一、泌尿系统肿瘤HSV-TK基因治疗的研究现状（论文文献综述）
毛明焕[1]（2018）在《三氧化二砷对缝隙连接蛋白43表达的影响及参与非肌层浸润膀胱癌半通道开放的研究》文中进行了进一步梳理研究背景:泌尿系统肿瘤中最常见的就是膀胱癌,主要是指膀胱黏膜细胞发生癌变,其中尿路上皮发生癌变（即临床常说的移行细胞癌）最为常见。膀胱癌的发病率在世界范围内不断升高,在我国其已经成为泌尿系统内发病率最高的恶性肿瘤,并且其病死率呈每年逐步升高趋势。流行病学调查研究发现男性膀胱癌的发病率高出女性2-3倍之多,在中国恶性肿瘤发病率排行中,男性群体中膀胱癌发病率位于第8位,而女性排行则为第12位。临床研究发现,按照膀胱癌浸润程度划分,浅表性膀胱癌在临床极为常见。浅表性膀胱癌临床又将其称为非肌层浸润性膀胱癌（non-muscle invasive bladder cancer,NMIBC）,而非肌层浸润性膀胱癌现有的一线临床治疗方法中,经尿道膀胱肿瘤切除术（transurethral resection of bladder tumor,TURBT）是最常用的治疗方法之一,而早期手术被认为是膀胱癌预后效果的关键影响因素。早期手术虽然能够术切除大部分癌细胞,但是术后复发率、复发患者恶性程度上升等均已经称为膀胱癌致死的重要因素,因此早期手术后进行辅助抗癌就显得极为重要。膀胱内药物灌注免疫治疗在浅表性膀胱癌的治疗中已经被广泛认可,早期手术后辅以膀胱灌注化疗被认为不仅能够有效降低患者术后复发的风险,而且能够有效提升预后效果和生存率,但是目前仍有超过60%的癌症患者术后复发。卡介苗（Bacillus Calmette–Guérin,BCG）膀胱灌注作为目前临床治疗浅表性膀胱癌一线免疫治疗方案,是膀胱癌辅助抗癌金标准疗法之一,被认为是灌注化疗失败后最有效的方法,但仍有30-45%病人对BCG治疗无反应,20%患者不能耐受其毒副作用。而且仍有一定比例病人不能耐受其毒副作用如出血性膀胱炎、造血和免疫功能抑制等,严重降低患者日常生活的质量。因此,改善BCG抗癌疗效、降低毒副作用是目前膀胱癌灌注治疗研究的热点。BCG联合化疗药物是目前可应用于临床的方法,效果与BCG单独应用的效果更具优势,而且有利于降低BCG有效治疗所需剂量。三氧化二砷（缩写为As2O3,即ATO）作为我国中医药体系中传统治疗药物——砒霜最重要的药物成分,能够有效治疗包括梅毒、结核、癌症等多种疾病,临床上历史悠久,上个世纪90年代我国科研工作者发现其能够靶向性治疗急性早幼粒细胞白血病（APL）并取得了突出的疗效,自此三氧化二砷的抗肿瘤活性引起了世界性的关注。在1999年,中国国家食品药品监督管理局（即SFDA）就已经审核通过了ATO注射液的生产申请,并允许其在临床治疗中应用,而美国食品与药物管理局相继在2000年通过了关于ATO注射液在美国上市的申请,将其批准成为复发/难治性APL治疗的二线药物。三氧化二砷对血液系统疾病疗效显着,通过观察分析ATO应用到血液系统肿瘤患者之后的效果发现,使用ATO之后血液系统肿瘤治疗效果（完全缓解率）、远期生存率等显着提高,且复发率明显下降、不良反应明显减轻,并且其并会与所用的其他化疗药物发生交叉耐药的现象。近年来,在实体肿瘤的临床治疗中,ATO的应用范围不断拓展,肺癌,乳腺癌,胃癌,前列腺癌,结肠癌,卵巢癌;肝癌等诸多实体肿瘤中均有其研究报道所查。目前诸多体内外相关实验表明ATO作为肿瘤治疗药物,对肿瘤细胞凋亡具有选择性诱导作用,而且能够不影响正常细胞的凋亡过程及抗肿瘤血管生成作用。但ATO的抗肿瘤作用具有明显的剂量和时间依赖特性,ATO治疗窗比较窄,大剂量ATO对正常细胞有明显的毒性作用,因此有效的给药途径和用药剂量是决定ATO临床疗效的关键。选择较低且有效的药物浓度,在保证抗肿瘤疗效的同时减少副作用是临床用药的基本原则。连接蛋白（Connexin,Cxs）有趋同的基本架构,具体结构的组成成分同时含有疏水跨膜片段（共4个）和亲水段,其中亲水段的位置在胞内环（1个）与胞外环（2个,组成成分均是6个保守性半胱氨酸残基）之间,而蛋白羧基末端、氨基末端全部存在于胞质之内。Cxs具有多种不同形式的羧基末端,是公认的关键部位,并在蛋白间相互作用过程中发挥着极其重要的调节作用。细胞缝隙连接（Gap junction,GJs）是由两个细胞缝隙连接蛋白六聚体互相对接形成的跨膜通道结构,在细胞表面还存在着许多未配对的半通道,与细胞缝隙连接有着相似的通透特性。细胞缝隙连接蛋白的半通道允许细胞交换分子量为1000D以下的离子、代谢产物、离子(K+、Ca2+)、白介素（IL-6、IL-10）和其他第二信使（cAMP、GSH、cGMP、NO和IP3等）,大分子则不允许通过（小RNAs除外）,在沟通细胞间及细胞与基质间信息,调控细胞代谢,增殖分化中发挥重要作用,已经有超过20种细胞缝隙连接蛋白被鉴定,几乎所有其它类型的细胞都有GJs的存在,除外骨骼肌、成熟的红细胞及精子,组织表达分布最广与肿瘤的关系最密切的是Cx43,在多种恶性肿瘤细胞中Cx43的表达下调与肿瘤的发生、发展及转移有关。在膀胱癌组织中的研究证实,肿瘤病灶周围的正常膀胱组织,其细胞内的Cx43蛋白多表现出高水平表达状态,在膀胱尿路上皮癌细胞中低表达。Cx43的基因突变极少见,其表达及功能的调控主要在转录及转录后水平进行。目前已经发现ATO可能通过调节CX43表达产生生物学效应,但是由于目前相关机制以及ATO联合BCG抗肿瘤效应、机制的研究仍属于空白。研发新型膀胱癌治疗药物不仅需要进行体外实验研究,而且需要进行体内实验模型建立并进一步证实其对机体的有效性和安全性。现今医疗研究中,膀胱癌的体外模型建立方法中最常用的就是向体内输注人膀胱癌细胞,该方法建立的实验模型不仅能够用于膀胱癌发生机制的各项研究中,而且能够初步评价抗膀胱癌治疗药物在体内应用的效果和安全性。体外动物模型建立的优势在于实验条件具有可控制性、操作方便、实验耗时较短,而且研发费用极为低廉;但是其缺点也极为明确,目前所用的膀胱癌细胞系其肿瘤细胞种类单一,并且均在体外生长,在生长方式、生长微环境、细胞构成种类方面不能够与人体膀胱癌细胞完全一致,因此其无法完全模拟人体膀胱癌组织发生病变特点,无法代表化疗药物毒副反应,由此可见,单纯体外研究成果并不能够完全反应化疗药物在体内作用的有效性、安全性,建立体内实验模型评价化疗药物治疗恶性肿瘤可行性是极为必要的。虽然目前恶性肿瘤动物模型建立过程可供选择的动物种类较多,但是最常用的动物种类仍然是小鼠或者裸小鼠,主要原因在于鼠类体型较小、繁殖时间短、遗传基因与人类有清晰的同源性、且生理生化代谢过程特点与人类高度相似,因此,相较于其他种类动物模型,裸小鼠恶性肿瘤模型能更好论证化疗药物可行性、有效性和安全性,并能够初步反应出药物体内代谢过程和动力学特点,因此,在膀胱癌新药研发中进行动物在体实验是必须的。鉴于此,本研究将利用人膀胱癌细胞系BIU-87、T24、5637等膀胱癌细胞株先设计特定的与临床极其相关的体外实验体系,随后建立膀胱癌异位移植瘤裸小鼠动物模型,通过体外细胞层次研究、实验动物在体实验研究两个层次综合分析三氧化二砷成为膀胱癌灌注化疗药物的可行性,通过体内、体外充分论证其药物治疗的有效性、安全性,为临床应用三氧化二砷治疗膀胱癌奠定实验基础,为临床推广中医药抗肿瘤治疗奠定科学而坚实的理论基础。本实验的主要目的是:（1）体外培养人膀胱癌细胞系BIU-87、T24、5637等膀胱癌细胞特定的体外细胞培养实验,通过多种实验技术及手段,确立膀胱癌模型建立方法（2）体外培养人膀胱癌细胞系,通过给予不同浓度的ATO,模拟ATO不同给药剂量对于肿瘤细胞增殖的影响,同时通过从细胞和分子层面针对三氧化二砷影响缝隙连接蛋白43与抗肿瘤作用的关系进行探讨。（3）膀胱癌皮下移植瘤小鼠模型建立过程中,选取的膀胱癌细胞种类为5637,细胞注射方式为皮下注射,通过腹腔注射不同药物的方法,分析干预方法对于肿瘤细胞的影响,初步分析ATO联合BCG膀胱灌注治疗膀胱癌移植瘤的效果和可能的抗肿瘤效应作用机制。方法:将NBT-II膀胱癌细胞株、BIU-87型膀胱癌细胞株、5637型膀胱癌细胞株、T24膀胱癌细胞株以及PBS细胞株进行体外传代培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中,细胞体外培养进入对数生长阶段之后,利用专用细胞平体外培养基对目标细胞进行重悬,调整细胞浓度,分别注射到Balb/c雌裸小鼠体内,根据所注射细胞的不同,将小鼠分为5组,分组结果为5637组、NBT-II组、BIU-87组、T24组以及PBS组,观察分析小鼠皮下肿瘤形成和生长情况,确定膀胱癌建模细胞种类,为体内实验建模奠定基础。