一、常氏肝癌细胞cDNA文库的构建及质量分析(英文)（论文文献综述）
朱蕊[1]（2021）在《转录因子Snail的去泛素化调节在食管鳞状细胞癌发生发展中的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理在肿瘤发生与转移的过程中,上皮间质转化过程发挥着关键性的作用,它赋予肿瘤上皮细胞某些间质样细胞的特征,从而使得肿瘤细胞具有更强的侵袭和迁移能力。Snail是上皮间质转化过程中发挥重要作用的转录因子,在肿瘤的进展和转移中起着重要的作用。因此,Snail的表达水平严格精密的受到转录、翻译和翻译后水平等多方面的调控。Snail在细胞中半衰期较短,由泛素-蛋白酶体系统介导迅速降解,而该过程受蛋白质泛素化修饰可逆调控。细胞中调节Snail多聚泛素化与蛋白稳定性主要依赖于E3泛素连接酶和去泛素化酶。真核细胞中E3泛素连接酶有大约五百种,去泛素化酶有约一百种,它们具有底物特异性,负责可逆的精密调控蛋白质的泛素化修饰。由于不同酶的底物特异性,存在某种酶调节多个底物蛋白泛素化水平的情况,而某个底物蛋白也往往受到多种酶的共同调控。转录因子Snail在肿瘤发生发展中发挥着关键性作用且泛素化修饰调控Snail是影响其表达水平的一个重要手段。迄今,已经证实存在多种能够参与调节Snail的泛素化修饰促进其蛋白酶体途径降解的E3泛素连接酶,但其逆过程-负责Snail的去泛素化的去泛素化酶（DUBs）在很大程度上仍然未知。鉴于细胞中蛋白质去泛素化修饰的复杂性,我们首先采用了免疫共沉淀串联质谱分析技术以寻找能与Snail相互结合的去泛素化酶。随后,在确证去泛素化酶PSMD14与Snail存在相互作用后,我们检测了 PSMD14靶向Snail以实现去泛素化和稳定Snail细胞内表达水平的功能。在食管鳞状细胞癌细胞中,PSMD14高表达显着降低了 Snail的泛素化水平并延长了 Snail的半衰期。在功能研究上,我们发现PSMD14的敲降极大地阻断了 Snail诱导的上皮间质转化过程,并在随后的体外实验中抑制了食管鳞癌细胞的迁移和侵袭以及在体内实验中抑制了食管鳞癌肿瘤的转移能力。此外,在临床样本中,PSMD14在食管鳞癌肿瘤组织中表达水平显着高于癌旁组织,且与Snail的表达水平呈正相关关系。而TCGA数据库中结果也显示在食管癌中PSMD14的高表达往往预示着患者的不良预后。以上这些发现表明,PSMD14作为去泛素化酶,能够在翻译后水平上调节Snail的表达水平,从而调控食管鳞状细胞癌的进展与转移。另一方面,我们又利用部分去泛素化酶的cDNA文库筛选能够调节Snail表达水平的去泛素化酶,希望能够从中发现影响Snail去泛素化水平和蛋白降解的新的去泛素化酶。通过筛选文库,我们确定了 OTUB1能够上调Snail表达,并在随后又确定了两者存在相互作用与细胞内的共定位。通过对去泛素化酶功能失活形式的OTUB1MUT3的研究,我们发现去泛素化酶OTUB1发挥抑制Snail多聚泛素化和蛋白酶体降解,增强Snail稳定性的功能依赖于OTUB1的酶活性。在功能研究上,OTUB1通过上调Snail蛋白水平,促进食管鳞状细胞癌的上皮间质转化过程,进而促进食管鳞癌肿瘤转移的发生。此外,OTUB1也在食管鳞状细胞癌中高表达且提示患者的不良预后。在临床样本中OTUB1与Snail表达水平呈正相关,在一定程度上也反映了两者之间的调控关系。因此,OTUB1作为Snail的另一个重要的去泛素化调控的蛋白,在食管鳞癌进展与转移中也起着关键作用。综上所述,我们的研究着眼于寻找在食管鳞状细胞癌中调控Snail稳定性与降解的去泛素化酶。新发现两种去泛素化酶PSMD14与OTUB1可以抑制Snail的泛素化水平,阻碍其蛋白酶体降解途径,从而促进Snail在细胞中的积累,并由此激活Snail介导的上皮间质转化过程,促进食管鳞癌肿瘤的进展和转移。我们的研究为进一步探究肿瘤转移的机制提供了新的线索,为食管鳞癌转移的治疗提供了新的策略。
郁宏伟[2]（2020）在《基于cDNA文库研究癌症病人血浆外泌体miRNA扩增效率》文中研究指明miRNA是一种由长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子,现已证明miRNA与多种肿瘤的形成有关,控制和抑制miRNA的形成可以降低肿瘤的形成,但miRNA在细胞内的表达量很少,目前miRNA在肿瘤内的作用机制尚不完全清楚。本研究通过两种方法构建癌症病人血浆外泌体miRNA cDNA文库模板,探究影响RT-qPCR反应体系扩增效率的因素。通过在miRNA的3’端和5’端连接适配子和在3’端进行PolyA和5’端连接适配子进行模板构建,通过RT-qPCR分析扩增效率,用酶切法和磁珠分离法去除扩增中非特异性扩增。主要实验结果如下:在miRNA稳定性实验中,将miRNA储存在不同温度,pH和时间条件下,通过RT-qPCR反应得到Ct值,通过标准曲线定量计算miRNA浓度,通过对不同影响因素进行定量分析后优化最佳储存条件,短时间储存可以在4℃,长时间储存在-80℃,储存缓冲液为中性。在模板构建实验中,第一种方法在miRNA的3’端和5’端分别连接一段适配子,通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证模板构建成功,并进行RT-qPCR实验,实验结果出现非特异性扩增曲线。第二种方法在3’端PolyA,在5‘端连接一段适配子,变形聚丙烯酰胺凝胶电泳验证模板构建成功,qPCR实验结果出现非特异性扩增曲线。两种方法由于非特异性扩增扩增效率较低。在非特异性扩增去除实验中,非特异性扩增来源于5’端未连接的适配子,通过phi29DNA聚合酶,核算外切酶T（EXOT酶）和磁珠分离去除5’端过量适配子,phi29DNA聚合酶和核算外切酶T降解效率和特异性低,9%PEG磁珠缓冲液沉淀大片段,15%PEG磁珠缓冲液沉淀目标片段,磁珠分离效率较高。在细胞和癌症病人血浆外泌体验证实验中,成功构建293T细胞总RNA和癌症病人血浆外泌体miRNA的RT-qPCR反应模板。
陈钶[3]（2019）在《1、核受体共激活因子NCoA6在肝细胞性肝癌发生发展中的作用及其分子调控机制的研究2、腹腔镜对比开腹右半肝切除术治疗肝细胞性肝癌的倾向性得分配对对照研究》文中认为原发性肝细胞性肝癌是全世界发病率最高的恶性肿瘤之一,尤其在中国,每年无论发病人数或死亡人数均占了全球肝癌患者总数的一半以上。肝癌是一种由多种危险因素导致各种分子机制异常改变的复杂疾病。虽然以手术为主的综合治疗取得了一定的进步,然而肝癌患者总体预后仍然较差。寻找能够用于肝癌早期诊断和治疗的靶点是改善患者预后的重要方法。NCoA6是诸多核激素受体和重要转录因子基因活化所必须的一种多功能的共激活因子,对机体正常生长、发育、创伤愈合以及维持能量平衡等发挥重要作用。有研究发现NCoA6在乳腺癌、结直肠癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、黑色素瘤等众多恶性肿瘤中表达上调,但NCoA6在肝细胞性肝癌中的表达情况和具体作用仍不明确。因此本文第一部分通过检测NCoA6在肝癌组织和细胞株中的表达情况,结合一系列体内外实验,详细阐述NCoA6在肝癌中的表达,并进一步探索该基因参与肝癌发生发展的生物学机制。如前所述,手术仍是目前肝癌综合治疗的最重要组成部分。但传统的开腹手术在治疗疾病的同时也造成了巨大的创伤。以腹腔镜技术为代表的“微创外科”被认为是21世纪外科发展的两大方向之一。近些年来腹腔镜肝脏手术发展迅猛。但肝细胞性肝癌患者往往合并有肝硬化、肝功能不全,这类患者易出血、对手术的耐受性差。若肿瘤位于右肝需行右半肝切除,对这类患者在腹腔镜下完成右半肝切除手术难度大、风险高,因而相关的研究报道甚少。因此本文第二部分回顾性分析了本中心因肝细胞性肝癌行右半肝切除的病例,将病例分为腹腔镜和开腹右半肝切除组,并使用倾向性指数配对的方法,对比分析两组间围手术期临床病理指标、术后恢复及并发症情况、肿瘤远期根治效果等,以探讨腹腔镜右半肝切除治疗肝细胞性肝癌的手术经验、安全性、有效性和应用价值。第一部分:核受体共激活因子NCoA6在肝细胞性肝癌发生发展中的作用及其分子调控机制的研究第一节:NCoA6在肝细胞肝癌中的表达及其与临床病理特征之间的相关性分析方法:对Oncomine和TGCA等数据库进行检索,运用生物信息学方法分析NCoA6在肝细胞肝癌中的表达情况以及与预后的相关性。运用PCR、Westernblot和免疫组织化学技术检测NCoA6在肝癌细胞株以及临床肝癌组织和癌旁正常组织中的表达情况,分析NCoA6与患者临床病理特征及预后的相关性。结果:生物学分析发现NCoA6在肝细胞肝癌中显着升高,并且与患者预后有显着相关性。PCR和Western blot结果证实NCoA6在肝癌细胞株和临床肝癌组织中呈高表达。对103例肝癌组织进行免疫组化分析,并结合肝癌患者的临床病理特征,我们发现NCoA6的高表达与患者的肝癌肿瘤大小密切相关（p=0.004）。结合患者的随访数据,进行Kaplan-Meier生存分析,结果发现NCoA6表达高的患者术后5年生存率显着低于表达较低的患者（p=0.01）。