问题,近年来癌症的发病率和死亡率逐年上升,已经成为疾病死亡的最主要原因。目前随着癌症免疫疗法的发展,部分患者的生存期得到延长而且生活质量也得到明显提高。但是癌症免疫疗法对肿瘤微环境中淋巴细胞浸润少的患者疗效不显着。而溶瘤病毒由于其独特的抗肿瘤特性能显着改变肿瘤微环境,促进肿瘤微环境中淋巴细胞的浸润。2015 年 FDA 批准了第一款溶瘤病毒 talimogene laherparepvec（T-VEC）用于治疗黑色素瘤患者,但是其持久应答率为1 6%,有待提高。T-VEC是以HSV-1为骨架改造而成,而HSV-1对干扰素十分敏感。为了进一步提高T-VEC的治疗效果,我们对抗HSV-1的干扰素诱导基因进行筛选并阐明其抗HSV-1的机制,同时进一步研究该干扰素诱导基因对HSV-1抗肿瘤免疫反应的影响。首先我们在HEK293T细胞中分别过表达288个干扰素诱导基因,然后再感染HSV-1-luc,通过检测luciferase的表达,我们发现有8个干扰素诱导基因能显着抑制HSV-1的复制。其中由于BACH1首次被报道具有抗病毒功能,而且临床上有降低BACH1表达的药物Panhemin,因此我们挑选BACH1做进一步研究。接下来我们在HEK293T、MEF、MCA205和B16细胞中降低BACH1的表达,之后再感染HSV-1-luc。通过检测HSV-1基因组拷贝数,我们发现BACH1缺失后HSV-1在细胞中的复制增加。由于血红素Hemin能促进BACH1泛素化修饰进而被蛋白酶体降解,从而降低BACH1在细胞内的水平。当我们用Hemin处理细胞后,结果发现HSV-1的复制增加。作为转录调节因子,BACH1抗HSV-1不依赖MAFK,而是通过结合到HSV-1基因ICP4、ICP27和UL39的启动子上并抑制这些基因的转录。在小鼠移植瘤模型中,我们发现在肿瘤细胞中敲除BACH1能促进HSV-1在小鼠肿瘤内的复制。同时敲除BACH1后再瘤内注射HSV-1能进一步抑制肿瘤生长,促进CD45+CD8+T淋巴细胞的浸润。BACH1缺失促进HSV-1的抗肿瘤免疫应答是由于BACH1缺失能促进HSV-1瘤内扩展,增加肿瘤免疫原性。当我们在BACH1敲除的MCA205细胞系中感染HSV-1后,结果发现BACH1缺失能促进HSV-1诱导的细胞凋亡、HMGB1的分泌和钙网蛋白的外露。进一步我们在小鼠肿瘤模型中用Hemin处理小鼠,结果发现Hemin处理能增加HSV-1在小鼠肿瘤内的复制。当我们将Hemin处理和HSV-1治疗联合使用时,发现肿瘤的生长显着减缓,而且CD45+CD8+T淋巴细胞的浸润也显着增加。综上所述,我们的研究系统筛选了抗HSV-1的ISGs,并阐明BACH1抗HSV-1的机制,而且敲除BACH1能增加HSV-1诱导的肿瘤免疫原性和抗肿瘤免疫反应,更重要的是Hemin处理和HSV-1联合使用能促进T淋巴细胞浸润并抑制肿瘤生长。因此该研究为临床上提高溶瘤病毒T-VEC的治疗效果提供了新的思路和应对策略。
王斌[4]（2020）在《猪肠道冠状病毒细胞受体及毒力因子研究》文中提出冠状病毒具有广泛的天然宿主,可感染人类、畜、禽和其他脊椎动物,且具有跨物种传播能力。感染猪肠道的冠状病毒主要有甲型冠状病毒属的猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）、猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）和猪甲型肠道冠状病毒（Swine enteric alphacoronavirus,SeACoV）以及丁型冠状病毒属的猪丁型冠状病毒（Porcine deltacoronavirus,PDCoV）。目前对养猪业危害最为严重的猪肠道冠状病毒为PEDV和PDCoV。本研究系统地进行腹泻样品病毒鉴定、病毒分离、病毒入侵的细胞受体研究以及通过建立病毒反向遗传操作系统探究病毒关键致病基因,以期能够更全面深入地了解猪肠道冠状病毒入侵和致病机制,为疾病防控和疫苗研发提供参考和理论依据。本研究首先对浙江某猪场临床腹泻样品进行病原鉴定,以猪肠道冠状病毒特异性检测引物,通过RT-PCR对腹泻样品核酸进行检测,结果显示该腹泻样品只有PDCoV核酸检测阳性,TGEV、PEDV及SeACoV均为核酸阴性。随后通过LLC-PK1细胞成功地从腹泻样品中分离出病毒,经过病毒基因组cDNA扩增、序列比对及PDCoV结构蛋白抗体的IFA鉴定,确定从腹泻样品中分离出的病毒为PDCoV。将PDCoV全基因组序列与GenBank中已公布的其他毒株序列进行进化树分析发现,本研究获得的PDCoV为中国株。其S基因与CH-WH-2017（MK040451）同源性最高。全基因组重组分析发现该毒株非结构蛋白基因可能来自 CHJXNI2/15（KR131621.1）与 CHN-HG-2017（MF095123.1）重组演化。随后本研究对PDCoV病毒入侵细胞的受体进行研究。通过推测并验证PDCoV S蛋白S1结构域能够通过猪氨基肽酶N（Porcine aminopeptidaseN,pAPN）结合到PDCoV易感细胞膜上,且可溶性pAPN蛋白能够阻断这种结合,体内外实验证实PDCoVS1蛋白能够与pAPN蛋白相互作用。外源表达pAPN蛋白能够介导PDCoV对非易感细胞的入侵和病毒增殖,产生的子代病毒同样具有感染能力。pAPN蛋白敲低实验进一步证实PDCoV对易感细胞的感染能力与细胞pAPN表达量呈正相关,表明pAPN能够作为PDCoV细胞受体介导病毒入侵感染。pAPN蛋白敲除实验则显示,易感细胞pAPN蛋白完全缺失后,仍然有少量PDCoV感染,说明除pAPN外,还存在有其他受体蛋白。为更好地研究猪肠道冠状病毒致病性,本研究尝试建立PDCoV病毒反向遗传操作系统。分段扩增病毒全长基因组,利用人工染色体组载体系统（BAC）为载体,通过同源重组方式将病毒全长基因组克隆到载体上,成功构建病毒全基因组感染性克隆质粒。通过转染细胞,在转染代细胞和感染第一代细胞均检测到病毒结构蛋白表达。至此,PDCoV反向遗传操作技术平台基本建立。以同样的感染性克隆构建方法和病毒拯救技术,本研究成功建立猪肠道冠状病毒PEDV的反向遗传操作系统。基于该系统,本研究对PEDVORF3基因及S蛋白C端7个氨基酸编码基因分别及同时进行缺失,成功获得基因修饰病毒,随后通过仔猪攻毒试验研究病毒致病性变化。实验结果发现ORF3及S蛋白C端7个氨基酸分别缺失均能一定程度致弱病毒,共同缺失后病毒致弱效果更为显着。随后本研究通过高致病性基因Ⅱ型PEDVS基因替换为低致病性基因Ⅰ型S基因的嵌合病毒仔猪致病性实验,证实病毒S基因为影响病毒毒力的关键基因,同时S基因以外的病毒基因同样会在病毒毒力中发挥作用。综上所述,本研究从分子病毒学水平研究了猪肠道冠状病毒细胞入侵和致病机制。成功分离获得一株猪肠道冠状病毒,并鉴定出其细胞入侵受体,通过建立反向遗传操作系统,证实猪肠道冠状病毒S基因是影响病毒毒力的主要因素。
牛越群[5]（2020）在《Linc00673/miR-150-5p/ZEB1轴在非小细胞肺癌中的调控功能及预后价值研究》文中研究表明背景与目的:肺癌是全球人口中发病率最高的肿瘤性疾病,也是导致癌症相关死亡的最主要原因之一。肺癌的转移是导致患者预后不佳的重要因素,而上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）是肺癌转移过程中的关键事件。既往有许多研究报道了长链非编码RNA（long noncoding RNA,lnc RNA）在包括非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）在内的多种肿瘤中发挥重要的调控作用。本研究旨在探索lnc RNA linc00673在NSCLC中对细胞增殖、迁移、侵袭能力以及EMT过程的调控功能及其在NSCLC中的预后价值,并进一步探索其发挥调控功能的分子机制。方法:采用CCK-8实验和EdU实验检测细胞的增殖能力;采用划痕实验和Transwell侵袭实验分别检测细胞的迁移能力和侵袭能力;实时荧光定量PCR被用于检测各种RNA分子的表达水平和EMT标志物的转录水平;蛋白免疫印迹实验和免疫荧光实验被用于检测EMT标志物的蛋白表达情况。采用双荧光素酶报告基因实验检测微小RNA（micro RNA,miRNA）与靶基因的互作情况。小鼠肺癌移植瘤实验被用于检验linc00673在动物体内对肿瘤形成的调控能力。采用生物信息学和循证医学的方法分析linc00673/miR-150-5p/ZEB1轴在NSCLC中的预后价值。结果:Linc00673可以促进NSCLC细胞的增殖、迁移、侵袭能力以及EMT过程,敲降linc00673表达水平显着逆转了由TGF-β诱导产生的EMT,而且也显着抑制了NSCLC移植瘤在小鼠体内的生长。Linc00673可以靶向结合miR-150-5p,过表达miR-150-5p后显着抑制了linc00673的表达水平,而抑制miR-150-5p则可以显着上调linc00673的表达水平,在双荧光素酶报告基因实验中我们也得到了相同的结论。同时,miR-150-5p可以靶向结合EMT关键转录因子ZEB1 m RNA的3’端非翻译区并抑制其表达,因此linc00673可以通过以内源竞争性RNA（competing endogenous RNA,ce RNA）的形式抑制miR-150-5p在细胞内的表达水平从而间接解除其对ZEB1的抑制作用,促进NSCLC中EMT的发生。此外,linc00673高表达提示NSCLC患者预后不佳,而miR-150-5p高表达则与NSCLC患者预后良好相关。在对ZEB家族成员的预后价值分析中,我们共筛选得到5项队列研究并对其报道的结果进行了合并,发现ZEB1高表达也与NSCLC患者的不良预后显着相关。结论:Linc00673以ce RNA的形式靶向结合miR-150-5p,间接上调ZEB1的表达水平,促进NSCLC细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT发生。Linc00673和ZEB1高表达提示NSCLC患者预后不佳,miR-150-5p高表达则与患者预后良好相关。综上,linc00673/miR-150-5p/ZEB1轴在非小细胞肺癌中发挥了关键的调控功能并且具有重要的预后价值。
