一、荧光定量PCR检测乙型肝炎患者血清中HBV DNA的临床意义（论文文献综述）
李茂仕[1]（2021）在《血清HBV RNA在慢性HBV感染者病情评估和耐药监测中的应用》文中提出背景及目的:慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染是全球性的公共卫生问题,肝细胞内的共价闭合环状DNA（ccc DNA）是HBV难以彻底清除进而引起不同临床结局的根本原因,但因检测需依赖肝活检而难以临床普及;虽然外周血中无法直接检测ccc DNA,但可通过其他血清指标来反映ccc DNA的变化。目前,核苷（酸）类似物（NAs）是主要的抗HBV治疗手段,但并不能直接清除ccc DNA,绝大部分的慢性HBV感染者均需长期用药。尽管高耐药屏障NAs使用后发生耐药的几率较前大为减少,但因HBV突变的必然性和复杂性,耐药株的出现实际上是NAs长期治疗不可避免的临床问题。不同于乙型肝炎表面抗原（HBs Ag）和HBV DNA,HBV RNA仅由ccc DNA转录产生且不受NAs治疗的影响,可较为真实反映肝内ccc DNA的表达情况。然而,HBV RNA检测尚无公认的标准化检测方法,其在慢性HBV感染者病情评估以及在NAs治疗耐药监测中的临床价值尚缺乏针对性研究。我们首先使用微滴数字PCR（dd PCR）技术建立了定量检测血清HBV RNA的方法,并使用商业化的实时荧光定量PCR方法进行对比评估以确保检测结果的准确性。然后我们观察了未治的慢性HBV感染者不同临床表型的血清HBV RNA水平,并追踪分析了恩替卡韦初治但在随访过程中发生了基因型耐药（GR）和部分病毒学应答（PVR）患者血清HBV RNA的动力学特征以及耐药突变情况,以期为血清HBV RNA应用于慢性HBV感染者病情评估以及监测耐药突变提供新的依据。方法:1.获取治疗和未治疗的慢性HBV感染者的血清各32例,平行使用dd PCR和商品化的q PCR方法检测血清HBV RNA水平,使用直线回归分析和Bland-Altman分析两种方法的相关性和一致性;以1例高浓度的HBV RNA样本进行梯度稀释,两种检测方法平行进行测定,每个梯度重复5次以明确两种方法的重复性,敏感性。2.根据常见临床指标将149例未治的慢性HBV感染者分为HBe Ag阳性伴ALT正常（EPNA）、HBe Ag阳性伴ALT升高（EPEA）、HBe Ag阴性伴ALT正常（ENNA）、HBe Ag阳性伴ALT升高（ENEA）等4种临床表型。使用q PCR法检测血清HBV RNA水平并在血清HBV DNA或/和HBV RNA阴性的患者中实施肝活检。使用单因素logistics回归分析探讨HBe Ag阴性患者中与ALT升高相关的危险因素。3.以31例HBe Ag阴性、HBV DNA阳性、ALT正常或者轻度异常（<2倍正常参考值上限,ULN）的未治慢性HBV感染者为研究对象,检测其血清HBV RNA水平,肝活检Scheuer评分系统对肝脏炎症评分（G）≥2判定为显着性肝炎,以受试者工作曲线（ROC）探讨血清HBV RNA水平在鉴别显着性肝炎中的价值。4.在我院肝炎数据库中筛选出5例ETV初治的慢性乙型肝炎（CHB）患者,其中包含了在持续抗病毒治疗过程中被检出GR的患者3例以及未检出耐药的PVR患者2例。耐药突变的信息是采用一代测序针对血清HBV DNA检测得到。调取生物样本库中该患者从初治到随访终点之间的血清样本,以dd PCR方法检测血清HBV RNA水平,观察其与HBs Ag、HBV DNA动态变化的特征,并使用三代测序技术（TGS）对部分随访点的血清HBV RNA的反转录区进行耐药突变的长期监测。结果1.两种血清HBV RNA检测方法在未治疗组和治疗组中的直线回归系数（R2）分别为0.912和0.874,95%一致性界限分别为（-1.430,1.506）和（-1.533,1.648）。梯度稀释实验显示dd PCR法和商品化的q PCR法在血清HBV RNA≥2.0 log10 copies/m L时检出率均为100%,CV值分别介于2.29%～10.8%和3.11%～7.33%;但在血清HBV RNA<2.0 log10 copies/m L时,随着梯度稀释倍数的增加,检出率逐渐下降,最低检测下限（LLo D）分别约为61 copies/m L和15 copies/m L。dd PCR法和商品化的q PCR法在HBV RNA可测结果和稀释倍数之间存在显着性线性相关,R2分别为0.895和0.938,P<0.0001。2.EPNA、EPEA、ENNA和ENEA四种临床表型的可测血清HBV RNA水平(log10copies/m L)分别为6.02±1.48、6.54±1.27、2.51±0.78和3.54±1.25。HBV RNA低水平(<2.0 log10 copies/m L)中以ENNA表型为主（76.9%）,高水平(>6.0 log10 copies/m L)中以HBe Ag阳性表型（EPNA和EPEA）为主（98.1%）。在EPNA、EPEA和ENEA中,血清HBV RNA与血清HBV DNA显着正相关,相关系数（r）分别为0.868(P=9.480×10-9)、0.687(P=2.621×10-8)、0.769(P=6.686×10-9),但在ENNA表型中,两者没有显着性相关关系（r=0.324,P=0.075）。在EPNA、EPEA表型中,血清HBV RNA与HBs Ag呈现显着正相关,相关系数分别为0.777(P=2.999×10-6)和0.637(P=4.993×10-7),但在HBe Ag阴性表型中则无此显着相关性。血清HBV DNA和HBV RNA水平均是与HBe Ag阴性患者ALT升高相关的独立危险因素,比值比（OR）分别为2.650（1.640～4.282）,P=6.823×10-5和2.570（1.541～4.286）,P=2.971×10-4。血清HBs Ag水平则处于接近于显着性的状态（P=0.053）。7例血清HBV DNA阴性,但RNA阳性的患者肝组织活检均显示为中度或重度肝脏炎症（G≥2）。3.血清HBV RNA水平具有鉴别HBe Ag阴性、DNA阳性、ALT正常或者轻度异常（<2×ULN）患者显着性肝炎的能力,受试者工作曲线下面积（AUC）为0.737（0.549,0.925）,P=0.029,而HBV DNA则不具有这种能力（P=0.248）。根据最大优登指数得出HBV RNA用于鉴别肝脏显着性炎症的最佳截断值为2.81 log10 copies/m L,此时敏感度73.7%,特异度66.7%,准确度71.0%。4.患者GR1、GR2和GR3分别在其抗病毒治疗第208、186及142周时检测出了耐药突变,在这时间点之前,3例患者血清HBV RNA持续>4.0 log10 copies/m L。2例PVR患者在我们观测的抗病毒治疗期间HBV RNA持续>6.0 log10 copies/m L。患者GR1和GR2在换用或者加用TDF之后,血清HBV RNA水平分别在此之后的26、22周时下降了1.63 log10和2.58 log10,HBV DNA水平则分别从4.40 log10和3.44 log10均降至LLo D,而HBs Ag则几乎没有变化(分别上升0.03log10和下降0.02log10)。3例GR患者和2例PVR患者的血清HBV RNA的RT区耐药位点突变结果与HBV DNA的耐药位点检测结果是一致的。利用三代测序技术对HBV RNA RT区长期监测发现,患者GR1和GR3在耐药发生之前没有观测到常见耐药位点的突变,而GR2患者则从初治开始就具备rt L180M+M204I突变。结论:1.我们使用dd PCR建立的方法和q PCR方法均是可靠的血清HBV RNA定量检测方法,低浓度血清样本的检出是困难的,但可以增加重复检测次数来改善;2.血清HBV RNA在不同临床表型中的水平存在差异,提示血清HBV RNA可以用于未治慢性HBV感染者病情的评估。血清HBV RNA与血清HBV DNA均是未治HBe Ag阴性患者ALT升高的独立危险因素,因此在血清HBV DNA阴性患者中检测HBV RNA是必要的,血清HBV RNA可补充HBV DNA用于反映肝脏炎症;3.在未经治疗的正常或者轻度ALT异常（ALT<2×ULN）的HBe Ag阴性患者中,血清HBV RNA可以用来判定肝脏炎症程度但HBV DNA不具备这样的能力,因此这部分患者可通过血清HBV RNA水平作为启动抗病毒治疗的依据;4.血清HBV RNA水平以及利用HBV RNA测序分析适合用于长期监测慢性乙型肝炎患者NAs抗病毒疗效和基因耐药突变的发生。总之,血清HBV RNA作为一个病毒学指标,可在血清HBV DNA阴性或者ALT<2×ULN的未治HBe Ag阴性患者中用于肝脏炎症的评估;血清HBV RNA也适合用于持续NAs治疗患者抗病毒疗效的评估以及耐药突变的长期监测,进而帮助临床医师为患者制定个体化管理和治疗策略提供参考依据。
