一、γ-羟基丁酸钠联合放射治疗脑胶质瘤Caspase3基因表达分析（论文文献综述）
刘耀[1]（2017）在《低氧微环境下替莫唑胺对脑胶质瘤细胞凋亡及对BCL-2表达的影响》文中提出第一部分:低氧微环境下替莫唑胺对脑胶质瘤细胞增殖与凋亡的影响[目的]TMZ如今被当作第一线药物用来治疗脑胶质瘤。MGMT是一种DNA修复酶,可以对烷化剂药物造成的DNA损伤进行修复,也会进一步使肿瘤细胞产生耐药性。按照脑胶质瘤细胞表达MGMT的高低,脑胶质瘤细胞可以分为MGMT高表达细胞和MGMT低表达细胞。其中T98G细胞为高表达细胞,U87细胞为低表达细胞。此部分研究通过模拟肿瘤体内低氧微环境,选择高浓度替莫唑胺干预T98G细胞,低浓度替莫唑胺干预U87细胞,培养后检测增殖及凋亡情况。[方法]将T98G细胞及U87细胞设为常氧对照组（21%02）、常氧+替莫唑胺实验组（21%02+TMZ）、0.5%低氧+替莫唑胺实验组（0.5%O2+TMZ）和5%低氧+替莫唑胺实验组（5%02+TMZ）,细胞贴壁后,T98G加1mmolTMZ,U87加0.1mmolTMZ培养72h;倒置显微镜下观察生长情况;利用MTS法检测吸光度即增值情况;AnnexinV/PI相关处理染色之后,利用流式细胞仪检测其凋亡情况。[结果]MGMT高表达的T98G细胞在倒置显微镜下的生长情况:常氧实验组形状细长;0.5%低氧实验组排列分散、突起不明显;5%低氧实验组形状细长、突起不明显。T98G细胞吸光度:常氧对照组（0.64±0.05）;常氧实验组（0.43±0.12）;0.5%低氧实验组（0.61±0.06）;5%低氧实验组（0.40±0.04）。0.5%低氧实验组吸光度即增殖率高于常氧实验组（P<0.05）。T98G细胞凋亡率:常氧对照组（19.57±1.61）;常氧实验组（37.83±9.46）;0.5%低氧实验组（34.63±0.98）;5%低氧实验组（21.10±3.58）。5%低氧实验组凋亡率低于常氧实验组（P<0.05）。MGMT低表达的U87细胞在倒置显微镜下的生长情况:常氧实验组形状细长:0.5%低氧实验组形状细长;5%低氧实验组形状细长、排列分散。U87细胞吸光度:常氧对照组（0.56±0.05）;常氧实验组（0.44±0.07）;0.5%低氧实验组（0.51 ±0.05）;5%低氧实验组（0.35±0.06）。0.5%低氧实验组吸光度即增殖率高于常氧实验组（P<0.05）。U87细胞凋亡率:常氧对照组（3.25±1.22）;常氧实验组（8.10± 1.10）;0.5%低氧实验组（6.64±0.89）;5%低氧实验组（4.84±1.78）。5%低氧实验组凋亡率低于常氧实验组（P<0.05）。[结论]适度的低氧微环境可以减弱TMZ对脑胶质瘤细胞的影响,产生耐药性,抵抗化疗作用。第二部分:低氧微环境下替莫唑胺对脑胶质瘤细胞BCL-2表达的影响[目的]在梯度低氧微环境下培养MGMT高表达的T98G细胞及MGMT低表达的U87细胞。给予预先确定的替莫唑胺浓度处理后,检测bcl-2的表达,用以验证低氧微环境下脑胶质逃避TMZ的凋亡诱导是通过上调bcl-2表达实现的。[方法]通过三气培养箱建立梯度低氧微环境;将脑胶质瘤细胞T98G细胞及U87细胞设为常氧对照组（21%O2）、常氧+替莫唑胺实验组（21%O2+TMZ）、0.5%低氧+替莫唑胺实验组（0.5%O2+TMZ）和5%低氧+替莫唑胺实验组（5%O2+TMZ）,细胞贴壁后,T98G细胞加1mmolTMZ,U87细胞加0.1mmolTMZ培养72h,通过western blot访法检测各组bcl-2表达情况,以此来验证低氧微环境下替莫唑胺对bcl-2的影响。[结果]检测到bcl-2在脑胶质瘤细胞T98G中的表达量由高到低依次为:常氧对照组、0.5%低氧实验组、5%低氧实验组、常氧实验组。检测到bcl-2在脑胶质瘤细胞U87中的表达量由高到低依次为:常氧对照组、0.5%低氧实验组、5%低氧实验组、常氧实验组。[结论]适度低氧微环境可以减弱TMZ的作用,通过上调bcl-2在脑胶质瘤细胞中的的表达,产生耐药性;低氧微环境与MGMT可能是产生耐药的的独立或者协同因素。
李杰林[2]（2015）在《对映—贝壳杉烷型二萜Weisiensin B对人脑胶质瘤U87细胞生长抑制、分化诱导作用的研究》文中提出脑胶质瘤是颅内最常见的原发性肿瘤,手术、化疗及放疗对脑胶质瘤的治疗效果不明显。诱导分化疗法是一种新的治疗肿瘤的疗法,在不杀伤正常细胞的前体下,诱导肿瘤细胞向正常或接近正常的细胞分化,此法具有用药剂量小,毒副作用低等优势,因此,寻找高效、低毒的诱导分化剂对治疗脑胶质瘤具有重要的意义。香茶菜属植物是民间传统的中草药,具有抗菌、抗肿瘤和抗氧化等多种药理作用。从香茶菜属植物中分离出多种化合物,其中对映-贝壳杉烷型二萜化合物的含量极为丰富,为主要次生代谢产物。研究证实,此类化合物具有多种生理活性,在抗肿瘤方面表现出很大的潜力。Weisiensin B是从维西香茶菜中分离得到的对映-贝壳杉烷型二萜化合物,研究显示该化合物有较强的细胞毒性,但其抗癌活性的机理却仍不明确,需进一步研究。目前,有关Weisiensin B对U87细胞诱导分化的研究尚未见文献报道。本文以人脑胶质瘤U87细胞为受试细胞。利用台盼蓝排染法和MTT法检测了Weisiensin B对U87细胞的生长抑制作用,用流式细胞术检测化合物对U87细胞周期分布的影响;用显微镜观察以及吉姆萨染色法研究Weisiensin B对细胞形态的影响;利用间接免疫荧光和荧光染色法,观察化合物对细胞内GFAP和Vimentin含量的影响以及对微丝、微管骨架重排的作用。主要结果如下:（1）台盼蓝排染法及MTT检测结果显示:Weisiensin B对U87细胞具有明显的生长抑制作用,随着药物浓度的增强,以及作用时间的延长,对细胞的生长抑制作用也逐渐增强,表现出浓度和时间依赖性。（2）倒置显微镜观察细胞形态以及吉姆萨染色法显示,Weisiensin B作用后U87细胞形态发生了改变,对照组细胞呈短梭形,两边有短的突起,细胞核质比大。化合物处理后,细胞体积变大,细胞核变小,细胞核质比减小,突起变长。高浓度处理组此现象更明显。表明化合物处理后细胞向星形细胞的方向分化。（3）PI染色后流式细胞仪检测细胞周期分布,结果显示,不同浓度的Weisiensin B处理U87细胞48h和72h后,可引起细胞G0/G1期周期阻滞,并具有浓度依赖性,但未检测到凋亡峰。AO/EB双染荧光显微镜观察结果也显示在药物浓度范围内并未引起细胞凋亡发生。（4）划痕法检测U87细胞迁移的结果显示,Weisiensin B对U87细胞的迁移能力具有明显的抑制作用,随着浓度升高、作用时间延长抑制作用也越明显,表现出时间-剂量效应。（5）免疫荧光染色显微镜观察及流式细胞术检测表明,Weisiensin B处理U87细胞后,可引起细胞内胶质纤维酸性蛋白（GFAP）含量的增加,并降低细胞内波形蛋白（Vimentin）的含量,且其变化具有浓度依赖性。此结果说明Weisiensin B可诱导U87细胞向成熟的星形胶质细胞方向分化。（6）罗丹明标记的鬼笔环肽及免疫荧光染色观察表明,Weisiensin B对U87细胞中的微丝骨架具有解聚作用,且具有浓度依赖性。Weisiensin B对U87细胞中微管骨架的重排有影响,对照组中微管蛋白主要分布在细胞边缘,细胞内微管蛋白较少,药物处理后细胞内微管蛋白向核周聚集,细胞内部微管增多。结果表明化合物可引起U87细胞骨架发生一定的改变,这可能与细胞分化过程中细胞形态的变化有关。（7）DCFH-DA染色后荧光显微镜观察以及流式细胞术检测细胞内ROS,结果表明,化合物可引起U87细胞内ROS含量增多,且ROS增加与药物浓度呈正相关,药物作用时间加长,细胞内ROS的量也增多。综上所述,Weisiensin B可引起U87细胞形态变化,将细胞周期阻滞在G0/G1期,进而抑制细胞生长。进一步研究发现,化合物可引起细胞内GFAP的含量的增加,并使Vimentin的含量降低,诱导细胞向正常胶质细胞分化。可引起细胞内微管的重排以及微丝的解聚。本研究首次检测Weisiensin B对U87诱导分化的影响,为进一步探明该药物抗癌作用机制提供一定的依据。