1、利用5637膀胱癌细胞株建立模拟临床膀胱癌术后膀胱灌注化疗药物的体外实验体系,根据干预方法的不同分为6组,依次为正常培养组（实验过程中未添加任何对细胞有影响的干预措施）、5μmol/L组（As2O3应用剂量为5μmol/L）、10μmol/L组（As2O3应用剂量为10μmol/L）;、15μmol/L组（As2O3应用剂量为15μmol/L）、20μmol/L组（As2O3应用剂量为20μmol/L）、25μmol/组（As2O3应用剂量为25μmol/L）,在完成细胞体外药物干预之后,在干预的24h、48h分别完成细胞增殖情检测况,同时对不同干预方法的各组的蛋白表达水平予以测定,其中蛋白检测指标包括Cx43、Nrf2、JNK、JNK-1,检测方法是western blot,基因检测指标是Cx43,检测方法是PCR法,采用CCK-8检测膀胱癌细胞存活率、应用流式细胞技术观察ATO对细胞凋亡情况的影响,从分子水平、基因水平对三氧化二砷对缝隙连接蛋白43及半通道的作用与抗膀胱癌作用的内在分子机制进行检测和分析,检测Cx43表达改变。2、选取5637作为膀胱癌动物模型建立的细胞株经皮下注射癌细胞并成功建立移植瘤模型之后,当平均肿瘤体积达100mm3150mm3大小时,依据瘤体积、裸鼠体重,遵循均衡随机原则,将模型鼠平均分为为4组,每组中实验动物模型均为9只,各组小鼠的肿瘤体积等差异均未超过均值的10%,并且按以下方案幵始给药:（1）三氧化二砷组:给予As2O3 10mg/kg;（2）Gap26组,Gap26阻滞后给予As2O310mg/kg;（3）空白对照组,不添加药物及阻滞剂,仅给予0.9%NaCl;（4）联合组,As2O3 10mg/kg+卡介苗（BCG）100g,连续干预10天,观察记录干预前后各组分别处理小鼠,观察对比瘤积和瘤重变化,同时各组移植瘤小鼠Cx43表达水平进行测定,从分子水平对As2O3与BCG对缝隙连接蛋白43的作用与抗膀胱癌作用的内在分子机制进行检测和分析。3、统计学处理:采用统计学专业软件（SPSS 13.0）对实验数据进行分类、整理和统计学分析,其中在分析不同阻滞剂在不同处理时间下对Cx43,p-Cx43总蛋白的影响需要行析因分析。对时间、阻滞剂单独效应等资料进行分析时则需用单因素方差分析,如果数据的方差不齐时,则需要以welch校正法对数据进行校正,方差不齐数据的分析方法为DunnettT3法。满足方差齐性条件的数据在分析时,按照均数士标准差（x±s）形式将数据表示后,多组间两两比较的方法是LSD法,多组间均数比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）,等级资料均以非参数检验（Independent Samples Test）完成,显着性评价水准是a=0.05,P<0.05认为有显着性。结果:1、BIU-87组、5637组、NBT-II组和T24组在实验过程中各组裸鼠状态好,体重无明显下降,无提前死亡小鼠出现,实验中全部所用小鼠在实验过程中并无严重不良反应显现,均饮食排便正常。在注射相同浓度细胞悬液的情况下,按肿瘤体积大于0.1cm3为成瘤标准,NBT-II组出瘤率最高,其次为5637组,各组裸鼠的膀胱癌出瘤率存在明显差异（P<0.05）;裸鼠皮下移植性膀胱癌模型裸鼠体重随着时间变化而体重明显改变（P<0.05）,NBT-II组和5637组在肿瘤体积、肿瘤重量以及增长速度方面并无明显差异（P>0.05）。2、CCK-8方法显示As2O3处理膀胱癌细胞在浓度10umol/LAs2O3即可产生明显抑制增殖效果,且As2O3抑制效果呈明显浓度依赖效应关系,LD50约为20umol/L;Western Blot对蛋白定量分析显示:和对照组定量分析结果比较,处理12h后,As2O3对Cx43、Nrf2、JNK及JNK-1蛋白表达都有明显的上调,随着药物剂量增加而增加,不同As2O3处理间具有统计学差异（P<0.05）。3、在给药之前,各组裸鼠瘤积未见无显着性差异（P>0.05）,应用药物干预之后,As2O3组、联合组裸鼠的瘤积、瘤重均出现大幅下降,与本组给药治疗前比较,数据有显着性变化（P<0.05）;而且在经过药物治疗后,联合组瘤积、瘤重相较于其他各组,均处于显着低水平（P<0.05）,且As2O3组的瘤积和瘤重显着低于Gap26组和对照组,组间相比有统计学差异（P<0.05）;联合组、As2O3组瘤在体内均有大量坏死组织出现,且残存活性细胞的核分裂现象减少,部分区域可见肿瘤细胞无一不出现坏死、消失,而且在细胞内部,棕黄色颗粒多见且大量沉着,细胞染色结果大部分是阳性;Gap 26组肿瘤细胞坏死不明显,大部分肿瘤细胞生长旺盛,黄色颗粒沉着很少,细胞染色多为弱阳性,空白对照组的癌细胞表现促快速生长趋势,核分裂多见,黄色颗粒沉着极为稀少,组间CX43水平差异显着（P<0.05）。结论:人膀胱癌T-24、BIU-87、5637细胞在成瘤率方面具有明显差异,在建立膀胱癌模型过程中应选用成瘤较高、稳定性较好、且为人源性的5637细胞进行模型建立。体外实验体系中,低浓度的三氧化二砷即可以有效抑制生长,并使缝隙链接蛋白43表达上调,而且三氧化二砷抑制效果具有明显的时间和剂量依赖性,使用半通道特异性阻滞剂后三氧化二砷抗肿瘤效用明显减低,提示三氧化二砷抗肿瘤作用与半通道开放有关。三氧化二砷与BCG合用能够明显上调缝隙链接蛋白表达,抑制裸小鼠皮下膀胱癌细胞移植瘤的生长,其效果明显优于三氧化二砷单独使用。综上所述,本课题立足于临床治疗效果,从体外实验、在体实验两种不同实验体系分别揭示了中药砒霜主要成分——三氧化二砷的抗肿瘤效果,初步明确了其成为膀胱癌术后新型辅助治疗药物的可行性、有效性、安全性,在医学研究领域初步明确了三氧化二砷具有重要抗肿瘤治疗应用价值。
冯承阳,刘东,张程亮[2]（2018）在《干细胞介导的酶前药策略与肿瘤靶向治疗研究进展》文中研究指明目的传统化疗在杀灭肿瘤细胞的同时也给患者机体带来了较大的毒副作用,严重影响患者生活质量。近年来,人们利用干细胞定向肿瘤迁移特性将其作为细胞载体,配合酶前药体系共同杀灭肿瘤细胞实现了较好的效果,本文综述了近年来干细胞介导的酶前药策略在肿瘤靶向治疗中的发展现状。方法应用PubMed分别以"Stem cell,Enzyme,Prodrug,Tumor"等为关键词检索相关文献,检索时间为建库开始到2017-08,共检索到有关英文文献89篇,主要选取近10年文献纳入分析。检索CNKI、维普、万方等中文数据库未发现有关文献,故未纳入中文文献。纳入标准:（1）应用于肿瘤治疗的干细胞及酶前药体系;（2）干细胞介导的酶前药策略治疗肿瘤的原理;（3）干细胞介导酶前药体系治疗肿瘤的疗效与存在问题。依据纳入标准,符合分析的文献共有38篇。结果干细胞介导的酶前药策略治疗肿瘤的原理在于通过基因工程使干细胞携带抗肿瘤前药的代谢酶基因,干细胞进入体内后定向迁移至肿瘤部位并在肿瘤局部表达药物代谢酶,全身给予抗肿瘤前药后,肿瘤局部可以生成浓度高的细胞毒性代谢产物可起杀肿瘤细胞作用。此法不仅可以提高治疗效率还可以减少药物治疗带来的毒副作用。结论干细胞介导的酶前药策略为肿瘤靶向治疗提供了一种新方法,也是近年来肿瘤领域研究的热点之一。随着研究的深入,干细胞介导的酶前药体系将有望更好地应用到肿瘤靶向治疗中。
陈鹏[3]（2011）在《HSV1-tk肺腺癌报告基因显像与自杀基因治疗的研究基础》文中进行了进一步梳理目的现今肺癌的发病率和死亡率增长迅速,已成为人类死亡的主要原因之一,各细胞类型中以肺腺癌的增加尤为明显。临床发现多为中晚期,手术及放化疗的总体疗效不甚乐观,易出现局部复发及远处转移。基因治疗是目前肺癌治疗的研究热点之一,其中自杀基因（suicidegene）治疗被认为是最有应用前景的基因治疗方法。目前,诸多治疗基因中单纯疱疹病毒胸苷激酶HSV1-tk基因研究最多,是最具前景的具有催化放射性核素的“自杀基因”。此外,HSV1-tk还兼具报告基因功能,故建立携带tk基因的肺腺癌裸鼠动物模型后,可在活体状态下能表达胸苷激酶ΓK。18F、124I、131I等标记的核苷类似物作为底物进行反应后通过PET显像实时监测HSV1-tk自杀基因在靶细胞内的表达情况,为今后进一步深入研究肺癌的自杀基因治疗研究和监测奠定基础。同时,也可以为下一步进行双报告基因报告显像跟踪监测骨髓间充质干细胞的活体修复等工作奠定可行性基础。内容将外源自杀基因特异地导入肿瘤细胞内并在靶细胞内高效且稳定的表达是能否成功基因治疗肿瘤的关键。对患者体内的自杀基因分布转导情况和治疗状态进行实时检测分析也是整个治疗过程中不可或缺的部分。故本研究拟在前期研究的基础上利用逆转录病毒载体介导HSV1-tk自杀基因兼报告基因转染肺腺癌A549细胞,经筛选阳性转导细胞,再利用稀释法单克隆建立一种能稳定表达HSV1-tk基因肺腺癌细胞株A549-tk,观察其与正常A549细胞的形态和生长状态的区别。建立能在活体内长期、稳定、高效表达HSV1-tk基因的肺腺癌裸鼠动物模型。方法利用分子克隆技术扩增带Bg1II、Sa1I酶切位点的HSV1-tk全基因片段,插入逆转录病毒载体pDON-AI-2-Neo中,与gag-pol表达质粒pGP和env表达质粒pE-ampho利用脂质体法转染293T包装细胞,形成pDON-AI-2-Neo-HSVI-tk重组报告基因假病毒颗粒,然后用其转染肺癌A549细胞,经G418筛选阳性表达,再经有限稀释法单克隆获得稳定表达株,RT-PCR检测证实A549-tk细胞的外源HSV1-tk基因在mRNA水平的稳定表达。