王伟[6]（2019）在《蛋白质芯片在肿瘤标志物筛查中的应用以及利用SELEX技术筛选CD20/486的ssDNA适配体的研究》文中研究指明目的:肿瘤的快速筛查和治疗是当前医学界的难题,本研究旨在利用高灵敏度化学发光蛋白质芯片技术（iPDMS蛋白芯片）,实现对低丰度的多种肿瘤相关标记物的高效筛选。分析筛选所得到的多种肿瘤相关性标志物,选择其中在8种常见肿瘤细胞中差异表达的CD20作为研究对象,设计和筛选CD20核酸适配体,探讨其检测肿瘤作用,为进一步利用CD20适配体在临床肿瘤靶向治疗奠定基础。方法:1.iPDMS芯片的制备和检测:在传统的聚二甲基硅氧烷（PDMS）材料中加入带烯烃末端的、表面引发聚合反应的引发剂,并通过热交联（硅氢键键合）固定到PDMS的三维结构中,得到一种新的材料即改性硅胶iPDMS。通过表面引发的原子转移自由基聚合反应（SI-ATRP）从活性引发位点处合成poly（OEGMA）高分子刷,即能得抗蛋白质非特异性吸附的iPDMS材料,利用喷点打印技术将肿瘤相关的抗原高通打印于芯片的特定区域,并组装成48孔的iPDMS芯片微孔板。应用iPDMS芯片对1152例临床常见肿瘤患者和192例体检健康者进行了两轮芯片筛查,检测血清样本的肿瘤相关的自身抗体。2.CD20核酸适配体的筛选:通过指数富集的配基系统进化技术（Systematic evolution ofligands by exponential enrichment,SELEX）筛选获得特异性和高亲合力结合肿瘤细胞表面分子标志CD20（Cluster of Differentiation,CD20）主要膜外区和胞质区片段CD20/486的ssDNA适配体（apatmers）,检测和分析所筛选的CD20/486适配体的序列和构象;适配体与靶分子的结合能力以及病理组化染色中的应用,为进一步利用CD20/487适配体在临床肿瘤靶向治疗和诊断奠定基础。本研究先在基因库中查找到人源的CD20基因全序列,找到包括全部膜外区序列的近C端486bp的核苷酸序列,根据密码子简并性将部分密码子进行修改,使之能在原核中表达,再将CD20/486构建到pGEX-4T中,融合表达GST-CD20/486蛋白。运用SELEX技术对融合表达的GST-CD20/486蛋白进行筛选,并用GST蛋白进行反筛。实验首先构建一个长度为80bp含有40个随机序列的单链DNA（ssDNA）文库,PCR扩增为双链DNA（dsDNA）随机文库后,作为初始模板保存,用不对称PCR扩增出每轮筛选的ssDNA随机库作为下一轮筛选适配体库。经10轮筛选后,将ssDNA扩增成dsDNA,连接到T载体上,测序后利用DNAMAN软件对所测定的序列进行序列一级结构和二级结构分析及同源性比较;酶联免疫吸附法（ELISA）方法检测单适配体与纯化的GST-CD20/486蛋白结合能力,流式细胞仪（FCM）检测单适配体与GST-CD20/486蛋白的亲和力。将亲和力最大的适配体用生物素标记后,用于临床肿瘤病理标本组化染色,用SABC试剂显色,同时做常规HE染色作为对照,确定筛选所得到的适配体用于肿瘤诊断的效果。结果:1.建立了用于肿瘤筛查的iPDMS芯片技术方法,检测1152例临床确诊的肿瘤样本,研究发现CD20、VEGF1、VEGF121和VEGF在常见8种肿瘤患者（乳腺癌、肺癌、直结肠癌、胃癌、肝癌、白血病、卵巢癌和淋巴瘤）中差异表达,血清中VEGF1、VEGF121和VEGF对应的抗体水平明显高于体检健康对照组,抗CD20抗体水平明显低于体检健康对照组,两者具有统计学意义（P<0.05）。2.将CD20蛋白C端486bp基因修改后,成功在原核细胞中表达并纯化出GST-CD20/486蛋白,并利用SELEX技术筛选得到特异性结合CD20/486的适配体。将第10轮筛选得到的适配体克隆到T载体得到22个单克隆的测序结果,命名为SW1至SW22,其中单适配体SW11表现出与CD20/486蛋白最强的的结合能力,解离常数（Kd）为28±6nM。3.生物素标记的单适配体SW11能与肿瘤病理切片中的肿瘤细胞CD20结合,CD20适配体在常见肿瘤中免疫组化结果阳性。结论:1.成功构建了一种化学发光标记的iPDMS蛋白芯片,可用于肿瘤相关的抗体或自身抗体的筛查。本研究在常见肿瘤筛查得到的CD20抗体可作为潜在的肿瘤标志物,可为肿瘤的诊断和机理分析提供切入点。2.本研究成功应用SELEX技术筛选得到与GST-CD20/486蛋白特异性结合的ssDNA适配体SW11,有望作为肿瘤检测的新型诊断试剂,并且为进一步进行临床靶向治疗奠定了基础。
史世锋[7]（2019）在《耐药细胞外泌体中miR193对食管癌细胞耐药作用及其机制》文中研究指明引言食管癌是全球第八大常见肿瘤,也是世界癌症相关死亡的最常见原因之一。统计结果显示,我国食管癌患者占全球患者总数的一半以上,男性和女性死亡率都居于全球首位,食管癌的治疗方案包括手术、化疗、放疗等。中晚期食管癌耐药性的产生是阻碍治疗效果的重要因素之一。肿瘤耐药的机制包括:（1）药物外排,减少肿瘤细胞内药物的浓度。（2）细胞凋亡阻滞。（3）DNA损伤修复应答。在肿瘤细胞中,耐药性的产生可能由一种或几种机制共同发挥作用,不同肿瘤细胞中的作用机制不同。外泌体是具有脂质双分子膜的纳米级囊泡,存在于所有体液中。肿瘤细胞分泌的外泌体参与多种细胞功能和生理病理事件。外泌体内容物包括mRNA、miRNA、蛋白质等,这些内容物都具有生物活性,能够在靶细胞中执行功能反应,而外泌体内容物miRNA与食管癌化疗耐药性的作用及其相关机制,目前尚不清楚。本实验通过食管癌细胞株TE1构建食管癌顺铂耐药细胞株TE1/DDP,并研究食管癌耐药细胞株TE1/DDP分泌的外泌体对敏感细胞株TE1顺铂敏感性的影响。通过对外泌体中的miRNA和处理细胞转录组进行高通量测序,利用生物信息学软件进行miRNA和mRNA关联分析,寻找与顺铂化疗耐药相关的miRNA,研究该miRNA对食管癌细胞生物学功能（增殖、凋亡、克隆形成能力、侵袭能力等）的影响,预测相关靶基因,分析其参与食管癌顺铂化疗耐药的机制。第一部分 顺铂耐药细胞外泌体对敏感细胞顺铂耐受性的影响目的构建食管癌顺铂耐药细胞株,研究食管癌顺铂耐药细胞株外泌体对顺铂敏感细胞株的影响。方法1.利用最低耐受浓度的顺铂处理食管癌顺铂敏感细胞株TE1,直至该细胞株对顺铂耐药,命名为TE1/DDP细胞株。2.利用CCK-8试剂盒和流式细胞术检测TE1/DDP细胞株在最低顺铂耐受浓度压力下的细胞活力和凋亡情况。3.利用超速离心法提取外泌体,透射电镜观察和Western blot检测鉴定提取的外泌体。4.通过CCK-8检测耐药细胞株外泌体干预敏感细胞后对顺铂耐受能力的影响。结果1.CCK-8试剂盒和流式细胞术检测结果显示,在IC50浓度（0.7 μg/mL）顺铂压力下,与TE1细胞株相比,TE1/DDP细胞株的活力显着升高（P<0.001）,细胞凋亡显着降低,说明成功构建食管癌顺铂耐药细胞株TE1/DDP。2.在透射电镜下,可以看到食管癌外泌体呈典型的圆形或椭圆形杯状结构,大小为50-200 nm。Western blot检测结果显示,TE1/DDP细胞和TE1细胞外泌体均可以检测到CD63蛋白。3.CCK-8结果显示在添加TE1/DDP的外泌体（浓度:5.32×109/mL）后TE1细胞对顺铂的耐受性显着增加（P<0.05）小结成功构建了食管癌顺铂耐药细胞株TE1/DDP,其外泌体能够使敏感细胞TE1增加对顺铂的抵抗。第二部分影响敏感细胞耐药的外泌体miRNA及靶基因筛选目的通过高通量测序技术,对食管癌顺铂耐药细胞株TE1/DDP和顺铂敏感细胞株TE1中外泌体中的miRNA和耐药外泌体干预后细胞转录组进行测序,寻找与食管癌细胞顺铂耐药相关的miRNA和mRNA,研究其与食管癌患者生存率的关系。方法1.利用超速离心法提取外泌体,总RNA提取试剂盒提取外泌体中的总RNA,构建RNA测序文库进行高通量测序;提取细胞总RNA构建转录组文库,进行转录组测序;2.从测序数据中选取表达量显着差异的miRNAs进行荧光定量PCR验证;3.生物信息学软件关联分析miRNAs和mRNAs,预测与食管癌细胞顺铂化疗耐药的miRNAs。结果1.两组外泌体共有3182个miRNAs共靶标到69540个基因;其中在TE1组中973个miRNAs共靶标到67631个基因,在TE1-DDP组中561个miRNAs共靶标到65885个基因。2.差异表达统计分析结果显示,TE1组和TE1/DDP组的差异miRNAs共有493个,其中189个属于上调miRNAs,304个属于下调的miRNAs。3.TE1组和TE1/DDP组的差异基因共有5155个,其中3446个基因上调,1709个基因下调。4.生物信息学软件对mRNAs和miRNAs进行关联分析结果显示,ESR1基因和TP53基因位于关联分析网络的核心位点,且均与TFAP2C基因相关。5.荧光定量PCR检测结果显示,miRNAs在食管癌中的表达与测序数据中的表达量结果相一致。6.生存曲线分析结果显示,TFAP2C高表达的食管癌患者整体生存率高于TFAP2C低表达的患者;miR193高表达的食管癌患者整体生存率低于miR193低表达的患者。小结TFAP2C基因与食管癌化疗耐药相关,miR193和TFAP2C与食管癌患者的生存率相关。第三部分miR193参与食管癌顺铂化疗耐药的机制研究目的检测TFAP2C和miR193在不同食管癌细胞株中的表达,检测不同食管癌细胞中耐药相关基因的表达,验证TFAP2C和miR193的结合情况,构建TFAP2C过表达和miR193过表达食管癌细胞株;研究TFAP2C和miR193表达量变化对食管癌细胞增殖、侵袭能力、克隆形成能力和凋亡的影响。方法1.利用荧光定量PCR技术和Western blot技术检测TFAP2C和miR193在不同食管癌细胞和外泌体中的表达;2.利用双萤光素酶报告基因检测TFAP2C和miR193的靶向结合;3.利用慢病毒载体构建TFAP2C过表达和miR193过表达食管癌细胞株;4.利用EdU细胞增殖实验、流式细胞术、克隆形成实验、Transwell实验,研究TFAP2C和miR193表达量变化对食管癌细胞增殖、细胞周期、侵袭能力、克隆形成能力和凋亡的影响。5.采用Western blot检测与细胞周期及凋亡相关蛋白的表达水平;6.通过ChIP实验检测TFAP2C与P21基因启动子相互结合;结果1.荧光定量PCR检测结果显示,miR193在TE1细胞株外泌体中的相对表达水平显着低于在TE1/DDP细胞株外泌体中的相对表达水平,P<0.001;miR193在TE1细胞中的相对表达水平显着低于在TE1/DDP细胞中的表达水平（P<0.001）,而加入TE1/DDP细胞株外泌体的TE1细胞（TE1/E）中miR193的相对表达水平显着高于TE1细胞,P<0.01。