牛俊婕[3]（2014）在《丙戊酸钠对C6胶质瘤大鼠正常脑组织的放射保护作用》文中指出目的脑胶质瘤,亦称神经胶质细胞瘤,是神经系统最常见的原发性肿瘤,因具有顽固性、易局部播散和复发等特点,预后极差。目前,放射治疗已成为脑胶质瘤术后的主要辅助治疗方式之一。然而,放射治疗在治愈或控制肿瘤时的剂量与引起正常组织损伤剂量之间的梯度较小。为了提高肿瘤放疗疗效,一方面可通过三维适形放疗减少正常组织的受量,同时加大肿瘤放疗剂量；另一方面也可通过改善肿瘤的放射敏感性,来增强放射线的杀伤力。放射治疗中在控制肿瘤的同时最大限度地减少对正常组织的损伤,是我们目前所面临的一个重大挑战。组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitors, HDACIs）作为新一代的抗肿瘤药物,近来有研究发现,HDACIs作为放射保护剂可以减轻正常组织的辐射损害。丙戊酸钠（valproic acid, VPA）由于其作用缓和、低毒性,被广泛应用于脑肿瘤患者的抗癫痫治疗。目前体内外实验发现VPA作为HDACIs可以增强脑肿瘤的放射敏感性,但是其作为放射保护剂的研究较少。本研究选取VPA作为研究对象,通过观察VPA对C6胶质瘤大鼠正常脑组织的放射保护作用,为VPA作为放射保护剂在胶质瘤放疗中的应用提供实验依据。方法体外常规培养C6细胞,种植于Wistar大鼠右侧尾状核,一周后MRI确认C6大鼠胶质瘤模型是否建立成功。48只荷瘤大鼠随机分为4组（n=12）,即对照组、VPA组、放疗组及联合组。对照组给予假照射和注射生理盐水；VPA组给予假照射和注射VPA （150mg/kg）,5天；放疗组给予单次剂量为3Gy X线照射5天和注射生理盐水；联合组给予单次剂量为3Gy X线照射5天和注射VPA （150mg/kg）,5天。放疗结束后24h,四组各取6只大鼠给予4%多聚甲醛心脏灌注处死,免疫组化检测荷瘤大鼠肿瘤对侧正常脑组织Caspase-3的表达水平来观察细胞凋亡情况；记录剩余4组（n=6）大鼠的生存期。24只正常大鼠同上随机分为四组,接受对应的相同处理。记录正常大鼠自VPA注射之日开始2周内每日体重变化。放疗结束后6个月,大鼠4%多聚甲醛心脏灌注处死,电镜观察正常脑组织血管壁、神经元细胞核、突触结构及数目改变。结果MRI显示C6大鼠胶质瘤模型建立成功。免疫组化结果示放疗组相较于联合组肿瘤对侧脑组织在细胞核上可见明显的Caspase-3表达,Caspase-3的表达定位于细胞核内,为棕黄色染色。VPA组、放疗组及联合组大鼠生存期较对照组（17d）延长,其中位生存期分别为19d、23d、28d。联合组与放疗组大鼠生存期存在明显差别（p<0.05）,同时联合组存在长期幸存大鼠（>50d）。自放疗开始后,放疗组与联合组大鼠体重存在明显差别（p<0.05）,且与其余3组相比较放疗组体重存在明显下降趋势。放疗期间联合组相较于放疗组存在一个相对稳定的体重缓慢增长趋势。放疗结束后,联合组及放疗组均存在体重上升趋势。电镜结果示放疗组血管壁出现严重的结构紊乱及不规则增厚,以及玻璃样变性和纤维变性等改变。联合组可见白质中部分毛细血管内皮细胞局部肿大,同时在不规则的管腔见毛细血管内皮细胞轻度肿大。然而在对照组及VPA组中可见正常血管壁。放疗组神经元核膜表面凹凸不平及不规整,甚至有损伤。然而联合组神经元核膜表面轻度不规整,没有损伤。对照组及VPA组示神经元核膜正常。电镜观察联合组突触结构尚清晰、数量多,放疗组突触结构不完整、数量减少。结论VPA对C6胶质瘤大鼠的正常脑组织存在放射保护作用,其中抑制放射所致的正常细胞凋亡发挥了重要作用。VPA联合放疗可显着延长C6胶质瘤大鼠的生存期,考虑与VPA发挥了保护正常脑组织作用有关,同时VPA增强了肿瘤细胞放射敏感性也起着重要作用。
王凤伟[4]（2014）在《Beclin-1和mTOR基因在人脑胶质瘤中的表达及意义》文中指出研究背景与目的人脑胶质瘤是来源于神经上皮的中枢神经系统最常见的原发性脑肿瘤，约占全部颅内肿瘤的35.26％60.96％，其具有血供丰富和侵袭性增殖等生物学特征，呈浸润性生长，手术不易全切，治疗效果差，而且在临床上还具有高复发率，高死亡率，高致残率和治愈率低的特征。目前的治疗仍以手术治疗为主结合放疗、化疗的综合治疗，虽然目前其诊断和规范治疗如手术，放疗和化疗取得了很大的进步，但是这些患者的预后依然很差。对于人脑胶质瘤的发生、发展及治疗研究仍是神经外科及相关领域研究的重点之一。近年来随着分子生物学在肿瘤研究中的进展，肿瘤的靶向治疗已成为肿瘤研究领域的重要课题。因此，寻求新的基因靶点治疗胶质瘤已成为当前关注的焦点。自噬是亚细胞水平上一个进化相对保守的细胞功能，细胞为适应环境保持内环境稳定，将细胞质及细胞器通过溶酶体降解为游离氨基酸及脂肪酸而实现了更新。自噬的负向调控如自噬活性的降低、信号及传输通路的改变，可能在多种肿瘤的产生及发展进程中发挥重要作用，异常激活的自噬基因可以促进或抑制某些肿瘤的演变。近年来发现的自噬基因Beclin-1，是一个与细胞自噬功能相关的候选抑癌基因，通过促进自噬及诱导凋亡抑制肿瘤的产生及进展，且在多种肿瘤中发现Beclin-1基因表达异常。Beclin-1基因主要是通过Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol3-kinase class Ⅲ，PI3K）将多种自噬相关基因（Autophagy-related genes，ATG）蛋白定位于前自噬体分子构成复合体进一步控制自噬活性。mTOR （mammalian target of rapamycin），即哺乳动物雷帕霉素靶蛋白。最近多种研究表明，细胞的生长增殖及存活如神经再生、肌肉组织增生及某些肿瘤的演进与其关系密切。研究发现，在调控自噬促进细胞存活的调控机制中，Beclin-1介导的自噬/凋亡互反馈作用机制及mTOR介导的自噬与mTOR的互反馈调控作用成为重要的途径，并形成一个由PI3K、Beclin-1和mTOR为节点靶点的PI3K-Beclin1-mTOR自噬交互调控网络。而有关Beclin-1和mTOR在人脑胶质瘤中的研究，国内外相关研究相对较少。本研究的主要目的是探索自噬基因Beclin-1和mTOR在人脑胶质瘤中的表达，分析其与病理级别之间的关联及二者的相关性，进一步分析二者在脑胶质瘤发生及发展中的作用，为脑胶质瘤的治疗提供新的思路。材料与方法脑胶质瘤标本取自郑州大学第二附属医院神经外科2012年7月-2013年8月43例手术标本，所有病例均为首发病例，且术前均未行放疗、化疗及免疫治疗，均有完整的临床资料，其中男23例，女20例，年龄6-69岁，平均39.72±18.24岁。将43例脑胶质瘤组织标本作为实验组，按2007年WHO病理级别标准将脑胶质瘤所有切片进行分级（详见表2.1），被归类为低级别组（其中Ⅰ级2例，Ⅱ级20例）22例，高级别组（其中Ⅲ级12例、Ⅳ级9例）21例。另取11例来自同期收治的脑外伤或脑出血患者的非瘤脑组织标本作为对照组。采用RT-PCR及免疫组化SP法检测了43例脑胶质瘤和11例非瘤脑组织中Beclin-1和mTOR基因mRNA及蛋白的表达情况，采用SPSS17.0软件进行数据处理，两组定量资料的比较采用两独立样本t检验，多组定量资料的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；两样本率的比较采用四格表资料的χ2检验，差异性分析采用配对χ2检验；相关性分析用Pearson关联性检验。以α=0.05作为差异显着性检验水准。结果1. Beclin-1的mRNA及蛋白的表达情况Beclin-1的mRNA在非瘤脑组织、胶质瘤组织、低级别组、高级别组中表达量依次为0.901±0.115、0.626±0.077、0.754±0.087、0.448±0.053，利用两独立样本t检验示非瘤脑组织与胶质瘤组织之间存在显着统计学意义（t=10.853，p＜0.05），经单因素方差分析、LSD-t检验示非瘤脑组织与低级别组和高级别组两两之间均存在显着统计学意义（F=92.445，p＜0.05）；Beclin-1蛋白在非瘤脑组织、胶质瘤组织、低级别组、高级别组中的表达阳性率分别为100.0%、51.2%、68.2%和38.1%，利用四格表资料的χ2检验，示非瘤脑组织与胶质瘤组织（χ2=6.856，p＜0.05）、低级别组和高级别组（χ2=3.909，p＜0.05）之间均存在显着统计学意义。