刘晓红[2]（2021）在《血清学标志物检测隐匿性乙型肝炎病毒感染研究价值分析及机制研究》文中进行了进一步梳理目的探讨乙肝表面抗原（HBs Ag）及乙型肝炎e抗原（HBe Ag）阴性,伴表面抗体（HBs Ab）、e抗体（HBe Ab）、核心抗体（HBc Ab）至少一项阳性的血清中,检测HBV DNA含量对隐匿性乙型肝炎病毒感染（OBI）的检出价值,及探讨OBI的发生机制。方法采用化学发光免疫分析法（CLIA）检测乙肝五项病毒血清标志物（HBV-M）,采用实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）进行HBV-DNA含量复筛,对OBI检出情况进行分析。采用湿化学法检测丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、总胆红素（BILT3）,分析受检患者肝损伤情况。采用CLIA方法检测丙型肝炎病毒抗体（HCV-Ab）、梅毒抗体（TP-Ab）、人类获得性免疫缺陷病毒抗体（HIV-Ab）,分析是否合并其他病毒感染及宿主免疫应答有无明显差异。测序法进一步检测HBV病毒是否存在基因突变,分析OBI发生机制。结果本次论文实验期间收集HBsAg及HBeAg阴性,伴HBs Ab、HBe Ab、HBc Ab至少一项阳性的血清共计1138份,PCR共检出35份HBV-DNA阳性,OBI检出率3.08%,其中HBc Ab、HBs Ab阳性和HBc Ab阳性HBV-M模式的检出率最高,分别为4.11%、4.04%。HBc Ab随着样本吸光度/临界值（S/Co值）升高,HBV-DNA阳性检出率依次显着升高（P<0.05）。596例患者接受肝功能检查,肝损伤占22.99%,肝损伤组HBV-DNA阳性率、HBc Ab高反应性（S/Co值≥10.0）均显着高于肝正常组（P<0.05）。35例HBV-DNA阳性标本接受HCV、TP、HIV检测,HCV阳性占11.43%,TP阳性占2.86%,HIV阳性为0,合并HCV病毒感染组与合并TP或HIV病毒感染组存在明显差异（P<0.05）。乙型肝炎病毒基因变异检测S区145位点、S区127位点、C区,未发现基因突变。结论常规检测HBsAg及HBeAg阴性伴HBcAb阳性提示存在OBI可能,且OBI发生风险随HBc Ab反应性S/Co值升高而明显升高。同时参考肝损伤指标,提示应当进一步行HBV DNA含量检测,为临床诊断OBI和降低OBI所致乙肝病毒传播风险提供参考。
徐博文[3]（2020）在《用探针法双重定量PCR同时检测乙型肝炎病毒前基因组RNA和DNA》文中研究说明现有的抗病毒药物比如核苷类似物（nucleotide analogues,NAs）、聚乙二醇化的干扰素α（PEGylated interferon alpha,PEG-IFNα）等可以有效抑制乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）的复制,但是难以清除肝细胞内的HBV共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA,cccDNA）。残余的cccDNA容易导致停药后慢性乙型病毒性肝炎（Chronic hepatitis B,CHB）的复发甚至进展。因此肝内cccDNA的水平是判断乙肝是否被治愈的重要参考指标。然而直接肝脏穿刺活检检测肝内cccDNA的水平属于有创检查,无法作为常规临床检查手段,需要寻找无创的替代手段,比如血清学检查反映肝内cccDNA的水平等。乙型肝炎病毒cccDNA可以生成0.7kb、2.1kb、2.4kb、3.5kb等多种不同长度的转录本,其中3.5kb的前基因组RNA（pregenomic RNA,pgRNA）是唯一能够反转录生成松弛环状DNA（relaxed circular DNA,rc DNA）负链的转录本。rc DNA是完整HBV颗粒的必要组成,因此pgRNA是HBV复制周期中的关键分子。血清中的pgRNA水平被证明和肝脏内cccDNA的转录活性具有较好的相关性,尤其在经过NAs治疗的病人,血清pgRNA比血清HBV DNA更能反映肝内cccDNA的转录活性,并且能够帮助判断停用抗病毒药物后乙肝在病毒学水平复发的几率,对于指导停药时机具有重要意义。因此血清pgRNA有望成为新的临床检验指标。尽管血清HBV RNA有独特的临床意义,但是其仍然无法替代HBV DNA成为更好的临床检测指标:HBV DNA水平不仅是决定患者是否进行抗病毒治疗的重要依据,同时也是评价患者病毒学应答的重要指标。另外有研究显示,HBV RNA与DNA的比值在不同自然感染史的CHB患者之间存在显着差异,因此HBV DNA和RNA的综合水平对于判断HBV感染阶段、疾病预后具有重要意义。但是目前临床上只有标准化的HBV DNA检测试剂盒,而无HBV RNA的标准检测方法。如果将来HBV RNA成为新的临床检验指标,也往往需要同时检测HBV DNA和RNA,如果分别检测必定带来耗费更多人力、时间、试剂、耗材和检测样品等问题。另一方面,目前检测HBV RNA尚无公认的常规方法,既往文献中的检测手段均存在一定局限。例如本课题的研究证明了直接抽提RNA并用oligo d T或基因特异性引物（gene specific primer,GSP）反转录的定量PCR可能因为难以消除的HBV DNA污染而存在定量不准,并且即使用DNase消化RNA提取物中的DNA也无法完全排除HBV DNA的干扰。还有其它文献报道了利用Quantigene核酸定量、微滴式数字PCR（droplet digital PCR,dd PCRds）等新技术进行HBV RNA的检测,虽然具有高灵敏度、特异性等优点,但是由于需要先进且昂贵的配套设备,目前只适用于实验室研究,尚难以在临床得到普及和推广。本课题开发了一种新的利用双重荧光定量PCR同时检测核酸提取物中pgRNA和DNA的方法,在克服了以往检测HBV RNA方法容易受到HBV DNA污染局限的同时,实现了两项指标的双检,相较于分别检测HBV DNA和RNA,可节省一半以上时间,以及减少一半的样本量需求,并且我们证明了该检测体系具有较高的特异性、准确性。本课题共设计有两种检测策略,第一种是反转录后拷贝数相减法的定量策略,适用于检测细胞培养上清标本,理论上也适合用于血清的检测;第二种策略是针对第一种的改良,方法是特异性扩增带锚定序列的c DNA然后定量,该改良检测策略对于检测细胞培养上清和细胞标本都能够胜任。综上,本课题设计的检测方法可以同时定量检测核酸提取物中HBV DNA和HBV RNA且具有定量准确、特异性好等优点,另外操作简单,节约了时间和人力物力成本,需要的检测样本量较少,因此能够较好地满足临床检验需求,具有潜在的转化价值。
白雪丁[4]（2020）在《重组酶介导的等温扩增技术（RAA）检测乙型肝炎病毒方法的建立与评估》文中研究表明目的乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）是一种广泛流行的血液传播病原体,与肝硬化和肝细胞癌的发生有关,尤其是在HBV高度流行且医疗资源有限的东南亚和非洲国家。因此,简单快速和便携式的现场检测方法对于有效监测HBV感染至关重要。研究基于重组酶介导的等温扩增技术（Recombinase-aid amplification,RAA）结合核酸热裂解处理,建立两种可现场应用的HBV-DNA检测方法。一种是使用便携式实时荧光检测设备的含内参的双重实时荧光RAA法,另一种是结合测流层析试纸条的可视化分析的试纸条法（Lateral flow dipstick,LFD-RAA）。对这两种方法进行临床应用评价。方法依据乙型肝炎病毒保守序列,参照设计原则设计引物探针,分别建立含内参的双重实时荧光RAA方法和LFD-RAA法,加以核酸热裂解前处理。以HBV阳性定量标准品为模板进行灵敏度检测;以HBV-DNA阴性的血清样本,巨细胞病毒和EB病毒阳性的血液标本为模板进行特异性检测。对来自河北157份临床样本,分别采用达安公司商业化实时荧光定量PCR试剂盒与双重实时荧光RAA和LFD-RAA方法进行平行检测,运用SPSS 21.0对两方法进行Kappa一致性分析,评估临床应用效能。结果实验已建立的核酸热裂解结合双重实时荧光RAA法和LFD-RAA法最低可检测到病毒载量为10 IU/m L的标准品,与血液中其他DNA病毒并无交叉反应,特异性好。在157份临床样本检测中,与q-PCR相比,检测灵敏度分别为97.18%,95.77%,特异性均为100%。结论研究已建立了双重实时荧光RAA方法和LFD-RAA方法检测乙型肝炎病毒,无需常规核酸提取,以热裂解为原理完成核酸前处理。该方法可在医疗资源有限的情况下进行HBV感染检测,适用于基层及临床快速诊断,在现场及时检测中展现巨大潜力。图8幅;表5个;参47篇。
刘贺[5]（2020）在《青藏高原藏族人群乙型肝炎病毒全基因组突变分析及时空动力学研究》文中研究表明目的:分析乙型肝炎病毒（HBV）CD重组体的遗传变异情况;探寻藏族人群HBV感染者血清中表面抗原（HBsAg）和抗表面抗原抗体（HBsAb）双阳性发生率及原因;分析HBV/CD重组体的时空动态传播过程和进化遗传学特征（包括基因序列起源、核苷酸替换率和居群动力学等）。方法:利用多阶段随机抽样的方法,在西藏自治区和青海省海南州进行社区藏族人群血清样本采集,西藏七个地市中共收集HBsAg阳性血清样本852例,青海省收集HBsAg 阳性血清样本411例。按照采样地区藏族人群人口分布情况,选取具有代表性的血清样本进行DNA提取,分别对HBV全长和BCP区采用巢式PCR方法进行扩增、测序和拼接,以获得HBV全序列。对获得的全序列进行重组分析,对不同重组型的基线情况、遗传变异、血清型进行比较;对重组体内不同基因型片段进行系统发育分析。以青藏高原藏族人群HBsAg和HBsAb双阳性血清样本做为观察组,并以1:4配比选择年龄、性别、病毒DNA水平和HBeAg状态同质的HBsAg 阳性/HBsAb阴性血清样本作为对照组,对两组间基因序列S区、PreS区氨基酸突变率、缺失和全基因组核苷酸突变位点分布情况进行比较。使用自NCBI中检索、收集的HBV C2亚基因型、D基因型和CD重组体全长序列,合并本研究中获得的185株全长序列,构建数据库。使用BEAST软件包对CD重组体中的D基因型片段和D1-5亚基因型;CD重组体中的C基因型片段和C2亚基因型分别进行系统发生生物地理学分析。同时,对CD1和CD2全长序列单独进行溯祖分析,并使用贝叶斯skyline重建方法推断种群数量的历史变化。结果:共获得185条HBV全长序列,其基因分型主要为CD重组基因型（181/185,97.84%）,包括:132株CD1型,其nt10-799为D基因型,其余部分为C基因型;49株CD2型,其nt10-1499为D基因型,其余部分为C基因型;除CD重组型,还获得了 4株C2亚基因型序列。185株测序样本中,HBeAg阳性组的病毒DNA水平高于HBeAg阴性组（P=0.001）;HBeAg阴性组年龄高于HBeAg阳性组（P=0.006）。CD1和CD2的C基因型区域均与C2亚基因型最为接近;CD重组体的D基因型段（nt10-799）与D4亚基因型最为接近,而CD2型nt800-1499序列在系统发育树中与D1-D3更为接近。CD2型重组体主要分布于与印度接壤的山南地区和日喀则市（P=0）。