2.TE1/DDP细胞株中TFAP2C的相对表达水平显着低于TE1细胞株中的相对表达水平（P<0.001）,而加入TE1/DDP细胞株外泌体的TE1细胞中TFAP2C的相对表达水平显着低于TE1细胞（P<0.01）。3.双萤光素酶报告基因检测结果显示,miR193与TFAP2C基因3’-UTR区相结合,提示TFAP2C是miR193的靶基因。4.细胞周期检测结果显示,TE1/DDP细胞株处于细胞周期G0/G1期的比例小于TE1细胞株,而TE1/DDP细胞株外泌体可以部分解除顺铂对食管癌细胞周期的阻滞作用;miR193过表达细胞株处于细胞周期G0/G1期的比例小于miR193过表达对照组,TFAP2C过表达细胞株处于细胞周期G0/G1期的比例大于TFAP2C过表达对照组。5.TE1/DDP细胞株中TFAP2C、TP53和P21基因的相对表达水平较低,EGFR和Cyclin D1基因的相对表达水平较高;而TE1/DDP细胞株外泌体可以改变这些基因在TE1细胞株中的相对表达水平。6.EdU增殖检测结果显示,在顺铂压力下,TE1/DDP细胞株增殖的细胞数显着大于TE1细胞株（P<0.01）;TFAP2C过表达细胞株增殖的细胞数显着小于TFAP2C过表达对照组（P<0.01）;miR193过表达细胞株增殖的细胞数显着高于miR193过表达对照组（P<0.01）。7.克隆形成实验结果显示,与TE1细胞株形成的克隆数相比,TE1/DDP细胞株的克隆形成数显着增多（P<0.01）;与TFAP2C过表达对照组相比,TFAP2C过表达组细胞株的克隆形成数显着降低（P<0.05）;与miR193过表达对照组相比,miR193过表达组细胞株的克隆形成数显着增多（P<0.01）。8.细胞凋亡实验结果显示,与TFAP2C过表达对照组细胞相比,TFAP2C过表达组细胞的凋亡率显着升高;与miR193过表达对照组细胞相比,miR193过表达组细胞的凋亡率显着降低;顺铂压力下miR193过表达组细胞的凋亡率显着高于正常条件下的miR193过表达组细胞。9.细胞侵袭实验结果表明,TFAP2C与miR193表达量变化对食管癌细胞侵袭能力没有显着性影响。10.ChIP实验得到的DNA中扩增获得了 P21启动子区的序列,由此可见TFAP2C能够与P21结合促进细胞周期的阻滞。小结1.TFAP2C基因是miR193调控的靶基因。2.TFAP2C过表达可以显着抑制食管癌细胞增殖、细胞周期和细胞克隆形成能力,促进细胞凋亡。3.TFAP2C能够与P21结合促进细胞周期的阻滞。miR193能够通过TFAP2C调节P21解除细胞周期阻滞。第四部分裸鼠荷瘤验证miR193促进食管癌细胞耐药目的在裸鼠体内移植瘤验证miR193对食管癌肿瘤细胞生长及顺铂敏感性的影响。方法1.将食管癌细胞悬液注射到裸鼠两侧腋下组织,每天观察接种肿瘤的结节生长情况,检测移植瘤在接种后1周、2周、3周、4周时的生长情况;2.所有实验动物均两侧植瘤。首先根据左侧植瘤细胞差异分为三组,右侧统一接种TE1细胞,左侧分别接种TE1、TE1/DDP、TE1/miR193。待两侧可触到明显结节后每组动物随机分为两个亚组进行顺铂干预,并以生理盐水为对照处理。3.生长4周后,颈椎脱臼法处死裸鼠,分离肿瘤实体,并进行拍照、称重、测量体积,做好记录,绘制肿瘤生长曲线。结果1.裸鼠荷瘤实验结果显示,TE1细胞株形成的肿瘤在顺铂压力下的肿瘤体积显着小于对照条件下的肿瘤体积（P<0.05）。2.TE1/DDP细胞株在顺铂压力下形成的肿瘤体积大小与正常对照组相比显着增大（P<0.05）。3.miR193过表达TE1细胞株在顺铂压力下形成的肿瘤体积大小显着小于正常对照组（P<0.05）。4.顺铂干预下,TE1/DDP细胞株形成的肿瘤大小显着大于TE1细胞株形成的肿瘤,miR193过表达TE1细胞株形成的肿瘤大小显着大于TE1细胞株形成的肿瘤。小结顺铂可以抑制食管癌肿瘤的生长,miR193过表达能够促进食管癌肿瘤的生长,增加其对顺铂的抵抗。结论1.食管癌耐药细胞外泌体能够增强顺铂敏感细胞TE1对顺铂的抵抗。2.TFAP2C基因是miR193调控的靶基因。3.TE1/DDP细胞株外泌体可以解除顺铂对食管癌的细胞周期阻滞作用。其机制是miR193的靶基因TFAP2C是P21的转录调节因子。顺铂可以抑制食管癌肿瘤的生长,miR193过表达能够促进食管癌肿瘤的生长,增加其对顺铂的抵抗。
乔雪[8]（2019）在《海南湍蛙肽HN-1抗乳腺癌活性及作用机制研究》文中研究表明近年来癌症的发病率和死亡率呈现逐渐上升的趋势,是威胁人类生命的主要疾病之一。而乳腺癌是女性中诊出率最高的癌症,同时也是威胁女性生命的头号杀手。目前,乳腺癌的治疗手段主要是外科手术和放化疗并辅以其他补充疗法,这些手段有效地提高了乳腺癌女性的生存率,但是由于癌细胞的转移和耐药性的高发,乳腺癌仍是女性中死亡率最高的癌症。化学药物治疗是目前肿瘤治疗中非常重要的分支,传统的化疗药物通常是通过干扰细胞的快速增殖而发挥作用,因此不可避免地产生一些副作用,如诱发系统性毒性,产生药物耐药性等,可见肿瘤的药物治疗期待着新的突破。抗癌肽（Anticancerpeptides,ACPs）即具有抗肿瘤活性的生物活性肽,其广泛存在于多种生物体内,包括哺乳动物、两栖类动物、昆虫、植物和微生物等。相较于传统化学抗癌药物,抗癌肽具有众多优势,如分子量低、结构简单、更高的抗癌活性、高选择性、较少的副作用、多种给药方式、不易引起多药耐药性等。另外,抗癌肽还可以与其他传统癌症治疗方法或抗癌分子联合使用,通常能够提高肿瘤治疗效果。近年来,肿瘤的免疫治疗药剂的兴起在肿瘤药物治疗领域引起了广泛关注,包括细胞因子、抗体类药物等,特别是免疫检查点抑制剂。另外,将免疫治疗药剂与放化疗结合的联合免疫治疗干预也是肿瘤治疗的热门研究方向。本文通过研究抗癌肽HN-1的抗乳腺癌作用机制和免疫调节机理,以期为新型肽类抗肿瘤药物的研发提供一定的基础理论依据。具体研究成果如下:（1）HN-1具有体内外的抗肿瘤活性并且毒性较小。实验中通过对HN-1的体外抗肿瘤作用筛选,发现HN-1对多株癌细胞具有不可逆的杀伤作用,其中对MCF-7细胞最为敏感,并且对阿霉素抗性的乳腺癌细胞MCF-7/ADR也有显着的抑制作用,但是HN-1对正常细胞的毒副作用却很小。不仅如此,HN-1显着性抑制裸鼠乳腺癌移植瘤的增长,并对内脏结构破坏较小。利用裸鼠建立MCF-7细胞的移植瘤,通过HN-1治疗,发现HN-1显着性地抑制了肿瘤的增长,并且H&E染色显示HN-1对内脏的毒性较小。（2）HN-1在体内外诱导caspase非依赖性凋亡。实验发现HN-1诱导MCF-7细胞凋亡,随后通过ELISA,Western blot等实验发现HN-1诱导的凋亡不依赖于caspase的激活。并且HN1激活p53/Bax/Bcl-2信号通路,进而导致AIF的核转移。通过Western blot、siRNA转染、流式细胞术和免疫荧光等实验证明了 HN-1诱导MCF-7细胞中p53的表达,进而影响Bcl-2家族蛋白的表达,从而导致线粒体膜电位的缺失,最后释放AIF进入细胞核导致DNA的片段化,并且ROS-MAPK和NF-κB信号通路也参与到HN-1诱导的caspase非依赖性凋亡中。（3）HN-1激活乳腺癌荷瘤小鼠体内免疫应答。利用BALB/c小鼠建立4T1乳腺癌模型,HN-1显着性抑制了肿瘤的增长,同时降低了患癌小鼠的脾指数。通过流式细胞术分选、ELISA和免疫组化等实验发现HN-1显着性提高了小鼠脾脏中CD4+T细胞亚群的数量,提高了血液中抗肿瘤相关细胞因子的水平,有效调节了肿瘤中CD4+T细胞和巨噬细胞的浸润,并且抑制肿瘤的血管新生。（4）HN-1在体内分布安全。通过小动物活体成像,证明FITC-HN-1在体内主要分布于肿瘤、脾脏、肠道、肾脏和膀胱中,而其他的脏器包括肝脏、心脏、肺部等,未见强荧光分布。说明了 FITC-HN-1能够靶向作用于4T1乳腺实体瘤,并降低在正常组织中的药物积累。综上所述,本文成功揭示了抗癌肽HN-1的抗乳腺癌作用及其分子机制,并且证明其在发挥抗肿瘤作用的同时还能够调节患癌个体体内的免疫调节作用,这些发现为乳腺癌的药物治疗提供了新的模板,同时也为肽类药物治疗提供更多的潜在作用靶点。
李征[9]（2019）在《肝内胆管癌的抗病毒治疗及长链非编码RNA在肿瘤进展中的作用和机制》文中研究指明第一部分肝内胆管癌的抗病毒治疗研究目的:乙肝病毒（hepatitis B virus,HBV）感染是肝内胆管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC）的重要危险因素,本研究拟评估抗病毒治疗（antiviral therapy,AVT）对合并HBV感染的ICC病人手术预后的影响。研究方法:回顾性的研究2006年至2011年,在上海东方肝胆外科医院和福建孟超肝胆外科医院接受肝切除治疗的928例合并HBV感染ICC病人的临床病理资料。详细记录病人的病毒再激活,肿瘤复发,肿瘤特异性生存和总体生存数据。生存率的分析使用时间依赖的Cox回归模型,以校正潜在协变量。结果:接受术前AVT,未接受术前AVT-低病毒载量（<2000 IU/mL）,以及未接受术前AVT-高病毒载量（≥2000 IU/mL）病人的术后病毒再激活率分别为3.3%,8.3%和15.7%（P<0.001）。高病毒载量和病毒再激活是肿瘤复发（hazard ratio[HR]:1.22和1.34）,肿瘤特异性生存（HR:1.36和1.46）和总体生存（HR:1.23和1.36）的独立危险因素。接受AVT治疗病人的术后5年肿瘤复发率,肿瘤特异性生存率和总体生存率（70.5%,46.9%和43.0%）优于未接受AVT-高病毒载量的病人（86.5%,20.9%和20.5%,所有P<0.001）;与未接受AVT-低病毒载量的病人无显着差异（71.7%,35.5%和33.5%,P=0.057,0.051和0.060）。同未接受AVT-高病毒载量的病人相比,无论是术前还是术后开始AVT治疗,均能改善病人的长期预后（肿瘤复发HR:0.44和0.54;肿瘤特异性生存HR:0.38和0.57;总体生存HR:0.46和0.54）。结论:病毒再激活影响合并HBV感染ICC病人的肝切除手术预后。AVT治疗可以降低病毒再激活率,改善高病毒载量病人的手术长期预后。第二部分长链非编码RNA在肝内胆管癌进展中的作用和机制研究目的:肝内胆管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC）的发病率和死亡率逐年升高,已成为研究热点。