COX多因素分析发现,NCoA6为肝癌患者总生存期和无瘤生存期的独立危险因素（p<0.05）。结论:NCoA6在肝癌细胞系以及患者肿瘤组织中呈异常高表达,并且与患者的预后存在明显相关性。第二节:NCoA6对肝细胞肝癌生物学行为的调控作用方法:通过体外转染小干扰RNA和感染慢病毒构建NCoA6敲减肝癌细胞株,通过CCK-8细胞增殖实验、克隆形成实验、EdU、流式细胞周期实验、流式细胞凋亡试验、Transwell细胞迁移/侵袭实验以及裸鼠皮下成瘤实验,并结合Western blot相关蛋白检测结果,观察和分析NCoA6对肝癌细胞周期、凋亡、增殖、迁移等能力的影响。结果:敲减NCoA6能明显抑制肝癌细胞株Huh7和HCC-LM3的增殖,发生细胞周期阻滞,促进细胞凋亡,并改变细胞周期和凋亡相关蛋白,但对细胞侵袭、迁移能力无影响,不改变EMT特征蛋白的表达。裸鼠肝癌移植瘤实验发现敲减NCoA6能显着抑制肿瘤的生长。结论:NCoA6参与调控肝癌细胞体外增殖、细胞周期、凋亡和体内成瘤能力,但对癌细胞的迁移和侵袭能力无明显影响。第三节:NCoA6通过PI3K/Akt/mTOR和NF-κB信号通路促进肝癌细胞增殖方法:利用基因表达谱芯片技术筛选NCoA6调控的下游靶基因。经qRCR验证基因芯片结果可靠后,对差异基因进行GO和KEGG富集分析,以判定差异基因主要影响的生物学功能和通路。根据富集分析结果并结合文献挑选可能受调控的信号通路,采用Western blot检测这些通路的相关蛋白表达。结果:根据富集分析结果并结合文献,我们发现NCoA6可能通过PI3K/Akt/mTOR和NF-κB信号通路调节肝癌的发生发展。Western blot检测上述两条通路相关蛋白,结果发现敲减NCoA6可以抑制这些通路的活性。结论:NCoA6通过PI3K/Akt/mTOR和NF-κB信号通路促进肝癌细胞周期进程,并抑制肝癌细胞凋亡。第二部分:腹腔镜对比开腹右半肝切除术治疗肝细胞性肝癌的倾向性得分配对对照研究方法:回顾性分析医院普外科于2007年5月至2019年2月因肝细胞性肝癌行标准右半肝切除的病例,并分为腹腔镜组和开腹组。基于年龄、性别、术前治疗、肿瘤大小和个数的1:1倾向性得分用来配对两组以减少选择偏倚的影响。分别对比两组间在配对前和配对后的临床病理学指标、术后恢复情况以及远期预后等。结果:共131例因肝细胞肝癌行右半肝切除的患者。其中腹腔镜组51例,开腹组80例。腹腔镜组中转开腹8例,中转开腹率15.7%;总体术后并发症率19.6%,无围手术期死亡病例。经倾向性得分配对后,两组各44例纳入本研究。两组间总手术时间差异无统计学意义（248.4±88.7 231.6±44.4 min,p=0.26）。但与开腹组相比,腹腔镜组术中出血显着减少[300（100-1200）500（200-2000）mL,p<0.01]。虽然腹腔镜组术后并发症率低于开腹组,但差异未达到统计学意义（18.2 29.5%,p=0.21）。腹腔镜组中位随访17（2-68）个月,开腹组中位随访15（3-103）个月。两组间3年无瘤生存率和总生存率的差异均无统计学意义。结论:腹腔镜右半肝切除治疗肝细胞性肝癌在手术安全性和肿瘤根治性上可以取得与开腹手术相似的效果。腹腔镜右半肝切除可以减少术中出血,还有可能减少术后并发症,缩短住院时间。本研究的结论需要在将来被设计严谨的更高质量对照研究进一步证实。
齐晓兰[4]（2018）在《PiggyBac转座子介导的全基因组CRISPR/Cas9文库的创建及应用》文中指出CRISPR/Cas9文库介导的全基因组筛选技术简单高效,已经被广泛地应用于病毒宿主因子筛选、肿瘤药物靶点筛选以及免疫因子筛选等多个研究领域。目前CRISPR/Cas9文库转染多数是由病毒载体介导的,而病毒文库在体内直接进行筛选受到诸多限制,因为它存在制备步骤繁琐、对实验条件要求高、具有安全风险、具有免疫原性、转染细胞类型受限等一系列问题。因此,开发一种新型的可以应用于体外和体内筛选的CRISPR/Cas9文库系统对于促进生命科学的发展具有非常重要的意义。本研究将CRISPR/Cas9技术与递送系统piggyBac（PB）转座子进行结合,创建了高效的基因打靶系统,并且在此基础上构建了靶向小鼠全基因组的PB-CRISPR/Cas9文库系统。首先,本研究以打靶小鼠Tet1、Tet2和Tet3基因为例,验证了 PB-CRISPR/Cas9打靶系统的有效性;随后,利用芯片合成技术合成了靶向小鼠全基因组的单链向导RNA（Single guide RNA,sgRNA）序列文库（文库靶向20611个编码基因和1175个microRNAs,针对每个基因设计了 4-6个sgRNAs,此外,文库中还包含1000条无意义的sgRNAs作为筛选成功与否的参考,共计130209条sgRNAs）,将其克隆到PB载体上获得了 PB-CRISPR/Cas9文库系统;对文库进行高通量测序分析发现,构建的文库中sgRNAs的数量占芯片合成文库的94.5%,并且在各染色体上均匀分布。结果证明PB-CRISPR/Cas9文库构建成功。为了验证PB-CRISPR/Cas9文库是否可以在体外进行高效稳定的筛选,本研究利用文库系统在小鼠胚胎干细胞中进行了多能性维持负调控因子的筛选。通过对Nanog-GFP报告系统的小鼠胚胎干细胞进行文库转染和严格筛选,获得了可以在分化培养基中长期传代的细胞;多能性因子的免疫荧光染色以及多能性基因表达检测结果表明,这些细胞仍然维持在多能性状态;对这些细胞中sgRNAs进行高通量测序分析发现,5次重复实验均得到了 Tcf7l1、Csnkla1、Socs3和Flcn等与干细胞自我更新维持相关的负调控因子。结果证明本研究创建的PB-CRISPR/Cas9文库能够在体外高效稳定地进行规模化筛选。为了验证PB-CRISPR/Cas9文库在体内环境下进行筛选的可行性,本研究利用文库系统在小鼠活体内进行了肝脏肿瘤抑制因子的筛选。通过尾静脉注射的方法将文库载体和肿瘤诱导背景载体(hNras（il2V过表达以及Cdkn2a敲除）转入到3-4周龄野生型ICR公鼠的肝脏细胞中,45-60天后实验小鼠产生了肝脏肿瘤;苏木精伊红染色和肿瘤标志蛋白的免疫组化染色结果表明,这些肿瘤大多数为肝内小胆管上皮细胞来源的肝内胆管细胞癌;对肝脏中的sgRNAs进行高通量测序分析,得到了Trp53、Cdkn2b、Parm1和Sel1l2等与肝脏肿瘤发生相关的肿瘤抑制因子。结果证明PB-CRISPR/Cas9文库可以在体内直接进行筛选应用。综上所述,本研究创建了靶向小鼠全基因的PB-CRISPR/Cas9文库系统,利用该文库系统在小鼠胚胎干细胞中筛选获得了多能性维持负调控因子,并且在活体小鼠肝脏中筛选获得了肝脏肿瘤抑制因子,体外和体内的结果均证明PB-CRISPR/Cas9文库系统筛选高效,应用便捷。这一系统的建立为今后在体内外的筛选提供了新的选择和思路。
刘京鸽[5]（2017）在《大白猪出生前后肝脏组织microRNA和mRNA深度测序分析及IGF-1基因差异表达调控机制研究》文中提出肝脏是分泌产生IGF1的主要场所。大量研究发现,类胰岛素样生长因子1（Insulin-like growth factor 1,IGF1）与其受体（IGF1R）以及相关结合蛋白（IGFBPs 1-6）组成的系统对动物的生长发育及代谢具有关键的调控作用。本项目组前期选择了出生前三个时期（妊娠50日胎龄、妊娠70日胎龄及妊娠90日胎龄）及出生后5个时期（出生当天、20日龄、70日龄、120日龄、180日龄）猪肝脏组织为试验材料,对IGF1在出生前后猪的肝脏中的表达模式进行了检测,研究结果显示,IGF1出生前的表达水平相对较低,出生后的表达量即出现了显着性的增加。尽管如此,IGF1在出生前后表达量的显着性变化是发生在妊娠90日龄至出生当天这段时间中的某一个节点,以及造成IGF1出生前后表达模式差异的分子调控机制仍不清楚。因此,本试验新增了妊娠110日龄阶段的猪肝脏组织,完善了IGF1在妊娠90日龄至出生当天的表达模式,并初步研究了 IGF1出生前后表达差异的分子调控机制。作为哺乳动物体内最大的内脏器官之一,肝脏表现出分泌多种激素的内分泌及外分泌的特质,在多种代谢的过程中发挥重要的作用。肝脏可合成分泌载脂蛋白及脂蛋白、脂代谢酶,表达脂蛋白受体摄取脂质等方式,维持机体的脂肪平衡状态,是研究机体脂代谢的合适靶器官。然后,妊娠时期及出生后的肝脏在脂代谢功能中所发挥的作用存在明显的差异,目前对不同动物的肝脏组织microRNA（miRNA）及mRNA的表达差异及功能鉴定已经有部分研究报道,但针对猪出生前后不同发育期肝脏组织差异表达的miRNA、mRNA,以及其所参与的生物学过程及通路的研究却鲜见报道。MiRNA是一种长约22bp的非编码RNA,通过表观遗传调控的方式参与了生物体一系列的生物学过程,包括细胞生长、细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡、糖代谢、脂肪成与分解及蛋白质的合成与分解等,因而受到了诸多科研工作者的关注。转录组高通量测序能够针对某一特定时期的某一特定组织或者是细胞挖掘出所有的基因及miRNA,对二者的整合分析可以准确的、深入的鉴定出影响猪肝脏组织发育相关及参与脂代谢的关键miRNA及基因,可以帮助我们更全面的了解肝脏发育及脂代谢等调控的分子机理。