CD重组体在S区氨基酸aa76、aa120和aa129与D基因型存在差异。HBV/CD重组体的主要血清学型为ayw2型（175/181,96.7%）。与CD1型相比,CD2型存在较多的S207N突变。HBV/CD重组体的T1762/A1764双突变发生率低于C基因型,与D基因型接近。HBV/CD病毒株的 G1896A（11.1%vs 25.6%）和A2189C（11.1%vs 50.0%）突变频率低于 C2基因型,G1613A（8.9%vs 10.3%）突变水平与C2基因型相近。青藏高原1263份HBsAg阳性样本的双阳性率为2.14%（27/1263）。在S蛋白全长、N端,MHR（aa100-169）,“a”决定簇（aa124-147）,茎环结构第一环（aa124-137）,第二环（aa139-147）和C端的氨基酸突变率,双阳性组均显着高于对照组;双阳性组中PreS区缺失显着高于对照组（以上结果中,均为P<0.001）。PreSI和PreS2氨基酸突变率在两组间无显着性差异（P=0.19;P=0.89）。PreC/C区C2002T、A2159G、A2189C、C2198A在两组间的分布均存在显着差异。双阳性组和对照组的核苷酸点突变比较,PreS/S区C3189A和T825C、P区C930A在两组间分布存在显着性差异。其中,PreS区C129T（S155L）仅存在于对照组;PreS区C3189A（D103E）和S区T825C（V224A）突变仅存在于双阳性组。HBVD基因型和CD重组体中的D型区域（nt10-799）可溯祖至271年前（95%HPD 138-477）的亚洲南部,其平均进化速率约为1.26×104（95%HPD 5.92×10-5-1.93×10-4）/位点/年。D4亚基因型是CD1和CD2中最为接近的分支,于1850年左右（95%HPD 1743-1934）进入青藏高原;1911年左右（95%HPD 1845-1971）分化为CD1和CD2内相应片段。CD1型较CD2型出现更早,表明先形成D基因型区段为nt10-799的CD1,后续形成D基因型区段为10-1499的CD2。HBV/CD1和HBV/CD2重组体分别形成三个独立的进化群。HBV/CD1重组体自1980年代开始至2000年,其种群大小保持稳定;HBV/CD2重组体自1997年首次报道以来,其种群大小经过短暂上升之后,随即出现了明显的下降趋势。全球C2亚型片段的传播最先起源于亚洲东部,首先传播到中国西北和亚洲北部,随后东亚分离株又进一步播散到美洲。结论:HBV/CD重组体是高原地区流行的主要基因型。HBeAg阴性组患者体内重组体DNA水平更高,病毒复制速度较快,病情处于进展期。年龄增长是导致HBeAg在感染HBV/CD的藏族人群血清中发生转阴的主要原因。HBV/CD1重组来源为D4和C2亚基因型;HBV/CD2可能经过重组来源为D1-3、D4和C2亚基因型的多次重组。基于各基因型的地理分布,形成CD重组体的主要重组来源可能为中国（C2亚基因型）和印度（D4亚基因型）。与D基因型相比,HBV/CD重组体的主要血清型无明显变化。HBV/CD重组体感染者均在高海拔地区生活,造成这种现象的可能原因是高原居民具有相近的遗传背景特征或长期的高海拔生活导致其具有相同或相似的生活习惯。青藏高原HBV表面抗原阳性人群中HBsAg和HBsAb双阳性的发生率接近大多数不同基因型的既往研究结果。与对照组相比,双阳性组的氨基酸突变率在S区全长及其内的各个区段均显着增加。S区高突并不是血清双阳性病的充分必要条件,并不能完全解释HBsAg/HBsAb共存现象,PreS区的改变可能是导致HBsAg/HBsAb双阳性的因素之一。S区T825C（V224A）、PreS区C3189A（D103E）仅存在于双阳性组中,这些氨基酸变异导致蛋白结构发生变化,可能是双阳性发生的重要条件。HBVD基因型最可能的起源地是南亚地区。D基因型原型株在18世纪中叶逐步从印度传播到中亚进而传播到欧洲、地中海地区和非洲。在此过程中,19世纪中叶先后分化出D1、D3和D2亚基因型。同时19世纪中叶自印度向东北方向传播,逐步形成D4亚基因型并在1910年左右进入青藏高原及周边地区与C2型发生重组,这与英军两次入侵西藏时间相吻合。欧洲主要HBV D亚型的传播可追溯到二十世纪早期,包括第一次世界大战特别是第二次世界大战在内的一段时期。此过程可能与战争中产生的创伤、输血和疫苗注射,以及有组织的大规模人口迁移导致HBV的快速传播和演化有关。C2基因型向美洲等地的播散则与亚洲在二十世纪八九十年代的欧美移民潮有关,随着大量东亚地区亚裔人口向欧美等发达国家移民导致C2亚基因型的世界范围传播。
魏杰[6]（2020）在《Id1通过E2F4实现对HBV转录和复制的抑制作用及其机制研究》文中研究表明目的:乙型肝炎病毒（HBV）是一种小病毒基因组的部分双链DNA病毒,HBV导致的慢性乙肝仍然是一个全球公共卫生问题,即使得益于乙肝疫苗和抗病毒药物的临床应用,目前全世界仍超过2亿人患有慢性乙肝,乙肝的长期发展又会导致肝硬化和肝癌的发生,对人类的身体健康造成严重威胁。Id1蛋白是分化抑制因子（Id1-4）中的一员,属于bHLH转录因子家族,由于Id1缺少了与DNA结合的碱性（basic）区,导致Id1蛋白通过与其他bHLH转录因子结合形成异源二聚体从而抑制了bHLH转录因子对下游靶基因的调控。Id1的功能主要与促进细胞增殖和抑制分化相关,许多参与调控细胞增殖的基因,同样参与HBV的表达调控,此外如E2F4转录因子也属于H（helix）超家族,已被报道与Id2存在相互作用,而该因子在HBV的复制调控中的作用还未见报道。因此本文重点研究了宿主因子Id1及相互作用的转录因子E2F4在HBV复制和转录过程中的调控作用及其分子机制,其研究结果进一步丰富宿主因子对HBV的调控网络,并有助于基于该机制研发新的抗病毒药物。方法:1,在临床样本中,运用qRT-PCR和western blot实验分析HBV相关的肝细胞肝癌中癌旁与肿瘤的HBV pgRNA的转录水平以及Id1和HBV核心蛋白的表达水平。2,在细胞水平和动物水平,同样应用western blot实验比较HBV复制阳性和HBV复制阴性的细胞以及HBV转基因小鼠和非转基因小鼠中Id1的表达水平。3,进一步应用western blot分析HBV四种蛋白（HBc/p/s/x）对Id1的影响以及研究HBV在HepG2-NTCP感染模型中对Id1的作用。4,运用Id1Ad感染HBV复制的细胞（HepG2.2.15,HepAD38和HepG2-HBV1.1）实现Id1蛋白的过表达,分别应用Southern blot实验,ELISA和western blot检测HBV DNA,HBeAg和HBc水平变化;应用qPCR检测HepG2.2.15细胞中HBV cccDNA和pgRNA的变化。5,运用pCDNA3.1-Id1转染HBV感染HepG2-NTCP模型,应用qPCR检测其中HBV DNA的变化。6,应用靶向Id1的shRNA1/2干扰序列降低HepG2.2.15和HepG2-HBV1.1细胞中的Id1水平,分别应用Southern blot实验,ELISA和western blot检测HBV DNA,HBeAg和HBc水平变化。7,通过尾静脉注射Id1Ad感染HBV-TgM,在体内小鼠过表达Id1,同样应用Southern blot和qPCR检测小鼠肝脏组织中HBV DNA的变化,应用western blot和IHC检测肝组织细胞Id1和HBc蛋白的变化,采用ELISA检小鼠血清中HBeAg的变化。8,通过qRT-PCR和western blot筛查Id1过表达对调控HBV的经典宿主因子的影响。9,通过qRT-PCR筛查HBV复制的细胞中的mRNA水平发生改变的HLH转录因子。10,构建潜在的发生变化的HLH因子的过表达质粒,通过筛查它们对HBV Cp启动子的影响,特别是E2F4发挥了对Cp启动子活性显着的促进作用。11,进一步研究比较了E2F4在HBV复制的HepG2.2.15,HepAD38和HepG2-HBV1.1细胞中以及25对临床样本中癌组织和癌旁组织的各自表达情况。12,利用E2F4Ad感染HepG2.2.15和HepG2-NTCP细胞过表达E2F4,应用qPCR检测其中HBV DNA和pgRNA的变化。13,免疫荧光试验,免疫共沉淀实验和GST-pulldown实验检测E2F4与Id1之间的相互作用。14,胞浆胞核蛋白分离联合western blot试验检测HBV复制和Id1对细胞中E2F4的核内外分布的影响。15,HepG2.2.15分别在过表达E2F4和干扰Id1以及过表达Id1和干扰E2F4之后,Southern blot检测HBV DNA的复制水平。16,ChIP实验检测Cp启动子是否招募E2F4蛋白,Id1对该招募的影响。17,应用体外EMSA实验检测Cp启动子和E2F4蛋白是否存在直接相互作用。18,根据E2F4的二级结构和识别位点规律,生物信息学进行分析E2F4在Cp启动子上存在的潜在识别位点,构建相应的启动子突变体,应用荧光素酶活性实验验证潜在位点的缺失是否导致E2F4对HBV的调控受阻。19,体外SPR实验和ITC实验检测E2F4截短蛋白和Cp启动子DNA链的相互结合作用。20,根据潜在位点构建相应的HBV1.3倍体突变体,通过ChIP实验检测突变的Cp启动子对E2F4的招募情况。21,在Huh7细胞中转染HBV1.3倍体突变体,qPCR检测该细胞分别感染E2F4Ad和Id1Ad后HBV DNA的变化,ELISA检测细胞上清中HBeAg的变化。22,生物信息学比对分析常见的四种HBV基因型（Gt A/B/C/D）中E2F4潜在识别位点的保守性,进而应用southern blot和qPCR检测E2F4和Id1对四种HBV复制调控作用的普适性。结果:1,在25对HBV相关的肝癌与癌旁组织样本中,癌旁样本的pgRNA整体表达水平大约是肝癌组织的两倍（P<0.05）,其中20对样本的HBc的蛋白水平在癌旁组织中明显高于癌组织,有18对样本的Id1的蛋白表达水平在肝癌组织中明显高于癌旁。2,在HBV稳定复制的细胞和HBV瞬时转染的细胞中Id1 mRNA和蛋白水平均明显低于非HBV复制的对照肝癌细胞。