手术切除是唯一可能治愈ICC的治疗方式,但术后复发率高,远期疗效并不理想。由于ICC起病隐匿,早期无明显临床症状,病人发现时多处于晚期阶段,失去手术机会。长链非编码RNA（long noncoding RNA,lnc RNA）长度大于200 bp,没有或仅有弱的蛋白编码能力。越来越多的证据表明,lnc RNA广泛参与细胞过程,包括表观遗传特征和基因表达的调控,但在ICC中却鲜有研究。本研究将探索lnc RNA在ICC肿瘤进展中的作用和机制,以期找到新的诊断标志物和治疗靶点。研究方法:通过基因芯片检测找出ICC癌和癌旁组织中差异表达的lnc RNA分子,结合高内涵增殖实验筛选,鉴定出增殖相关功能阳性目的基因。q PCR验证目的基因芯片检测结果,并进行大样本验证,分析目的基因的表达与病人临床病理特征及手术预后的关系。选择RBE细胞系作为工具细胞,短发卡RNA（short hairpin RNA,sh RNA）慢病毒敲减目的基因,观察目的基因改变对细胞凋亡,细胞周期和克隆形成能力的影响。裸鼠成瘤实验观察目的基因改变对QBC939细胞成瘤能力的影响。使用RNA荧光原位杂交技术及核质分离PCR对目的基因进行亚细胞定位。生物信息学预测目的基因可以靶定的微小RNA（micro RNA,mi RNA）及下游靶基因,双荧光素酶报告基因验证目的基因和靶基因之间的相互作用。结果:共7对ICC癌和癌旁组织用于基因芯片检测,发现113条lnc RNA分子在癌组织中高表达。在RBE细胞系中使用sh RNA慢病毒干扰目的基因,结合高内涵增殖实验筛选,找出一条与ICC增殖相关的lnc RNA,并将其命名为URICC（up regulated in intrahepatic cholangiocarcinoma）。对116例ICC病人的分析显示,URICC高表达的病人具有更高的血清糖链抗原19-9水平（58.8 vs.27.2 U/m L,P=0.030）,更大的肿瘤直径（7.0 vs.6.1 cm,P=0.019）,肿瘤数目多发者以及合并大血管侵犯者更多（50.0%vs.25.9%,P=0.007;25.9%vs.8.6%,P=0.014）。多因素Cox回归分析显示,URICC高表达是病人术后复发（hazard ratio[HR]:1.974,P=0.020）和总体生存（HR:1.796,P=0.047）的独立危险因素。干扰URICC的表达能够将细胞周期阻滞在G2/M期,促进细胞凋亡,抑制克隆形成。体内实验表明,干扰URICC的表达可减弱QBC939细胞的裸鼠皮下成瘤能力。双荧光素酶报告基因显示,URICC可以通过竞争性内源RNA（competitive endogenous RNA,ce RNA）机制,解除mi R-320a对MCL-1的抑制,从而逃避线粒体途径的细胞凋亡。结论:URICC在ICC癌组织中高表达,干扰URICC可以抑制ICC细胞增殖。高表达URICC与病人差的预后显着相关。在机制上,URICC可以通过靶向结合mi R-320a,解除其对MCL-1的抑制,从而促进ICC的进展,是ICC的潜在治疗靶点和肿瘤标志物。
陈芳芳[10]（2019）在《PD-L1/PD-1免疫检测点信号通路抑制剂的筛选及机制研究和Axl抑制剂R428抗肿瘤机理研究》文中指出在第一部分的研究中,我们讨论了逃避免疫杀伤是肿瘤的主要特征之一,上调肿瘤细胞表面的抑制性免疫检测点蛋白（包括PD-L1）,是主要的手段。PD-L1蛋白被报道过表达于多种类型的肿瘤细胞表面,通过与肿瘤浸润淋巴细胞表面的PD-1受体结合抑制T细胞的效应功能。目前,阻断PD-L1/PD-1相互作用的单克隆抗体已在临床上被批准用于治疗多种类型的肿瘤,尤其是难治性或晚期肿瘤。然而,尽管抗体药物取得了巨大的成功,它们仍然存在诸多限制,比如自身带有免疫原性、不稳定性、高成本和弱组织渗透性等,这强调了开发小分子抑制剂的必要性。为了有效地筛选靶向于PD-L1/PD-1检测点的小分子抑制剂,我们首先建立了一个可评估PD-L1/PD-1相互作用的体外共培养体系,由表达PD-L1的PC-9/PD-L1肿瘤细胞与表达PD-1的Jurkat/PD-1 T细胞组成。我们发现两种细胞的共培养可促进PD-1通过溶酶体快速降解,在此过程中PD-1的降解程度与PDL1/PD-1相互作用程度正相关,因此,共培养后PD-1的表达量变化可用以表征候选化合物阻断PD-L1/PD-1的能力。基于这一模型,我们筛选得到可有效阻断PD-L1/PD-1的先导化合物——007,它可随浓度/时间依赖性地抑制共培养后PD-1的降解。与anti-PD-L1 Ab不同,007同时可抑制PD-L1蛋白的糖基化修饰,这显示它与阻断性抗体的作用机理不同。在进一步的机理研究中,我们发现PD-L1是007的直接作用靶点,007主要通过诱导合成早期的PD-L1在内质网中聚集,使其无法进一步分泌到高尔基体中,聚集的PD-L1最终通过ERAD通路降解致使膜上表达量下降,阻碍其与PD-1结合。PD-L1的分泌受阻同时伴随其糖基化修饰受阻。007的衍生物014被证实在体内模型中可有效抑制PDL1的糖基化。我们的研究将为PD-L1/PD-1小分子抑制剂的结构优化提供指导,为免疫治疗方案带来改革。在第二部分的研究中,我们讨论了Axl通路的上调是肿瘤恶化、转移的一种普遍机制,Axl被看作有潜力的开发抗肿瘤药物靶点。R428作为首个Axl特异性抑制剂被发现并进入临床试验,具有里程碑式的意义。虽然R428可有效抑制Axl酪氨酸激酶的磷酸化并诱导多种肿瘤细胞发生凋亡,但这两者间的关联仍存在许多疑问。我们的研究表明R428对Axl抑制只是瞬时性的,R428的抗肿瘤作用与它对Axl通路的抑制活性无关。为了阐释R428抗肿瘤的作用机理,我们从其诱导的胞质中异常起泡现象入手,发现R428可抑制溶酶体酸化和更新,从而导致溶酶体异常膨胀。与此同时,R428作用于自噬通路,其一方面诱导自噬相关基因的转录促进自噬的启始,另一方面又抑制自噬下游的降解,引起自噬体与溶酶体在胞内过度累积。通过小分子抑制剂或敲除的方式阻断自噬通路可削弱R428诱导的起泡和凋亡。我们的研究发现了除Axl磷酸化抑制外R428的新功能与作用机理,这将有助于在临床上更好的应用R428于抗肿瘤治疗中。同时,我们的研究也为自噬和凋亡的调控提供了新的认识。
二、内部核糖体进入位点控制人癌胚抗原与共刺激分子B7-1的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、内部核糖体进入位点控制人癌胚抗原与共刺激分子B7-1的表达（论文提纲范文）
（1）环状RNA ACTN4促进肝内胆管癌进展的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 实验结果 |
| 一、CircACTN4在ICC组织中显着性高表达 |
| 二、CircACTN4 的表达与临床预后的关系 |
| 三、CircACTN4 对胆管癌细胞表型的影响 |
| 四、CircACTN4 调控FZD7 的表达 |
| 五、CircACTN4与YBX1 相互作用 |
| 六、CircACTN4 招募YBX1 共同激活FZD7 的转录 |
| 七、CircACTN4 充当miR-424-5p的分子海绵 |
| 八、CircACTN4 参与Wnt和 Hippo信号通路的调节 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 环状RNA分子的研究进展及其与疾病的联系 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文和参加科研工作情况 |
| 致谢 |
（2）Hsa＿circ＿0005230/miR-1299/RHOT1轴对胃癌病理生物学行为的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 Hsa_circ_0005230 表达及与胃癌临床病理因素间的关系 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 仪器 |
| 2.2 研究对象 |
| 2.2.1 收集组织标本 |
| 2.2.2 细胞系的培养 |
| 2.3 研究方法 |
| 2.3.1 提取Total RNA |
| 2.3.2 反转录cDNA |
| 2.3.3 qRT-PCR产物环化验证及表达检测 |
| 2.3.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 PCR产物Sanger测序证实碱基序列剪接成环 |
| 3.2 Hsa_circ_0005230 在胃癌细胞系中表达显着上调 |
| 3.3 Hsa_circ_0005230 在胃癌组织中表达显着上调 |
| 3.4 Hsa_circ_0005230 表达水平与胃癌组织学分级、淋巴结转移和pTNM分期相关 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 Hsa_circ_0005230 对胃癌细胞恶性生物学行为的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 研究对象 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 合成siRNA |
| 2.2.2 胃癌细胞培养及siRNA转染 |
| 2.2.3 提取Total RNA及制备cDNA |
| 2.2.4 检测沉默效率 |
| 2.2.5 CCK-8 实验 |
| 2.2.6 平板克隆形成 |
| 2.2.7 流式细胞术 |
| 2.2.8 细胞划痕愈合实验 |
| 2.2.9 Transwell迁移实验 |
| 2.2.10 Transwell侵袭实验 |
| 2.2.11 Western Blotting 实验 |
| 2.2.12 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 siRNA片段有效沉默hsa_circ_0005230 的表达 |
| 3.2 CCK-8 实验显示沉默hsa_circ_0005230后胃癌细胞增殖能力显着抑制 |
| 3.2.1 沉默hsa_circ_0005230后HGC-27 胃癌细胞增殖能力受到抑制 |
| 3.2.2 沉默hsa_circ_0005230后AGS胃癌细胞增殖能力受到抑制 |