通过长时间的传代培养进行细胞的生长、形态观察并绘制细胞生长曲线。将克隆细胞株种瘤于裸鼠后,比较正常A549瘤和A549-tk瘤两者之间的生长差异,取动物模型的成瘤做RT-PCR检测到HSV1-tk基因的表达.结果重组质粒pDON-AI-2-Neo-HSV1-tk经过酶切、测序鉴定证明与GenBank基因库公布的HSV1-tk基因序列（gi：59974）完全一致。并与gag-pol表达质粒pGP和env表达质粒pE-ampho通过包装细胞制备成感染性假病毒颗粒。经G418抗生素阳性筛选及有限稀释单克隆法培养出含HSV1-tk基因的单克隆细胞株,RT-PCR检测证实外源基因HSV1-tk成功导入A549细胞。比较A549-tk细胞株和正常A549两者的生长及形态特征并绘制细胞生长曲线,结果发现两种细胞的外形基本一致,生长特征也无明显差别（P>0.05）。A549-tk细胞株和A549细胞的成瘤率均为100%。比较了两种细胞肿瘤的生长特征,发现正常A549瘤和A549-tk两者之间的肿瘤的生长大小并无明显差异（P>0.05）。三次传代后经RT-PCR检测表明,成功建立了能稳定高效表达HSV1-tk基因的动物模型。结论1重组质粒pDON-AI-2-Neo-HSV1-tk能在肺腺癌细胞A549进行正确的翻译表达。2外源基因HSV1-tk在成功制备的A549-tk细胞株中可被长期稳定表达。3外源基因HSV1-tk的导入并没有影响到A549细胞的正常生理功能和形态。4外源HSV1-tk报告基因导入A549细胞后对肿瘤的生长状况无明显影响。5本实验成功建立了能稳定高效表达HSV1-tk基因的动物模型。
张鹏[4]（2010）在《hTERT启动子调节HSV-TK和IL-12融合基因肿瘤细胞特异性表达载体的构建及其表达鉴定》文中指出目的为在肿瘤基因治疗领域展开更深入的研究,探索新的肿瘤基因治疗策略,我们构建了由人端粒酶逆转录酶启动子（hTERT启动子）调控的单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）和人白细胞介素12（hIL-12）融合基因表达载体,并鉴定其在细胞中的表达,为其进一步研究奠定了实验基础。方法分别以人Hela细胞基因组、pNZTK2. pCMV6-XL4p40和人脾文库为模板,利用PCR法分别扩增hTERT启动子序列、HSV-TK序列、人IL-12p40和IL-12p35序列。将人IL-12p40和IL-12p35基因利用重组PCR法融合成人IL-12p70基因。之后,再次利用重叠扩增法对IL-12p70的单一位点进行突变。并将合成的hTERT启动子基因、HSV-TK基因、人IL-12p70点突变基因分别克隆至pShuttle载体上,合成pShuttle-hTERTp-HSV-TK-linker-IL-12融合基因表达载体。酶切和测序检验结果表明载体正确无误。使用VigoFect试剂盒将合成载体转染293T细胞,利用western-blot法和细胞间接免疫荧光法检测其在细胞中的表达。结果各基因片段成功扩增,大小分别为1084bp、1173bp和1557bp,与预期大小相符合,并成功联结至pShuttle载体上。对所构建新载体分别行酶切鉴定,结果显示各融合基因片段酶切大小与预期大小相符。同时,DNA序列测定结果显示,IL-12p70点突变构建成功,其他碱基与目标序列完全一致,无突变发生。将构建成功的pShuttle-hTERTp-HSV-TK-linker-IL-12载体转染293T细胞后,使用western-blot法和间接免疫荧光法分别进行表达鉴定,只有转染pShuttle-hTERTp-HSV-TK-linker-IL-12融合基因表达载体的细胞裂解物中能够检测到融合基因的表达且能明显观察到FITC的绿色荧光,而转染空载体的细胞中则未检测到,证明构建载体在细胞水平有所表达。结论成功构建了肿瘤特异性启动子调控的融合基因表达载体pShuttle-hTERTp-HSV-TK-linker-IL-12,并成功地在细胞中表达。为进一步应用肿瘤特异性启动子调控的融合基因载体治疗肿瘤奠定了坚实基础。
傅崇德,王志平[5]（2009）在《重组腺病毒治疗膀胱癌的研究进展》文中研究说明
易华[6]（2009）在《从缝隙连接探讨六味地黄丸对自杀基因治疗肝癌的增效作用》文中指出原发性肝癌是世界范围内发病率最高的恶性肿瘤之一,素有“癌王”之称。中国肝癌发病人数居世界首位,每年约23万人死于肝癌,其恶性程度高,预后差。使用基因疗法对付肿瘤已经成为中外科学家一个重要的选择。1989年—2003年6月,美国批准注册的基因治疗临床试验方案共523项,约占世界总数的80%,接受治疗病例数达到15000人,其中肿瘤基因治疗约占70%/。自杀基因疗法因存在旁观者效应的独特机制而成为具有广泛应用前景的肿瘤治疗新方法,但单纯应用不能完全治愈肿瘤,因而增强自杀基因治疗的效果成为研究热点。改善荷瘤机体的免疫状态是其增效措施之一,中药方药具有肯定的免疫药理作用,课题组前期以此为切入点开展研究,证实滋阴补肾经典复方六味地黄丸对肝癌HSV-tk/GCV自杀基因治疗具有增效作用,其机理与该方改善自杀基因抗肿瘤作用的炎症免疫微环境,增强自杀基因的旁观者效应有关。而GJIC介导的缝隙连接机制被认为是自杀基因旁观者效应的主要机制,鉴于中药方药具有多途径、多靶点的特点,该方对自杀基因治疗增效作用的机制也可能与缝隙连接机制相关。本课题拟对其进行研究,探讨六味地黄丸对自杀基因治疗的增效作用是否与其改善肝癌细胞GJIC功能相关,并进一步明确其机制。一、研究目的:本研究在前期工作的基础上,应用中药复方血清药理学的方法,以大鼠肝癌细胞CBRH7919为研究对象,初步探讨六味地黄丸对肝癌HSV-tk/GCV自杀基因治疗增效作用的缝隙连接机制,以期为临床自杀基因疗法联合中药复方的中西医结合治疗方案的建立提供实验数据、科学依据及工作基础。二、研究方法:1.免疫组化SABC法检测肝癌荷瘤小鼠肿瘤组织Cx26、Cx43、Cx32蛋白的表达:选用课题组前期实验保存的3批肝癌荷瘤小鼠肿瘤组织的石蜡标本（分为肿瘤模型组、自杀基因治疗组、六味地黄丸治疗组、自杀基因治疗联合六味地黄丸治疗组共4个组）,每组选取18个左右动物蜡块,常规切片DAB免疫组化染色,显微镜下随机选取5个高倍视野计数,根据显色强度和阳性细胞数两项指标判断阳性等级。2.四甲基偶氮唑盐（MTT法）观测六味地黄丸含药血清对自杀基因HSV-tk/GCV系统杀伤大鼠肝癌CBRH7919细胞的增效作用:选用前期构建的HSV-tk/GCV CBRH7919自杀基因治疗系统,确定丙氧鸟苷（GCV）工作浓度为39.2μmol/L、鼠血清添加量为10%（体积分数）;制备SD大鼠4d和8d六味地黄丸(32g·kg-1·d-1)灌胃含药血清和生理盐水灌胃的对照血清;大鼠肝癌细胞CBRH7919/tk-及CBRH7919/10%tk+（tk+与tk-细胞以1:9比例混合）细胞按3×103个/孔密度接种96孔板,设对照血清组、GCV加对照血清组、1 0%tk+/GCV联合对照血清组、含药血清组、GCV加含药血清组及10%tk+/GCV联合含药血清组;8d含药血清组又再分为低剂量组、中剂量组和高剂量组,每组6个复孔,用完全培养基培养24h后,相应组分别加入空白血清或含药血清,孵育12h,加入GCV培养60h,MTT法检测细胞存活率,用Q值（实测药效与理论药效的比值）分析自杀基因系统与含药血清联合的相互作用是否具有协同性（0.85≤Q≤1.15为相加作用,Q≥1.15为协同作用）。3.检测六味地黄丸含药血清对CBRH7919细胞GJIC功能的影响:设血清对照组（10%鼠空白血清）、含药血清低剂量组（2.5%含药血清+7.5%对照血清）、中剂量组（5%含药血清+5%对照血清）和高剂量组（10%含药血清）。添加不同浓度的六味地黄丸含药血清孵育CBRH7919细胞4gh,采用预标记双染料传输技术及荧光光漂白恢复技术检测各组细胞染料传输功能即GJIC功能的状况。4.采用实时荧光定量RT-PCR技术检测六味地黄丸含药血清对CBRH7919细胞Cx26、Cx43、Cx32 mRNA表达的影响:设细胞对照组（不添加鼠血清）、血清对照组（10%鼠空白血清）、含药血清低剂量组（2.5%含药血清+7.5%空白血清）、中剂量组（5%含药血清+5%空白血清）和高剂量组（10%含药血清）。含药血清作用CBRH7919细胞48h,应用实时荧光定量RT-PCR染料法检测Cx26、Cx43、Cx32mRNA的相对表达量。以看家基因GAPDH作为实时荧光定量PCR反应的内参照,结果计算:Δct=Cx的ct均值—GAPDH的ct均值,然后取2-ΔCt即代表某样品其初始cDNA的相对量。5.