3,在HBV感染细胞模型中,HBV的感染导致Id1的蛋白水平明显减少,过表达HBV相关蛋白HBp和L-HBs同样导致Id1蛋白水平的降低,HBV转基因小鼠的肝组织中,Id1蛋白水平也显着低于普通C57小鼠。4,Id1过表达可显着抑制HBV复制细胞（HepG2.2.15,HepAD38和HepG2-HBV1.1细胞）中HBV DNA复制中间体,pgRNA和HBc的表达水平,上清中HBeAg的分泌水平（P<0.01）,此外过表达Id1也显着下调HepG2.2.15细胞中HBV cccDNA的复制水平和Cp启动子的活性（P<0.05）。5,下调Id1的表达可显着促进HBV复制细胞（HepG2.2.15和HepG2-HBV1.1细胞）中HBV DNA复制中间体和HBc的表达水平,上清中HBeAg的分泌水平（P<0.05）。6,Id1过表达可显着抑制HBV转基因小鼠肝组织中HBV DNA复制水平和HBc的表达水平,也导致血清HBeAg分泌水平的显着下降（P<0.05）。7,在HepG2.2.15细胞中,Id1过表达没有导致经典的HBV调控因子发生明显变化,但HBV的复制导致4种HLH因子mRNA（E2F4,TCF3,E40和USF1）发生显着上调和2种HLH因子（Clock和HIF1α）的显着下调。8,E2F4过表达可以显着促进HBV Cp启动子活性和上调HBV pgRNA,HBV DNA的复制。9,在HBV复制的细胞中E2F4蛋白水平明显高于对照肝癌细胞;在HBV相关的肝癌临床样本中,E2F4的整体蛋白水平在癌旁组织中明显高于癌组织（P<0.05）。10,通过IP和GST-pulldown实验表明E2F4和Id1存在相互作用,Id1的过表达减弱了HBV复制引起的p130和E2F4的核转移。11,过表达E2F4可以进一步促进干扰Id1导致HBV DNA的上调,相反过表达Id1并没有显着抑制干扰E2F4导致HBV DNA的下调。12,ChIP实验证实E2F4能被Cp启动子招募,Id1的过表达同样也阻止了Cp启动子对E2F4的招募作用。13,EMSA实验中,随着E2F4截短蛋白(E2F41-180)的增加,Cp启动子的迁移速率明显下降,并且Cp冷探针可以竞争结合E2F4截短蛋白。14,生物信息学表明E2F4在Cp上存在潜在的识别位点5’-1758TTAAAGGTC1766-3’,该位点的缺失导致E2F4对HBV Cp启动子活性的促进作用消失;在相应的HBV1.3突变体（HBV1.3 mut2.3）中,E2F4和Id1都失去了对HBV的调控作用。15,SPR和ITC实验表明包含5’-1758TTAAAGGTC1766-3’的Cp2短链可以直接与E2F4的DNA识别区域相互结合。16,进步分析发现5’-1758TTAAAGGTC1766-3’在HBV Gt A/B/C/D基因型中高度保守,并且E2F4和Id1对这四种基因型的HBV的调控具有普适性。结论:在本研究中,我们阐明了Id1及其相互作用的转录因子E2F4在HBV复制和转录中的协同调控作用。研究结果显示,无论是在HBV复制背景下的细胞水平还是组织水平中,Id1表达水平均显着下调,而E2F4表达水平则显着上调;E2F4可以通过上调HBV Cp启动子活性从而促进HBV复制和相应的转录;上游Id1分子则通过与E2F4相互作用抑制其核内转移,导致HBV的复制和转录受抑制;5’-1758TTAAAGGTC1766-3’是E2F4在Cp启动子上的直接识别位点,在HBV A/B/C/D四种基因型中高度保守,是Id1和E2F4实现对四种基因型HBV调控的基础。我们的研究进一步完善了宿主因子对HBV的调控网络,为研发新的抗病毒策略提供了新的思路。
巫智勇[7]（2020）在《国产试剂与Roche试剂HBV DNA荧光定量PCR检测方法的精度比较》文中提出目的:了解Roche公司Cobas PCR试剂与国产HBV荧光定量PCR试剂对HBV DNA检测的差异性,以更好地指导抗病毒治疗。方法:收集安医大一附院2019年3月至2019年6月期间门诊和住院的未经和已经进行核苷类药物治疗的慢性乙型肝炎或乙型肝炎肝硬化患者的血清70份,采用相关性分析来评价Cobas检测和国产检测对不同HBV DNA载量标本的精确性。HBV DNA定量检测:HBV DNA分别用Cobas定量试剂（Roche）和上海之江生物科技股份有限公司试剂（ZJ）进行检测。扩增反应分别在Cobas Taq Man 48 PCR仪和美国Applied Biosystem公司生产的ABI 7500基因扩增仪进行。同一份标本采用2种试剂进行平行检测,具体操作和结果判定参照试剂盒说明进行。结果:1.上海之江生物科技股份有限公司生产的试剂ZJ试剂检测结果与Roche检测结果的总体相关系数r=0.612,P=0.004,说明两者之间存在显着的线性相关。2.国产试剂对于病毒载量低于106 copy/ml的标本检测结果的问题突出体现在三个方面:1)检测结果准确性差;2)相当比例的标本国产试剂出现检测值≤1000copy/ml,病毒载量越低,出现检测值低于下限的比例越高。3)病毒载量低于106 copy/ml的标本,国产试剂检测结果的重复性差,同一标本不同批次的检测结果可以相差1个数量级。在103<HBV DNA≤106范围内,P值大于0.05,提示两种检验方法间不存在显着相关性,在HBV DNA>107copy/ml范围以上,两种检验方法间存在显着的线性相关。3.ZJ试剂检测结果≤1000copy/ml而Roche检测结果>1000copy/ml的,即ZJ试剂检测结果呈假阴性的标本有16例,占37.2%。结论:1.国产试剂与Roche试剂具有较好的相关性,表明国产试剂总体来说反映了标本中的病毒载量水平,可以用于常规检测。国产试剂与Roche试剂在病毒载量高于107 copy/ml以上时具有较好的相关性,在病毒载量低于≤106 copy/ml范围内的检测精度相关性差。2.血清HBV DNA高滴度或低滴度持续存在是乙型肝炎病情进展和肝癌发生的危险因素,血清HBV DNA的高精度检测至关重要,建议对于HBV DNA低于106 copy/ml的标本,尤其是经过抗病毒治疗后国产检测低于检测下限的,应当使用用Cobas高精度病毒载量检测系统进行检测或复测,尽量避免假阴性结果而延误患者病情。
王珊[8]（2019）在《基于CRISPR技术的乙肝病毒DNA及YMDD耐药突变高灵敏检测技术研究》文中研究说明慢性乙型肝炎（以下简称乙肝）是目前最突出的全球性公共卫生问题之一,严重威胁人类健康。尽管近些年乙肝疫苗的使用有效降低了乙肝的发病率,每年仍有1-3千万人感染乙肝病毒（Hepatitis B virus,HBV）,约有1百万人死于HBV感染及其并发症。为了有效地控制HBV的传播,确保HBV感染者得到及时的治疗,对HBV的高效检测尤为重要。而针对HBV DNA的核酸检测技术由于其具有灵敏度高、特异性强等优势,已广泛应用于乙肝的诊断、监测、预后评价和输血筛查等方面。然而,目前临床上仍有部分HBV感染者体内存在现有方法难以检出的低浓度HBV DNA,这不仅增加了由此引发的慢性肝炎、肝硬化和原发性肝癌的发病风险,还可能造成输血以及肝移植过程中的HBV感染。此外,对乙肝病毒耐药突变的检测和监测可预防由此引发的抗病毒治疗失败。但由于“准种”的存在,部分患者体内存在难以检出的极低含量的HBV耐药突变株,在某种情况下,如肝移植、丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus,HCV）合并感染等,这些未检出的低含量HBV耐药突变株,可能带来严重的临床后果（如HBV感染、肝衰竭等）。因此,研发一种高灵敏度的HBV DNA和耐药突变检测技术对乙肝的防治具有重大现实意义。近年来,新的RNA靶向系统CRISPR-Cas13a已被开发为一种可检测痕量核酸的高灵敏、高特异检测技术,通过结合RPA等温扩增技术可实现对单拷贝核酸和单碱基突变的准确检测和鉴定。相比检测成本高、稳定性差的等温扩增技术,基于PCR技术的核酸检测方法具有更高的临床实用性。因此,在本研究中,我们首次基于PCR扩增技术和CRISPR-Cas13a系统建立了针对HBV DNA及耐药突变的高灵敏、高特异核酸检测技术（PCR-CRISPR）,可实现对低至单拷贝HBV DNA的高灵敏检测。通过临床样本的验证,该方法对HBV DNA的检测灵敏度高于qPCR,达到甚至超过了数字PCR（ddPCR）的检测灵敏度。同时,我们还基于上述方法建立了针对乙肝YMDD耐药突变的高灵敏检测技术,可以特异性地检测出低至单拷贝耐药突变株,并在极低病毒载量临床样本中,鉴定出了qPCR无法检出的YMDD耐药突变株。1.建立基于PCR-CRISPR技术的高灵敏度HBV DNA检测方法通过LwCas13a蛋白的诱导表达、纯化及活性鉴定,获得了具有良好RNA酶活性的LwCas13a蛋白,纯度可达96%;通过比对不同基因型HBV聚合酶区（P区）的基因序列,我们在保守区设计并筛选出可以高效检测HBV DNA的crRNA。建立了基于PCR扩增、转录、crRNA识别及LwCas13a激活、报告RNA剪切及荧光检测的新型核酸检测技术:PCR-CRISPR。并实现了对低至单拷贝HBV DNA的高灵敏检测。2.利用PCR-CRISPR技术检测血清样本中HBV DNA我们利用PCR-CRISPR方法对32份已知血清样本进行HBV DNA的检测,检测结果（16份阴性,16份阳性）与qPCR一致。通过对280份未知血清样本的检测,进一步探索了该方法对临床样本HBV DNA检测的敏感度和特异性。检测结果显示,90份qPCR检测为HBV DNA阳性的血清样本和180份qPCR检测阴性的血清样本均被PCR-CRISPR成功检出。同时,对于10例qPCR判定为阴性的血清样本,PCR-CRISPR方法和ddPCR均检测出了痕量的HBV DNA（浓度约1.2-5.4拷贝/反应）。随后,我们利用PCR-CRISPR方法和ddPCR对该10例痕量样本分别进行了10次重复检测,结果显示PCR-CRISPR平均检出次数为7次,而ddPCR平均检出次数为3次。通过查阅患者的临床信息我们发现,其中6例患者存在慢性乙肝病史,2例显示为HBV感染者。