因此,本研究以大白猪妊娠70日龄及出生后70日龄猪的肝脏组织为试验材料,每个时期选取4个个体,共计8个样本进行了如下内容的研究:（1）通过RNA-Seq技术,对大白猪出生前后两个时期的肝脏组织进行高通量测序,通过数据分析鉴定出出生前后肝脏组织中差异表达的miRNA和mRNA,并对两个转录组的数据进行联合分析。所获得的研究结果为进一步了解miRNA对肝脏组织发育及脂代谢的调控提供坚实有力的理论基础;（2）研究了转录因子C/EBPβ影响IGF1表达的转录调控机制;（3）研究C/EBPβ在猪肝脏中的表达规律及其表达的调控,并探讨其出生前后表达水平显着性变化的机制;（4）从表观调控的角度,探讨IGF1启动子区甲基化差异对其表达的影响;（5）根据miRNA及mRNA测序结果、从表观调控的角度探究了潜在调控IGF1表达的miRNA。根据以上研究内容所获得的研究结果如下:1.大白猪妊娘70日龄胎猪（P70）及70日龄仔猪（D70）肝脏组织miRNA测序分析本研究共构建了 8个miRNA文库（每个发育期分别建立了 4个肝脏样本测序文库）,平均获得约28M（百万）的raw reads。去掉无效数据后,分别获得约20M（百万）、可用于后续分析的clean reads。长度统计分析显示,肝脏组织的miRNA主要分布在21-23nt范围内,符合miRNA的长度分布特点。进一步,对所获得的miRNA进行表达差异分析、聚类分析、GO富集分析以及KEGG通路富集分析。差异表达分析的结果显示:本试验gong共鉴定了 116个差异表达的miRNA,较70日龄仔猪（D70）而言,61个是表达上调的,55个是表达下调的。而聚类分析的结果显示,同一生长发育期的4个样本可以很好的聚到一起,说明样本的整齐度较高,后续进行的一系列生物信息学分析更加可靠。另外,GO功能注释及KEGG通路富集分析发现,主要富集的GO条目有细胞分化过程、发育过程、代谢过程、信号传导过程及生物学调节等条目;主要富集的KEGG条目有cAMP信号通路、Wnt信号通路、Notch信号通路、PI3K-Akt、MAPK信号通路、FoxO信号通路、脂肪细胞因子信号通路、甲状腺激素信号通路等。这些通路对动物肝脏的发育及脂代谢的过程具有重要的作用。在此基础上,随机挑选10个差异表达的的miRNA进行qRT-PCR验证,结果表明,荧光定量结果同高通量测序获得的结果一致,表明测序结果真实可靠。2.大白猪妊娘70日龄胎猪（P70）及70日龄仔猪（D70）肝脏组织mRNA测序分析本研究gong共构建了 8个mRNA文库（每个发育阶段分别选取4个肝脏样本）,测序分析共鉴定了25323个已知的基因、9986个新的转录本。差异表达分析显示,两个不同发育期共存在4916个差异表达的mRNA,较70日龄仔猪（D70）而言,2502个基因是表达上调的,2414个基因是表达下调的。其中126个基因仅在P70样本中表达,75个基因仅在D70样本中表达,4715个基因在两个生长期的样本中均有表达。对差异表达的miRNA进行层次聚类分析,结果显示同一生长发育的4个样本可以很好的聚到一起,说明统一阶段重复样本的整齐度较高。进一步,对差异表达的mRNA进行GO功能注释及KEGG通路富集分析发现,分析结果显示,主要富集的GO条目包括代谢、应激和免疫反应等;KEGG条目包括DNA复制、细胞周期、脂肪酸代谢、糖代谢、药物代谢、氨基酸降解、PPAR信号通路、类固醇激素合成等过程。随机挑选10个差异表达的的mRNA进行qRT-PCR验证,结果显示,荧光定量结果同高通量测序所获的的结果一致,说明了本次测序结果真实可靠。3.MiRNA及mRNA测序结果的整合分析在高通量转录组测序基础上,本研究使用miRanda及TargetScan等软件对差异显着上调的的miRNA进行靶基因预测,并与mRNA测序中获得的差异显着性下调的基因进行交集分析,以此获得“表达量上调的miRNA-表达量下调的mRNA对”,本研究共获得60对“上调miRNA-下调mRNA”;对差异显着下调的的miRNAs进行靶基因预测,并与mRNA测序中获得的差异显着性上调的基因进行交集分析,以此获得55对“下调miRNA-上调mRNA”。进一步GO及KEGG富集分析结果显示,主要富集的GO条目为血小板生成素受体活性及抗原结合等;主要富集的KEGG条目为TNF及免疫系统等信号通路上。4.双荧光素酶报告系统研究潜在转录因子C/EBPβ对IGF1的表达调控荧光定量PCR结果显示,不同发育期C/EBPβ mRNA水平的表达模式同IGF1 mRNA表达模式相似:出生后的表达量显着的高于出生前的表达量。双荧光素酶报告试验显示,C/EBPβ可以显着性的增加野生型的IGF1启动子区的荧光素酶活性,位点2突变后,荧光酶活性较野生型而言,有了极显着性的下降;位点1突变后,荧光素酶活性有了细微的下降,但差异并不显着;位点1、2同时突变后,其荧光素酶活性较野生型而言有了极显着性的下降。以上结果说明C/EBPβ主要通过作用于IGF1启动子区的位点2处,从而调控IGF1基因的表达。5.猪出生前后肝脏组织IGF1不同型启动子甲基化模式的研究针对大白猪IGF1基因的潜在Ⅰ型及Ⅱ型启动子区序列进行甲基化测序,结果分析显示,大白猪妊娠70日龄（P70）、妊娠110日龄（P110）、出生当天（D0）及出生70日龄（D70）的肝脏组织、共16个样本中,IGF1的两个潜在的启动子区域的甲基化水平并没有显着性的变化,而只是在个别位点存在细微差异,但这种差异并不显着。研究结果表明IGF1在出生前后肝脏中的急剧变化并不是由其启动子区的甲基化差异所导致。6.miR-18b及miR-130b可以直接靶向IGF1的3,-UTR区,从而调控其表达MiRNA及mRNA测序联合分析结果显示,IGF1是miR-1 8b和miR-130b直接靶向基因,且miR-18b和miR-130b与IGF1呈现相反的表达模式。在此基础上,本研究采用qRT-PCR技术对他们的表达模式进行了检测,结果表明,荧光定量结果与测序结果完全一致。进一步,本研究利用双荧光素酶报告系统对它们之间的调控关系进行了验证,结果表明miR-18b及miR-130b可以通过直接靶向IGF1 3’-UTR区抑制IGF1的表达。7.猪出生前后肝脏组织C/EBPβ上游潜在转录因子表达模式研究生物信息学分析显示,C/EBPβ上游调控区域存在多个潜在的转录位子结合位点,因此本研究利用荧光定量PCR对C/EBPβ上游潜在转录因子在猪出生前后肝脏组织中的表达模式进行了检测,荧光定量PCR结果显示,不同发育期C/EBPβ的潜在转录因子STAT3,CALR,CUGBP1,Sβl的mRNA水平的表达模式同C/EBPβmRNA表达模式相似,即出生后的表达量显着的高于出生前的表达量;而Myb,RARA及SREBP mRNA水平的表达同C/EBPβmRNA表达模式相反,即出生前的表达量显着的高于出生后。
林俊献[6]（2016）在《ADAMs相关基因在肝癌细胞中的表达及功能分析》文中进行了进一步梳理背景ADAMs家族成员属于I型跨膜蛋白,具有相似的基本结构,都含有去整合素和金属蛋白酶功能结构域,与细胞外基质的降解,细胞-细胞的黏连,细胞-基质的黏连及信号转导等多种细胞功能有关。虽然对ADAMs家族的功能已经有很多了解,但是由于其结构复杂,成员众多且组织分布具有特异性,仍需要进一步研究。目的构建去分化处理的常氏肝癌细胞（一种人源肝癌细胞）的c DNA文库,免疫筛选并克隆与分化相关的ADAMs基因,并初步研究其功能。方法1.Western blot方法检测DM（去分化培养基）处理的常氏肝癌细胞中蛋白表达的变化。2.构建DM处理的常氏肝癌细胞c DNA文库。3.用通用抗体对文库进行免疫筛选,克隆基因全长并测序分析。4.构建ARP1的原核表达载体,用SDS-PAGE和Western blot方法分析ARP1的功能。5.用蛋白水解酶复性电泳及SDS-PAGE分析大鼠的包括肝在内的17种组织器官的ADAMs的组成及蛋白图谱和蛋白水解酶谱。结果1.与未经处理的常氏肝癌细胞相比,DM处理的常氏肝癌细胞出现了30k D、50k D和105k D三种ADAMs。其中30k D和50k D ADAMs为DM所诱导。2.经检测,成功构建了DM处理的常氏肝癌细胞的c DNA文库。3.用ADAMs通用抗体对文库进行了免疫筛选和基因全长克隆,测序分析并注册了4个物种特异性的与ADAMs相关的基因。4.成功构建了ADAM相关基因1（ARP1）的原核表达载体,用活性电泳、Western blot方法分析发现,ARP1表达产物具有偏碱性蛋白水解酶活性,可降解明胶,并且可以和ADAMs通用抗体结合。5.通过分析不同组织器官的ADAMs的分布及蛋白图谱和蛋白水解酶谱,结果显示ADAMs的分布及酶活具有很大差异。结论本研究通过DM处理常氏肝癌细胞,构建c DNA文库并进行表达文库免疫筛选等方法,初步验证了DM处理可以诱导常氏肝癌细胞合成30k D和50k D ADAMs;构建的c DNA文库质量达标,可用性强;建立了切实可行的表达文库免疫筛选方法;注册了4个物种特异性的与ADAMs相关基因;构建了ADAMs相关基因1（ARP1）的原核表达载体,表达产物具有偏碱性蛋白水解酶活性,可以和ADAMs通用抗体结合。在不同组织器官中,ADAMs的分布及酶活具有很大差异。以上结果为进一步研究ADAMs及其相关基因的功能提供了重要资料。