检测六味地黄丸含药血清对CBRH7919细胞Cx26、Cx43、Cx32蛋白表达的影响:六味地黄丸含药血清作用CBRH7919细胞48h,然后采用FITC间接免疫荧光染色,激光扫描共聚焦显微镜观察和流式细胞仪及Western-blot技术检测各组细胞Cx26、Cx43、Cx32蛋白的相对表达量。三、研究结果:1.免疫组化SABC法检测肝癌荷瘤小鼠肿瘤组织Cx26、Cx43、Cx32蛋白的表达,镜下观察阳性表达定位于细胞浆和细胞膜。Cx43在癌旁组织,特别是有纤维组织浸润的部位表达呈强阳性,而在癌结节中肿瘤细胞表达相对较弱;Cx26、Cx32在肿瘤细胞特别是脂肪组织浸润附近的癌组织中呈现强阳性表达。GCV治疗组三种Cx蛋白的表达与肿瘤模型组水平差异不大（P＞0.05）,而六味地黄丸治疗组和联合治疗组的蛋白表达均高于肿瘤模型组,其中联合组三种蛋白阳性表达与模型组的差异具有统计学意义（P＜0.05）。2.对照血清组、含药血清组、GCV加对照血清组、GCV加含药血清组细胞均未显示明显细胞毒性,表明在实验条件下血清和GCV对肿瘤细胞的生长无明显影响;自杀基因系统10%tk+/GCV加对照血清,及10%tk+/GCV联合不同浓度的含药血清组均具有明显的杀伤作用（P＜0.05,与空白血清组比较）,表明自杀基因系统具有生物学功能;10%tk+/GCV系统联合5%、10%含药血清组的细胞存活率均明显低于10%tk+/GCV加对照血清组及相对应的含药血清组,联合组的实际抑制率均显着高于理论抑制率,Q值分别为1.16、1.49,均大于1.15,说明其相互作用具有协同性,且随着含药血清浓度的增高Q值增大,协同作用增强。对照血清和含药血清浓度在体积分数20%以下时未显示明显细胞毒性;血清浓度为体积分数5%和7.5%时,自杀基因系统联合含药血清组与单独含药血清组及自杀基因系统加对照血清组比较,联合组对肿瘤细胞的杀伤作用均强于其他非联合组,细胞存活率均有显着性差异（P＜0.01）,而且自杀基因系统联合含药血清的作用具有明显的协同性（Q＞1.15）。3.六味地黄丸含药血清对CBRH7919细胞GJIC功能的影响:（1）流式细胞仪测定结果显示,CBRH7919细胞经六味地黄丸含药血清作用一定时间后,与对照组相比,六味地黄丸含药血清组的双阳性细胞比例（红色和绿色荧光皆阳性的细胞数占总细胞数的比例）逐渐升高,到48h可达32%,达到饱和状态后随着时间的延长双阳性细胞比例逐渐下降;48h检测三个剂量组双阳性细胞的比例,对照组为18.76±2.22%,低剂量组27.93±3.55%,中剂量组35.23±4.15%,高剂量组39.93±5.71%,随着六味地黄丸含药血清浓度的增加,双阳性细胞率逐渐增加（低剂量组P＜0.05,中高剂量组P＜0.01）,并呈现出一定的剂量依赖效应。（2）从荧光漂白恢复图像上发现,在强激光漂白前,各组CBRH7919细胞都被激发出较强的蓝绿色荧光。选择的受试漂白细胞经瞬间漂白后细胞内荧光强度明显变弱,随着时间的推移荧光逐渐恢复,至4 min时对照血清组的平均荧光恢复率为5.93±0.72%,而含药血清组的平均荧光恢复率明显高于对照组,并呈现出一定的浓度依赖趋势。由低到高剂量组分别为15.71±3.81%,38.34±2.64%（P＜0.01）,46.22±4.33%（P＜0.01）。4.六味地黄丸含药血清作用于CBRH7919细胞48h后,随着六味地黄丸含药血清浓度的增加,CBRH7919细胞中Cx26、Cx32和Cx43基因mRNA相对表达量逐渐增多,并呈现出一定的剂量依赖效应,而Cx32和Cx43基因mRNA的表达以中剂量组最明显。设对照血清组Cx mRNA表达量为1,含药血清各剂量组Cx26mRNA相对表达量分别为6.63±0.78、19.29±3.62、29.04±5.35,与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01）;Cx32 mRNA相对表达量分别为23.02±5.10、261.55±29.11、73.68±16.23,Cx43 mRNA相对表达量分别为1.53±0.84、6.75±1.71、4.09±0.98,中、高剂量组Cx32和Cx43 mRNA与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01,P＜0.05）。5.激光共聚焦显微镜观察可见,各组阴性对照组未见阳性细胞表达,细胞对照组和血清对照组CBRH7919细胞表达Cx26、Cx32及Cx43较少,阳性细胞的荧光强度较弱。阳性细胞荧光表达主要集中在胞浆,部分在胞膜,特别是细胞连接部位;六味地黄丸含药血清各浓度组CBRH7919细胞表达Cx 26、Cx32及Cx43较多,阳性细胞的荧光强度较强。含药血清组Cx 32蛋白在CBRH7919细胞膜上呈强阳性表达,特别是细胞连接部位,荧光沿其细胞膜呈颗粒状或细线状分布,胞浆部分也有表达。Cx 26和Cx43阳性表达主要集中在胞浆、细胞连接处、胞膜及核膜周边,荧光呈颗粒状或细线状分布。流式细胞仪结果显示,与细胞血清组相比,鼠血清对照组三种Cx膜蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）;与对照血清组相比,各浓度含药血清组Cx26、Cx32和Cx43膜蛋白的表达量均显着增加,差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）,尤其是Cx32含药血清组阳性细胞率可达70%以上。且呈现一定的剂量效应依赖趋势,与低剂量组相比,含药血清中、高剂量组Cx32阳性细胞率差异有统计学意义（P＜0.05）。而Cx43和Cx32的阳性细胞率有增高的趋势,但尚无统计学差异。Western-blot测定结果显示,含药血清各浓度组显着可提高Cx26、Cx32蛋白的表达,并呈现明显的量效关系。四、结论:1.免疫组化SABC法检测肝癌荷瘤小鼠肿瘤组织Cx26、Cx43、Cx32蛋白的表达结果显示,与肿瘤模型组相比,六味地黄丸联合自杀基因治疗组能增强Cx26、Cx43、Cx32蛋白表达,尤其是促进Cx26的表达,提示六味地黄丸增强自杀基因旁观者效应的机制与缝隙连接相关。2.HSV—tk/GCV自杀基因治疗系统联合六味地黄丸对杀伤肝癌细胞具有协同增效作用。3.六味地黄丸含药血清具有上调大鼠肝癌细胞CBRH7919 GJIC功能的作用,并呈一定的剂量依赖关系。4.六味地黄丸含药血清能显着增加CBRH7919细胞Cx26、Cx32和Cx43总蛋白的表达,并能增多其在细胞膜的定位分布,尤其促进Cx32在细胞膜的表达。并显示出一定的剂量依赖效应。5.六味地黄丸含药血清能显着增加CBRH7919细胞Cx26、Cx32和Cx43mRNA的表达,从转录水平增强Cx的表达。综上所述,六味地黄丸可能通过调控大鼠肝癌CBRH7919细胞Cx26、Cx32Cx43蛋白及mRNA表达、促进Cx的成熟与定位分布,在一定程度上恢复了Cx介导的GJIC功能,重新建立细胞间缝隙连接,进而提高HSV-tk/GCV系统旁观者效应来实现对自杀基因系统杀伤肝癌细胞的协同性增效作用。
杜标炎,张爱娟,谭宇蕙,易华,吴映雅[7]（2008）在《自杀基因系统联合六味地黄丸对肝癌细胞杀伤的协同作用》文中提出【目的】观察六味地黄丸含药血清协同HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统杀伤大鼠肝癌CBRH7919细胞的作用,探讨建立自杀基因联合中药方药的肿瘤基因治疗联合方案的可行性。【方法】构建HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统,确定丙氧鸟苷（GCV）工作浓度（39.2μmol/L）;选用SD大鼠灌胃制备六味地黄丸含药血清和空白血清,并观察含药血清和空白血清对肿瘤细胞生长的影响。设空白对照组、GCV对照组、自杀基因治疗对照组,以上3组均为无大鼠血清的对照组。空白血清组、GCV加空白血清组、自杀基因系统加空白血清组、含药血清组、GCV加含药血清组、自杀基因系统联合含药血清组中,所有大鼠的空白血清和含药血清再分为体积分数5%和7.5%2种浓度,每组设6个复孔。将大鼠肝癌细胞CBRH7919/tk+和CBRH7919/tk-混合,使tk+细胞的比例分别占0%、5%、10%,按3×103个/孔细胞分别接种到96孔板,用完全培养基培养细胞24h后,相应加入体积分数5%或7.5%的大鼠空白血清和含药血清,孵育12h,加入GCV,培养60h,四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测细胞存活率,用Q值（实测药效与理论药效的比值）分析自杀基因系统与含药血清联合的相互作用是否具有协同性（0.85≤Q<1.15为相加作用,Q≥1.15为协同作用）。【结果】空白血清和含药血清浓度在体积分数20%以下时未显示明显细胞毒性;血清浓度为体积分数5%和7.5%时,自杀基因系统联合含药血清组与单独含药血清组及自杀基因系统加空白血清组比较,联合组对肿瘤细胞的杀伤作用均强于其他非联合组,细胞存活率均有显着性差异（P<0.01）,而且自杀基因系统联合含药血清的作用具有明显的协同性（Q>1.15）。【结论】HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统联合六味地黄丸对杀伤肿瘤细胞具有协同增效作用。