2. mTOR的mRNA及蛋白的表达情况mTOR的mRNA在非瘤脑组织、胶质瘤组织、低级别组、高级别组中表达量依次为0.206±0.035、0.575±0.063、0.413±0.052、0.654±0.075，利用两独立样本t检验示非瘤脑组织与胶质瘤组织之间存在显着统计学意义（t=-17.112，p＜0.05），经单因素方差分析、LSD-t检验示非瘤脑组织与低级别组和高级别组两两之间均存在显着统计学意义（F=103.419，p＜0.05）；mTOR蛋白在非瘤脑组织、胶质瘤组织、低级别组、高级别组中的表达阳性率分别为18.2%、69.8%、54.5%和85.7%，利用四格表资料的χ2检验，示非瘤脑组织与胶质瘤组织（χ2=7.636，p＜0.05）、低级别组和高级别组（χ2=4.949，p＜0.05）之间均存在显着统计学意义。3. Beclin-1和mTOR基因在胶质瘤中表达的相关性Beclin-1和mTOR的mRNA在人脑胶质瘤组织中的表达量经Pearson关联性分析得出关联系数r=-0.838，p＜0.05，具有显着统计学差异。Beclin-1和mTOR蛋白表达经配对χ2检验得出r，=-0.493，p＜0.05，具有显着统计学差异。定量及定性分析结果均表明二者呈负相关。结论1. Beclin-1表达的mRNA及蛋白在非瘤脑组织高表达，在人脑胶质瘤组织中随病理级别的升高其表达量逐渐下调。2. mTOR表达的mRNA及蛋白在非瘤脑组织低表达，在人脑胶质瘤组织中随病理级别的升高其表达量逐渐升高。3. Beclin-1和mTOR在人脑胶质瘤组织中的表达呈负相关，提示Beclin-1表达的下调可能通过mTOR介导的信号通路促进肿瘤的发生发展。
李博[5]（2014）在《白头翁皂苷D抑制人脑胶质母细胞瘤U87MG及U251MG生长的实验研究》文中进行了进一步梳理近年来天然植物提取物单体在抗肿瘤增殖和促肿瘤凋亡方面取得了一系列进展，以其对正常细胞细胞毒性小，对恶性肿瘤细胞毒性大和促凋亡而备受青睐。白头翁皂苷D存在于自然界多种植物内。本实验主要针对白头翁皂苷D对恶性胶质母细胞系U87MG和U251MG的生长抑制作用和促凋亡作用及机制展开研究，共分为两个部分:第一部分：研究在体外白头翁皂苷D（Pulsatilla saponin D）对人源性胶质母细胞瘤系U87MG及U251MG的生长抑制和促凋亡作用及其主要机制目的：以人脑恶性胶质瘤细胞系U87MG及U251MG为对象，研究白头翁皂苷D（即盲测试剂太白银莲花W-6单体）抑制其生长及致凋亡的作用机理，为治疗恶性胶质瘤药物的研究和开发利用提供进一步的依据。方法：1.采用噻唑蓝（MTT）比色法研究白头翁皂苷D对胶质瘤细胞的增殖抑制作用：以正常人静脉内皮细胞系EVC304以及人脑正常星形胶质细胞为阳性对照组，U87MG和U251MG作为实验组，每组中各设自身阴性对照组；在等比浓度梯度（0.219nmol/ml、0.438nmol/ml、0.876nmol/ml、1.752nmol/ml、3.504nmol/ml、7.008nmol/ml、14.016nmol/ml and28.032nmol/ml）下，用白头翁皂苷D，分别作用于人脑恶性胶质瘤细胞系U87MG及U251MG，在24小时和72小时检验其增殖抑制作用。同时求得白头翁皂苷D对U87MG及U251MG的IC25、IC50及IC75值；以同样的浓度梯度检测其对EVC304以及人脑正常星形胶质细胞的增殖抑制情况；2.采用流式细胞检测技术检测凋亡作用：在经MTT实验求得IC25、IC50及IC75浓度的基础上，用白头翁皂苷D分别作用U87MG和U251MG，经12小时和16小时后送检，检测细胞的凋亡现象及其细胞周期变化；3.形态学观察凋亡现象：用IC25、IC50及IC75浓度的白头翁皂苷D分别处理U87MG和U251MG细胞6小时、12小时、24小时后，采用Hoshest33342染色剂浸染15分钟，观察细胞核形态变化；采用TUNEL/PI法，观察计数其凋亡情况；对经白头翁皂苷D处理的U87MG和U251MG，采用透射电镜法，经固定、包埋、切片处理后行超微结构观察；4.生化指标检测：选取凋亡蛋白Caspase家族中的重要成员Caspase-3、Caspase-8，以及其上游的Fas/Fas-L及线粒体Bcl-2/Bax作为检测指标，研究相关蛋白表达水平变化，初步探究其致凋亡机制；检测自噬特异性抗微管相关蛋白LC-3表达水平来验证药物对肿瘤细胞发生自噬现象的诱导作用。5.DNA碎片检测：按IC50和IC75的浓度，用头翁皂苷D处理U87MG及U251MG细胞，分别经12小时和16小时后，用PBS洗脱，Tris–HCl溶解细胞，20mMEDTA和0.2%Triton-X100在4℃静置30min，套管离心，washing-buffer进行洗涤，洗脱液洗脱并提取样品，后在加有溴化乙锭的琼脂糖凝胶上进行电泳。结果：1.MTT实验后，统计数据，发现白头翁皂苷D对人脑恶性胶质瘤细胞系U87MG及U251MG增殖具有显着的抑制作用；在白头翁皂苷D浓度为14.016nmol/ml时，对U87MG和U251MG的抑制率分别为87.423%和94.034%（n=6, p<0.05）；并求得白头翁皂苷D对U87MG和U251MG的IC50值分别为7.018nmol/ml和10.132nmol/ml；而药物对EVC304和正常胶质细胞其生长抑制作用并不显着；2.经FITC-Annexin V/PI染料染色、流式细胞仪检测后，发现在不同浓度下用白头翁皂苷D分别处理U87MG和U251MG12小时和16小时后，早期凋亡和中晚期凋亡呈明显增加：其中，U87MG的中晚期凋亡率由对照的1.5%增加到57%,其早期凋亡率由0.2%增加到25.8%，凋亡增加显着；U251MG的同样增加显着；周期检测，U87MG和U251MG样品都出现SubG1峰，并呈明显梯度变化趋势；且细胞周期阻滞在G0/G1期；3.药物处理组经Hoshest33342染色后，在荧光显微镜下，可明显观察到处理组细胞核呈新月形、车轮状等典型凋亡特征，并随着浓度增高和时间延长，细胞核破碎并呈点状分布；而对照组和EVC304组未见明显核型异常；在电镜下观察细胞，可见早期凋亡细胞细胞质浓缩，染色质浓聚和边集，可形成新月形小体，随后可见核裂解，有凋亡小体形成，同时我们发现了疑似自噬小体的存在；经TUNEL/PI染色后，可见凋亡细胞呈橘黄色，而未凋亡或者死亡细胞则为红色；4.在凋亡生化指标检测中，用免疫印迹实验检测相关蛋白，发现Caspase-3、Caspase-8表达随着药物作用的时间和浓度的增加而升高，Fas/Fas-L表达也随之升高，Bcl-2的表达变化降低， Bax表达随着药物作用的时间和浓度的变化增加；LC-3Ⅱ/LC-Ⅰ灰度比值随着药物浓度的增加显着升高；5.用DNA ladder法检测DNA碎片，可见在IC50和IC75组出现典型梯状条带，而对照组未见明显断裂条带。第二部分：白头翁皂苷D（Pulsatilla saponin D）对荷瘤小鼠模型胶质瘤生长抑制的作用研究目的：研究在体内情况下，白头翁皂苷D（Pulsatilla saponin D）对于构建的胶质瘤动物模型中肿瘤的生长抑制和促凋亡作用。方法：1.进行荷瘤载体造模：选择15g～18g的9只雄性昆明小鼠，以鼠胶质细胞瘤细胞系G422行皮下注射进行造模，14天后观察肿瘤生长情况；检测体重，按空白组、安慰剂组、给药组，进行随机匹配分组；后按体重0.0056mg/g行腹腔注射给药，7天后进行观察；相同方案下，选择3～4周雄性裸鼠以U87MG细胞进行造模，后统计分析；2.用HE染色和TUNEL法检测给药处理后肿瘤标本，观察并统计其凋亡情况；并送电镜检测其微观结构变化。结果：1.进行荷瘤载体研究，并分析给药组肿瘤生长情况，发现给药组肿瘤平均重量较空白组和安慰剂组均显着减轻且与给药浓度成反比；2.经药物处理后的肿瘤经HE染色，可见细胞核深染，胞核着色明显，TUNEL/PI染色后可见明显黄染区；电镜可见肿瘤核型明显浓聚，胞浆皱缩。结论：1.白头翁皂苷D明显对人脑恶性胶质瘤细胞系U87MG及U251MG有抑制增殖作用，且呈时间和浓度依赖；2.体内体外实验证实白头翁皂苷D对人脑恶性胶质瘤细胞系U87MG及U251MG有较强致凋亡作用，使细胞周期阻滞在G0/G1期；且其致凋亡主要通过肿瘤坏死因子受体途径和线粒体途径介导；3.初步研究发现白头翁皂苷D可诱导U87MG及U251MG细胞发生自噬。