陈敬林[7]（2016）在《HSPC238相互作用蛋白的初步筛选及验证》文中研究说明研究背景和目的原发性肝细胞癌（Hepatocellular caicinoma,HCC；简称肝癌）是临床上常见的恶性肿瘤,近年来随着乙型和丙型肝炎病毒的感染率在世界范围内的增加,肝癌的发病率也逐渐上升,有报告显示,每年有新发肝癌超过70万例。目前肝癌已成为世界上第五大最常见的恶性肿瘤,肝癌致死率在癌症死亡率中排名第三。只有约15%的肝癌有机会通过手术治愈（例如,肝切除或移植）或微创局部治疗（例如,射频消融）。随着医学影像等技术手段的提高,肝癌的早期诊断和治疗虽取得了巨大进步,但长期预后仍不理想,有学者研究报道,肝癌患者平均的5年生存率仅为8.9%。大多数肝癌是由慢性肝病（如乙肝、丙肝、酒精肝等）发展而来的,但仍有15-50%的新发病例病因不清。肝癌的早期转移是影响其临床预后的一个重要因素,在这一复杂过程中,涉及到多基因、多蛋白的参与。当前对肿瘤发生发展机制的研究大多关注癌基因、抑癌基因、小分子RNA等单个或多个分子的作用和功能,而蛋白质作为基因编码产物,是生命活动的最终执行者,其在肿瘤中的表达、对肿瘤发生发展所起的作用,仍有待阐明。随着分子生物学及蛋白质组学技术的发展,在细胞内执行生物学功能的蛋白质又重新得到重视,蛋白质分子间的相互作用作为蛋白质组学研究的主要内容之一已成为近年来的研究热点。蛋白质之间的相互作用不但能够提供蛋白质本身功能的信息,而且能够提供蛋白质在代谢调控、信号传导和复合体中起作用的信息,这为揭示肿瘤发生发展机制带来了新的希望。锌指蛋白具有指状结构,常出现在DNA结合蛋白中,属于真核转录因子的一大家族,锌指蛋白结构域有胱氨酸和组氨酸残基以及锌离子构成。根据锌离子与这两种氨基酸的组合方式,锌指蛋白可以分为C2H2、C3、C4等多种类型。许多锌指蛋白除了能够识别特定的DNA序列,还参与蛋白质与RNA和蛋白质-蛋白质相互作用。本研究中的HSPC238蛋白,其基因组全长716个碱基,编码153个氨基酸,其第40至60氨基酸残基能够形成特殊的RING指结构域,故也是一种C3HC4型锌指蛋白。本课题组在前期研究中发现HSPC238蛋白是一种新的抑癌蛋白。我们通过对139例具有完整临床随访资料的肝癌组织标本进行了免疫组织化学检测,结果显示：HSPC238蛋白在正常肝组织中的表达水平显着高于肝癌组织,与肝癌患者的年龄、性别及临床分期无相关性,但与肝癌的分化程度呈负相关；在体外培养的SMMC7721细胞系中改变HSPC238的表达,结果发现,上调HSPC238的表达可抑制SMMC7721细胞株的增殖和克隆形成,下调HSPC238的表达可促进SMMC7721细胞株的增殖和克隆形成；进一步通过体内裸鼠成瘤实验证实,上调HSPC238可抑制裸鼠体内肿瘤细胞的增殖,干扰HSPC238的表达则可促进裸鼠体内肿瘤的增殖；进一步深入研究发现,HSPC238通过ERK/MAPK途径对肝癌细胞发挥抑制作用。这些前期研究结果为探索肝癌抑癌机制及寻找新的肝癌诊断潜在标志物提供了新的理论依据和研究靶点。除上述研究结果外,国内外尚无对HSPC238蛋白与肝癌功能的相关报道,为进一步深入研究HSPC238在肝癌中的抑癌作用机制,本实验拟通过酵母双杂交系统筛选与HSPC238相互作用的目标蛋白,并进一步通过激光共聚焦、免疫共沉淀及pull-down等实验技术对筛选到的目标蛋白进行验证,从而为全面研究HSPC238的功能及其在肝癌中的作用机制奠定基础。方法：1.重组诱饵质粒载体的构建、酵母转化及自激活检测1.1重组诱饵质粒载体的构建将装载了人工合成的目的基因HSPC238的质粒载体（pUC19-HSPC238质粒,前期研究中制备并保存）通过转化大肠杆菌Top10感受态细胞进行扩增和质粒抽提,以获取足量的目的基因片段；所得质粒（pUC19-HSPC238质粒）经电泳、测序等方法鉴定后与酵母双杂交诱饵载体质粒pGBKT7双酶切后连接,初步获得含诱饵蛋白（HSPC238）的重组载体pGBKT7-HSPC238,连接体系再次转化大肠杆菌Top10以扩增重组载体（pGBKT7-HSPC238）,随机挑取3个转化子接种于带卡那抗性的液体LB培养基过夜,抽提质粒并电泳初步鉴定质粒,酶切进一步鉴定是否插入了目标片段（HSPC238）。1.2诱饵载体的酵母转化及自激活检测经过鉴定的pGBKT7-HSPC238载体与pGADT7空载体采用醋酸锂法共转化酵母AH109细胞,同时根据试剂盒说明书中的要求设置阳性及阴性对照,分别涂布不同营养缺陷性平板,通过蓝白斑筛选及营养缺陷筛选,判断诱饵蛋白HSPC238对酵母AH109是否存在毒性及自激活活性。2.人胎肝cDNA文库的筛选2.1文库质粒的扩增、抽提和转化筛选稀释文库菌液后涂布LB+Amp平板扩增培养,抽提文库质粒,检测所得文库质粒的浓度及质量。用含有正确pGBKT7-HSPC238载体的感受态酵母菌AH109作为受体菌,将文库质粒转入其中,观察转化结果。2.2阳性克隆的鉴定和质粒抽提用绒布对筛库平板（SD-Trp-Leu-His平板）进行影印清除,以消除背景生长菌落的影响,挑取再次长出的转化子依次经SD-Trp-Leu-His+3AT平板、SD-Trp-Leu-His-Ade平板及蓝白斑筛选,将能同时通过3个报告基因（LacZ,HIS3和ADE2）检测的阳性克隆菌株接种于SD-Leu液体培养基,振荡培养过夜后抽提酵母质粒,转化大肠杆菌Top10进行扩增培养,转化子转接含有Amp的LB液体培养基扩增后抽提质粒。2.3阳性克隆质粒的BLAST比对分析及回转验证对质粒进行DNA测序和BLAST比对,结合生物信息学分析,确定阳性克隆菌落所含目标蛋白的基因名。将抽提到的阳性克隆质粒分别与诱饵基因质粒（pGBKT7-HSPC238）共转化同一个酵母细胞,再次检验每一对蛋白在共转化的酵母细胞中对3个报告基因（LacZ, HIS3和ADE2）的激活情况。对其中重复出现的阳性克隆只选取其中ORF （Open Reading Frame,开放阅读框）序列最长的一个。最后根据文献分析,初步锁定五种可能与HSPC238相互作用的目标蛋白用于后续研究。3. HSPC238与目标蛋白相互作用的鉴定3.1激光共聚焦定位检测构建HSPC238、目标蛋白的过表达质粒,其中HSPC238蛋白携带Flag标签（pcDNA3.1-HSPC238-Flag）,目标蛋白携带His标签（pcDNA3.1-目标蛋白-His）。分别将pcDNA3.1-HSPC238-Flag质粒与pcDNA3.1-目标蛋白-His质粒瞬时共转染293T和SMMC7721细胞,依次加入一抗（兔源性anti-HSPC238、鼠源性anti-目标蛋白）、二抗（CY3标记的羊抗兔二抗、FITC标记的羊抗鼠二抗）后孵育,通过激光共聚焦显微镜观察HSPC238及目标蛋白在293T和SMMC7721细胞中的共定位情况,以确定目标蛋白与HSPC238蛋白是否在细胞内存在空间相遇的可能。3.2免疫共沉淀分析HSPC238与目标蛋白是否在体内存在相互作用以HSPC238过表达质粒（pcDN A3.1-HSPC238-Flag）和目标蛋白过表达质粒（pcDNA3.1-目标蛋白-His）分别共转染293T、SMMC7721细胞株,裂解细胞后收集蛋白上清,以anti-Flag抗体进行免疫共沉淀以获取共沉淀物,再分别以anti-His、anti-Flag、anti-HSPC238、anti-目标蛋白做免疫印迹,同时与细胞裂解液比较,以确定HSPC28和目标蛋白是否存在相互作用。3.3 Pull-Down分析HSPC238与目标蛋白是否在体内存在相互作用以HSPC238过表达质粒（pcDNA3.1-HSPC238-Flag）和目标蛋白过表达质粒（pcDNA3.1-目标蛋白-His）分别共转染293T、SMMC7721细胞株,裂解细胞后,收集蛋白上清,镍柱纯化携带His标签的目的蛋白,BCA法测定洗脱液浓度,选取浓度最高的一组点样,以anti-Flag、anti-HSPC238、anti-His、anti-目标蛋白等抗体做免疫印迹,同时与细胞裂解液比较,以确定HSPC238和目标蛋白是否存在相互作用。结果：1.重组诱饵质粒载体的构建、酵母转化及自激活检测扩增后的pUC19-HSPC238质粒与诱饵质粒pGBKT7双酶切后,在T4连接酶的作用下成功连接,连接体系转化大肠杆菌Top10扩增后抽提质粒电泳并测序表明：包括sfiI酶切位点在内的序列均未发生突变,重组质粒pGBKT7-HSPC238构建成功；进一步转化酵母AH109细胞,经通过蓝白斑筛选及营养缺陷筛选,三种报告基因（LacZ, HIS3和ADE2）均未激活,即诱饵蛋白HSPC238对酵母AH109不存在毒副作用及自激活活性。2.人胎肝cDNA文库的筛选文库菌经稀释后扩增并抽提质粒,最终得到的文库质粒浓度为600ng/ul。涂布LB+Amp抗性平板,随机挑取单克隆进行质粒抽提,经琼脂糖凝胶电泳检测,所得文库质粒均插入了不同条带的目的基因,即文库质量合格。