| 3.3 平板克隆形成实验显示沉默hsa_circ_0005230 后胃癌细胞克隆形成能力减弱 |
| 3.3.1 沉默hsa_circ_0005230后HGC-27 胃癌细胞克隆形成能力减弱 |
| 3.3.2 沉默hsa_circ_0005230后AGS胃癌细胞克隆形成能力减弱 |
| 3.4 流式细胞术显示沉默hsa_circ_0005230 后胃癌细胞细胞周期阻滞在G0/G1期 |
| 3.4.1 沉默hsa_circ_0005230 后流式细胞术检测HGC-27 胃癌细胞细胞周期阻滞于G0/G1期 |
| 3.4.2 沉默hsa_circ_0005230 后流式细胞术检测AGS细胞细胞周期阻滞于G0/G1期 |
| 3.5 划痕愈合实验显示沉默hsa_circ_0005230 后胃癌细胞迁移能力减弱 |
| 3.5.1 沉默hsa_circ_0005230 后划痕愈合实验检测HGC-27 胃癌细胞迁移能力减弱 |
| 3.5.2 沉默hsa_circ_0005230 后划痕愈合实验评估AGS胃癌细胞迁移能力减弱 |
| 3.6 Transwell迁移实验显示沉默hsa_circ_0005230 后胃癌细胞迁移能力减弱· |
| 3.6.1 沉默hsa_circ_0005230后transwell迁移实验评估HGC-27 细胞迁移能力减弱 |
| 3.6.2 沉默hsa_circ_0005230后transwell迁移实验评估AGS细胞迁移能力减弱 |
| 3.7 Transwell侵袭实验显示沉默hsa_circ_0005230 后胃癌细胞侵袭能力减弱· |
| 3.7.1 沉默hsa_circ_0005230后transwell侵袭实验评估HGC-27 细胞侵袭能力减弱 |
| 3.7.2 沉默hsa_circ_0005230后transwell侵袭实验评估AGS细胞侵袭能力减弱 |
| 3.8 沉默 hsa_circ_0005230 抑制 EMT 通路中关键蛋白的表达 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 Hsa_circ_0005230/miR-1299/RHOT1轴对胃癌生物学行为的影响机制 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 仪器 |
| 2.2 研究对象 |
| 2.2.1 组织标本的收集 |
| 2.2.2 细胞系的培养 |
| 2.3 研究方法 |
| 2.3.1 提取Total RNA |
| 2.3.2 RNA反转录及qRT-PCR |
| 2.3.3 Kaplan-Meier生存分析 |
| 2.3.4 生物信息学分析 |
| 2.3.5 双荧光素酶报告基因实验 |
| 2.3.6 Western Blotting实验 |
| 2.3.7 免疫组织化学染色(IHC) |
| 2.3.8 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 MiR-1299 在胃癌细胞系及胃癌组织中表达水平下调 |
| 3.1.1 MiR-1299 在胃癌细胞系表达水平下调 |
| 3.1.2 MiR-1299 在胃癌组织中表达显着下调 |
| 3.2 胃癌组织中miR-1299 高表达患者预后较好 |
| 3.3 RHOT1 mRNA在胃癌细胞系及胃癌组织中表达上调 |
| 3.3.1 RHOT1 mRNA在胃癌细胞系中表达上调 |
| 3.3.2 RHOT1 mRNA在胃癌组织中表达上调 |
| 3.4 胃癌组织中RHOT1 mRNA高表达患者预后较差 |
| 3.5 RHOT1 mRNA的表达水平与淋巴结转移和pTNM分期相关 |
| 3.6 沉默hsa_circ_0005230后miR-1299 表达上调,RHOT1 mRNA表达下调 |
| 3.6.1 沉默hsa_circ_0005230后miR-1299 的表达上调 |
| 3.6.2 沉默hsa_circ_0005230后RHOT1 mRNA表达下调 |
| 3.7 相关性分析 |
| 3.7.1 胃癌组织中hsa_circ_0005230与miR-1299 表达水平呈负相关 |
| 3.7.2 胃癌组织中miR-1299与RHOT1 mRNA表达水平呈负相关 |
| 3.7.3 胃癌组织中hsa_circ_0005230与RHOT1 mRNA表达呈正相关 |
| 3.8 双荧光素酶报告基因实验显示RHOT1与miR-1299 间有特异性结合位点 |
| 3.9 RHOT1 蛋白在胃癌组织中表达上调 |
| 3.10 RHOT1 蛋白在胃癌组织呈阳性表达 |
| 3.10.1 RHOT1 蛋白在胃癌组织中显着高表达 |
| 3.10.2 RHOT1 蛋白表达与胃癌临床病理因素间的关系 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第四部分 FUS影响hsa_circ_0005230 的表达 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 仪器 |
| 2.2 研究对象 |
| 2.2.1 收集组织标本 |
| 2.2.2 细胞系的培养 |
| 2.3 研究方法 |
| 2.3.1 提取Total RNA |
| 2.3.2 反转录cDNA |
| 2.3.3 相关性分析 |
| 2.3.4 Kaplan-Meier生存分析 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 FUS mRNA在胃癌细胞系及胃癌组织中表达上调 |
| 3.1.1 FUS mRNA在胃癌细胞系表达上调 |
| 3.1.2 FUS mRNA在胃癌组织中表达上调 |
| 3.2 FUS mRNA在胃癌高表达与胃癌淋巴结转移和pTNM分期相关 |
| 3.3 胃癌患者FUS mRNA高表达预后较差 |
| 3.4 相关性分析 |
| 3.4.1 胃癌组织FUS mRNA与 hsa_circ_0005230 表达呈正相关 |
| 3.4.2 胃癌组织FUS与 RHOT1 表达水平正相关 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 环状 RNA 生物学特性及其在胃癌中功能研究新进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）干扰素诱导基因BACH1缺失促进溶瘤病毒HSV-1抗肿瘤免疫应答的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 肿瘤的基本特征及免疫治疗 |
| 1.1.1 肿瘤的基本特征 |
| 1.1.2 肿瘤的免疫治疗 |
| 1.2 溶瘤病毒疗法 |
| 1.2.1 溶瘤病毒治疗的发展历史 |
| 1.2.2 溶瘤病毒种类 |
| 1.2.3 溶瘤病毒治疗的挑战 |
| 1.2.4 溶瘤病毒未来的发展方向 |
| 1.3 HSV-1简介 |
| 1.3.1 HSV-1的流行病学 |
| 1.3.2 HSV-1病原学 |
| 1.3.3 HSV-1生物学特性 |
| 1.4 抗HSV-1天然免疫 |
| 1.4.1 Toll样受体 |
| 1.4.2 维甲酸诱导基因I样受体(RLR)和DExD/H-box解旋酶(DHXs) |
| 1.4.3 环鸟苷单磷酸-腺苷单磷酸合成酶 |
| 1.4.4 干扰素γ诱导蛋白16 |
| 1.4.5 干扰素诱导基因 |
| 1.5 BACH1概述 |
| 1.5.1 BACH1的结构及其在细胞内的分布 |
| 1.5.2 BACH1的生物学功能 |
| 1.6 本课题研究的内容和意义 |
| 第二章 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 实验小鼠 |
| 2.1.3 引物 |
| 2.1.4 质粒 |
| 2.1.5 病毒 |
| 2.1.6 抗体 |
| 2.1.7 试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 质粒构建 |
| 2.2.2 细胞复苏 |
| 2.2.3 细胞传代 |
| 2.2.4 细胞冻存 |
| 2.2.5 扩增HSV-1病毒和超速离心浓缩HSV-1病毒 |
| 2.2.6 筛选抗HSV-1的ISGs |
| 2.2.7 构建敲除细胞系 |
| 2.2.8 构建敲低细胞系 |
| 2.2.9 构建过表达细胞系 |
| 2.2.10 Western blot实验 |
| 2.2.11 Hemin配制(以配制50 mL 20 mM的Hemin溶液为例) |
| 2.2.12 RNA抽提、逆转录和实时荧光定量PCR |
| 2.2.13 染色质免疫沉淀 |
| 2.2.14 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 2.2.15 流式细胞仪检测Calrecticulin的表达 |
| 2.2.16 酶联免疫吸附实验检测胞外HMGB1浓度 |
| 2.2.17 构建小鼠肿瘤模型 |
| 2.2.18 肿瘤组织淋巴细胞组分分析 |
| 2.2.19 免疫组化检测T淋巴细胞的浸润 |
| 2.2.20 酶联免疫斑点检测实验 |
| 2.2.21 统计学方法 |
| 第三章 实验结果与分析 |
| 3.1 筛选抗HSV-1的ISGs |
| 3.2 BACH1缺失能增加HSV-1-Luc的复制 |
| 3.3 BACH1缺失促进HSV-1的抗肿瘤效果 |
| 3.4 BACH1缺失促进HSV-1诱导的T淋巴细胞浸润 |
| 3.5 BACH1缺失促进HSV-1诱导产生的细胞凋亡 |
| 3.6 BACH1缺失促进HSV-1诱导钙网蛋白外露和HMGB1释放 |
| 3.7 BACH1通过抑制ICP4、ICP27和UL39的转录来抑制HSV-1的复制 |
| 3.8 BACH1抗HSV-1不依赖于MAFK |
| 3.9 Hemin和HSV-1治疗联合使用进一步抑制肿瘤生长 |
| 3.10 Hemin和HSV-1联合治疗进一步促进T淋巴细胞浸润 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 综述冠状病毒感染与宿主免疫系统的相互作用及抗冠状病毒药物和疫苗的发展 |