陈秋铃[6]（2013）在《Nodosin对恶性胶质瘤的作用及其机制研究》文中进行了进一步梳理目的：恶性胶质瘤,是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤,已成为危害人类健康的重要脑部疾病。化疗是其临床综合治疗的重要手段之一,是治疗晚期恶性肿瘤以及防止复发必不可少的。然而,对于占恶性肿瘤90%以上的实体瘤,化疗尚未能取得满意的效果。且化疗药物对肿瘤细胞与正常细胞的选择性较差,对人体往往产生一定的毒副作用。因此,寻找高效、特异和低毒的抗肿瘤药物是肿瘤防治研究中的重要课题。Nodosin是从唇形科香茶菜属植物中提取出来的一种五环二萜类化合物,来源广泛,具有抑菌、抗炎等作用。本课题以恶性胶质瘤细胞株C6、U87和C6移植瘤模型为研究对象,研究nodosin对脑胶质瘤的抑制作用,并探讨其作用机制,为其临床抗胶质瘤的研究提供有力的实验依据和理论基础,为进一步开发新型抗胶质瘤药物扩展新视野。方法：采用倒置显微镜对胶质瘤细胞进行形态学观察；采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定细胞生存率,乳酸脱氢酶（LDH）法检测细胞毒性,BrdU检测法检测细胞增殖情况；应用流式细胞仪技术研究nodosin对细胞周期的影响；采用Hoechst33342染色法、原位末端标记技术（TUNEL）法观察nodosin对细胞凋亡的影响。采用western blot方法对细胞周期相关蛋白cyclin B1和cdc2和细胞凋亡相关蛋白bcl-2、Bcl-xL、 Bax、Bak及相关胶质瘤细胞内信号通路的蛋白水平进行检测；以及通过对caspase-3/7、caspase-8、caspase-9活性检测和细胞线粒体膜电位的测定（JC-1染色）,来研究nodosin抑制胶质瘤细胞增殖及诱导细胞凋亡的机制。同时,应用GSK3β抑制剂LiCl联合nodosin,研究nodosin对细胞凋亡的影响。选择划痕实验和Transwell细胞迁移、侵袭实验评价nodosin对胶质瘤细胞的侵袭迁移能力；应用激光共聚焦扫描显微镜对胶质瘤细胞骨架进行观察,并通过western blot方法检测MMP-9的蛋白含量来研究nodosin对胶质瘤细胞的迁移与侵袭的机理。通过建立大鼠恶性胶质瘤细胞株C6细胞皮下移植瘤模型,探讨在在体条件下nodosin对肿瘤体积、肿瘤重量等的影响,并通过HE染色观察肿瘤病理组织学的改变。成果：MTT结果显示nodosin对胶质瘤细胞的生长有明显的抑制作用,且呈现明显的量效、时效关系,处理细胞24h后,对大鼠胶质瘤C6细胞和人胶质瘤U87细胞的IC50分别为：25.81μM、11.05μM;而nodosin在24h时对人正常胶质细胞HEB及大鼠原代胶质细胞的存活率影响不大,其IC50分别为：32.06μM、46.69μM。LDH检测发现,nodosin对C6及U87没有细胞毒作用。这些结果表明,nodosin的抗肿瘤作用具有较强的细胞选择性,其抗肿瘤作用机制可能与细胞周期阻滞、细胞凋亡诱导和侵袭转移抑制有关。BrdU检测法和流式细胞术检测结果显示,nodosin对C6及U87胶质瘤细胞具有较好的增殖抑制作用,通过使胶质瘤细胞组滞于G2/M期的机制,抑制胶质瘤细胞进入下一增殖周期,从而抑制胶质痈细胞增殖。Western blot法实验显示,5μM、10μM、15μM的nodosin处理C6、U87细胞24h后,cyclinBl和cdc2蛋白表达水平下调。细胞形态学观察、Hoechst33342染色法染色以及原位末端标记技术（TUNEL）检测结果显示,nodosin能诱导胶质瘤细胞的凋亡,作用胶质瘤细胞24h后,细胞形态发生改变,细胞数量与密度减少,随着剂量增加,培养基中悬浮的死亡细胞增多,出现染色质边集,细胞核碎片化,凋亡小体形成。Caspase活性检测发现,nodosin能够增加C6、U87细胞中caspase-3/7、caspase-8、caspase-9的活性,并成一定的剂量依赖关系,提示着我们,nodosin诱导胶质瘤细胞凋亡的作用,既通过死亡受体通路,亦通过线粒体通路。Western blot法结果显示,nodosin能够下调Bcl-2、Bcl-x1蛋白表达水平,上调Bak蛋白的表达水平,Bax蛋白水平不变；同时,能抑制P38MAPK、 PI3K/Akt和PKC信号通路；应用GSK3β抑制剂LiCl联合nodosin,发现LiCl可阻断nodosin引起的细胞凋亡。划痕实验和Transwell细胞迁移、侵袭实验结果显示,nodosin能够剂量依赖性地阻止胶质瘤细胞的迁移与侵袭；cofocal结果发现,nodosin可抑制微管聚集；western blot分析结果显示,5、10和15μM的nodosin能以剂量依赖方式减少MMP-9蛋白表达水平。提示,nodosin对胶质瘤细胞的迁移侵袭抑制机制与其促进细胞微管解聚以及下调MMP-9蛋白表达水平相关。接种胶质瘤C6细胞后第3d,对照组和nodosin组的肿瘤生长没有明显差异。接种后第4d到第12d,对照组的肿瘤生长快速,nodosin组的肿瘤生长缓慢,差异有显着性意义（P<0.05）；裸鼠肿瘤重量、肿瘤体积增长率均明显小于对照组。HE染色显示,对照组C6胶质瘤细胞丰富密集,坏死很少,nodosin组C6胶质瘤细胞生长密度低于对照组,并可见到细胞体积变小,核固缩深染的凋亡形态学改变,部分区域出现液化坏死。结论：（1）首次在胶质瘤细胞模型上研究nodosin抗恶性胶质瘤的作用,发现nodosin对胶质瘤细胞的生长具有明显的选择性抑制作用；（2） Nodosin对胶质瘤细胞具有细胞增殖抑制作用,这种作用通过阻滞细胞周期于G2/M期以及下调cyclinBl和cdc2蛋白水平来实现；（3） Nodosin具有诱导胶质瘤细胞凋亡的作用,其机制为：nodosin通过增加Caspase-3/7、Caspase-8、Caspase-9活性、降低线粒体膜电位、下调Bcl-2、Bcl-x1蛋白的表达水平以及上调Bak蛋白的表达水平来诱导胶质瘤细胞凋亡；nodosin能抑制P38MAPK、Akt和PKC等相关胶质瘤细胞内信号通路的蛋白水平；GSK3β在nodosin诱导细胞凋亡中是必需的。（4） Nodosin能通过促进细胞微管解聚以及下调MMP-9蛋白水平来抑制胶质瘤细胞的迁移侵袭。（5）首次在体内实验中,发现nodosin能抑制裸鼠内胶质瘤的肿瘤生长及减少肿瘤重量,具有体内抗恶性胶质瘤作用。
张开治[7]（2011）在《β-二酮钴的配合物抗胶质瘤细胞作用的实验研究及机制探讨》文中进行了进一步梳理β-二酮钴的配合物抗胶质瘤细胞作用的实验研究及机制探讨研究背景:脑胶质瘤是神经系统中发病率最高的肿瘤,同时也是死亡率最高的神经系统肿瘤,其死亡率接近发病率,同其他恶性肿瘤一样,手术、放疗、化疗是其治疗的主要手段。然而因其病理学上恶性行为的突出表现（即浸润性生长）,及其显微手术都难以将其全切的特点,预示其预后不佳,因此术后的放化疗在脑胶质瘤的治疗过程中有着重要意义。研究表明脑胶质瘤具有一定的抗辐射性,故放疗在胶质瘤治疗上的获益有限。当前脑胶质瘤治疗研究领域中,以化疗最为活跃。目前替莫唑胺在胶质瘤治疗中的地位得到承认,然而大量的研究结果显示替莫唑胺的作用仍不能让人满意,因此研发新型、高效、低毒的抗胶质瘤药物迫在眉睫。随着多学科协作、合作的不断深入,医学与化学交织,利用各种新型化合物解决医学难题的研究层出不穷,化学金属配合物与DNA作用的研究不断涌现,尤其小分子与DNA之间的相互作用常常会诱发许多生物效应,其意义影响深远。钴是一种高熔点、稳定性良好的磁性硬金属。正常人体的钴含量为1.1～1.5mg,其中14%分布于骨骼中,43%分布于肌肉中,余下的分布于人体其它软组织中。在探讨含钴化合物的抗肿瘤活性研究进展中,我们发现多种含钴配合物都对肿瘤细胞表现出明显的抑制作用,其抗癌活性的发挥主要表现在其与DNA之间的相互作用。因此研发新型的含钴配合物在胶质瘤治疗领域将具有重要的现实意义。