将此文库质粒转入含有正确pGBKT7-HSPC238载体的酵母菌AH109,用绒布对筛库平板（SD-Trp-Leu-His）进行影印清除后,继续培养两周,初步得到124个转化子菌落。转接SD-Trp-Leu-His+3AT平板,排除11个由于AH109菌株中his3基因渗漏表达所造成的假阳性菌落。再次转接SD-Trp-Leu-His-Ade平板,排除7个不能激活HIS3和ADE2报告基因的假阳性菌落。最后检测LacZ报告基因,通过蓝白斑筛选,再次排除掉不能变蓝的42个假阳性菌落,最终得到64个可能存在与人HSPC238相互作用蛋白的可疑菌落。将同时通过了3个报告基因（LacZ, HIS3和ADE2）检测的64个可疑阳性克隆菌株转接SD-Leu液体培养基,扩增培养后抽提酵母质粒,转化大肠杆菌Top10进行扩增,转化子转接含有Amp的LB液体培养扩增后抽提质粒,对质粒进行DNA测序和BLAST比对结合生物信息学分析,表明它们分别编码19种不同的蛋白质。且编码该19种蛋白的阳性菌落均通过回转验证,最后经查阅文献,我们选定最有可能与HSPC238相互作用的五种蛋白（HMOX1, MT2A, RPS27A, UBB, RPL5）用于后续研究。3. HSPC238相互作用蛋白的鉴定激光共聚焦技术观察显示,HSPC238蛋白与目标蛋白（HMOX1, MT2A, RPS27A, UBB, RPL5）在293T和SMMC7721细胞中都分布于细胞质中,在胞质中高度共存,即有在胞质中存在相互作用的可能。免疫共沉淀前期实验中,pCDNA3.1-RPL5-His质粒瞬时转染293T细胞,以anti-His尝试多次仍无法检测到RPL5蛋白的表达,故排除RPL5蛋白,后续实验仅以HMOX1, MT2A, RPS27A, UBB作为研究对象。免疫共沉淀实验结果表明,共转染组裂解细胞收集的蛋白上清液,经anti-Flag抗体获取共沉淀物后,经anti-His、anti-Flag、anti-HSPC238、anti-目标蛋白（HMOX1, RPS27A, UBB, MT2A）等抗体做免疫印迹,均能检测到正确大小的目的条带,且与细胞裂解液中的表达位置基本一致,由此,我们推测HSPC238与HMOX1, RPS27A, UBB, MT2A等目标蛋白在293T和SMMC7721细胞株内发生了结合。Pull-Down实验表明,共转染组裂解细胞收集的蛋白上清液,经镍柱纯化携带His标签的蛋白复合物,洗脱后选取洗脱液浓度最高的一组点样,以anti-Flag、 anti-HSPC238、anti-His、anti-目标蛋白（HMOX1, RPS27A, UBB, MT2A）等抗体做免疫印迹,结果显示洗脱液中能检测到预期的目的条带,且与裂解液组的泳带位置基本一致,由此我们推测HSPC238与HMOX1, RPS27A, UBB, MT2A存在相互作用。结论：本实验成功构建了HSPC238真核表达载体,通过酵母双杂交技术从胎肝cDNA文库中筛选到与HSPC238相互作用的目标蛋白,经文献分析初步锁定几种特定蛋白后,通过激光共聚焦、免疫共沉淀及Pull-Down实验证实了HSPC238与目标蛋白在细胞体内存在相互作用。本实验为进一步研究HSPC238的功能及在肝癌中的作用机制奠定了基础。
傅倩云[8]（2015）在《中国人肝癌和肺癌细胞CPR技术的建立和耐药相关基因的初步筛选》文中研究指明肿瘤的耐药状态是化疗失败的主要原因,解析其耐药机理来指导药物的个性化治疗是临床急需解决的瓶颈问题。论文采用了病毒循环包装法（Cyclical Packaging Rescue,CPR）,对来源于中国人肺腺癌细胞株LTEP-a-2和中国人肝癌细胞株Bel-7405的c DNA文库进行耐药基因的初步筛选,为解释肿瘤耐药机制提供了依据,也为肿瘤精准化治疗方案的确立提供了新的思路。论文的主要研究结果如下:1.鉴于种属的差异性,论文以中国人肺腺癌细胞株LTEP-a-2和中国人肝癌细胞株Bel-7405为研究材料,采用SMART（switching mechanism 5’end of RNA transcript）法构建其全长的c DNA文库,以期达到具有代表中国人肺癌和肝癌基因特征的目的。所建的c DNA文库的库容量达到了107数量级,文库片段大小分布在0.4-2 kb之间,保障了从文库筛选耐药相关基因完整性的目的。2.以Phoenix?逆转录病毒表达试剂盒中的包装细胞Phoenix?293T为宿主细胞,将c DNA文库片段插入p LIB载体的LTR之间,形成逆转录病毒c DNA文库。转染宿主细胞,构建含c DNA片段多样性的逆转录病毒表达系统。实时定量PCR（RT-PCR）法测得含c DNA片段的逆转录病毒滴度约为1.0×105 copies/μL,满足耐药基因筛选的库容量需求。以干预药物阿霉素（ADM）、敏感的小鼠成纤维细胞（NIH-3T3）为材料,含c DNA片段多样性的逆转录病毒感染细胞,药物干预条件下收集存活细胞;将带有逆转录病毒结构基因p GP和p E-eco的质粒共转染存活细胞,包装出含有目的 c DNA片段的逆转录病毒,形成可循环包装的病毒展示c DNA片段的方法,即CPR平台。提取存活细胞基因组DNA,PCR鉴定基因片段的多样性,验证CPR技术的可行性。3.以NIH-3T3为研究材料,采用CPR将多样性c DNA片段通过逆转录病毒展示在NIH-3T3中;定量干预药物ADM筛选后,从存活细胞中获得含目标基因的逆转录病毒。PCR分析和鉴定目标基因后,再将收集的含目标基因的逆转录病毒感染工作细胞NIH-3T3,形成CPR筛选目标基因的循环系统。论文研究获得七个基因,通过体外药物敏感实验验证发现Bcl-6相关抗凋亡基因（BAG6）、乙醛脱氢酶2（ALDH2）、人长非编码RNA（BCYRN1）和sna R非编码小RNA（H8iii sna R-A）四个基因与ADM耐药相关联。论文通过改进建立的中国人肺腺癌细胞株LTEP-a-2和肝癌细胞株Bel-7405 c DNA文库CPR技术平台,筛选获得了耐ADM的相关基因,提升了分析肿瘤耐药基因的高通量筛选手段。初步筛选获得的与耐ADM相关的基因,尚需采用其他技术进行进一步鉴定,以达到确认这些基因在肿瘤耐药机制中作用的目的。
明慧馨[9]（2015）在《鼻咽癌循环肿瘤单细胞分离方法和单细胞cDNA文库的建立》文中指出背景:鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）是我国南方及东南亚各国高发的恶性头颈肿瘤之一,其起病隐匿,极容易发生颈部淋巴结转移和远处转移,大部分患者在临床确诊时已处于中晚期。随着放疗技术的发展,早期鼻咽癌的治疗效果已得到提高,但有远处转移的鼻咽癌患者预后仍不理想,远处转移仍然是目前鼻咽癌治疗失败的主要原因。探索鼻咽癌远处转移的机制,寻找转移的生物标记和治疗靶点是目前鼻咽癌防治的可能突破点。循环肿瘤细胞（circulating tumor cells,CTC）是指从实体瘤或转移灶自发或因诊疗操作脱落至循环系统中的肿瘤细胞,是肿瘤发生远处转移的先决条件。在循环系统中找寻CTC并对其生物学特性进行研究有利于揭示肿瘤远处转移的机制。单细胞转录组分析技术能从单细胞层面研究CTC的生物学特性,从而揭示肿瘤转移机制。然而现有的利用上皮表型分选循环肿瘤细胞技术仍不能完全界定肿瘤细胞,限制了 CTC的临床应用,并给分析CTC的生物学特性带来偏倚。因此建立一个无偏倚的鼻咽癌CTC分离方法,基于此建立鼻咽癌单个CTC的cDNA文库,是鼻咽癌循环肿瘤单细胞转录组研究的关键。目的:建立鼻咽癌循环肿瘤细胞捕获和鉴定方法体系,并构建鼻咽癌循环肿瘤单细胞cDNA文库,以供下游Smart-seq2单细胞全长转录组测序。方法:本研究首先在鼻咽癌细胞系HONE1中按照Smart-seq2测序步骤建立细胞系单细胞cDNA文库,并用real-time PCR的方法检测mRNA的完整性,对cDNA文库进行质控。其次比较红细胞裂解液和淋巴细胞分离液去除血液红细胞的效果并评价两种方法对单细胞cDNA文库的影响;随后对鼻咽癌原发肿瘤组织及转移淋巴结组织进行免疫组化染色评价EpCAM和CK作为鼻咽癌CTC标志物的可行性;并进一步利用稳定表达绿色荧光的胃癌AGS-EBV-GFR细胞与健康人外周血按比例混合模拟鼻咽癌CTC模型,通过检测绿色荧光及DAPI染色后进行细胞计数评价EpCAM免疫磁珠获取CTC效率及特异性。最后从鼻咽癌患者外周血中分离CTC并进行单细胞cDNA文库构建,用RT-PCR方法检测单细胞EBV编码产物LMP2A的表达以确定单细胞来源于鼻咽癌CTC,并使用Bioanalyzer系统评价cDNA文库的质量是否符合Smart-seq2平台标准。结果:1、设计的 real-time PCR 引物 hmPOLR2A、hmPOLR2A-2 和hmPOLR2A-l能成功扩增目的片段,鼻咽癌细胞系构建单细胞cDNA文库RNA模板N端与C端起始浓度相近;2、红细胞裂解液和淋巴细胞分离液均能成功除去血液中红细胞,使用淋巴细胞分离液处理外周血构建单细胞cDNA文库成功率（50%）高于使用红细胞裂解液（16.7%）;3、EpCAM和CK在正常鼻咽粘膜上皮细胞、鼻咽癌原发肿瘤组织与转移淋巴结组织中的肿瘤细胞均有表达,EpCAM表达于细胞膜表面,在转移灶中的表达低于原发灶;4、在利用AGS-EBV-GFR细胞模拟的CTC模型中,EpCAM免疫磁珠获取CTC效率可达56.7%,所获取的细胞100%绿色荧光阳性,均为AGS细胞;5、同一例鼻咽癌患者CTC单细胞cDNA文库LMP2A检测阳性率为80%（4/5）;6、构建的鼻咽癌患者CTC单个细胞cDNA文库片段大小集中在600-2000bp,无或含少量500bp以下片段,符合Smart-seq2平台建库要求。结论:通过淋巴细胞分离液分离,结合EpCAM免疫磁珠正筛选及EBV编码产物LMP2A表达检测,可实现更大的无偏倚性分离捕获鼻咽癌CTC单细胞,由此建立的鼻咽癌CTC单细胞cDNA文库可应用于后续的Smart-seq2全长转录组测序分析。