马建军[8]（2008）在《NDRG2基因在肾癌中的表达及其抑制肾癌A-498细胞增殖的实验研究》文中研究说明目的意义:NDRG2基因是1999年从正常人全脑cDNA文库中克隆到的新基因[GenBank登录号AF159092.],染色体定位于14q12.1,基因组中由15个内含子,16个外显子构成。NDRG2基因的cDNA全长为2024 bp,编码357个氨基酸的蛋白质,分子量约41kD。目前研究表明,NDRG2基因在多种肿瘤组织或细胞系如结肠癌、胶质瘤、白血病、淋巴瘤和腮腺癌中无表达或低表达,相反在上述肿瘤相应的正常组织细胞中有较高水平的表达。另外在中枢神经系统的大脑皮质、白质、神经核,唾液腺上皮细胞和骨骼肌细胞中高表达。同时基因转染实验表明,NDRG2可抑制胶质瘤BT325细胞由G1期向S期的过渡,因此,推测NDRG2可能是一种新的抑癌基因。本研究的目的意义是探讨NDRG2基因在肾癌发病机制中的作用,确定NDRG2基因的功能,为肾癌的防治提供理论依据。实验方法:采用RT-PCR、Western blot和免疫组织化学方法确定NDRG2在肾癌细胞系、肾脏细胞系及正常组织和肾癌组织的表达;构建NDRG2的腺病毒表达载体并进行腺病毒的包装及滴度测定,获得高滴度的重组NDRG2腺病毒用于后续的细胞功能实验研究;用NDRG2重组腺病毒转染经证实低表达NDRG2的肾透明细胞癌细胞系A-498中,提高该细胞中NDRG2表达水平,通过流式细胞术分析细胞周期并检测凋亡,并运用蛋白免疫印迹检测细胞周期相关蛋白的变化;通过p53重组腺病毒转染肾癌A-498细胞,观察p53基因对NDRG2基因表达的影响。实验结果:1、通过免疫组织化学、RT-PCR、蛋白印迹等检测了人肾癌组织和人肾小管上皮细胞系、肾癌细胞系中NDRG2蛋白和mRNA的表达,结果显示:人近端肾小管上皮细胞HK-2细胞系、人胚肾上皮细胞HKC细胞系中NDRG2的mRNA表达水平较高;而在肾癌细胞系786-O、A-498中NDRG2的mRNA表达水平较低;NDRG2 mRNA在18例肾癌患者肿瘤组织中的表达水平较其相应癌旁组织低,且该表达与其病理分级呈正相关趋势;仅有6例患者的肾肿瘤组织中NDRG2的mRNA表达水平高于相对应的自身肿瘤瘤旁组织;另外有14例患者两者NDRG2 mRNA的表达无差异。2、采用美国Novagen公司成熟的pAdTrack-CMV腺病毒表达系统首先构建了含有NDRG2基因的重组穿梭载体,通过脂质体转染法将线性化的重组穿梭载体与骨架蛋白载体转染293细胞获得了原始病毒种,通过挑选单蚀斑进一步感染293细胞获得了单蚀斑病毒裂解液,在此基础上我们建立了原始种子批、主种子批及工作种子批,最后用工作种子批完成了pAd-GFP-NDRG2重组腺病毒的生产、病毒的纯化及病毒滴度的测定,最终获得的重组腺病毒滴度为1.1×1011pfu /ml。3、通过蛋白印迹实验证实重组腺病毒pAd-GFP-NDRG2转染可增加A-498细胞内源性NDRG2的表达水平;随后的MTT检测结果表明:A-498细胞病毒转染组,各检测时间点MTT OD值均低于未转染和空质粒转染组,48h差异具有显着性,说明NDRG2表达对A-498细胞生长具有抑制作用;进一步的细胞周期分析显示:A-498细胞质粒转染组出现G1期阻滞（G1期捕获）,提示NDRG2通过细胞周期阻滞来抑制A-498细胞增殖;凋亡检测实验结果显示:与未转染的A-498细胞（1.0%）和不含插段的重组腺病毒感染的A-498细胞（2.0%）相比,含NDRG2插段的重组腺病毒组感染的A-498细胞中凋亡细胞明显增多,感染48h后达12.0%;最后通过蛋白印迹实验检测发现:人NDRG2基因转染A-498细胞后,周期素蛋白cyclinD1、cyclinE表达减少,cyclinD2、cyclinD3和cdk2表达无明显变化,由此推测NDRG2基因抑制细胞增殖可能是通过影响周期素蛋白D1和E起作用的。4、通过蛋白印迹和RT-PCR发现A-498细胞表达没有活性的p53,但是基本检测不到NDRG2的表达;通过转染活化型p53基因到A-498细胞后观察到了NDRG2表达水平的升高,且呈剂量依赖关系,该结果说明NDRG2可受到p53基因的调控,提示NDRG2也是p53的一个下游基因。实验结论:NDRG2在正常肾组织中高表达,而在肾癌组织中出现低表达或无表达;NDRG2能够抑制肾癌A-498细胞的增殖,并能产生G1期阻滞,抑制细胞周期素D1、E的表达;p53的表达能够上调NDRG2的表达,本研究的结果进一步证实NDRG2基因是一种新的抑癌基因,以其为靶点的基因治疗策略可为肾癌的基因治疗提供新思路。
杨阔[9]（2008）在《慢病毒介导对TGF-β失敏感的肿瘤特异性CTL在前列腺癌免疫治疗中的实验研究》文中指出目的:目前我国诊断的前列腺癌患者仍以晚期患者为主,而对于晚期患者,治疗方式仍以内分泌治疗为主。在任何内分泌治疗过程中,前列腺癌都不可避免地发展为激素难治性前列腺癌。而激素难治性前列腺癌的治疗是目前前列腺癌治疗中的重点与难点。虽然各种治疗方法层出不穷,从化疗到放疗,从生物治疗到同位素治疗,但真正能延长生存的治疗方法并不多。肿瘤免疫学认为:肿瘤的发生发展与肿瘤逃逸密切相关,而在肿瘤逃逸的因素中,肿瘤细胞自身分泌的免疫抑制因子具有重要作用。其中TGF-β是肿瘤细胞分泌的已知的最强的免疫抑制因子。我们通过用携带显性负相的TGF-βⅡ型受体基因的慢病毒载体感染人CTL,使其对TGF-β不敏感,然后研究对TGF-β失敏感的肿瘤特异性CTL在前列腺癌治疗中的作用和意义,为晚期前列腺癌的治疗探索一条新的治疗途径。方法:分三个步骤进行:首先,在已有的pMIG-TβRIIDN（MSCV-RIIDN-IRESGFP）和pAdTrack-CMV-TK质粒的基础上制备感染效率高的慢病毒载体,此载体携带显性负相的TGF-βⅡ型受体（dominant negative TGF-beta typeⅡreceptor）和HSV-tk（herpes simplex virus thymidine kinase）融合基因,HSV-tk基因主要用于去除多余的淋巴细胞。其次,前列腺根治性切除术时采集新鲜前列腺癌组织标本,分为两部分,一部分储存于组织库,另一部分立即剪成1～2mm的小块,用基底膜基质（Matrigel Basement Membrane Matrix）进行包埋,1天后种植于4周龄雄性裸鼠前侧躯干皮下。待皮下包块长到1.5cm大小时,取出肿瘤组织块,再进行裸鼠传代。当第三代前列腺癌异种移植模型的皮下组织块长到1.5cm时采集与组织来源同一患者的外周血20ml,然后进行单核细胞体外分离,当天将DC与CTL分开培养。5天后用肿瘤抗原粗提物刺激体外培养的DC细胞,48小时后将DC和CTL细胞混合培养,使CTL具有肿瘤特异性。第三,用慢病毒将显性负的TβRⅡDNglytk基因导入到肿瘤特异性的CTL细胞,获得对TGF-β不敏感的同源的肿瘤特异性CTL细胞。第四,以表达TRANSglytk蛋白的CTL作对照,验证所制备的对TGF-β不敏感的肿瘤特异性的CTL细胞对肿瘤异种移植裸鼠模型所负载的前列腺癌的治疗作用。结果:1、运用重组PCR技术合成了TβRⅡDNglytk及TRANSglytk基因,将此基因用Invitrogen公司的TOPO技术连接到pLenti6/V5-D-TOPO（?）载体,构建成功了慢病毒表达载体,并经过测序验证;并制备了含有TβRⅡDNglytk及TRANSglytk基因的慢病毒液,病毒滴度分别达到了5.85×106和6.2×106。2、前列腺癌肿瘤蛋白粗提物能有效刺激DC,进而使CTL细胞具有肿瘤抗原特异性;肿瘤特异性的CTL显示了与非肿瘤特异性CTL不同的特点;携带TβRⅡDNglytk或TRANSglytk基因的慢病毒可以有效转染肿瘤特异性CTL;经Western blot鉴定,表达TβRⅡDNglytk蛋白的CTL对TGF-β反应不敏感,而表达TRANSglytk蛋白的CTL却在TGF-β刺激下出现较强的TGF-β下游蛋白P-Smad2/3的表达;表达TβRⅡDNglytk或TRANSglytk蛋白的CTL能被GCV杀灭,提示转入的HSV-tk基因是有效的,运用此系统可以作为杀灭多余CTL的工具。3、用裸鼠成功建立前列腺癌异种移植模型,用体外过继培养得到的对TGF-β不敏感的肿瘤特异性CTL能显着抑制同一个体来源的裸鼠异种移植模型所负载的前列腺癌组织的生长。结论:裸鼠异种移植模型的制备为前列腺癌免疫治疗的体内及体外研究提供良好的实验条件;在体外过继培养中,通过对肿瘤特异性的CTL进行修饰改造,使其对TGF-β失敏感,用这种对TGF-β不敏感的肿瘤特异性CTL作用于裸鼠前列腺癌异种移植模型,可以显着抑制肿瘤的生长。显示了此方法在晚期前列腺癌患者的治疗中可用于前列腺癌的个体化免疫治疗,具有一定的应用前景。