| 5.1 冠状病毒的分类和生物学特征 |
| 5.2 冠状病毒感染的致病性 |
| 5.3 抗冠状病毒天然免疫 |
| 5.4 冠状病毒逃逸天然免疫反应机制 |
| 5.5 冠状病毒的预防与治疗方法 |
| 5.6 结语 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表与注释 |
| 致谢 |
（4）猪肠道冠状病毒细胞受体及毒力因子研究（论文提纲范文）
| 论文课题来源 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 猪肠道冠状病毒流行情况 |
| 2 冠状病毒病原学 |
| 3 冠状病毒受体研究进展 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 病毒的分离及鉴定 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 临床样品采集 |
| 1.1.2 细胞 |
| 1.1.3 试剂及抗体 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 主要培养基配制 |
| 1.2.2 腹泻样品处理 |
| 1.2.3 腹泻样品病毒RNA提取 |
| 1.2.4 腹泻样品腹泻病毒核酸检测 |
| 1.2.5 病毒的分离及鉴定 |
| 1.2.6 病毒的全长基因组克隆 |
| 1.2.7 病毒基因组遗传进化分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 腹泻样品中猪肠道冠状病毒核酸检测结果 |
| 2.2 PDCoV病毒的细胞分离 |
| 2.3 病毒全长基因组分段扩增及克隆 |
| 2.4 病毒全基因组遗传进化分析 |
| 2.5 病毒S基因序列同源性分析 |
| 2.6 PDCoV ZJU3毒株全基因组水平重组分析 |
| 3 讨论 |
| 第二章 病毒入侵细胞受体研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病毒与细胞 |
| 1.1.2 抗体 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.2 材料 |
| 1.2.1 质粒构建 |
| 1.2.2 蛋白免疫印迹实验 |
| 1.2.3 免疫共沉淀(Co-IP) |
| 1.2.4 斑点杂交实验 |
| 1.2.5 蛋白表达纯化 |
| 1.2.6 间接免疫荧光实验 |
| 1.2.7 流式细胞分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 蛋白表达与纯化 |
| 2.2 PDCoV S1蛋白与猪源易感细胞表面结合情况 |
| 2.3 不同细胞表达pAPN情况鉴定 |
| 2.4 S1蛋白与pAPN蛋白体内外结合情况验证 |
| 2.5 可溶性pAPN蛋白抑制S1蛋白与表达pAPN蛋白的细胞结合 |
| 2.6 外源性表达pAPN蛋白介导PDCoV对非易感细胞的入侵 |
| 2.7 可溶性pAPN对PDCoV病毒增殖的抑制作用 |
| 2.8 PDCoV感染Vero-pAPN细胞病毒增殖情况检测 |
| 2.9 PDCoV感染Vero-pAPN细胞子代病毒感染能力验证 |
| 2.10 易感细胞pAPN蛋白敲低抑制PDCoV感染 |
| 2.11 pAPN敲除后不能完全抑制PDCoV感染 |
| 3 讨论 |
| 第三章 猪丁型冠状病毒反向遗传系统建立尝试 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞和病毒 |
| 1.1.2 载体及菌株 |
| 1.1.3 抗体与试剂 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 溶液配制 |
| 1.2.2 病毒核酸抽提 |
| 1.2.3 RNA反转录 |
| 1.2.4 PCR引物设计与片段扩增 |
| 1.2.5 PDCoV全长基因组cDNA克隆构建 |
| 1.2.6 PDCoV全长基因组克隆重组质粒提取 |
| 1.2.7 PDCoV全长基因组克隆重组质粒鉴定 |
| 1.2.8 PDCoV全基因组克隆质粒大量制备 |
| 1.2.9 PDCoV全基因组克隆质粒转染 |
| 1.2.10 PDCoV全基因组质粒转染验证 |
| 2 结果 |
| 2.1 成功扩增涵盖PDCoV全基因组的15个片段 |
| 2.2 成功构建PDCoV全基因组cDNA克隆 |
| 2.3 PDCoV全基因组cDNA克隆细胞拯救 |
| 3 讨论 |
| 第四章 猪流行性腹泻病毒反向遗传系统的建立及应用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病毒及细胞 |
| 1.1.2 载体及菌株 |
| 1.1.3 相关抗体 |
| 1.1.4 试剂 |
| 1.1.5 仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 溶液配制 |
| 1.2.2 RNA提取 |
| 1.2.3 逆转录 |
| 1.2.4 引物设计 |
| 1.2.5 PCR扩增 |
| 1.2.6 PEDV感染性克隆构建 |
| 1.2.7 PEDV全长感染性cDNA克隆PCR鉴定 |
| 1.2.8 PEDV病毒拯救 |
| 1.2.9 PEDV病毒的免疫荧光检测 |
| 1.2.10 PEDV病毒TCID_(50)测定 |
| 1.2.11 PEDV病毒空斑实验 |
| 1.2.12 动物实验分组 |
| 1.2.13 攻毒后仔猪腹泻状态评分 |
| 1.2.14 粪拭子采集与样品处理 |
| 1.2.15 粪便样品中PEDV核酸拷贝数检测 |
| 1.2.16 仔猪肠道组织样品处理及分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 PEDV-G2全长感染性克隆构建 |
| 2.2 rPEDV-G2病毒拯救与鉴定 |
| 2.3 荧光标记病毒的构建拯救与鉴定 |
| 2.4 拯救亲本毒与GFP标记病毒仔猪攻毒致病性研究 |
| 2.5 分泌型荧光素酶标记病毒构建与拯救 |
| 2.6 基因Ⅱ型PEDV S基因及ORF3基因修饰毒构建 |
| 2.7 基因修饰毒致病性实验 |
| 2.8 嵌合型重组病毒的致病性研究 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表论文情况 |
（5）Linc00673/miR-150-5p/ZEB1轴在非小细胞肺癌中的调控功能及预后价值研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 1 引言 |
| 2 方法 |
| 2.1 细胞培养与化学药品 |
| 2.2 细胞转染 |
| 2.3 细胞增殖实验 |
| 2.4 划痕实验与Transwell侵袭实验 |
| 2.5 实时荧光定量PCR |
| 2.6 蛋白免疫印迹实验 |
| 2.7 免疫荧光实验 |
| 2.8 双荧光素酶报告基因实验 |
| 2.9 小鼠肺癌移植瘤实验 |
| 2.10 ZEB家族成员在NSCLC中预后价值的meta分析 |
| 2.11 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 第一章 Linc00673/miR-150-5p/ZEB1轴在非小细胞肺癌中的调控功能及其分子机制 |
| 3.1 Linc00673促进非小细胞肺癌增殖、迁移、侵袭 |
| 3.2 Linc00673促进非小细胞肺癌的上皮间质转化 |
| 3.3 Linc00673 作为ce RNA与 miR-150-5p相互作用 |
| 3.4 Linc00673/miR-150-5p/ZEB1 轴调控非小细胞肺癌增殖、迁移、侵袭和上皮间质转化 |
| 第二章 Linc00673/miR-150-5p/ZEB1轴在非小细胞肺癌中的预后价值 |
| 3.5 Linc00673/miR-150-5p的预后价值 |
| 3.6 ZEB家族转录因子高表达与非小细胞肺癌不良预后相关 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 长链非编码RNA在非小细胞肺癌中的生物学功能及临床意义 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
（6）蛋白质芯片在肿瘤标志物筛查中的应用以及利用SELEX技术筛选CD20/486的ssDNA适配体的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 iPDMS蛋白芯片在恶性肿瘤筛查的应用研究 |
| 1.1 背景 |
| 1.2 材料和方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 第二部分 CD20适配体的筛选及功能检测 |
| 2.1 背景 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 小结 |
| 附录 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 博士学位期间的主要科研成果 |
| 致谢 |
（7）耐药细胞外泌体中miR193对食管癌细胞耐药作用及其机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 前言 |
| 第一部分 顺铂耐药细胞外泌体对敏感细胞顺铂耐受性的影响 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 细胞株 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验试剂 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 细胞培养 |
| 3.2 食管癌顺铂耐药细胞株TE1/DDP的建立 |
| 3.3 CCK-8法检测细胞增殖和药物敏感性 |
| 3.4 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 3.5 外泌体提取 |