孙伟伟,韩金红,王聪睿,任太芳,刘瑞,李端,康静,许重洁,丰慧根[10]（2012）在《含三磷腺苷的Hanks平衡盐溶液处理张氏肝癌细胞诱导新去整合素金属蛋白酶相关蛋白的表达》文中认为目的研究不同条件下张氏肝癌细胞中去整合素金属蛋白酶（ADAMs）及ADAM相关蛋白的表达和功能改变。方法用热激、含有三磷腺苷（ATP）的Hanks平衡盐溶液（HBSS）处理张氏肝癌细胞,Western blotting检测AD-AM相关蛋白,对处理过的细胞构建cDNA文库,用ADAMs通用抗体对文库进行免疫筛选,对阳性克隆的插入序列测序并进行体外表达,分析蛋白的性质。结果包含ATP的HBSS处理张氏肝癌细胞诱导出2个新的相对分子质量为30 000和50 000的ADAM相关蛋白,热激处理未出现相同的反应。对处理细胞构建了cDNA文库,筛选出1个新的有碱性蛋白酶活性的ADAM相关蛋白。结论含有ATP的HBSS处理张氏肝癌细胞可以诱导出1种新的ADAM相关蛋白。
二、常氏肝癌细胞cDNA文库的构建及质量分析(英文)（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、常氏肝癌细胞cDNA文库的构建及质量分析(英文)（论文提纲范文）
（1）转录因子Snail的去泛素化调节在食管鳞状细胞癌发生发展中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 1. 上皮间质转化相关转录因子Snail在食管癌中高表达 |
| 2. 去泛素化酶PSMD14通过调控Snail蛋白稳定性促进人食管鳞状细胞癌的肿瘤转移 |
| 3. 去泛素化酶OTUB1通过调控Snail蛋白稳定性促进人食管鳞状细胞癌的肿瘤转移 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 基金资助 |
| 已发表与学位论文相关的英文论文 |
| 文献综述 去泛素化酶在肿瘤转移中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者致谢 |
| 个人简历 |
（2）基于cDNA文库研究癌症病人血浆外泌体miRNA扩增效率（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 miRNA研究历史、现状和发展情况 |
| 1.3 miRNA的cDNA文库建立的研究历史、现状和发展情况 |
| 1.3.1 cDNA文库简介 |
| 1.3.2 cDNA文库建立主要过程 |
| 1.3.3 目前cDNA文库建立的研究现状 |
| 1.3.4 全长cDAN文库的构建策略 |
| 1.4 选题研究的主要内容和重点 |
| 1.4.1 课题的研究意义 |
| 1.4.2 课题的研究内容 |
| 1.4.3 课题的创新之处 |
| 第2章 miRNA稳定性的初步探究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验工艺及相关仪器设备 |
| 2.2.1 具体工艺 |
| 2.2.2 实验设备 |
| 2.2.3 实验试剂 |
| 2.2.4 结果分析方法 |
| 2.2.4.1 miRNA定量检测方法 |
| 2.2.4.2 miRNA定量检测 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 miRNA定量检测中标准曲线的绘制 |
| 2.3.2 时间对miRNA稳定性的影响 |
| 2.3.3 温度对miRNA稳定性的影响 |
| 2.3.4 PH对miRNA稳定性的影响 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 USR3SR+Cal01+USR5SR模板链构建 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验工艺及相关仪器设备 |
| 3.2.1 具体工艺 |
| 3.2.2 实验设备 |
| 3.2.3 实验试剂 |
| 3.2.4 结果分析方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 USR3SR磷酸化对模板链构建影响 |
| 3.3.2 USR3SR磷酸化后沉淀对模板链构建影响 |
| 3.3.3 USR3SR腺苷化对模板链构建影响 |
| 3.3.4 USR3SR-p腺苷化后沉淀对模板链构建影响 |
| 3.3.5 Cal01磷酸化对模板链构建影响 |
| 3.3.6 合成miRNA Cal01-p与USR3SR腺苷化连接对模板链构建影响 |
| 3.3.7 USR5SR磷酸化对模板链构建影响 |
| 3.3.8 USR5SR+Cal01-p+USR3SR连接反应对模板构建影响 |
| 3.4 本章小节 |
| 第4章 PolyA+Cal01-p+USR5SR模板链构建 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验工艺及相关仪器设备 |
| 4.2.1 具体工艺 |
| 4.2.2 实验设备 |
| 4.2.3 实验试剂 |
| 4.2.4 结果分析方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 Cal01-p+PolyA对模板链构建影响 |
| 4.3.2 Cal01-p和ATP用量对模板链构建影响 |
| 4.3.3 USR5SR+Cal01-p+PolyA对模板链构建影响 |
| 4.3.4 连接反应后RT对模板链构建影响 |
| 4.3.5 预扩增体系对模板链构建影响 |
| 4.3.6 qPCR体系对模板链构建影响 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 qPCR反应中的非特异性扩增 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验工艺及相关仪器设备 |
| 5.2.1 实验设备 |
| 5.2.2 实验试剂 |
| 5.2.3 结果分析方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 模板链构建中非特异性扩增的来源 |
| 5.3.2 不同酶对USR5SR去除效果影响 |
| 5.3.3 磁珠分离中不同浓度PEG对USR5SR去除效果影响 |
| 5.4 实验结果与讨论 |
| 5.4.1 磁珠去除大片段的最佳比例 |
| 5.4.2 磁珠沉淀目标片段的最佳比例 |
| 5.5 本章小结 |
| 第6章 miRNA cDNA文库模板构建验证 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验工艺及相关仪器设备 |
| 6.2.1 实验设备 |
| 6.2.2 实验试剂 |
| 6.2.3 结果分析方法 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 293T细胞培养方法 |
| 6.3.2 癌症病人血浆外泌体提取方法 |
| 6.3.3 外泌体中提取miRNA方法 |
| 6.3.4 优化体系对合成miRNA验证实验 |
| 6.3.5 优化体系对293T细胞miRNA cDNA文库模板构建验证实验 |
| 6.3.6 优化体系对血浆外泌体miRNA cDNA文库模板构建验证实验 |
| 6.4 本章小结 |
| 第七章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者和导师简介 |
| 附件 |
（3）1、核受体共激活因子NCoA6在肝细胞性肝癌发生发展中的作用及其分子调控机制的研究2、腹腔镜对比开腹右半肝切除术治疗肝细胞性肝癌的倾向性得分配对对照研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 中英文缩写词对照表 |
| 第一部分核受体共激活因子NC〇A6在肝细胞性肝癌发生发展中的作用及其分子调控机制的研究 |
| 绪论 |
