一、抗黄曲霉毒素M_1的单克隆抗体细胞株的建立（论文文献综述）
蒋佳伊[1]（2020）在《黄曲霉毒素B1单克隆抗体的制备及其在中药材污染快速检测中的应用》文中认为中药材以植物性来源为主,在未能及时干燥、储存不当或因其他外界条件影响时,易发生霉变从而污染黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1,AFB1）。其致癌性极强,可引发肝、肾毒性,抑制免疫系统等,对人体健康带来极大损害。因此,为了有效控制中药材AFB1污染,保障中药品质和用药安全性,研究高效灵敏的快速检测方法十分重要。目前传统的用于中药材AFB1的检测方法主要为仪器分析法,包括高效液相以及液质联用等,但其样品前处理繁琐、耗时且操作要求高等,导致在大批量中药材AFB1筛查应用中具有局限性。而基于抗原抗体特异性识别的免疫学检测技术（ELISA、GICA等）具有操作简单、高通量以及可进行现场检测等特点,可作为实验室仪器分析检测技术的有效补充,但是受中药材复杂基质的影响,其在中药检测中需要更高的检测灵敏度和稳定性。基于此,本论文开展了以下研究:获取高灵敏的抗体是免疫学检测技术建立的最重要前提。首先,本研究通过改进的肟化法改造AFB1后,将其与BSA和OVA进行偶联,成功获得AFB1完全抗原,反应无需加热,且未使用苯等有机溶剂,有利于环境保护。此外,采用加大免疫剂量、皮下多点和腹腔注射相结合的方式对Balb/c雌鼠进行免疫,方法中增加了免疫部位,使免疫更加充分,经细胞融合及多次克隆筛选后获得三株稳定的AFB1单克隆细胞株1E5、1E6以及1F7,选择抑制AFB1效果最好的1F7细胞株通过诱生腹水法并纯化以获得大量的AFB1单克隆抗体。该抗体免疫特性鉴定结果显示其属于IgG2b型抗体,灵敏度(IC50)可达0.15μg/L,亲和力常数为2.81×108 L/mol,与AFB2、AFG1、AFG2、AFM1交叉反应率分别为35.07%、8.75%、1.15%、36.75%,且与其他类真菌毒素几乎不存在交叉反应,表明本研究制备的抗体在保证高特异性和高亲和力的同时,具有较高的灵敏度,可用于AFB1快速检测方法开发及生产应用。以高通量快速检测为目的,基于制备得到的AFB1单克隆抗体,以易污染中药材酸枣仁为研究对象,通过系统优化同时结合基质匹配标准曲线以消除基质效应干扰,建立了高灵敏的中药材AFB1的间接竞争酶联免疫分析（Indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）快速检测方法,检测限可达1.69μg/kg,AFB1在0.050.58μg/L范围内线性良好（R2=0.992）,加标回收率为88%119%。采用所建立的方法对33批酸枣仁中AFB1进行了测定,并采用HPLC-MS/MS对检测结果进行了对比和确证,结果显示,ELISA检测结果无假阳性和假阴性,将两种方法所测得的含量数据进行线性拟合,相关系数R为0.996,表明本研究中建立的ic-ELISA方法准确、可靠,可用于实际酸枣仁样品初筛,同时可为其他中药材AFB1的快速筛查提供参考。此外,以现场快速检测为目的,研究中利用制备的AFB1单克隆抗体,开发了两种不同检测形式的胶体纳米金探针的免疫层析试纸条,即以金标抗体是否固定化分为湿法试纸条法（W-GICA）和干法试纸条法（D-GICA）。研究中重点考察了免疫层析试纸条构建过程中的关键参数,包括抗体与胶体金偶联的pH、抗体偶联量以及抗原浓度等条件。经优化后,W-GICA检测AFB1标准溶液的可视检测限为0.25 ng/mL,灵敏度为0.5 ng/mL,而D-GICA的可视检测限只能达到1 ng/mL。因此最终选择更加灵敏简便的W-GICA法,用于中药材中黄曲霉毒素B1的检测。本研究中选取易污染,同时富含色素的酸枣仁为模式研究样品,检验方法的适用性。结果表明,样品仅需经简单提取后进行一步稀释,其可视检测限即可达到5μg/kg,满足现行《中国药典》及欧盟对中药材中AFB1污染限量标准水平的检测需求。33批酸枣仁样品中试纸条测定结果有12批超标,通过HPLC-MS/MS验证结果一致,该方法中有效地避免了很多快检方法中所采用的样品浓缩步骤,同时还可通过对样品提取液稀释以降低基质干扰,可实现中药材在产地初加工、仓储过程中等现场的快速筛选。