β-二酮作为螯合剂,具有广泛的螯合能力, Jensen于1959年首次合成,并对其螯合作用进行了研究,研究结果表明其对金属具有良好的螯合作用。针对上述特点,我们通过以下实验对β-二酮-钴这一新型的金属配合物在抗胶质瘤方面的作用进行深入的探讨,期待寻找出新型、高效、低毒的抗胶质瘤药物。研究目的:旨通过实验,探讨β-二酮钴的配合物对脑胶质瘤的抑制作用及作用机制,为其临床抗胶质瘤的研究提供有力的实验依据和理论基础,为开发新型抗胶质瘤药物扩展新视野。研究方法及结果:1通过体外敏感性实验探讨β-二酮的钴配合物对胶质瘤细胞的增殖抑制作用。化合物经体外抗肿瘤活性初筛后,选择抗肿瘤活性较高的β-二酮的钴配合物作为受试化合物,采用MTT法检测β-二酮的钴配合物作用C6大鼠脑胶质瘤细胞株的细胞生长抑制率。检测结果表明:与阴性对照组相比,在浓度为6.25～100μg/mL时,β-二酮的钴配合物对C6大鼠脑胶质瘤细胞株有明显的抑制作用（p<0.05）,且随着浓度的升高,抑制作用更加明显,抑制率最高可达83.1%（100μg/ml）。与阳性对照组相比,在相同浓度下,β-二酮的钴配合物对胶质瘤细胞株抑制作用较细胞毒性药物氟尿嘧啶强。2β-二酮的钴配合物的急性毒性动物实验选择成年健康昆明种小鼠80只,完全随机将分成8组,并给予不同浓度受试药物（根据预实验结果确定浓度）,观察小鼠2周的状态和反应,记录小鼠的中毒表现及动物的死亡数量和时间,并对小鼠内脏行病理剖检和组织学观察。结果显示:给药后6小时开始出现死亡,死亡前小鼠出现昏睡、皮毛无光泽、体重减轻等中毒症状;病理解剖及组织学观察发现其肝脏及肠道等脏器有不同程度的损伤。按Bliss法,计算该化合物LD50为3099.1mg/kg。3探讨β-二酮的钴配合物对C6大鼠脑胶质瘤细胞DNA合成的抑制作用将进入对数生长期的C6大鼠脑胶质瘤细胞铺于96孔培养板上,分组加入受试药物及3H -TdR,合理培养后烤箱烘干,加入闪烁液,测定cpm值,计算胶质瘤细胞抑制率。实验结果显示:β-二酮的钴配合物对C6大鼠脑胶质瘤细胞DNA合成有明显的抑制作用,且呈剂量效应关系,最高抑制率近50%。4探讨β-二酮的钴配合物对C6大鼠脑胶质瘤细胞株细胞周期的影响采取流式细胞术,测定细胞周期各时相细胞百分数,对β-二酮的钴配合物对C6大鼠脑胶质瘤细胞株细胞周期的影响进行分析。实验结果显示:实验组处于S期的百分率明显高于对照组（P<0.01）,但随着给药时间及浓度的改变,S期细胞比例无明显趋势性变化。5探讨β-二酮的钴配合物对C6大鼠脑胶质瘤细胞株细胞凋亡的影响将C6大鼠脑胶质瘤细胞用不同浓度β-二酮的钴配合物作用后,DAPI染色,置于显微镜下观察细胞的形态及生长密度变化。结果显示:实验组细胞形态研究方法及结果:学变化表现为细胞密度减低,细胞体积变小,部分细胞收缩呈圆形,并可见细胞碎片。荧光染色后观察,实验组可见核呈致密浓染强荧光表现的凋亡细胞,高度浓度组还可见到颗粒块状DNA荧光碎片细胞,即有核碎裂表现的凋亡细胞。采用Annexin V和PI双染流式细胞术检测β-二酮的钴配合物对胶质瘤细胞细胞凋亡的影响,结果显示:实验组细胞发生凋亡的百分率明显高于对照组,随着给药浓度的增加,细胞凋亡率逐渐提高,随着作用时间的延长,凋亡率也提高,即对凋亡率的影响具有时间及剂量效应。6探讨β-二酮的钴配合物作用C6大鼠脑胶质瘤细胞对细胞凋亡因子表达的影响采用Western blot免疫印迹分析β-二酮的钴配合物作用48h后脑胶质瘤细胞的Bcl-2、Bax蛋白表达。结果显示:随着β-二酮的钴配合物浓度的增加,Bcl-2蛋白表达量随着降低,而Bax蛋白表达量随着增高。结论:1.β-二酮的钴配合物对胶质瘤细胞的生长有明显的抑制作用,且存在剂量-效应关系;2.β-二酮的钴配合物为低毒化合物,肾损害小,毒性靶器官为肝脏及肠道;3.β-二酮的钴配合物能阻止胶质瘤细胞DNA合成,从而抑制胶质瘤细胞的复制及增殖;4.β-二酮的钴配合物通过使胶质瘤细胞阻滞于S期的机制,抑制胶质瘤细胞进入下一增殖周期,从而抑制胶质瘤细胞增殖;5.β-二酮的钴配合物有诱导细胞凋亡的作用;6.β-二酮的钴配合物抗肿瘤机制与诱导促凋亡因子Bax的表达,减弱凋亡抑制因子Bcl-2的表达密切相关。以上结论说明,β-二酮的钴配合物在体外实验中表现出较强的抗脑胶质瘤细胞的作用,在探讨其抗胶质瘤作用机制的研究中我们发现,其作用与影响胶质瘤细胞DNA合成、细胞阻滞、诱导细胞凋亡及影响细胞凋亡因子的表达密切相关,然而其确切的分子基础仍待进一步研究。
王新军[8]（2008）在《Bcl-xL反义寡核苷酸联合嘧啶亚硝脲治疗脑胶质母细胞瘤的实验研究》文中提出胶质母细胞瘤的发生发展不仅与肿瘤细胞的克隆性异常增生有关,而且与肿瘤细胞正常凋亡功能的减弱和凋亡抑制基因的过度表达有密切关系,可能存在多种形成和发展通路/途径。尽管各种分子病理学途径不完全相同,但差不多所有的胶质母细胞瘤都具有共同的神经病理学特点和生物行为学特性:潜在的高侵袭性、潜在的性、活跃的增值能力和对常规的细胞毒素药物治疗耐药,是所有人类肿瘤中治疗最困难的一种。亚硝脲类药物是治疗恶性胶质瘤的首选药物,在胶质母细胞瘤术后治疗中具有重要的作用,如何使它在常规安全剂量下,发挥最大疗效是众多学者们都在研究的课题。Bcl-xL基因是bcl-2家族中重要的凋亡抑制基因,在正常组织中低表达,在人类恶性肿瘤组织中广泛表达,它的异常表达可使已有基因异常改变的细胞逃避凋亡,与肿瘤的发生、发展及预后有关,与许多恶性肿瘤的化疗耐药性存在密切关系。.已发现它的表达与多种肿瘤预后相关,目前为止,有关Bcl-xL诱导肿瘤细胞凋亡的研究多集中在消化系统、泌尿系统肿瘤及黑色素瘤方面,而Bcl-xL在胶质母细胞瘤中的表达特点和联合亚硝脲类药物治疗相关研究国内外尚未见报道。本研究从观察不同胶质母细胞瘤组织中Bcl-xL的表达情况入手,分析总结Bcl-xL表达及其表达水平与与患者临床预后的相关性,并采用阳离子脂质体介导的反义寡核苷酸技术进行了体内外实验治疗的系统研究,主要内容及结果如下:第一部分Bcl-xL在胶质母细胞瘤中的表达以及与临床预后的相关性研究目的:分析总结Bcl-xL在胶质母细胞瘤组织中的表达及其表达水平与与患者临床预后的相关性,为胶质母细胞瘤的综合治疗和诱导分化治疗提供临床依据。方法:应用免疫组化和RT-PCR技术系统检测了20例正常脑组织、53例原发胶质母细胞瘤组织、35例复发胶质母瘤组织、16例术前经过放射治疗和11例术前经过化疗的胶质母瘤组织和人工培养的胶质母细胞瘤A-172细胞株中Bcl-xL蛋白和Bcl-xL mRNA的表达。免疫组化和RT-PCR试验是在双盲下进行的,实验操作者事前并不知道该患者的临床资料和随访结果。用单变量分析和多变量分析研究Bcl-xL表达和生存之间的关系,使用Kaplan-Meier法计算生存曲线并采用Logrank（对数秩）检验。结果:胶质母细胞瘤组织及人胶质母细胞瘤A-172细胞株中均存在着Bcl-xL蛋白和Bcl-xL mRNA的过表达,但也存在着Bcl-xL的差异性表达。复发性胶质母细胞组织中Bcl-xL阳性率大于首次接受治疗的胶质母细胞瘤组织,其相对表达量也高于首次接受手术的胶质母细胞瘤组（P＜0.05）。在复发胶质母细胞瘤组中,化疗后手术组Bcl-xLmRNA相对量明显高于放疗后手术组。阳性率差异不显着（P＞0.05）,但阳性强度等级构成比差异显着性（P＜0.05）,其相对表达量化疗后手术组明显高于放疗后手术组,具有显着性差异（P＜0.01）。生存分析显示;88例中,Bcl-xL86.36%（76/88）阳性表达,全组阴性患者生存时间明显高于阳性病例（P＜0.01）,阴性患者平均生存时间23.5个月,阳性病例只有10.8个月。Bcl-xL表达水平和表达强度与患者生存时间缩短有密切负相关系（P＜0.05）。结论:首先,Bcl-xL在胶质母细胞瘤中的过表达,增强了肿瘤细胞亲润性生长的能力。可能是胶质母细胞瘤逃逸凋亡的内在原因之一,也是造成胶质母细胞瘤恶性生长的机制之一。Bcl-xL的阳性表达和表达水平可以作为胶质母细胞瘤预后价值指标。为胶质母细胞瘤分子病理学研究带来的新思路。其次,在体外细胞株试验中,Bcl-xL的表达可以直接引起化疗耐药和对放射治疗的耐受。