| 第一节 NCoA6在肝细胞肝癌中的表达及其与临床病理特征之间的相关性分析 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二节 NCoA6对肝细胞肝癌生物学行为的调控作用 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三节 NCoA6通过PI3K/Akt/mTOR和NF-κB信号通路促进肝癌细胞增殖 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 腹腔镜对比开腹右半肝切除术治疗肝细胞性肝癌的倾向性得分配对对照研究 |
| 前言 |
| 1 资料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
（4）PiggyBac转座子介导的全基因组CRISPR/Cas9文库的创建及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 全基因组突变筛选方法概述 |
| 1.1.1 DNA诱变介导的全基因筛选方法 |
| 1.1.2 插入突变介导的全基因组筛选方法 |
| 1.1.3 RNAi介导的全基因组筛选方法 |
| 1.1.4 cDNA文库介导的全基因组筛选方法 |
| 1.2 CRISPR/Cas9全基因组筛选技术的研究进展 |
| 1.2.1 CRISPR/Cas9技术简介 |
| 1.2.2 CRISPR/Cas9筛选技术发展概述 |
| 1.2.3 CRISPR/Cas9技术在体外筛选中的应用 |
| 1.2.4 CRISPR/Cas9技术在体内筛选中的应用 |
| 1.2.5 CRISPR/Cas9筛选技术与其它筛选技术的比较 |
| 1.3 规模化筛选的递送系统概述 |
| 1.3.1 逆转录病毒介导的递送系统 |
| 1.3.2 慢病毒介导的递送系统 |
| 1.3.3 腺相关病毒介导的递送系统 |
| 1.3.4 piggyBac转座子作为递送系统的应用潜力 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验菌株和细胞系 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.1.5 实验结果分析软件和网站 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 感受态细胞的制备与测定 |
| 2.2.2 质粒的提取 |
| 2.2.3 细胞系的建系、培养与转染 |
| 2.2.4 细胞克隆的核型鉴定、免疫荧光染色及AP染色 |
| 2.2.5 小鼠水动力尾静脉注射 |
| 2.2.6 细胞、组织基因组提取与打靶情况检测 |
| 2.2.7 Southern Blot检测 |
| 2.2.8 细胞、组织RNA提取与反转录及荧光定量PCR(Q-PCR) |
| 2.2.9 蛋白的提取与Western Blot鉴定 |
| 2.2.10 肿瘤组织切片制备及H&E染色与免疫组化染色 |
| 第三章 实验结果与分析 |
| 3.1 PB介导的CRISPR/Cas9文库的创建 |
| 3.1.1 PB-CRISPR/Cas9基因打靶系统的构建及有效性验证 |
| 3.1.2 PB-CRISPR/Cas9文库的构建 |
| 3.2 利用PB-CRISPR/Cas9文库在小鼠胚胎干细胞中进行筛选 |
| 3.2.1 表达Cas9的Nanog-GFP报告系统的小鼠胚胎干细胞系的建立 |
| 3.2.2 利用PB-CRISPR/Cas9文库在分化培养条件中筛选获得多能性干细胞 |
| 3.2.3 候选多能性维持负调控因子的分析与验证 |
| 3.3 利用PB-CRISPR/Cas9文库在小鼠肝脏细胞中进行筛选 |
| 3.3.1 在小鼠肝脏中进行全基因筛选的可行性分析 |
| 3.3.2 利用PB-CRISPR/Cas9文库在活体小鼠肝脏中进行全基因组筛选 |
| 3.3.3 候选肝脏肿瘤抑制因子的分析与验证 |
| 第四章 讨论与展望 |
| 4.1 PB-CRISPR/Cas9全基因组筛选文库系统的高效性 |
| 4.2 小鼠ES细胞多能性维持负调控因子的筛选及验证 |
| 4.3 小鼠肝脏肿瘤抑制因子的筛选及验证 |
| 4.4 PB-CRISPR/Cas9文库在其它组织器官中进行筛选的潜力 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 表S1 本论文中所用引物序列 |
| 表S2 18个肝脏肿瘤高通量测序结果分析 |
| 个人简历 |
（5）大白猪出生前后肝脏组织microRNA和mRNA深度测序分析及IGF-1基因差异表达调控机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表(Abbreviations) |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 MiRNA的研究进展 |
| 1 MiRNA的生物合成及作用机制 |
| 1.1 MiRNA的发现及生物合成 |
| 1.2 MiRNA的功能及作用机制 |
| 1.3 MiRNA靶基因的预测及鉴定 |
| 2 MiRNA的检测技术 |
| 2.1 基因克隆 |
| 2.2 Northern blotting |
| 2.3 实时荧光定量PCR (qRT-PCR) |
| 2.4 基因芯片法 |
| 2.5 高通量测序 |
| 3 MiRNA与肝脏脂肪代谢 |
| 3.1 miRNAs对脂代谢过程中相关转录因子的调控 |
| 3.2 miRNAs对脂生成过程中相关酶的调控 |
| 3.3 miRNAs对脂氧化过程中相关酶的调控 |
| 第二章 转录组学的研究进展 |
| 1 转录组研究的概述 |
| 2 转录组研究的意义 |
| 3 转录组测序技术在猪上的应用 |
| 3.1 转录组技术在猪肌肉研究上的应用 |
| 3.2 转录组技术在猪脂肪研究上的应用 |
| 3.3 转录组技术在猪肝脏研究上的应用 |
| 4 MiRNA和mRNA的整合分析 |
| 第三章 IGF1基因的研究进展 |
| 1 IGF1基因的发现及作用机制 |
| 2 IGF1的基因结构、定位及可变剪切 |
| 3 IGF1对动物生长发育的调节及其在肝脏中表达模式的变化 |
| 4 IGF1基因的表达调控 |
| 4.1 转录因子对IGF1表达的调控 |
| 4.2 表观遗传对IGF1表达的调控 |
| 第二篇 试验部分 |
| 第四章 RNA-seq鉴定分析大白猪不同发育期肝脏miRNA |
| 1 引言 |
| 2 试验材料 |
| 2.1 试验动物和样品采集 |
| 2.2 试验主要仪器设备 |
| 2.3 试验主要试剂及配制 |
| 2.4 试验主要数据库及分子生物学分析软件 |
| 3 试验方法 |
| 3.1 总RNA的提取及质量检测 |
| 3.2 miRNA文库构建、检测及测序 |
| 3.3 原始测序数据的过滤、基因组比对及miRNA分类注释 |
| 3.4 差异表达miRNA的筛选及其靶基因预测 |
| 3.5 差异表达miRNA靶基因GO和KEGG分析 |
| 3.6 qRT-PCR验证测序结果 |
| 4 技术路线 |
| 5 结果与分析 |
| 5.1 总的RNA质量检测 |
| 5.2 测序原始数据的整体评价 |
| 5.3 miRNA的分类注释及新的miRNA的鉴定 |
| 5.4 差异表达miRNA的筛选及靶基因预测 |
| 5.5 GO和KEGG富集分析 |
| 5.6 差异表达miRNA的qRT-PCR验证结果 |
| 6 讨论 |
| 6.1 测序平台的选择、测序质量的评估及测序结果的验证 |
| 6.2 差异表达miRNA的筛选及靶基因预测 |
| 6.3 差异miRNA靶基因的GO、KEGG富集分析 |
| 第五章 RNA-seq鉴定分析大白猪不同发育期肝脏mRNA |
| 1 引言 |
| 2 试验材料 |
| 2.1 试验动物和样品采集 |
| 2.2 试验主要仪器设备 |
| 2.3 试验主要试剂及配制 |
| 2.4 试验主要数据库及分子生物学分析软件 |
| 3 试验方法 |
| 3.1 总RNA的提取及质量检测 |
| 3.2 cDNA文库的构建及测序 |
| 3.3 测序原始数据的过滤、比对及组装 |
| 3.4 保守、新转录本及可变剪切体的鉴定 |
| 3.5 转录本表达水平的确定 |
| 3.6 差异表达转录本的鉴定及其GO和KEGG富集分析 |
| 3.7 PPI(protein-protein-interaction)相互作用网络分析 |
| 3.8 qRT-PCR验证转录本测序结果 |
| 3.9 差异表达的转录本及小RNA的联合分析 |
| 4 技术路线 |
| 5 结果与分析 |
| 5.1 总RNA的提取及质量检测 |
| 5.2 原始测序数据的质量评估及过滤 |
| 5.3 测序数据的比对分析 |
| 5.4 已知、新转录本及可变剪切体的鉴定与分析 |
| 5.5 差异表达转录本分析 |
| 5.6 GO及KEGG功能富集分析 |
| 5.8 PPI蛋白网络互作分析 |
| 5.9 差异表达转录本的荧光定量PCR验证结果 |