以上结果表明,新建立的PCR-CRISPR方法对HBV DNA检测的灵敏度明显高于qPCR,达到甚至高于ddPCR的检测灵敏度。3.建立基于PCR-CRISPR技术的乙肝病毒YMDD耐药突变检测方法通过对HBV YMDD区序列的保守性分析,我们设计并筛选了分别针对YVDD和YIDD耐药突变的crRNAs并建立了针对上述两种耐药突变的PCR-CRISPR检测方法。该技术可在PCR扩增后10 min内检测出低至单个拷贝的YVDD突变株,和100个拷贝的YIDD耐药突变株。该方法还可以通过荧光强度有效区分1 copy的YVDD突变株与106 copy的野生株。在本部分研究表明,新建立的PCR-CRISPR乙肝病毒YMDD耐药突变检测方法,可以实现对乙肝YMDD耐药突变株的快速、高灵敏检测。4.利用PCR-CRISPR技术检测血清样本中乙肝病毒YMDD耐药突变利用qPCR、直接测序法和PCR-CRISPR方法,我们对424份血清样本进行了YMDD耐药突变的检测,结果显示,3种方法均检测出了27例血清样本（HBV DNA>100 IU/mL）中的YMDD耐药突变（5例YVDD和22例YIDD）;此外,qPCR和PCR-CRISPR 2种方法均检出了18例直接测序法未检出的YMDD耐药突变（5份YVDD和13份YIDD）;值得一提的是,PCR-CRISPR方法还在12例HBV DNA浓度低于100 IU/mL的血清样本中,检测出了qPCR和直接测序法均未检出的YMDD耐药突变（4例YVDD和8例YIDD）。以上结果表明,该技术可用于血清样本中YMDD耐药突变株的高灵敏检测,尤其适用于对低浓度HBV DNA血清样本中耐药突变的检测。综上,本研究首次将PCR扩增技术和CRISPR-Cas13a检测技术结合,建立了基于PCR-CRISPR技术的乙肝病毒DNA和YMDD耐药突变的高灵敏度、高特异性的检测方法。该方法可以用于对血清中低浓度HBV DNA的高灵敏检测,对降低输血和肝移植中HBV感染的风险、减少抗病毒治疗停药后的乙肝复发率,制定合适的抗病毒治疗方案具有重大临床意义。此外,本研究也为将该方法用于对其它病原的高灵敏高特异核酸检测奠定了理论和技术基础。
徐亮[9]（2019）在《应用高灵敏方法评估现行HBV母婴阻断方案研究》文中研究说明目的采用高灵敏方法评估实施乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）母婴阻断后孩子发生隐匿性HBV感染（Occult HBV infection,OBI）的现状、探讨孩子发生OBI的相关危险因素及对母亲的影响。方法研究分三部分,第一部分为现行HBV母婴阻断方案实施后子代乙肝病毒标志物的随访、变化分析;第二部分对经过HBV母婴阻断的孩子进行7月-24月的随访,应用nested PCR检测其外周血中HBV DNA、HBV RNA的基因表达,以评估现行HBV母婴阻断方案疗效。第三部分为实施HBV母婴阻断的HBsAg阳性母亲分娩后1年内肝功能、HBV DNA变化的随访研究。结果按照我国现行HBV母婴阻断疗效评估标准,51例HBsAg阳性母亲所生孩子HBsAg、HBV DNA均阴性,HBV阻断成功率为100%。对其中随访资料相对完整的13对母子外周血进行nested PCR检测,证实诊断为OBI的孩子多达11例,结果发现HBeAg阳性母亲所生孩子发生OBI的几率明显高于HBeAg阴性母亲所生孩子,χ2=5.318,P=0.021;脐带血PBMC细胞中HBV基因检测结果与母亲外周血PBMC细胞一致,而脐带血血浆中未能检测出HBV基因;HBV血清标志物仅抗-HBs阳性的7例孩子中有5例可以检测HBV基因。HBsAg阳性母亲所生孩子的抗HBs水平在出生2月时升高,阳性率高达96.1%;HBeAg阳性率在出生2天时高达54%,12月时全部阴转;HBeAb阳性率在出生2天时高达50%,在24月时仅剩1例阳性;Anti-HBc出生时阳性率100%,随后逐渐下降,但在24月时反跳至91.9%。将母亲分娩前HBV DNA分为HBV DNA<500 Copies/mL,HBV DNA≥500 Copies/mL且<10^6 Copies/mL,以及HBV DNA≥10^6 Copies/mL三组,发现孩子HBeAg阳性率在出生2天、2月时分别为22.7%、63.6%、93.3%和0、36.4%、36.4%,HBeAb阳性率在孩子2天、2月、7月时分别为77.3%、45.5%、13.3%,65.2%、27.3%、6.7%及36.8%、11.1%、0%,均P<0.01。分娩前HBeAg阳性母亲所生孩子出生2天、2月的HBeAg阳性率分别为85.2%、33.3%,明显高于HBeAg阴性母亲所生孩子的7.1%、0%,均P<0.01;其HBeAb阳性率分别为18.5%、3.7%、0%,明显低于HBeAg阴性母亲所生孩子的100%、100%、60%,均P<0.01。孩子出生2天肝功能异常比较常见,轻度肝功能异常（ALT和或AST>40 U/L且<80 U/L）47.1%,肝功能明显异常（80 U/L<ALT和或AST）占35.2%,但无肝衰竭病例发生,且多无需特殊治疗。对母亲产后随访1年,肝功能异常率为33.3%（17/51）,肝炎发生率为27.4%（14/51）。将母亲分为替比夫定（Telbivudine,LdT）组及非LdT组,进行肝功能异常率比较,LdT组为60%（6/10）,非LdT组26.8%（11/41）,其中明显肝功能异常者LdT组仅10%（1/10）,非LdT组为7.3%（3/41）;肝炎发生率,LdT组为40%,非LdT组为24.4%,两组比较均P>0.05。两组肝炎发作均在3月内,且均未出现TBIL的升高。10例停用LdT母亲在1年内有6例发生HBV DNA反弹,主要发生在产后3月内（5/6）,其中4例发生肝炎。HBeAg阳性母亲肝炎发生率为33.3%,显着高于HBeAg阴性母亲的8.3%,χ2=4.694,P=0.032;HBV DNA≥10^6 Cs/mL母亲肝炎的发生率53.3%,也显着高于HBV DNA<10^6 Cs/mL母亲的8.3%,χ2=12.675,P=0.001。多元线性回归分析显示母亲是否发生肝炎仅与分娩前log10 HBV DNA呈显着相关性（β系数=0.507,t=2.747,P=0.009）。结论按照现行HBV母婴阻断评估标准,HBV母婴阻断“成功”的13例孩子有11例发生OBI,应引起临床重视;母亲HBeAg阳性是孩子发生OBI的危险因素;脐带血PBMC细胞可能是母婴传播OBI的一个重要途径;孩子HBV血清标志物仅抗-HBs阳性并不能排除OBI。孩子出生后HBeAg、HBeAb的表达主要受母亲HBV DNA水平及HBeAg的影响,12月内HBeAg、HBeAb、抗-HBc考虑主要来自于母体。HBsAg阳性母亲分娩后停用LdT发生HBV DNA反弹、肝炎发作比较常见,多在产后3月内,所以分娩后3月内是监测肝功能、HBV DNA水平的关键时期,分娩前HBeAg阳性、HBV DNA水平≥10^6 Cs/mL是发生肝炎的危险因素。
王永力[10]（2019）在《慢性乙型肝炎患者肝组织HBV cccDNA定量检测及临床应用》文中研究指明目的:乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）共价闭合环状DNA（Covalently closed circular DNA,cccDNA）是乙肝病毒前基因组RNA（Pregenomic RNA,pg RNA）复制的原始模板,对乙肝病毒的复制以及感染状态的建立具有十分重要的意义。以往文献报告了多种进行HBV cccDNA定量检测的方法,各有其利弊。本研究拟采用荧光定量聚合酶链反应即荧光定量PCR（Fluorescence quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR）的检测方法进行HBV cccDNA定量检测,初步探讨HBV cccDNA荧光定量检测方法在慢性乙型肝炎患者肝组织中的临床应用及意义。方法:通过使用HBV cccDNA、HBV Total DNA以及HBV pg RNA的特异性引物和探针,将含有HBV基因的p HBV1.3-B6质粒作为标准品,根据HBV质粒的不同拷贝数,建立FQ-PCR检测的标准曲线,通过实时荧光定量PCR检测HBV cccDNA、BV Total DNA以及HBV pg RNA含量;用Jukart细胞DNA作为检测管家基因β-actin的标准品,根据人类基因组DNA（Human genomicDNA,hg DNA）的不同拷贝数,建立FQ-PCR检测的标准曲线,通过实时荧光定量PCR检测β-actin基因含量,计算肝细胞数,并对每个肝细胞内含有的HBV cccDNA、HBV Total DNA以及HBV pg RNA进行标准化;并在He PGAD38细胞和THP-1细胞中验证该方法。检测HBV感染患者肝组织HBV cccDNA定量,包括终末期肝病患者（包括肝硬化和肝癌）11例和核苷酸类似物（Nucleos（t）ide analogs,NAs）经治的慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B,CHB）患者5例（于基线和继续NAs治疗48周时肝穿刺活检取样）。通过检测患者肝组织的相关病毒学指标,分析肝细胞HBV cccDNA、HBV Total DNA和HBV pg RNA定量在临床实践中的意义。结果:1.在He PGAD38细胞中成功检测到HBV cccDNA、HBV Total DNA和HBV pg RNA,其含量分别为3.89 copies/cell（IQR 3.44-4.49）、1289.43 copies/cell（IQR859.96-6038.50）、6.42 copies/cell（IQR 5.06-7.85）,而阴性对照的THP-1细胞未能检查到相关指标。2.HBe Ag阴性的终末期肝病患者中,未经抗病毒治疗的患者肝细胞HBV cccDNA和HBV Total DNA水平显着高于已接受抗病毒治疗的患者（分别为P<0.0001,P=0.0004）;在HBe Ag阴性的核苷类似物经治的终末期肝病患者中,血清HBV DNA阳性的患者肝细胞HBV cccDNA水平明显高于血清HBV DNA转阴的患者（P=0.0238）,而肝细胞HBV Total DNA定量水平两组无显着性差异（P>0.05）。