在临床上也确实存在这种情况,因为本组病例从选择到治疗都是同一标准,但结果并不相同,也可能是Bcl-xL表达降低了这些细胞的凋亡能力。第二部分Bcl-xL反义寡核苷酸联合ACNU体外治疗胶质母细胞瘤的实验研究目的:探讨Bcl-xL反义寡核苷酸联合嘧啶亚硝脲（ACNU）在抑制胶质母细胞瘤细胞增殖以及体外下调Bcl-xLmRNA和蛋白的表达与细胞凋亡的作用。方法:采用阳离子脂质体介导的反义寡核苷酸技术转染胶质母细胞瘤A-172细胞株,并应用RT-PCR、Western blot杂交、MTT检测、流式细胞术和细胞凋亡的原位酶标记检测（TUNEL检测）等技术进行了胶质母细胞瘤体外治疗的相关研究。结果:Bcl-xL-ASODN和ACNU对A-172细胞都具有一定的程度的凋亡诱导作用,ACNU单一治疗最佳浓度为25ug/ml,凋亡率为40.82%（FCM）,Bcl-xL-ASODN最佳浓度为300nmol/L,细胞凋亡率为37.88%（FCM）。Bcl-xL反义寡核苷酸联合ACNU治疗组对肿瘤细胞抑制率为88.63%,对Bcl-xL mRNA表达的抑制率为88.76%,在mRNA和蛋白质水平分别下调了88.76%和87.04%;同时,caspase-3的表达增加了430.41%,肿瘤细胞凋亡率为80.54%,与对照组、空白组、NODN组、ACNU和ASODN组相比较,均具有显着差异（P＜0.05）。结论:阳离子脂质体介导法具有使用方便、特异性封闭靶基因及无毒性等特点,是外源基因导入细胞内的良好途径。Bcl-XL反义寡核苷酸联合嘧啶亚硝脲可有效抑制胶质母细胞瘤的细胞增值,揭示了影响胶质母细胞瘤细胞凋亡的主要机制之一可能是Bcl-xL增强了胶质母细胞瘤恶性增殖能力造成的,通过反义寡核苷酸下调Bcl-xL的表达,显着增强了胶质母细胞瘤对嘧啶亚硝脲的敏感性,提示Bcl-xL高表达是胶质母细胞瘤对嘧啶亚硝脲耐药的又一重要因素,为提高胶质母细胞瘤临床治疗效果提供又一理论依据。第三部分BCL-XL反义寡核苷酸联合ACNU裸鼠体内治疗胶质母细胞瘤的研究目的:探讨Bcl-xL反义寡核苷酸联合嘧啶亚硝脲（ACNU）在抑制移植瘤的生长以及体内下调Bcl-xLmRNA和蛋白的表达与细胞凋亡的作用。方法:首先进行人胶质母细胞瘤细胞株A-172在裸鼠体内的成瘤实验,细胞浓度为1×107/ml,每只鼠右前腿背侧皮下注射0.2ml（细胞数为2×106/ml）,建立人胶质母细胞瘤异种移植瘤实验动物模型。将构建成功的动物模型随机分为5组:空白对照组（A）、无关序列寡核酸对照组（B）、Bcl-xLASODN治疗组（C）、ACNU治疗组（D）、ACNU联合Bcl-xLASODN治疗组（E）;采用瘤旁注射的方式,每日一次共15次。观察裸鼠及移植瘤的生长状态。应用游标卡尺测量、MTT、Western blot、RT-PCR、TUNEL及HE染色等方法,观察裸鼠体内人胶质母细胞瘤移植瘤治疗前后的生长抑制情况及组织学形态,检测移植瘤中Bcl-xL及caspase-3表达变化及移植瘤细胞凋亡的情况。结果:胶质母细胞瘤A-172细胞株裸鼠皮下异种移植成功率为100%,出瘤时间为接种后6-8d。Bcl-xL ASODN在裸鼠体内能够下调移植瘤中Bcl-xL的表达,激活Caspase-3的表达。肿瘤组织中Bcl-xL表达按照C组、D组及E组的顺序表达下调,尤其是E组Bcl-xLmRNA和蛋白质水平的表达分别下调了86.46%和88.31%,均明显高于以上各组（P＜0.01）。E组caspase-3蛋白的表达增加了376.46%,显着高于以上各组（P＜0.01）。TUNEL显示,A、B、C、D、E各组的细胞凋亡率分别为:2.25%、2.75%、36.75%、39.25%、65.25%,C、D、E三组明显高于A、B组（P＜0.01）,且E组又明显高于C、D组（P＜0.01）,经15天的治疗,联合治疗组移植瘤体积缩小了56.36%。结论:单一应用ACNU或Bcl-xLASODN在裸鼠体内对移植瘤生长有一定程度的抑制作用,ACNU联合Bcl-xLASODN在裸鼠体内对移植瘤有明显的治疗作用,降低了肿瘤细胞中Bcl-xL的表达,激活Caspase-3的表达,增加了肿瘤细胞胞对ACNU的敏感性。本研究结果表明,胶质母细胞瘤的发展存在一个渐进过程,细胞凋亡屏障的增加促使部分病人耐药、对放疗不敏感是最终加速复发根本原因,Bcl-xL的异常表达可能是诸多途径中重要的途径之一;Bcl-xL在胶质母细胞瘤中的表达特点,有利于更好理解胶质母细胞瘤的发病机理,为胶质母细胞瘤分子病理学研究带来的新思路,Bcl-xL有可能成为重要的临床预后标记指标。我们采用阳离子脂质体包裹目的基因方法,利用ACNU联合Bcl-xL-ASODN体内外治疗胶质母细胞瘤后,明显抑制了A-172细胞及裸鼠体内移植瘤的生长,下调了肿瘤细胞中Bcl-xL的表达,增加了肿瘤细胞胞对ACNU的敏感性,显着提高嘧啶亚硝脲的治疗效果,表明提高ACNU化疗敏感性与下调Bcl-xL的表达有关,Bcl-xL高表达是胶质母细胞瘤对ACNU耐药的重要因素之一,这为临床克服嘧啶亚硝脲治疗胶质母细胞瘤化疗耐药提供了重要的实验依据,对提高胶质母细胞瘤临床治疗效果具有极大的指导意义。
巫智勇,熊平[9]（2005）在《胱天蛋白酶和肿瘤放射治疗》文中进行了进一步梳理
楚建军,韩泽广,杜荣兰,赵涤非,王明智,范强[10]（2003）在《γ-羟基丁酸钠联合放射治疗脑胶质瘤Caspase3基因表达分析》文中研究表明目的 探讨γ 羟基丁酸钠对脑组织Caspase3的表达影响及其与放射性损伤严重程度的关系 方法 采用逆转录 多聚酶链反应（RT PCR）技术检测γ 羟基丁酸钠联合放射治疗脑胶质瘤前后瘤组织与瘤旁脑组织Caspase 3mRNA表达量,分析Caspase3基因表达活性与放射性损伤的关系 结果 常规放疗、超分割放疗组的瘤组织、瘤旁脑组织Caspase 3mRNA表达量较高;放疗前40min给予GHB200mg/kg联合常规放疗、超分割放疗,其Caspase 3mRNA表达显着降低（Q=7 93,P<0 01） 而GHB200mg/kg不接受放疗,其脑胶质瘤组织Caspase 3mRNA表达量较低,仅为19 182±1 19,较常规放疗差别显着（P<0 05） 胶质瘤及瘤旁正常脑组织放疗前Cas pase 3mRNA表达量较低,放疗后显着增加;射野内瘤组织Caspase 3mRNA表达量明显高于瘤旁组织,脑组织放射损伤严重程度野内高于野外 使用GHB后瘤组织Caspase 3mRNA表达量降低,降幅达16 2%左右,常规放疗组瘤旁脑组织Caspase 3mRNA的表达量较超分割放疗组（HF）高1 22倍 采用HF较常规放疗脑组织Caspase 3mRNA表达量减少21 83% 结论 γ 羟基丁酸钠联合放射治疗显着脑胶质瘤Caspase3基因表达,Caspase 3mRNA表达量与放射损伤严重程度有关,并且GHB对射野周围正常脑组织具有明显保护作用
二、γ-羟基丁酸钠联合放射治疗脑胶质瘤Caspase3基因表达分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、γ-羟基丁酸钠联合放射治疗脑胶质瘤Caspase3基因表达分析（论文提纲范文）
（1）低氧微环境下替莫唑胺对脑胶质瘤细胞凋亡及对BCL-2表达的影响（论文提纲范文）
| 缩写词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 低氧微环境下替莫唑胺对脑胶质瘤细胞增殖与凋亡的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 低氧微环境下替莫唑胺对脑胶质瘤细胞BCL-2表达的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（2）对映—贝壳杉烷型二萜Weisiensin B对人脑胶质瘤U87细胞生长抑制、分化诱导作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 综述 |
| 1 脑胶质瘤的研究概况 |
| 1.1 胶质瘤的发病率及其危害 |
| 1.2 胶质瘤发病原因 |
| 1.2.1 遗传因素 |
| 1.2.2 病毒因素 |
| 1.2.3 基因变异 |