| 3.6 外泌体鉴定 |
| 3.7 统计学分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 TE1/DDP细胞活力检测 |
| 4.2 TE1/DDP细胞凋亡检测 |
| 4.3 外泌体鉴定 |
| 4.4 TE1/DDP外泌体对TE1的影响 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第二部分 影响敏感细胞耐药的外泌体miRNA及靶基因筛选 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 细胞株 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验试剂 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 细胞培养 |
| 3.2 食管癌顺铂耐药/敏感细胞株外泌体的提取 |
| 3.3 外泌体RNA cDNA文库构建 |
| 3.4 高通量测序 |
| 3.5 外泌体miRNA荧光定量检测 |
| 4 结果 |
| 4.1 测序结果统计 |
| 4.2 small RNA长度分布统计 |
| 4.3 序列比对基因组比较 |
| 4.4 序列比对内含子和外显子 |
| 4.5 miRNA热图分析 |
| 4.6 miRNA差异表达分析 |
| 4.7 miRNA靶基因富集分析 |
| 4.8 差异基因表达量丰度分析 |
| 4.9 样本相关性分析 |
| 4.10 外泌体差异表达miRNAs实验验证 |
| 4.11 mRNA和miRNA数据关联分析 |
| 4.12 差异miRNA及靶基因mRNA在食管癌患者中生存率分析 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第三部分 miR193参与食管癌顺铂化疗耐药的机制 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 细胞株 |
| 2.2 实验仪器与试剂 |
| 2.3 引物信息 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 细胞培养 |
| 3.2 TFAP2C和miR193在食管癌细胞株中的表达 |
| 3.3 双萤光素酶报告基因检测 |
| 3.4 过表达细胞株构建 |
| 3.5 EdU检测食管癌细胞增殖 |
| 3.6 流式细胞仪检测细胞周期 |
| 3.7 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 3.8 细胞克隆形成实验 |
| 3.9 Transwell实验 |
| 3.10 染色质免疫共沉淀(ChIP)实验 |
| 3.11 统计学分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 miR193在食管癌细胞中的表达 |
| 4.2 TFAP2C在不同细胞中的表达 |
| 4.3 细胞周期检测 |
| 4.4 细胞周期及耐药相关基因表达情况 |
| 4.5 双萤光素酶报告基因检测 |
| 4.6 EdU检测细胞增殖 |
| 4.7 TFAP2C与miR193对细胞周期的影响 |
| 4.8 克隆形成实验结果 |
| 4.9 细胞凋亡实验结果 |
| 4.10 细胞侵袭实验结果 |
| 4.11 ChIP检测TFAP2C调节P21 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第四部分 裸鼠荷瘤验证miR193促进食管癌细胞耐药 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 结果 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 外泌体与肿瘤研究的进展 |
| 参考文献 |
（8）海南湍蛙肽HN-1抗乳腺癌活性及作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 1 绪论 |
| 1.1 癌症的治疗手段概述 |
| 1.1.1 传统癌症治疗手段 |
| 1.1.2 肿瘤的分子靶向治疗 |
| 1.1.3 肿瘤的免疫治疗现状 |
| 1.2 抗癌肽概述 |
| 1.2.1 抗癌肽的基本特征 |
| 1.2.2 抗癌肽的作用机制 |
| 1.2.3 抗癌肽的应用前景 |
| 1.2.4 抗癌肽药物研发所面临的挑战和解决方案 |
| 1.3 本文选题依据和研究内容 |
| 1.3.1 选题依据 |
| 1.3.2 研究内容 |
| 2 HN-1的体内外抗肿瘤作用研究以及毒性的初步评价 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 仪器与试剂 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验试剂与材料 |
| 2.2.3 试剂配制 |
| 2.2.4 细胞 |
| 2.2.5 实验动物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 HN-1的化学合成 |
| 2.3.2 细胞培养 |
| 2.3.3 体外抗癌活性和毒性检测 |
| 2.3.4 乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测 |
| 2.3.5 细胞集落形成实验 |
| 2.3.6 HN-1和阿霉素(adriamycin,ADR)联合用药实验 |
| 2.3.7 裸鼠MCF-7乳腺癌模型建立与HN-1治疗 |
| 2.3.8 内脏组织石蜡切片 |
| 2.3.9 苏木精-伊红(Hematoxylin-Eosin,H&E)染色 |
| 2.3.10 统计学分析 |
| 2.4 实验结果与讨论 |
| 2.4.1 HN-1的体外抗肿瘤活性筛选 |
| 2.4.2 HN-1对阿霉素抗性MCF-7(MCF-7/ADR)细胞的毒性检测 |
| 2.4.3 HN-1与阿霉素(ADR)的联合用药检测 |
| 2.4.4 HN-1对接种MCF-7细胞荷瘤裸鼠的治疗作用 |
| 2.4.5 HN-1在体内的毒性初步评价 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 HN-1的抗肿瘤作用分子机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 仪器与试剂 |
| 3.2.1 仪器 |
| 3.2.2 实验试剂与材料 |
| 3.2.3 试剂配制 |
| 3.2.4 细胞 |
| 3.2.5 实验动物 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.2 SEM观察细胞形态变化 |
| 3.3.3 HN-1的结构分析 |
| 3.3.4 Annexin V-FITC和PI双染实验 |
| 3.3.5 DAPI核染实验 |
| 3.3.6 TUNEL染色实验 |
| 3.3.7 线粒体膜电位(△Ψm)检测实验 |
| 3.3.8 caspase活性检测实验 |
| 3.3.9 细胞和肿瘤组织全蛋白提取 |
| 3.3.10 细胞核蛋白与细胞浆蛋白提取 |
| 3.3.11 蛋白浓度定量 |
| 3.3.12 Western bloting |
| 3.3.13 siRNA和过表达质粒转染 |
| 3.3.14 裸鼠MCF-7乳腺癌模型建立与HN-1治疗 |
| 3.3.15 石蜡切片 |
| 3.3.16 免疫荧光实验 |
| 3.3.17 统计学分析 |
| 3.4 实验结果与分析 |
| 3.4.1 HN-1对MCF-7细胞形态的影响 |
| 3.4.2 HN-1的结构信息 |
| 3.4.3 HN-1对MCF-7细胞核形态的影响 |
| 3.4.4 HN-1诱导MCF-7细胞凋亡 |
| 3.4.5 HN-1诱导MCF-7细胞DNA片段化 |
| 3.4.6 HN-1破坏MCF-7细胞线粒体膜电位 |
| 3.4.7 HN-1激活Caspase非依赖性的凋亡通路 |
| 3.4.8 HN-1激活AIF的核转移 |
| 3.4.9 敲除MCF-7细胞中AIF对HN-1抗肿瘤作用的影响 |
| 3.4.10 HN-1激活裸鼠体内MCF-7移植瘤内的AIF核转移 |
| 3.4.11 HN-1改变Bcl-2家族蛋白的表达 |
| 3.4.12 敲除Bax和过表达Bcl-2对HN-1作用的影响 |
| 3.4.13 HN-1激活MCF-7细胞抑癌基因p53的表达 |
| 3.4.14 敲除p53对HN-1激活凋亡通路的影响 |
| 3.4.15 HN-1诱导MCF-7细胞中活性氧提升 |
| 3.4.16 HN-1激活MCF-7细胞中MAPK和NF-κB信号通路 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 HN-1的抗肿瘤免疫调节作用机制研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 仪器与试剂 |
| 4.2.1 仪器 |
| 4.2.2 实验试剂与材料 |
| 4.2.3 试剂配置 |
| 4.2.4 细胞 |
| 4.2.5 实验动物 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞培养 |
| 4.3.2 MTT检测HN-1对4T1细胞的杀伤作用 |
| 4.3.3 细胞集落形成实验 |
| 4.3.4 体外细胞因子和趋化因子检测 |
| 4.3.5 Real-time quantitative PCR(RT-qPCR) |
| 4.3.6 体内细胞因子和趋化因子检测 |
| 4.3.7 BALB/c小鼠4T1乳腺癌模型建立和HN-1治疗 |
| 4.3.8 血清中细胞因子和趋化因子的检测 |
| 4.3.9 脾脏中CD4+、CD8+T细胞亚群的测定 |
| 4.3.10 内脏和肿瘤组织石蜡切片 |
| 4.3.11内脏组织石蜡切片HE染色 |
| 4.3.12 肿瘤组织免疫组化 |
| 4.4 实验结果与讨论 |
| 4.4.1 HN-1对4T1荷瘤BALB/c小鼠的治疗效果 |