王德贵[10]（2008）在《膀胱癌溶瘤病毒和丁酸钠治疗研究》文中认为第一部分膀胱肿瘤特异性溶瘤腺病毒治疗膀胱癌目的膀胱癌是泌尿系统常见肿瘤,目前对膀胱癌的治疗主要有手术、放疗、化疗等多种方法,但疗效尚不能使人满意。探讨新的疗法十分必要。肿瘤的发生发展与基因的改变密切相关,基因治疗就是试图通过针对基因物质的作用达到治疗肿瘤的目的。近年来肿瘤的基因治疗发展迅速。uroplakin是尿路上皮特异性糖蛋白,前列腺干细胞抗原（prostate stem cell antigen,PSCA）在膀胱癌高表达而在正常组织低表达。本研究的目的就是通过前列腺干细胞抗原增强子（prostate stem cell antigen,enhancer,PSCAE）和尿路特异糖蛋白Ⅱ（uroplakinⅡ,UPⅡ）启动子构建膀胱特异性溶瘤腺病毒载体以寻求膀胱癌靶向治疗的新方案。方法通过Western-blot检测UMUC-3,5637,HepG2,PC3,LNCAP,BGC823和NHU细胞PSCA和AR的表达。通过PCR技术获得前列腺干细胞抗原增强子PSCAE和uroplakinⅡ的启动子（UPⅡpromoter）。通过酶切从质粒pBK-CMV-Luc获得荧光素酶报告基因Luc,从质粒RpS-TOAD-PSE-PBN—E1A酶切获得E1A基因,并将PSCAE,UPⅡ,Luc,E1A和无编码对照序列Null定向连接入穿梭质粒,构建出质粒RpS-UPⅡ-E1A;RpS-E-UPⅡ-E1A;RpS-UPⅡ-Luc;RpS-E-UPⅡ-Luc;RpS-UPⅡ-Null;RpS-E-UPⅡ-Null。利用同源重组原理获得腺病毒质粒Ad-E-UPⅡ-E1A、Ad-UPⅡ-E1A、Ad-RpS-E—UPⅡ-Null;Ad-RpS-UPⅡ-Null。并且通过脂质体转染的方法用质粒Rp-UPⅡ-Luc和Rp-E-UPⅡ-Luc转染膀胱癌细胞T24,UMUC-3,5637,和非膀胱癌细胞HepG2,PC3,BGC823以及尿路上皮细胞NHU。pCMV-β-gal作为内参照。转染后在含有雄激素或雄激素受体拮抗剂的培养液中培养,24小时后裂解细胞并检测细胞裂解液内萤光素酶活性和半乳糖苷酶活性,以荧光强度与半乳糖苷酶反应后吸光度的比值作为校正的萤光素酶活性。将腺病毒质粒线性化后转染293细胞,包装成腺病毒颗粒。鉴定后分别感染膀胱癌细胞进行溶细胞活性观察。结果:①本研究构建的质粒均通过PCR和酶切双重鉴定来确定产物正确。②通过Western-blot检测T24,UMUC-3,5637,HepG2,PC3,LNCAP,BGC823和NHU细胞中PSCA和雄激素受体AR的表达,膀胱癌细胞T24,UMUC-3,5637和前列腺癌细胞PC3,LNCAP以及胃癌细胞系BGC823都高表达PSCA。NHU和肝癌细胞HepG2呈现PSCA低表达。膀胱癌T24,和5637细胞AR+,而膀胱癌UMUC-3细胞AR-。前列腺癌细胞LNCAP为AR+,而前列腺癌细胞PC3为AR-,NHU细胞AR-。③经Rp-UPⅡ-Luc质粒转染膀胱癌细胞和尿路上皮细胞都可以导致较高的萤光素酶活性表达,但在非泌尿系来源性细胞中表达较低,差异有显着性。经Rp-E-UPⅡ-LUC质粒转染后也可以导致膀胱上皮癌细胞中萤光素酶活性明显高于非泌尿系统来源细胞的表达,差异有显着性（P＜0.01）。Rp-E-UPⅡ-LUC转染后膀胱癌细胞中萤光素酶活性明显高于正常尿路上皮表达,差异有显着性（P＜0.01）。PSCAE置于UPⅡ上游可以提高膀胱癌细胞中萤光素酶活性而在正常尿路上皮细胞和其他组织来源肿瘤细胞中却不增加其活性表达。④雄激素受体激动剂R1881可以提高Rp-E-UPⅡ-LUC转染后的AR阳性膀胱癌细胞T24和5637中萤光素酶活性,而对AR阴性膀胱癌细胞UMUC-3中不能明显提高其萤光素酶活性。雄激素受体阻断剂Flutamide不能使Rp-E-UPⅡ-LUC在AR阴性和阳性细胞活性下调。R1881和Flutamide对Rp-UPⅡ-LUC在膀胱癌中萤光素酶活性影响不明显。R1881和Flutamide对Rp-UPⅡ-LUC和Rp-E-UPⅡ-LUC在非膀胱癌细胞中活性的影响不明显。⑤将腺病毒包装后获得的腺病毒Ad-Rp-E-UPⅡ-E1A转染膀胱癌细胞T24后能够导致明显的细胞病变并最终裂解肿瘤细胞。结论:uroplakinⅡ启动子能够驱动目的基因在膀胱癌中高表达,而在其他组织来源肿瘤细胞中低表达,具有组织特异性。PSCAE能够增强uroplakinⅡ启动子在膀胱癌细胞中的活性而在非尿路上皮来源细胞和正常尿路上皮细胞中增强作用不明显。雄激素受体激动剂可以在AR阳性膀胱癌细胞中提高PSCAE活性而在AR阴性膀胱癌细胞中和正常尿路上皮以及其他组织来源肿瘤中却不能。雄激素受体阻断剂不能完全阻断PSCAE活性,说明PSCAE具有部分雄激素非依赖特性。基于PSCAE和UPⅡ启动子的溶瘤腺病毒Ad-Rp-E-UPⅡ-E1A可以有效裂解膀胱癌细胞。第二部分丁酸钠作用2小时可以提高膀胱癌对化疗药物的敏感性目的观察HDAC抑制剂丁酸钠（sodium butyrate,NaB）对膀胱癌细胞生长的抑制作用以及丁酸钠与抗癌药物联用对膀胱癌的杀伤作用的体内外研究。方法通过MTT法检测丁酸钠单用或分别与ADM、MMC和DDP联用对膀胱癌细胞生长的抑制作用。Hochest33258染色和电镜观察丁酸钠处理后细胞形态学变化。流式细胞术检测bcl-2,BAX,caspase-3表达。观察膀胱灌注丁酸钠联合腹腔注射化疗药物对N-甲基亚硝基脲（MNU）诱导的膀胱癌模型大鼠肿瘤生长的抑制作用。通过Western blot检测丁酸钠处理后乙酰化组蛋白3,bcl-2表达的变化。结果丁酸钠对EJ,BIU87,5637细胞的抑制率均随着浓度的增加而明显增加。电镜观察和Hochest33258染色显示丁酸钠可以诱导膀胱癌细胞凋亡。丁酸钠可下调膀胱癌细胞bcl-2的表达上调caspase-3的表达。5mM丁酸钠与ADM、MMC、DDP联用具有明显的协同作用;5mM丁酸钠处理细胞2小时后可提高膀胱癌对化疗药物的敏感性。经丁酸钠膀胱灌注可以明显抑制膀胱癌模型大鼠肿瘤生长,肌侵润癌比例明显低于未治疗组。结论丁酸钠可明显抑制膀胱肿瘤的生长并与化疗药物有协同作用,2小时丁酸钠处理膀胱癌细胞能增强抗癌药物对膀胱癌细胞的杀伤作用。丁酸钠有望成为膀胱癌灌注治疗的理想药物。
二、泌尿系统肿瘤HSV-TK基因治疗的研究现状（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、泌尿系统肿瘤HSV-TK基因治疗的研究现状（论文提纲范文）
（1）三氧化二砷对缝隙连接蛋白43表达的影响及参与非肌层浸润膀胱癌半通道开放的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩写词简表 |
| 前言 |
| 实验一：不同膀胱癌细胞成瘤情况 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验主要材料 |
| 1.1.1 实验细胞 |
| 1.1.2 实验动物 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.1.4 主要试剂 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 细胞培养 |
| 1.2.2 皮下模型建立 |
| 1.3 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 各组小鼠成活情况 |
| 2.2 在相同条件不同膀胱癌细胞出瘤率比较 |
| 2.3 各组膀胱癌细胞荷瘤鼠肿瘤体积和增长速度比较 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 实验二：三氧化二砷调节膀胱癌细胞Cx43表达 |
| 5 材料和方法 |
| 5.1 实验主要材料 |
| 5.1.1 实验细胞 |
| 5.1.2 主要仪器 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.1.4 主要溶液配制 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 5637膀胱癌细胞培养 |
| 5.2.2 药物处理 |
| 5.2.3 观察项目 |
| 5.3 统计学分析 |
| 6 结果 |
| 6.1 三氧化二砷对膀胱癌细胞生长的影响 |
| 6.2 WesternBlot分析As2O3对Cx43、JNK、JNK-1、NRF2蛋白表达的影响 |
| 7 讨论 |
| 8 结论 |
| 实验三：As2O3与BCG联合治疗裸鼠荷膀胱癌皮下移植瘤疗效分析 |