| 1.2.4 放射因素 |
| 1.2.5 化学因素 |
| 1.3 胶质瘤的治疗 |
| 1.4 胶质瘤的分化治疗 |
| 1.4.1 脑胶质瘤常用的诱导分化剂 |
| 1.4.1.1 环腺苷酸及其类似物 |
| 1.4.1.2 维甲酸类化合物 |
| 1.4.1.3 极性平面化合物 |
| 1.4.1.4 脂肪酸类分化剂 |
| 1.4.1.5 细胞因子 |
| 1.4.1.6 其他诱导剂 |
| 2 细胞骨架 |
| 2.1 细胞骨架概述 |
| 2.1.1 微丝 |
| 2.1.2 微管 |
| 2.1.3 中等纤维 |
| 2.2 细胞骨架与肿瘤发生 |
| 2.3 细胞骨架与细胞凋亡 |
| 2.4 细胞骨架与细胞分化 |
| 3 香茶菜属二萜化合物的研究概况 |
| 3.1 香茶菜属植物研究概况 |
| 3.2 二萜化合物的药理活性研究 |
| 3.2.1 二萜化合物的抗肿瘤作用 |
| 3.2.2 二萜化合物的抗菌作用 |
| 3.2.3 二萜化合物的抗氧化作用 |
| 3.2.4 二萜化合物的其它作用 |
| 4 本研究的目的及意义 |
| 第二章 对映-贝壳杉烷型二萜Weisiensin B对人脑胶质瘤细胞U87生长抑制、分化诱导作用的研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验试剂及受试单体化合物 |
| 3 实验仪器 |
| 4 实验方法 |
| 4.1 细胞培养 |
| 4.2 台盼蓝排染法检测Weisiensin B对U87细胞的生长抑制作用 |
| 4.3 MTT法测试Weisiensin B的细胞毒作用 |
| 4.4 流式细胞术检测Weisiensin B对U87细胞周期的影响 |
| 4.5 吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）双染法检测Weisiensin B引起的凋亡 |
| 4.6 倒置显微镜观察Weisiensin B对U87细胞形态的影响 |
| 4.7 吉姆萨染色观察Weisiensin B对U87细胞核形态影响 |
| 4.8 划痕法测试Weisiensin B对U87细胞迁移的影响 |
| 4.9 间接免疫荧光技术检测Weisiensin B对U87细胞GFAP的影响 |
| 4.10 间接免疫荧光技术检测Weisiensin B对U87细胞的波形蛋白的影响 |
| 4.11 罗丹明标记的鬼笔环肽检测Weisiensin B对U87细胞微丝的影响 |
| 4.12 间接免疫荧光技术观察U87细胞微管骨架 |
| 4.13 流式细胞术检测Weisiensin B对细胞内活性氧的影响 |
| 4.14 数据统计 |
| 5 实验结果 |
| 5.1 Weisiensin B对U87细胞的生长抑制作用 |
| 5.2 MTT法测定细胞毒活性 |
| 5.3 Weisiensin B对U87细胞周期分布的影响 |
| 5.4 AO/EB染色检测Weisiensin B对U87细胞是否有凋亡作用 |
| 5.5 Weisiensin B对U87细胞形态的影响 |
| 5.6 吉姆萨染色观察Weisiensin B引起的U87细胞形态变化 |
| 5.7 划痕法测试Weisiensin B对U87细胞迁移的影响 |
| 5.8 Weisiensin B对U87细胞内GFAP表达水平的影响 |
| 5.9 Weisiensin B对U87细胞内Vimentin表达水平的影响 |
| 5.10 Weisiensin B对U87细胞微丝的影响 |
| 5.11 Weisiensin B对U87细胞微管的影响 |
| 5.12 Weisiensin B引起U87细胞中ROS含量的变化 |
| 6 分析及讨论 |
| 7 结论 |
| 参考文献 |
| 硕士在读期间发表论文及成果 |
| 致谢 |
（3）丙戊酸钠对C6胶质瘤大鼠正常脑组织的放射保护作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的文章及参与课题 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（4）Beclin-1和mTOR基因在人脑胶质瘤中的表达及意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词对照表 |
| 个人简历 |
| 研究生期间发表的论文 |
| 致谢 |
（5）白头翁皂苷D抑制人脑胶质母细胞瘤U87MG及U251MG生长的实验研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 1. 恶性胶质瘤的治疗及其进展 |
| 2. 调控细胞周期与肿瘤细胞增殖抑制 |
| 3. 细胞凋亡 |
| 4.细胞自噬 |
| 5.植物提取物单体在抗肿瘤方面研究进展 |
| 6.白头翁皂苷的研究进展 |
| 第一部分 白头翁皂苷 D（PULSATILLASAPONIN D）对人胶质母细胞瘤系 U87MG及U251MG 增殖的影响及其主要作用机制 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 白头翁皂苷 D（PULSATILLASAPONIN D）抑制荷瘤小鼠模型胶质瘤生长的作用研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（6）Nodosin对恶性胶质瘤的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 1.1 胶质瘤的治疗研究现状 |
| 1.1.1 胶质瘤概述 |
| 1.1.2 胶质瘤的治疗进展 |
| 1.2 香茶菜属二萜化合物抗胶质瘤研究进展 |
| 1.3 Nodosin研究进展 |
| 1.3.1 Nodosin概述 |
| 1.3.2 Nodosin药理作用研究进展 |
| 第二章 Nodosin对恶性胶质瘤细胞增殖与凋亡的影响 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞来源 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要试剂和药物配制 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 细胞形态学观察 |
| 2.2.3 细胞活性检测(MTT法) |
| 2.2.4 细胞毒性检测(LDH法) |
| 2.2.5 细胞增殖检测(BrdU检测) |
| 2.2.6 对细胞周期的影响 |
| 2.2.7 Hoechst 33342染色检测细胞凋亡 |
| 2.2.8 原位末端标记技术(TUNEL)检测细胞凋亡 |
| 2.2.9 统计方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 Nodosin选择性杀伤恶性胶质瘤细胞 |
| 2.3.2 Nodosin对C6、U87没有细胞毒作用 |
| 2.3.3 Nodosin抑制恶性胶质瘤细胞增殖 |
| 2.3.4 Nodosin诱导胶质瘤细胞凋亡 |
| 2.4 讨论 |
| 第二章 Nodosin对恶性胶质瘤细胞增殖与凋亡的信号通路研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 细胞来源 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要试剂配制 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 对细胞周期蛋白cyclin B1和cdc2的影响 |
| 3.2.3 Caspase-3/7、Caspase-8、Caspase-9活性的检测 |
| 3.2.4 对细胞线粒体膜电位的影响 |
| 3.2.5 对细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bcl-x_L、Bax、Bak的影响 |
| 3.2.6 Nodosin对胶质瘤细胞内信号通路的影响 |