唐晓倩[2]（2020）在《农产品典型真菌毒素生物识别材料与快速检测方法研究》文中认为真菌毒素危害大、防控难,威胁农产品质量安全。开展农产品真菌毒素现场快速检测技术研究,及时发现污染,是防止真菌毒素进入食物链的重要手段。目前快检技术主要面临的挑战表现在:部分真菌毒素高亲和力抗体匮乏、多种类风险因子同步检测难、速测产品抗干扰性差。针对上述问题,本学位论文研制出高灵敏高特异性单克隆抗体、纳米抗体,改良了核酸模拟抗体（适配体）等生物识别材料;并基于三种识别材料依次建立了系列真菌毒素快速检测技术,用于粮油、乳品、水果等不同农产品中典型真菌毒素的高灵敏检测。论文最后,系统分析了这三类主要识别材料的应用特性及在快检产品开发中应用前景。具体研究结果如下:（1）研制出伏马毒素B1（FB1）、二乙酰镳草镰刀菌烯醇（DAS）等系列单克隆抗体（mAb）,建立了粮油中FB1灰度成像、真菌毒素与农残同步侧向流层析,及基于新型纳米仿生催化材料的DAS免疫气压传感检测方法。（1）研制出FB1单克隆抗体7A11,半抑制浓度（IC50）为0.66 ng/mL。建立了两类结果输出方式的现场快速检测方法:基于纳米金比色定性方法与灰度成像定量方法,定量线性范围为0.24～15.0 ng/mL。可用于大米、玉米、花生、小麦等农产品中FB1检测,为粮油产品中FB1现场快速筛查提供了经济、快速、可定量的选择方案。（2）研制出甲萘威单克隆抗体1D2与克百威单克隆抗体G11,IC50值分别为0.80 ng/mL和127.6 ng/mL,特异性良好。针对农产品中不同种类小分子污染物并存的现状,以黄曲霉毒素、甲萘威和克百威为例,建立了时间分辨荧光免疫层析（TRFICA）同步快速分析方法。研究表明,该方法对黄曲霉毒素、甲萘威、克百威检测限依次为0.03、0.02、60.2 ng/mL,克服了真菌毒素与农药残留检测方法不同步、灵敏度低的难题。（3）研制出特异性DAS单克隆抗体5E7,亲和力常数Ka值达5.4×108,IC50值为3.08ng/mL;合成并表征了Au@PtNPs纳米颗粒及其与抗体标记探针,由此建立了免疫气压生物传感方法。研究结果表明,该方法检测限达0.46 ng/mL。攻克了DAS识别材料特异性差,缺乏灵敏、准确、便携现场快速筛查方法的技术瓶颈。（2）构建了噬菌体展示纳米抗体文库,研制出黄曲霉毒素M1（AFM1）抗独特型纳米抗体（AIdnb）;将纳米抗体用作替代抗原分别开发了牛奶中AFM1电化学检测方法和多种真菌毒素TRFICA同步检测方法。（1）研制的AFM1抗独特型纳米抗体VHH 4-1-1表征结果显示,其对AFM1的IC50值为8.54 ng/mL;采用重氮盐电接枝方法,将VHH 4-1-1修饰在丝网印刷碳电极表面;再采用计时电流法,建立了基于纳米抗体替代抗原的免疫竞争电化学传感方法。研究结果表明,所建立方法对牛奶中AFM1的检测限为0.18 ng/mL,检测范围为0.25～5.0 ng/mL,特异性良好。为食品安全检测领域提供了新型绿色检测方法。（2）为研究抗独特型纳米抗体在TRFICA上作为无毒替代抗原的可行性,采用黄曲霉毒素B1（AFB1）抗独特型纳米抗体phage 2-5和ZEN抗独特型纳米抗体phage 8#为核心识别材料,分别研究了固定化AIdnb的TRFICA竞争分析模式（AIdnb-TRFICA）和固定化mAb的TRFICA竞争分析模式（mAb-TRFICA）。比对两种竞争分析模式的结果表明,AIdnb-TRFICA的灵敏度较高,检测AFB1、ZEN的IC50值分别为0.46和0.86ng/mL,是mAb-TRFICA的18.3和20.3倍。由此采用AIdnb-TRFICA建立了同步检测方法,对AFB1、ZEN检测限达0.13 ng/mL和0.20 ng/mL。结果表明,建立的AIdnb-TRFICA可用于粮食中多种真菌毒素的同步检测,为绿色无毒现场快速、准确定量检测提供了新方法。（3）改良修饰了展青霉素适配体探针,研究建立了基于适配体的苹果汁中展青霉素侧向流层析快速检测方法。以地高辛标记的展青霉素适配体互补链作为捕获探针,生物素标记的适配体作为识别探针,构建了基于“地高辛抗体-捕获探针-识别探针-纳米金信号因子”复合物侧向流层析检测方法,对展青霉素的检测限达2.3 ng/mL,检测范围为2.7～139.8 ng/mL,具有良好的特异性。