| 5.10 差异miRNA及mRNA的联合分析 |
| 6 讨论 |
| 6.1 测序质量的评估 |
| 6.2 差异转录本的分析 |
| 第六章 肝脏IGF1的表达调控研究 |
| 1 引言 |
| 2 试验材料与方法 |
| 2.1 试验动物和样本采集 |
| 2.2 试验主要仪器设备 |
| 2.3 试验主要试剂 |
| 2.4 试验主要数据库及分子生物学软件 |
| 3 试验方法 |
| 3.1 组织DNA及RNA的提取 |
| 3.2 实时荧光定量PCR (qRT-PCR)分析各基因在不同时期表达模式变化 |
| 3.3 载体的构建 |
| 3.4 293T细胞的培养及质粒的转染 |
| 3.5 双荧光素酶活性的检测 |
| 3.6 甲基化分析 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 出生前后肝脏组织IGF1、C/EBP家族成员的表达模式 |
| 4.2 IGF1启动子区转录因子的预测 |
| 4.3 启动子区双荧光素酶活性检测 |
| 4.4 出生前后肝脏组织IGF1不同型启动子区甲基化模式 |
| 4.5 靶向调控IGF1基因表达的miRNA鉴定 |
| 4.6 出生前后肝脏组织C/EBPβ潜在转录因子的表达模式 |
| 5 讨论 |
| 5.1 DNA甲基化水平对基因表达的影响 |
| 5.2 IGF1在大白猪肝脏不同发育期的表达差异及C/EBPβ对其的调控 |
| 5.3 miRNA对IGF1的表达调控 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 本文创新点与有待进一步解决的问题 |
| 致谢 |
（6）ADAMs相关基因在肝癌细胞中的表达及功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 综述：ADAMTS研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）HSPC238相互作用蛋白的初步筛选及验证（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 HSPC238诱饵表达载体的构建及自激活检测 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 实验小结 |
| 第二章 人胎肝cDNA文库的筛选 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 实验小结 |
| 第三章 HSPC238相互作用蛋白的验证 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 实验小结 |
| 第四章 讨论 |
| 全文小结与研究展望 |
| 综述 蛋白质相互作用研究方法进展 |
| 参考文献 |
| 部分英汉缩略名词对照 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（8）中国人肝癌和肺癌细胞CPR技术的建立和耐药相关基因的初步筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 中国肿瘤现状 |
| 1.1.2 肿瘤的耐药机制 |
| 1.1.3 功能基因筛选方法的研究进展 |
| 1.1.4 cDNA文库的构建方法和功能基因筛选的应用 |
| 1.1.5 CPR技术的应用 |
| 1.2 研究意义 |
| 1.3 研究内容 |
| 第二章cDNA文库的构建及鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 逆转录病毒载体 |
| 2.1.3 试剂 |
| 2.1.4 仪器 |
| 2.1.5 引物 |
| 2.2 流程与方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 TRIzol法提取总RNA |
| 2.2.3 RNA甲醛变性核酸凝胶电泳 |
| 2.2.4 cDNA文库的构建 |
| 2.2.5 连接产物转化感受态大肠杆菌 |
| 2.2.6 转化子收集 |
| 2.2.7 质粒提取 |
| 2.2.8 cDNA插入片段的鉴定 |
| 2.2.9 构建含cDNA片段多样性的逆转录病毒表达系统 |
| 2.2.10 病毒滴度测定 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 总RNA的完整性分析 |
| 2.3.2 双链ds cDNA的合成 |
| 2.3.3 层析柱CHROMA SPIN-400 c DNA分选结果图 |
| 2.3.4 预实验摸索连接体系 |
| 2.3.5 逆转录病毒cDNA文库的库容量分析 |
| 2.3.6 逆转录病毒cDNA文库中插入片段的鉴定 |
| 2.3.7 实时定量PCR法测定病毒滴度 |
| 2.4 本章小结与讨论 |
| 第三章CPR平台的构建及应用 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞株 |
| 3.1.2 质粒 |
| 3.1.3 试剂 |
| 3.1.4 仪器 |
| 3.1.5 引物 |
| 3.2 流程 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.2 体外药物敏感实验 |
| 3.3.3 病毒感染工作细胞 |
| 3.3.4 质粒转染和病毒上清收集 |
| 3.3.5 基因组提取 |
| 3.3.6 PCR |
| 3.3.7 琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 工作细胞和干预药物的确定 |
| 3.4.2 药物干预条件的确定 |
| 3.4.3 CPR平台的构建及可行性分析 |
| 3.4.4 CPR技术应用于筛选肺癌和肝癌cDNA文库中耐ADM相关基因 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 总结与展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 不足与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
（9）鼻咽癌循环肿瘤单细胞分离方法和单细胞cDNA文库的建立（论文提纲范文）
| 个人简历 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 鼻咽癌肿瘤单细胞cDNA文库构建方法的初步建立 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第二部分 鼻咽癌患者循环肿瘤细胞的分离及单细胞捕获方法的建立 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第三部分 鼻咽癌循环肿瘤单细胞cDNA文库的构建 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 中英文缩略词对照表 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 附件 |
四、常氏肝癌细胞cDNA文库的构建及质量分析(英文)（论文参考文献）
- [1]转录因子Snail的去泛素化调节在食管鳞状细胞癌发生发展中的作用及机制研究[D]. 朱蕊. 北京协和医学院, 2021
- [2]基于cDNA文库研究癌症病人血浆外泌体miRNA扩增效率[D]. 郁宏伟. 北京化工大学, 2020(02)
- [3]1、核受体共激活因子NCoA6在肝细胞性肝癌发生发展中的作用及其分子调控机制的研究2、腹腔镜对比开腹右半肝切除术治疗肝细胞性肝癌的倾向性得分配对对照研究[D]. 陈钶. 浙江大学, 2019(03)
- [4]PiggyBac转座子介导的全基因组CRISPR/Cas9文库的创建及应用[D]. 齐晓兰. 中国农业大学, 2018(02)
- [5]大白猪出生前后肝脏组织microRNA和mRNA深度测序分析及IGF-1基因差异表达调控机制研究[D]. 刘京鸽. 南京农业大学, 2017(07)
- [6]ADAMs相关基因在肝癌细胞中的表达及功能分析[D]. 林俊献. 新乡医学院, 2016(04)
- [7]HSPC238相互作用蛋白的初步筛选及验证[D]. 陈敬林. 南方医科大学, 2016(02)
- [8]中国人肝癌和肺癌细胞CPR技术的建立和耐药相关基因的初步筛选[D]. 傅倩云. 江南大学, 2015(12)
- [9]鼻咽癌循环肿瘤单细胞分离方法和单细胞cDNA文库的建立[D]. 明慧馨. 广西医科大学, 2015(12)
- [10]含三磷腺苷的Hanks平衡盐溶液处理张氏肝癌细胞诱导新去整合素金属蛋白酶相关蛋白的表达[J]. 孙伟伟,韩金红,王聪睿,任太芳,刘瑞,李端,康静,许重洁,丰慧根. 新乡医学院学报, 2012(06)