3.本研究3例HBe Ag阳性核苷经治患者基线时肝组织HBV cccDNA、HBV Total DNA和HBV pg RNA定量分别为0.93 copies/cell、1.62 copies/cell、0.05 copies/cell（均取中位数）;2例HBe Ag阴性患者肝组织HBV cccDNA、HBV Total DNA和HBV pg RNA定量分别为0.05 copies/cell、0.38 copies/cell、0.01 copies/cell（均取中位数）。HBe Ag阳性患者肝细胞HBV cccDNA、HBV Total DNA和HBV pg RNA含量均高于HBe Ag阴性患者,两组比较没有统计学差异（P>0.05）。继续NAs抗病毒治疗48周后肝组织检测,3例HBe Ag阳性肝组织HBV cccDNA、HBV Total DNA和HBV pg RNA定量的中位数分别为0.31 copies/cell、0.22 copies/cell、0.06 copies/cell;2例HBe Ag阴性患者肝组织HBV cccDNA、HBV Total DNA和HBV pg RNA的含量分别为0.05copies/cell、0.22 copies/cell、0.00 copies/cell。治疗48周后,HBe Ag阳性患者肝细胞HBV cccDNA、HBV Total DNA含量均较基线时降低（无统计学差异,P>0.05）。HBe Ag阴性患者HBV Total DNA和HBV pg RNA定量中位数在48周较基线时有所下降（无统计学差异）,但HBV cccDNA定量无变化。结论:成功建立了慢性乙型肝炎患者肝组织HBV cccDNA定量检测的荧光定量PCR方法。抗病毒治疗可显着降低HBe Ag阴性的终末期肝病患者肝细胞HBV cccDNA和HBV Total DNA水平。肝细胞HBV cccDNA定量是可用于评价临床慢乙肝患者抗病毒疗效较为精确可靠的指标之一,本研究不足之处在于样本量较小,需要进一步扩大样本研究。
二、荧光定量PCR检测乙型肝炎患者血清中HBV DNA的临床意义（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、荧光定量PCR检测乙型肝炎患者血清中HBV DNA的临床意义（论文提纲范文）
（1）血清HBV RNA在慢性HBV感染者病情评估和耐药监测中的应用（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 微滴数字PCR用于血清HBVRNA定量方法的建立及与实时荧光定量PCR方法的对比评价 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 血清HBV RNA在未治慢性HBV感染者中的分布特点及其临床意义 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 恩替卡韦耐药及部分病毒学应答患者血清HBV RNA动力学特征以及用于长期监测耐药突变的初步研究 |
| 4.1 研究对象和方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 全文总结与研究展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 慢性乙型肝炎血清学标志物研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的文章 |
| 致谢 |
（2）血清学标志物检测隐匿性乙型肝炎病毒感染研究价值分析及机制研究（论文提纲范文）
| 中文论着摘要 |
| 英文论着摘要 |
| 英文缩略语 |
| 前言 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 文献综述 隐匿性乙型肝炎病毒感染的研究现状 |
| 参考文献 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）用探针法双重定量PCR同时检测乙型肝炎病毒前基因组RNA和DNA（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一部分 用于检测培养上清中 HBV DNA 和 RNA 的双重定量PCR 体系的建立 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 用拷贝数相减法检测 hep G2.2.15 细胞内和培养上清中的 HBV DNA 和 RNA |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 双重定量 PCR 检测 HBV DNA 和 RNA 的方法的改良 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 工作小结 |
| （一）主要研究内容 |
| （二）下一步需要解决的问题 |
| 参考文献 |
| 文献综述 HBV RNA 的检测方法和临床意义研究进展 |
| 一、病毒复制周期中的血清HBV RNA |
| 二、血清HBV RNA的种类和检测方法 |
| 三、血清HBV RNA与其他HBV标记物的相关性 |
| 四、血清HBV RNA的临床意义 |
| 五、血清HBV RNA的研究展望 |
| 六、总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（4）重组酶介导的等温扩增技术（RAA）检测乙型肝炎病毒方法的建立与评估（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 引言 |
| 第1章 含内参的双重实时荧光重组酶介导的等温扩增技术检测乙型肝炎病毒方法的建立与评估 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 临床样本 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 引物、探针设计原则 |
| 1.2.2 引物、探针设计与合成 |
| 1.2.3 内参质粒的制备 |
| 1.2.4 阳性质控品的制备 |
| 1.2.5 核酸提取 |
| 1.2.6 单重实时荧光RAA法建立与灵敏度分析 |
| 1.2.7 双重实时荧光RAA法建立与内参浓度优化 |
| 1.2.8 双重实时荧光RAA方法灵敏度和特异性检测 |
| 1.2.9 临床样本检测 |
| 1.2.10 统计学分析 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 单重实时荧光RAA法灵敏度 |
| 1.3.2 双重实时荧光RAA法内参质粒浓度优化 |
| 1.3.3 双重实时荧光RAA法灵敏度与特异性 |
| 1.3.4 临床样本检测 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 参考文献 |
| 第2章 乙型肝炎病毒核酸热裂解与双重重组酶介导的等温扩增检测方法的建立及初步应用 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 HBV阳性标准品及临床样本 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 引物和探针设计及合成 |
| 2.2.2 核酸热裂解 |
| 2.2.3 核酸热裂解结合双重实时荧光RAA扩增方法的建立 |
| 2.2.4 核酸热裂解结合双重实时荧光RAA扩增方法灵敏度和特异性检测 |
| 2.2.5 临床样本检测 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 核酸热裂解结合双重实时荧光RAA扩增方法灵敏度和特异性检测 |
| 2.3.2 临床样本检测 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 参考文献 |
| 第3章 侧流层析试纸条结合重组酶介导的等温扩增技术对乙型肝炎病毒核酸粗提取检测方法的建立及初步应用 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 HBV阳性标准品及临床样本 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 引物和探针设计及合成 |
| 3.2.2 核酸热裂解 |
| 3.2.3 核酸热裂解结合LFD-RAA扩增方法的建立及反应条件优化 |
| 3.2.4 核酸热裂解结合LFD-RAA扩增方法灵敏度与特异性检测 |
| 3.2.5 临床样本检测 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 反应条件优化 |
| 3.3.2 核酸热裂解结合LFD-RAA扩增方法灵敏度与特异性检测 |
| 3.3.3 临床样本检测 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 第4章 综述 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 HBV病原学及流行病学特征 |
| 4.3 变温核酸检测 |
| 4.3.1 聚合酶链反应 |
| 4.3.2 连接酶链反应 |
| 4.4 等温核酸检测 |
| 4.4.1 环介导等温扩增技术 |
| 4.4.2 依赖核酸序列的扩增技术 |
| 4.4.3 滚环扩增技术 |
| 4.4.4 转录介导扩增 |
| 4.4.5 重组酶介导的等温扩增 |
| 4.5 基因测序 |
| 4.6 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间研究成果 |