| 3.2.7 对GSK3β抑制剂LiCl作用后细胞凋亡的影响 |
| 3.2.8 统计方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 Nodosin下调细胞周期蛋白cyclin B1和cdc2蛋白表达 |
| 3.3.2 Nodosin激活Caspase-3/7、Caspase-8、Caspase-9活性 |
| 3.3.3 Nodosin引起线粒体膜电位下降 |
| 3.3.4 Nodosin对恶性胶质瘤C6和U87细胞内凋亡相关蛋白表达水平的影响 |
| 3.3.5 Nodosin抑制胶质瘤细胞内P38 MAPK、Akt和PKC信号通路 |
| 3.3.6 Nodosin下调CREB的磷酸化蛋白表达 |
| 3.3.7 GSK3β抑制剂LiCl可阻断nodosin引起的细胞凋亡 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 Nodosin对胶质瘤细胞的迁移与侵袭的影响及机制研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 细胞来源 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要试剂和药物配制 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 细胞培养 |
| 4.2.2 划痕试验(wound heal ing assay) |
| 4.2.3 Transwell法评价胶质瘤细胞迁移能力 |
| 4.2.4 Transwell法评价脑胶质瘤细胞侵袭能力 |
| 4.2.5 nodosin对细胞骨架的影响 |
| 4.2.6 Western blot检测MMP-9蛋白表达 |
| 4.2.7 统计方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 Nodosin阻断胶质瘤细胞迁移 |
| 4.3.2 Nodosin抑制胶质瘤细胞侵袭 |
| 4.3.3 Nodosin促进细胞微管解聚 |
| 4.3.4 Nodosin下调胶质瘤细胞MMP-9蛋白表达水平 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 Nodosin对C6胶质瘤的体内实验研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 细胞来源 |
| 5.1.2 实验动物 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.1.4 主要试剂配制 |
| 5.1.5 主要仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 细胞培养及动物饲养 |
| 5.2.2 裸鼠皮下移植瘤模型的建立与给药 |
| 5.2.3 观察药物对肿瘤生长的影响 |
| 5.2.4 病理学观察 |
| 5.2.5 统计方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 Nodosin抑制肿瘤生长 |
| 5.3.2 Nodosin减少肿瘤重量 |
| 5.3.3 Nodosin对移植瘤病理学组织的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 统计学证明 |
（7）β-二酮钴的配合物抗胶质瘤细胞作用的实验研究及机制探讨（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 绪论 |
| 第1章 文献综述 |
| 综述1 具有抗肿瘤活性的含钴化合物的研究概况 |
| 综述2 β-二酮配合物在医学抗肿瘤领域的研究 |
| 综述3 化学药物在脑胶质瘤治疗中的作用 |
| 综述4 抗癌药??对脑胶质瘤细胞凋亡的影响 |
| 立题依据 |
| 第2章 实验研究 |
| 实验1 β-二酮的钴配合物对胶质瘤细胞株体外敏感性试验 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验2 β-二酮的钴配合物的急性毒性动物实验 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验3 β-二酮的钴配合物对C6 鼠脑胶质瘤细胞DNA 合成的抑制作用 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验4 β-二酮的钴配合物对C6 大鼠脑胶质瘤细胞株细胞周期 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验5 β-二酮的钴配合物对C6 大鼠脑胶质瘤细胞株细胞凋亡的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验6 β-二酮的钴配合物作用C6大鼠脑胶质瘤细胞后细胞凋亡因子的表达 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第3章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（8）Bcl-xL反义寡核苷酸联合嘧啶亚硝脲治疗脑胶质母细胞瘤的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 Bcl-xL在胶质母细胞瘤中的表达以及与临床预后的相关性研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 Bcl-xL反义寡核苷酸联合ACNU体外治疗胶质母细胞瘤的实验研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 BCL-XL反义寡核苷酸联合ACNU裸鼠体内治疗胶质母细胞瘤的研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 附录 |
| 致谢 |
（9）胱天蛋白酶和肿瘤放射治疗（论文提纲范文）
| 1 caspase家族概述 |
| 1.1 caspase家族的结构和特性 |
| 1.2 caspase的激活和调控 |
| 2 caspase家族与肿瘤放射治疗 |
| 3 caspase在放射线诱导肿瘤细胞凋亡中的作用机制 |
| 4 caspases在肿瘤放射治疗中的应用前景 |
四、γ-羟基丁酸钠联合放射治疗脑胶质瘤Caspase3基因表达分析（论文参考文献）
- [1]低氧微环境下替莫唑胺对脑胶质瘤细胞凋亡及对BCL-2表达的影响[D]. 刘耀. 昆明医科大学, 2017(02)
- [2]对映—贝壳杉烷型二萜Weisiensin B对人脑胶质瘤U87细胞生长抑制、分化诱导作用的研究[D]. 李杰林. 西北师范大学, 2015(06)
- [3]丙戊酸钠对C6胶质瘤大鼠正常脑组织的放射保护作用[D]. 牛俊婕. 山东大学, 2014(11)
- [4]Beclin-1和mTOR基因在人脑胶质瘤中的表达及意义[D]. 王凤伟. 郑州大学, 2014(02)
- [5]白头翁皂苷D抑制人脑胶质母细胞瘤U87MG及U251MG生长的实验研究[D]. 李博. 第四军医大学, 2014(01)
- [6]Nodosin对恶性胶质瘤的作用及其机制研究[D]. 陈秋铃. 广州中医药大学, 2013(10)
- [7]β-二酮钴的配合物抗胶质瘤细胞作用的实验研究及机制探讨[D]. 张开治. 吉林大学, 2011(09)
- [8]Bcl-xL反义寡核苷酸联合嘧啶亚硝脲治疗脑胶质母细胞瘤的实验研究[D]. 王新军. 华中科技大学, 2008(05)
- [9]胱天蛋白酶和肿瘤放射治疗[J]. 巫智勇,熊平. 南华大学学报(医学版), 2005(04)
- [10]γ-羟基丁酸钠联合放射治疗脑胶质瘤Caspase3基因表达分析[J]. 楚建军,韩泽广,杜荣兰,赵涤非,王明智,范强. 江南大学学报, 2003(06)