| 4.4.2 HN-1对小鼠体内细胞因子和趋化因子的影响 |
| 4.4.3 HN-1对小鼠脾脏中CD4+和CD8+T细胞亚群数量的影响 |
| 4.4.4 HN-1对肿瘤浸润免疫细胞和血管新生的影响 |
| 4.4.5 HN-1对肿瘤转移和内脏结构的影响 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 HN-1在荷瘤小鼠体内的药物分布初步检测 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 仪器与试剂 |
| 5.2.1 仪器 |
| 5.2.2 实验试剂与材料 |
| 5.2.3 试剂配置 |
| 5.2.4 细胞 |
| 5.2.5 实验动物 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 FITC-HN-1的化学合成 |
| 5.3.2 FITC-HN-1在细胞中分布实验 |
| 5.3.3 BALB/c小鼠4T1乳腺癌模型建立 |
| 5.3.4 FITC-HN-1在动物体内的实时分布实验 |
| 5.4 实验结果与讨论 |
| 5.4.1 FITC-HN-1在MCF-7细胞中分布 |
| 5.4.2 FITC-HN-1在动物体内的实时分布 |
| 5.5 本章小结 |
| 6 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 攻读博士学位期间科研项目及科研成果 |
（9）肝内胆管癌的抗病毒治疗及长链非编码RNA在肿瘤进展中的作用和机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一部分 肝内胆管癌的抗病毒治疗 |
| 前言 |
| 病人和方法 |
| 研究结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 长链非编码RNA在肝内胆管癌进展中的作用和机制 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文和参加科研工作情况 |
| 致谢 |
（10）PD-L1/PD-1免疫检测点信号通路抑制剂的筛选及机制研究和Axl抑制剂R428抗肿瘤机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 PD-L1/PD-1免疫检测点信号通路抑制剂的筛选及机制研究 |
| 1.1 引言 |
| 1.1.1 肿瘤与免疫的关系 |
| 1.1.1.1 肿瘤抗原 |
| 1.1.1.2 肿瘤免疫逃逸 |
| 1.1.2 肿瘤免疫治疗分类 |
| 1.1.2.1 肿瘤疫苗 |
| 1.1.2.2 嵌合抗原受体T细胞疗法 |
| 1.1.2.3 免疫检测点抑制剂 |
| 1.1.3 PD-1、PD-L1和PD-L1/PD-1通路 |
| 1.1.3.1 PD-L1/PD-1通路 |
| 1.1.3.2 PD-1通路抑制T细胞的效应功能 |
| 1.1.3.3 肿瘤细胞中PD-1通路的功能 |
| 1.1.4 已上市的PD-L1/PD-1通路抑制剂 |
| 1.1.5 靶向PD-L1/PD-1通路的小分子抑制剂的开发 |
| 1.2 实验材料与方法 |
| 1.2.1 细胞株及试剂 |
| 1.2.1.1 细胞株及培养条件 |
| 1.2.1.2 试剂 |
| 1.2.1.3 SiRNA和Primer序列 |
| 1.2.2 实验方法 |
| 1.2.2.1 质粒转染 |
| 1.2.2.2 Western blot检测蛋白表达 |
| 1.2.2.3 稳转株单克隆筛选 |
| 1.2.2.4 免疫荧光检测蛋白定位 |
| 1.2.2.5 流式细胞仪检测Jurkat细胞表面PD-1表达 |
| 1.2.2.6 共培养系统筛选PD-L1抑制剂 |
| 1.2.2.7 MTT法检测细胞存活率 |
| 1.2.2.8 PNGase F或Endo H酶消化蛋白的N-糖链 |
| 1.2.2.9 免疫沉淀 |
| 1.2.2.10 ER-tracker或Lysosome-tracker red染色 |
| 1.2.2.11 荧光素酶报告基因检测NFAT通路 |
| 1.2.2.12 流式细胞仪检测细胞周期 |
| 1.2.2.13 Real-time PCR检测细胞因子转录 |
| 1.2.2.14动物实验 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 构建稳定表达PD-1和PD-L1分子的单克隆细胞株 |
| 1.3.2 检测PD-L1/PD-1相互作用的共培养体系的建立 |
| 1.3.2.1 细胞间接触促进共培养后PD-1经溶酶体降解 |
| 1.3.2.2 共培养体系的PD-1水平与PD-L1/PD-1相互作用呈负相关 |
| 1.3.2.3 PC-9/PD-L1-Jurkat/PD-1共培养体系可用于PD-L1/PD-1抑制剂的筛选 |
| 1.3.3 共培养体系筛选阻断PD-L1/PD-1检测点的候选小分子化合物 |
| 1.3.3.1 先导化合物的发现 |
| 1.3.3.2 阳性化合物阻断PD-L1/PD-1结合的方式与抗体不同 |
| 1.3.4 PD-L1是阳性化合物的直接作用靶点 |
| 1.3.5 007特异性抑制PD-L1蛋白的N-糖基化 |
| 1.3.5.1 007不完全抑制PD-L1糖基化 |
| 1.3.5.2 007特异性抑制PD-L1的糖基化 |
| 1.3.5.3 007同时抑制组成型和诱导型PD-L1的糖基化 |
| 1.3.5.4 007作用的N-糖基化位点研究 |
| 1.3.6 007抑制PD-L1蛋白的膜定位 |
| 1.3.7 007诱使PD-L1滞留于内质网中 |
| 1.3.8 007促进PD-L1通过蛋白酶体通路降解 |
| 1.3.9 007可解除PD-L1/PD-1通路引起的T细胞内部NFAT通路的抑制 |
| 1.3.10 007可恢复T细胞效应功能 |
| 1.3.11 007应用于动物实验模型 |
| 1.3.11.1 007类似物014可在体内抑制人源PD-L1糖基化 |
| 1.3.11.2 007系列化合物不作用于鼠源PD-L1 |
| 1.4 结果讨论 |
| 第2章 Axl抑制剂R428抗肿瘤机理研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.1.1 Axl受体酪氨酸激酶及其抑制剂 |
| 2.1.2 细胞死亡概述 |
| 2.1.2.1 细胞凋亡 |
| 2.1.2.2 自噬与自噬性细胞死亡 |
| 2.1.2.3 副凋亡 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 细胞株及试剂 |
| 2.2.1.1 细胞株及培养条件 |
| 2.2.1.2 试剂 |
| 2.2.1.3 Primer序列 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.2.1 克隆形成实验(结晶紫实验) |
| 2.2.2.2 RTCA实时监测细胞生长曲线实验 |
| 2.2.2.3 活细胞工作站实时检测细胞形态变化实验 |
| 2.2.2.4 中性红或吖啶橙染色实验 |
| 2.2.2.5 细胞骨架染色实验 |
| 2.2.2.6 透射电子显微镜分析 |
| 2.2.2.7 生长因子刺激受体内吞降解实验 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 Axl抑制剂R428发挥抗肿瘤作用不依赖于Axl |
| 2.3.2 R428诱导形成异常的泡状结构但不具备paraptosis特征 |
| 2.3.3 R428诱导的vacuoles来源于溶酶体 |
| 2.3.4 R428影响溶酶体pH值 |
| 2.3.5 R428诱导溶酶体和自噬体增多并促进自噬相关基因的表达 |
| 2.3.6 R428抑制自噬性降解 |
| 2.3.7 R428诱导vacuolization与细胞内部自噬活动程度相关 |
| 2.3.8 抑制自噬启始可削弱R428诱导的vacuolization |
| 2.3.9 抑制自噬启始可减少R428对细胞生长的抑制 |
| 2.3.10 自噬参与R428作用后引起的Axl磷酸化增加 |
| 2.3.11 R428同时抑制细胞的内吞途径 |
| 2.3.12 有机胺结构赋予R428溶酶体趋向性 |
| 2.4 结果讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
四、内部核糖体进入位点控制人癌胚抗原与共刺激分子B7-1的表达（论文参考文献）
- [1]环状RNA ACTN4促进肝内胆管癌进展的机制研究[D]. 陈秦俊杰. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [2]Hsa＿circ＿0005230/miR-1299/RHOT1轴对胃癌病理生物学行为的影响及机制研究[D]. 彭妍钰. 中国医科大学, 2021(02)
- [3]干扰素诱导基因BACH1缺失促进溶瘤病毒HSV-1抗肿瘤免疫应答的机制研究[D]. 潘超虎. 北京协和医学院, 2020(05)
- [4]猪肠道冠状病毒细胞受体及毒力因子研究[D]. 王斌. 浙江大学, 2020
- [5]Linc00673/miR-150-5p/ZEB1轴在非小细胞肺癌中的调控功能及预后价值研究[D]. 牛越群. 浙江大学, 2020(01)
- [6]蛋白质芯片在肿瘤标志物筛查中的应用以及利用SELEX技术筛选CD20/486的ssDNA适配体的研究[D]. 王伟. 南方医科大学, 2019
- [7]耐药细胞外泌体中miR193对食管癌细胞耐药作用及其机制[D]. 史世锋. 郑州大学, 2019(02)
- [8]海南湍蛙肽HN-1抗乳腺癌活性及作用机制研究[D]. 乔雪. 大连理工大学, 2019(06)
- [9]肝内胆管癌的抗病毒治疗及长链非编码RNA在肿瘤进展中的作用和机制[D]. 李征. 中国人民解放军海军军医大学, 2019(10)
- [10]PD-L1/PD-1免疫检测点信号通路抑制剂的筛选及机制研究和Axl抑制剂R428抗肿瘤机理研究[D]. 陈芳芳. 中国科学院大学(中国科学院上海药物研究所), 2019(07)