| 9 材料和方法 |
| 9.1 材料 |
| 9.1.1 实验细胞 |
| 9.1.2 实验动物 |
| 9.1.3 主要仪器 |
| 9.2 实验方法 |
| 9.2.1 Balb/c-nu裸小鼠膀胱癌转移模型的建立 |
| 9.2.2 皮下模型建立 |
| 9.2.3 实验分组 |
| 9.2.4 观察项目 |
| 9.3 统计方法 |
| 10 实验结果 |
| 10.1 各组给药前后皮下移植瘤瘤积和瘤重对比 |
| 10.2 各组HE染色结果对比 |
| 10.3 各组肿瘤组织Cx43表达情况 |
| 11 讨论 |
| 12 结论 |
| 全文小结 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（2）干细胞介导的酶前药策略与肿瘤靶向治疗研究进展（论文提纲范文）
| 1 干细胞的分类 |
| 1.1 神经干细胞 |
| 1.2 间充质干细胞 |
| 1.3 胚胎干细胞 |
| 1.4 诱导型多能干细胞 |
| 2 酶前药系统 |
| 2.1 HSV-TK/GCV体系 |
| 2.2 CD/5-FC体系 |
| 2.3 CES/CPT-11体系 |
| 3 干细胞介导的酶前药体系治疗肿瘤 |
| 3.1 脑部肿瘤 |
| 3.2 前列腺和膀胱肿瘤 |
| 3.3 肝部和肺部肿瘤 |
| 3.4 卵巢癌和乳腺癌 |
| 结语 |
（3）HSV1-tk肺腺癌报告基因显像与自杀基因治疗的研究基础（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、部分重组质粒pDON-AI-2-Neo-HSV1-tk的构建及逆转录病毒包装 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 药品与试剂 |
| 1.1.2 仪器设备 |
| 1.1.3 溶液及配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 重组质粒pDON-AI-2-Neo-HSV1-tk的构建 |
| 1.2.1.1 设计HSV1-tk基因全序列引物 |
| 1.2.1.2 质粒pHSV106的细菌扩增及提取 |
| 1.2.1.3 PCR扩增HSV1-tk基因片段并引入相应酶切位点 |
| 1.2.1.4 纯化PCR获得的目的基因片段HSV1-tk |
| 1.2.1.5 HSV1-tk基因片段与pMD18-T载体连接 |
| 1.2.1.6 连接质粒的扩增、提取及鉴定 |
| 1.2.1.7 连接质粒pMD18-T/tk和载体pDON-AI-2-Neo提取、纯化 |
| 1.2.1.8 重组质粒pDON-AI-2-Neo-HSV1-tk的构建 |
| 1.2.2 逆转录病毒的包装 |
| 1.2.2.1 包装细胞293T的培养、扩增 |
| 1.2.2.2 重组质粒pDON-AI-2-Neo-HSV1-tk的逆转录病毒包装 |
| 1.2.2.3 逆转录病毒基因组鉴定 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 重组质粒pDON-AI-2-Neo-HSV1-tk的构建 |
| 1.3.1.1 HSV1-tk基因片段的扩增 |
| 1.3.1.2 HSV1-tk基因片段与pMD18-T载体连接 |
| 1.3.1.3 HSV1-tk基因片段与载体pDON-AI-2-Neo的连接 |
| 1.3.2 重组逆转录病毒基因组鉴定 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 二、HSV1-tk基因转染A549细胞及A549-tk单克隆细胞株建立 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 药品与试剂 |
| 2.1.2 仪器设备 |
| 2.1.3 溶液及配制 |
| 2.2 实验方法和步骤 |
| 2.2.1 肺腺癌A549细胞的培养 |
| 2.2.1.1 A549细胞的复苏、培养 |
| 2.2.1.2 A549细胞传代扩增 |
| 2.2.1.3 细胞计数 |
| 2.2.1.4 A549细胞的冻存 |
| 2.2.2 逆转录病毒感染A549细胞 |
| 2.2.2.1 G418对A549细胞最适浓度的确定 |
| 2.2.2.2 逆转录病毒感染A549细胞及G418筛选阳性表达细胞 |
| 2.2.2.3 阳性表达HSV1-tk基因的A549细胞克隆团的鉴定 |
| 2.2.3 单克隆细胞株的建立 |
| 2.2.3.1 有限稀释单克隆法培养阳性表达HSV1-tk的A549细胞 |
| 2.2.3.2 稳定农达HSV1-tk基因的A549-tk细胞株鉴定 |
| 2.2.3.3 A549细胞与A549-tk细胞形态观察及生长特性测定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 A549细胞的培养 |
| 2.3.1.1 正常A549细胞的培养 |
| 2.3.1.2 G418筛选的最适浓度确定 |
| 2.3.2 转染A549细胞 |
| 2.3.3 A549-tk单克隆细胞株培养 |
| 2.3.3.1 A549-tk细胞单克降株的建立 |
| 2.3.3.2 A549-tk单克隆株中tk基因表达的鉴定 |
| 2.3.3.3 正常A549细胞和A549-tk细胞的生长特征比较 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 三、转染动物模型的建立 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 建立A549-tk细胞株动物模型 |
| 3.2.2 动物模型的HSV1-tk基因的表达检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 A549-tk和A549的Balb/c裸鼠肿瘤模型 |
| 3.3.2 动物模型组织的RT-PCR鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 创新性评价与不足 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）hTERT启动子调节HSV-TK和IL-12融合基因肿瘤细胞特异性表达载体的构建及其表达鉴定（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 正文 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 引物合成及序列测定 |
| 1.2 菌株和细胞株 |
| 1.3 质粒及基因组 |
| 1.4 分子生物学工具酶 |
| 1.5 常用试剂盒 |
| 1.6 细胞培养试剂 |
| 1.7 抗体 |
| 1.8 主要实验仪器 |
| 2.方法 |
| 2.1 重组表达载体的构建 |
| 2.1.1 hTERT启动子的扩增和连接 |
| 2.1.2 HSV-TK基因的扩增和连接 |
| 2.1.3 人IL-12 p40基因的扩增 |
| 2.1.4 人IL-12 p35基因的扩增 |
| 2.1.5 人IL-12 p70基因的扩增 |
| 2.1.6 人IL-12 p70点突变体基因的扩增和连接 |
| 2.2 重组表达载体的表达鉴定 |
| 2.2.1 表达细胞的选择和培养 |
| 2.2.2 表达细胞真核高效转染 |
| 2.2.3 细胞真核表达的Western blot分析 |
| 2.2.4 细胞真核表达的免疫荧光分析 |
| 结果 |
| 第一部分 重组表达载体的构建 |
| 1.1 hTERT启动子的特异性扩增 |
| 1.2 HSV-TK-linker基因的特异性扩增 |
| 1.3 人IL-12 p40基因的扩增 |
| 1.4 人IL-12 p35基因的扩增 |
| 1.5 人IL-12 p70基因的重组扩增 |
| 1.6 人IL-12 p70基因点突变体上下游的扩增 |
| 1.7 人IL-12 p70点突变全长基因的重组扩增 |
| 1.8 pShuttle-hTERTp-HSV-TK-linker-IL-12重组质粒的鉴定 |
| 小结 |
| 第二部分 重组表达载体的表达鉴定 |
| 2.1 重组表达载体转染细胞的western-blot检测 |
| 2.2 重组表达载体转染细胞的细胞间接免疫荧光检测 |
| 小结 |
| 结论总结 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 附录 |
| 英文缩写词表 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（5）重组腺病毒治疗膀胱癌的研究进展（论文提纲范文）