（5）青藏高原藏族人群乙型肝炎病毒全基因组突变分析及时空动力学研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语表 |
| 前言 |
| 第一部分 青藏高原藏族人群HBV基因序列分析 |
| 一、材料与方法 |
| 1.样本来源 |
| 2.引物及扩增条件 |
| 3.主要试剂、耗材及生产厂家 |
| 4.主要仪器设备及生产厂家 |
| 5.HBV生物信息学分析主要软件 |
| 6.实验方法 |
| 7.HBV荧光定量PCR检测 |
| 8.生物信息学分析方法 |
| 9.统计分析 |
| 10.质量控制 |
| 二、结果 |
| 1.青藏高原藏族人群血清HBV全序列扩增结果 |
| 2.HBV DNA全长序列分型分析 |
| 3.青藏地区HBV/CD重组体不同区段系统发育分析结果 |
| 4.青藏高原藏族人群全长序列基本信息及地理分布 |
| 5.HBV/CD重组体全序列基因变异分析结果 |
| 6.HBV血清型分析结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 第二部分 HBV/CD重组型表面抗原抗体双阳性研究 |
| 一、材料与方法 |
| 1.样本来源 |
| 2.DNA序列拼接与分析 |
| 3.HBV荧光定量PCR检测 |
| 4.统计分析 |
| 二、结果 |
| 1.HBsAg和HBsAb双阳性的发生率 |
| 2.双阳性组和对照组的基本信息 |
| 3.PreS/S区氨基酸突变率分析结果 |
| 4.全序列核苷酸和氨基酸突变位点分析结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 第三部分 HBV/CD重组体时空动力学分析 |
| 一、材料与方法 |
| 1.HBV全长基因序列数据库构建 |
| 2.数据库内序列的基因型和重组分析 |
| 3.用于时空动态分析的主要工具和软件 |
| 4.时空动态分析方法 |
| 5.统计分析 |
| 二、结果 |
| 1.HBV全长基因序列数据库构建情况 |
| 2.HBV D基因片段tMRCA分析结果 |
| 3.HBVC基因片段tMRCA分析结果 |
| 4.HBV/CD1重组体tMRCA及种群动态分析结果 |
| 5.HBV/CD2重组体tMRCA及种群动态分析结果 |
| 6.HBVC基因型和D基因型时空动态分析结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 全文小结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 乙肝病毒感染者血清表面抗原表面HBsAg/HBsAb双阳性研究进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表文章 |
| 致谢 |
（6）Id1通过E2F4实现对HBV转录和复制的抑制作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一章 Id1在HBV表达的环境中发生下调 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 比较HBV相关的肝癌组织和癌旁组织中pgRNA的表达水平 |
| 2.2 比较HBV相关的肝癌组织和癌旁组织中Id1和HBc的蛋白表达水平 |
| 2.3 HBV复制在细胞水平对Id1表达水平的影响 |
| 2.4 比较HBV转基因小鼠和普通C57 小鼠中Id1 蛋白表达水平 |
| 2.5 HBV感染HepG2-NTCP对 Id1 表达水平的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 Id1通过抑制核心启动子的活性下调HBV转录和复制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 过表达Id1对HBV复制水平的影响 |
| 2.2 过表达Id1对HBV转录水平的影响 |
| 2.3 过表达Id1对HepG2-NTCP模型中HBV复制水平的影响 |
| 2.4 过表达Id1对HBV4个启动子活性的影响 |
| 2.5 沉默Id1对HBV复制水平的影响 |
| 2.6 沉默Id1对HBV转录水平的影响 |
| 2.7 过表达Id1对HBV转基因小鼠HBV复制和转录水平的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 E2F4通过激活核心启动子的活性上调HBV转录和复制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 过表达Id1筛查对HBV转录调控的转录因子的影响 |
| 2.2 HepG2 转染HBV1.1 倍体分析HLH转录因子表达变化 |
| 2.3 过表达E2F4激活HBV核心启动子活性 |
| 2.4 过表达E2F4促进HBV的转录和复制 |
| 2.5 比较HBV相关的肝癌组织和癌旁组织中E2F4的蛋白表达水平 |
| 2.6 沉默E2F4对HBV转基因小鼠HBV复制和转录水平的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 Id1 通过结合E2F4 并阻断其对HBV核心启动子的激活 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 Id1抑制E2F4的核转移 |
| 2.2 Id1和E2F4的相互作用 |
| 2.3 E2F4介导Id1对HBV抑制作用 |
| 2.4 E2F4通过识别核心启动子促进HBV的转录和复制 |
| 2.5 Id1阻断核心启动子对E2F4的招募 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 E2F4 通过识别结合Cp启动子上5'-1758TTAAAGGTC1766-3'位点对HBV表达调控中的实现促进作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 筛选E2F4在Cp启动子上的识别位点 |
| 2.2 5 '-1758TTAAAGGTC1766-3'是E2F4和Cp的相互作用的基础 |
| 2.3 5 '-1758TTAAAGGTC1766-3'的突变体导致E2F4和Id1 失去对HBV调控作用 |
| 2.4 5 '-1758TTAAAGGTC1766-3'的保守性是E2F4和Id1对A-D基因型HBV发挥调控作用的基础 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间撰写和发表的文章 |
（7）国产试剂与Roche试剂HBV DNA荧光定量PCR检测方法的精度比较（论文提纲范文）
| 英文缩略语 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 个人简历 |
| 致谢 |
| 综述 慢性乙型肝炎的病毒学检测及预后 |
| 参考文献 |
（8）基于CRISPR技术的乙肝病毒DNA及YMDD耐药突变高灵敏检测技术研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 一、研发针对乙肝病毒DNA的高灵敏检测技术对乙肝的防治至关重要 |
| 1.1 乙肝的流行概况 |
| 1.2 高灵敏HBV DNA检测的临床意义 |
| 1.3 现有HBV DNA检测技术仍存在诸多不足 |
| 二、研发针对乙肝病毒耐药突变的早期检测技术是实现精准治疗的关键 |
| 2.1 乙肝病毒耐药概述 |
| 2.2 高灵敏检测乙肝耐药突变的重要性 |
| 2.3 现有的乙肝病毒耐药突变检测技术仍存在诸多不足 |
| 三、CRISPR-Cas13a系统可用于核酸的高灵敏、高特异性检测 |
| 3.1 CRISPR-Cas13a系统简介 |
| 3.2 CRISPR-Cas13a系统在核酸检测技术中的应用 |
| 3.3 本文研究 |
| 第一章 基于CRISPR-Cas13a系统的高灵敏度HBV DNA检测方法的建立 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 质粒载体与细胞系 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 Lw Cas13a蛋白的诱导表达 |
| 1.2.2 Lw Cas13a蛋白的纯化 |
| 1.2.3 Lw Cas13a蛋白的Western Blot鉴定 |
| 1.2.4 Lw Cas13a蛋白的活性检测 |
| 1.2.5 基于PCR和 CRISPR的HBV DNA检测方法的建立 |
| 1.2.6 数据分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 Lw Cas13a蛋白电泳鉴定 |
| 1.3.2 Lw Cas13a蛋白的Western Blot检测 |
| 1.3.3 Lw Cas13a蛋白活性检测 |
| 1.3.4 CRSPR-LwCas13a结合PCR的PCR-CRISPR检测方法的建立 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 本章小结 |
| 第二章 基于PCR-CRISPR方法的血清样本HBV DNA的高灵敏检测 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 血清样本 |
| 2.1.2 质粒及引物 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 血清样本核酸提取 |
| 2.2.2 血清样本HBV DNA的PCR-CRISPR检测 |
| 2.2.3 血清样本HBV DNA的qPCR检测 |
| 2.2.4 血清样本HBV DNA的ddPCR检测 |