| 一、以复制缺陷型腺病毒作载体导入治疗基因 |
| 1.导入抑癌基因行基因校正治疗: |
| 2.导入细胞因子行免疫基因疗法: |
| 3.导入自杀基因: |
| 4.反义基因疗法: |
| 二、条件复制腺病毒 |
| 1.改造腺病毒复制必需基因, 增强其肿瘤特异性: |
| 2.插入肿瘤组织特异性启动子驱动病毒在膀胱癌中特异性复制: |
| 三、增强腺病毒转染效率的治疗 |
| 四、协同策略 |
| 五、总结 |
（6）从缝隙连接探讨六味地黄丸对自杀基因治疗肝癌的增效作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 研究背景 |
| 一、肿瘤自杀基因治疗现状与发展趋势 |
| (一) 肿瘤自杀基因治疗系统概述 |
| (二) 自杀基因疗法的旁观者效应及机制 |
| (三) 缝隙连接机制与旁观者效应 |
| 二、缝隙连接通讯与肿瘤 |
| (一) 缝隙连接的生物特性 |
| (二) GJIC与肿瘤抑制 |
| 三.中医对肿瘤的认识及治疗法则 |
| (一) 溯源 |
| (二) 病因病机 |
| (三) 治法 |
| 四、六味地黄丸的抗肿瘤作用进展 |
| (一) 直接抗肿瘤作用 |
| (二) 抗放、化疗毒副作用,间接发挥抑瘤作用 |
| (三) 通过调节机体的免疫功能,增强人体抗病邪的能力,间接发挥抑瘤作用 |
| (四) 通过影响肿瘤细胞内cAMP含量,作用于肿瘤细胞 |
| (五) 通过缝隙连接机制对肿瘤自杀基因疗法起到增效作用: |
| 五、中药血清药理学研究进展 |
| (一) 中药血清药理学概述 |
| (二) 中药血清药理学的优势 |
| (三) 中药血清药理学存在的问题 |
| (四) 中药血清药理学方法在我国的应用现状 |
| (五) 中药血清药理学的应用前景 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第一章 免疫组化SABC法检测肝癌荷瘤小鼠肿瘤组织Cx26、Cx43、Cx32蛋白的表达 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二章 六味地黄丸含药血清对大鼠肝癌CBRH7919细胞HSV-tk/GCV系统旁观者效应的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三章 六味地黄丸含药血清对大鼠肝癌细胞CBRH7919 GJIC功能的影响 |
| 实验一 预标记双染料传输流式细胞术检测六味地黄丸含药血清对大鼠肝癌细胞CBRH7919 GJIC功能的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 FRAP法检测六味地黄丸含药血清对大鼠肝癌CBRH7919细胞GJIC功能的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第四章 荧光定量RT-PCR检测六味地黄丸含药血清对大鼠肝癌细胞CBRH7919 Cx26、Cx43、Cx32 mRNA表达的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第五章 六味地黄丸含药血清对大鼠肝癌细胞CBRH7919Cx26、Cx43、Cx32蛋白表达的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（7）自杀基因系统联合六味地黄丸对肝癌细胞杀伤的协同作用（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂与仪器 |
| 1.2 细胞株 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 GCV杀伤敏感性及GCV工作浓度的确定 |
| 1.5 六味地黄丸含药血清和非含药血清的制备 |
| 1.6 血清对大鼠肝癌细胞的影响 |
| 1.7 自杀基因系统联合六味地黄丸含药血清对大鼠肝癌细胞杀伤效应的检测 |
| 1.8 统计方法和协同性分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 GCV的工作浓度 |
| 2.2 大鼠血清对CBRH7919细胞的影响 |
| 2.3 自杀基因系统联合六味地黄丸含药血清对大鼠肝癌细胞的杀伤效应及协同性分析 |
| 2.3.1 含5%tk+ |
| 2.3.2 含10%tk+ |
| 3 讨论 |
（8）NDRG2基因在肾癌中的表达及其抑制肾癌A-498细胞增殖的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言和文献回顾 |
| 正文 NDRG2 基因在肾癌中的表达及其抑制肾癌A-498 细胞增殖的实验研究 |
| 实验一 NDRG2 基因在肾癌细胞系及肾癌组织中的表达 |
| 引言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验讨论 |
| 实验二 NDRG2 重组腺病毒表达体系的建立 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验讨论 |
| 实验三 过表达NDRG2 对A-498 细胞的影响及机理研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验讨论 |
| 实验四 P53 对肾癌细胞A-498 NDRG2 表达的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 实验讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简介和研究成果 |
| 致谢 |
（9）慢病毒介导对TGF-β失敏感的肿瘤特异性CTL在前列腺癌免疫治疗中的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 第一部分 慢病毒载体的制备 |
| 前言 |
| 一 对象和方法 |
| 二 结果 |
| 三 讨论 |
| 四 小结 |
| 五 结论 |
| 第二部分 对TGf-β不敏感的肿瘤特异性CTL细胞的制备与检验 |
| 前言 |
| 一 对象与方法 |
| 二 结果 |
| 三 讨论 |
| 四 小结 |
| 五 结论 |
| 第三部分 人前列腺癌裸鼠异种模型制备与体内实验 |
| 前言 |
| 一 对象与方法 |
| 二 结果 |
| 三 讨论 |
| 四 小结 |
| 五 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（10）膀胱癌溶瘤病毒和丁酸钠治疗研究（论文提纲范文）
| 第一部分: 膀胱肿瘤特异性溶瘤腺病毒治疗膀胱癌 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分: 丁酸钠作用2小时可以提高膀胱癌对化疗药物的敏感性 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 缩略词表 |
| 综述一 |
| 综述二 |
| 博士期间发表论文与基金课题申请 |
| 致谢 |
四、泌尿系统肿瘤HSV-TK基因治疗的研究现状（论文参考文献）
- [1]三氧化二砷对缝隙连接蛋白43表达的影响及参与非肌层浸润膀胱癌半通道开放的研究[D]. 毛明焕. 中国医科大学, 2018(03)
- [2]干细胞介导的酶前药策略与肿瘤靶向治疗研究进展[J]. 冯承阳,刘东,张程亮. 中华肿瘤防治杂志, 2018(02)
- [3]HSV1-tk肺腺癌报告基因显像与自杀基因治疗的研究基础[D]. 陈鹏. 天津医科大学, 2011(01)
- [4]hTERT启动子调节HSV-TK和IL-12融合基因肿瘤细胞特异性表达载体的构建及其表达鉴定[D]. 张鹏. 中国人民解放军军医进修学院, 2010(09)
- [5]重组腺病毒治疗膀胱癌的研究进展[J]. 傅崇德,王志平. 现代泌尿生殖肿瘤杂志, 2009(04)
- [6]从缝隙连接探讨六味地黄丸对自杀基因治疗肝癌的增效作用[D]. 易华. 广州中医药大学, 2009(10)
- [7]自杀基因系统联合六味地黄丸对肝癌细胞杀伤的协同作用[J]. 杜标炎,张爱娟,谭宇蕙,易华,吴映雅. 广州中医药大学学报, 2008(04)
- [8]NDRG2基因在肾癌中的表达及其抑制肾癌A-498细胞增殖的实验研究[D]. 马建军. 第四军医大学, 2008(04)
- [9]慢病毒介导对TGF-β失敏感的肿瘤特异性CTL在前列腺癌免疫治疗中的实验研究[D]. 杨阔. 天津医科大学, 2008(12)
- [10]膀胱癌溶瘤病毒和丁酸钠治疗研究[D]. 王德贵. 兰州大学, 2008(12)