| 2.2.5 数据分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 临床信息已知的血清样本HBV DNA的检测 |
| 2.3.2 临床信息未知的血清样本HBV DNA的检测及与qPCR的比较 |
| 2.3.3 血清样本HBV DNA的ddPCR验证 |
| 2.3.4 PCR-CRISPR与ddPCR检测HBV DNA的结果比较 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 基于CRISPR-Cas13a系统的乙肝病毒YMDD耐药突变检测方法的建立 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 质粒 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 乙肝病毒YMDD耐药突变检测方法的设计 |
| 3.2.2 YMDD区基因序列分析及耐药突变质粒的构建 |
| 3.2.3 YVDD和YIDD耐药突变crRNA的设计 |
| 3.2.4 YVDD和YIDD耐药突变crRNA的特异性检测 |
| 3.2.5 YMDD耐药突变的灵敏度检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 .YMDD突变区序列的保守性分析 |
| 3.3.2 YVDD和YIDD耐药突变crRNA的设计效果 |
| 3.3.3 YMDD突变检测的灵敏度 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 基于PCR-CRISPR方法的血清样本乙肝病毒YMDD耐药突变的检测 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 血清样本 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 血清样本核酸提取 |
| 4.2.2 直接测序法检测血清样本中的YMDD突变 |
| 4.2.3 qPCR法检测血清样本中的YMDD突变 |
| 4.2.4 PCR-CRISPR检测血清样本中的YMDD突变 |
| 4.2.5 PCR-CRISPR检测血清样本YMDD突变的效果评价 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 血清样本YVDD突变检测 |
| 4.3.2 血清样本YIDD突变检测 |
| 4.3.4 血清样本YMDD突变的测序验证 |
| 4.3.5 PCR-CRISPR检测血清样本YMDD突变的效果评价 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录A HBV DNA靶点序列保守性分析结果 |
| 附录B 280份血清样本基本信息 |
| 附录C 用于突变检测的144份血清样本基本信息 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 主要简历 |
| 致谢 |
（9）应用高灵敏方法评估现行HBV母婴阻断方案研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、现行HBV母婴阻断方案实施后子代乙肝病毒标志物研究 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 对象 |
| 1.1.2 方法 |
| 1.1.3 统计方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 HBsAg阳性母亲所生孩子基本情况 |
| 1.2.2 HBV母婴阻断后孩子乙肝病毒标志物表达变化情况分析 |
| 1.2.3 孩子出生2 天肝功能与性别、母亲HBV DNA、母亲孕期应用LdT的关系 |
| 1.2.4 孩子肾功能与性别、出生2 天肝功能、母亲HBV DNA及其孕期应用LdT的关系 |
| 1.2.5 HBsAg阳性母亲所生孩子性别与乙肝病毒标志物阳性率情况比较 |
| 1.2.6 HBsAg阳性母亲孕期抗病毒治疗与乙肝病毒标志物阳性率变化情况比较 |
| 1.2.7 HBsAg阳性母亲分娩前HBV DNA水平与孩子乙肝病毒志物阳性率变化情况比较 |
| 1.2.8 HBsAg阳性母亲分娩前HBeAg的状态与孩子乙肝病毒志物阳性率变化情况比较 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、现行HBV母婴阻断方案疗效新评估 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 对象 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.3 统计方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 13例 HBsAg 阳性母亲所生孩子基本情况及肝肾功能随访情况 |
| 2.2.2 13 例HBsAg阳性母亲HBV情况和孩子随访及干预情况 |
| 2.2.3 HBsAg阳性母亲所生孩子2 月时乙型肝炎病毒情况 |
| 2.2.4 HBsAg阳性母亲所生孩子7 月时肾功能、乙型肝炎病毒情况 |
| 2.2.5 HBsAg阳性母亲所生孩子12 月时肾功能、乙型肝炎病毒情况 |
| 2.2.6 HBsAg阳性母亲所生孩子24 月时肾功能、乙型肝炎病毒情况 |
| 2.2.7 HBsAg阳性母亲、脐带血及所生孩子血液标本nested PCR结果汇总 |
| 2.2.8 孩子发生OBI的相关因素分析 |
| 2.2.9 补种HepG和 HBIG与 OBI发生的关系 |
| 2.2.10 HBsAg阳性母亲所生孩子行nestedPCR后 HBVDNA阳性率分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 HBV母婴传播导致隐匿性HBV感染的流行病学 |
| 2.3.2 HBV母婴传播导致隐匿性HBV感染的危险因素及应对策略探讨 |
| 2.3.3 检测HBV母婴传播导致隐匿性HBV感染的新方法 |
| 2.3.4 不同血液标本对OBI诊断敏感性比较 |
| 2.3.5 补种HepG和 HBIG与 OBI发生的关系 |
| 2.4 小结 |
| 三、实施HBV母婴阻断后HBsAg阳性母亲随访研究 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 对象 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.3 统计方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 HBsAg阳性母亲基本情况及分娩前后肝功能变化 |
| 3.2.2 HBsAg阳性母亲家族史及分娩前后肝功能变化分组比较 |
| 3.2.3 产后HBsAg阳性母亲发生肝炎发作相关相关性分析 |
| 3.2.4 产后HBsAg阳性母亲HBV DNA反弹情况分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）慢性乙型肝炎患者肝组织HBV cccDNA定量检测及临床应用（论文提纲范文）
| 英文缩略语对照表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 慢性乙型肝炎患者肝组织HBV CCCDNA定量的检测方法 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 慢性乙型肝炎患者肝组织HBV CCCDNA定量检测方法的临床应用 |
| 1.前言 |
| 2.研究对象 |
| 3.实验方法 |
| 4.统计学方法 |
| 5.结果 |
| 6.讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 乙型肝炎病毒CCCDNA的临床应用及研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、荧光定量PCR检测乙型肝炎患者血清中HBV DNA的临床意义（论文参考文献）
- [1]血清HBV RNA在慢性HBV感染者病情评估和耐药监测中的应用[D]. 李茂仕. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [2]血清学标志物检测隐匿性乙型肝炎病毒感染研究价值分析及机制研究[D]. 刘晓红. 锦州医科大学, 2021(01)
- [3]用探针法双重定量PCR同时检测乙型肝炎病毒前基因组RNA和DNA[D]. 徐博文. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(02)
- [4]重组酶介导的等温扩增技术（RAA）检测乙型肝炎病毒方法的建立与评估[D]. 白雪丁. 华北理工大学, 2020(02)
- [5]青藏高原藏族人群乙型肝炎病毒全基因组突变分析及时空动力学研究[D]. 刘贺. 中国疾病预防控制中心, 2020(02)
- [6]Id1通过E2F4实现对HBV转录和复制的抑制作用及其机制研究[D]. 魏杰. 重庆医科大学, 2020(01)
- [7]国产试剂与Roche试剂HBV DNA荧光定量PCR检测方法的精度比较[D]. 巫智勇. 安徽医科大学, 2020(02)
- [8]基于CRISPR技术的乙肝病毒DNA及YMDD耐药突变高灵敏检测技术研究[D]. 王珊. 军事科学院, 2019(09)
- [9]应用高灵敏方法评估现行HBV母婴阻断方案研究[D]. 徐亮. 天津医科大学, 2019(05)
- [10]慢性乙型肝炎患者肝组织HBV cccDNA定量检测及临床应用[D]. 王永力. 华中科技大学, 2019(03)
标签：基因型论文; 实时荧光定量pcr仪论文; 血清蛋白论文; dna提取论文; 重组蛋白论文;