检测结果与高效液相比对验证表明,该方法可用于苹果汁中展青霉素的快速检测,克服了缺少展青霉素高亲和识别元件导致的现场高灵敏检测技术缺乏的瓶颈难题。（4）系统分析了上述核酸适配体、单克隆抗体、纳米抗体等真菌毒素主要生物识别材料的特性开发与应用前景。研究比较了本文研制的适配体、单克隆抗体与纳米抗体与已报道同类抗体的灵敏度和特异性,结果表明,伏马毒素7A11为迄今报道灵敏度最高,DAS的5E7特异性最好,AFM1抗独特型纳米抗体为首次报道,为快速检测技术提供了高质量核心生物识别材料。通过比较研究各类识别材料发现:适配体的展青霉素分析方法虽然获得了灵敏、准确的定量检测结果,然而适配体与展青霉素的最佳孵育时间长达40 min,为了实现快速检测,该适配体结构仍需进一步优化以缩短反应时间。因此,在缺乏高亲和力抗体时,适配体可作为识别材料的有效选择。本文研制的FB1、DAS、甲萘威、克百威单克隆抗体具有良好的亲和力与特异性,在纳米金、TRFICA及气压传感器检测方法的建立与应用中均实现了灵敏、准确、快速的定量检测。因此,单克隆抗体仍是目前快速检测技术中识别材料的主流选择。纳米抗体是近年来发展起来的新兴识别材料,本文研制的抗独特型纳米抗体对2C9抗体具有特异性识别作用,经纳米抗体修饰后的丝网印刷碳电极具有出色的稳定性。另外,纳米抗体可吸附在硝酸纤维素膜表面,用作无毒替代抗原,在TRFICA方法建立中获得了较高的检测灵敏度,实现了真菌毒素的无毒快速现场检测。因此,纳米抗体在农产品快速检测应用中,既具备单克隆抗体的高亲和性与特异性,又表现出了适配体的稳定与易于修饰的特性。重要的是纳米抗体可作为替代抗原建立无毒快速检测技术,也是其他识别材料无法替代的独有特性。在未来发展方向中,纳米抗体可通过体外亲和力定向改造与结构功能化进一步提高亲和力,拓展新的检测方法与检测模式,在农产品危害物的快速检测领域将具有更为广阔的应用前景。综上所述,研制的系列单克隆抗体、纳米抗体等生物识别材料解决了农产品快速检测中部分真菌毒素高亲和力抗体匮乏难题,并被成功应用于真菌毒素的生物传感检测方法的构建;建立的真菌毒素与农药残留时间分辨荧光同步检测技术解决了多种类风险因子同步检测难的技术瓶颈;而基于纳米抗体无毒抗原生物传感方法的研究解决了农产品快检方法抗干扰性差的难题。因此,本文研制的基于三种识别材料的真菌毒素生物传感方法为目前农产品中面临的挑战提供了解决方案的方法参考。
任显凤[3]（2020）在《粮油黄曲霉与毒素同步检测及木霉阻控技术研究》文中提出黄曲霉毒素（Aflatoxin）是目前发现毒性最强的一类真菌毒素,能引起肝脏的急性或慢性损害,对人和动物具有严重的致癌、致畸、致突变作用。黄曲霉毒素主要由黄曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（A.parasiticus）代谢产生,在世界范围内广泛污染花生、玉米、小麦、大米、棉花、坚果等农产品,其中以花生和玉米受污染最为严重。在我国黄曲霉污染广泛,而寄生曲霉污染罕见。农产品黄曲霉及其毒素污染不仅会对人、畜的健康构成威胁,还会大大降低农产品的营养价值和经济价值,严重损害经济效益,是农产品质量与安全的重大风险隐患。本文研究建立了粮油类农产品黄曲霉及其毒素快速同步检测和基于木霉菌的高效生物防控技术,对及早发现污染并科学监管,保障粮油质量安全具有重要意义。检测技术是及时发现污染、采取有效防控的“眼睛”,目前已有许多检测农产品中黄曲霉毒素的技术方法,如高效液相色谱分析、酶联免疫吸附分析、免疫传感器分析、免疫层析等,但是多组分同步检测尤其是小分子污染物与食源性微生物同步检测技术相对十分缺乏。生物防控具有环境友好、高效、安全等特点,近年来在食物病原菌及毒素污染防控领域备受青睐。但是,现阶段粮油产品黄曲霉及其毒素污染的生物防控领域仍面临诸多挑战,如缺乏高效的生防菌剂、生防作用机理不明、缺失实践应用等。针对以上问题,本论文作了如下研究,具体研究内容和结论如下:1.建立了RT-PCR同步检测粮油产品中黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮的技术方法。依据免疫反应中纳米抗体V2-5和V8#分别与黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮竞争结合单克隆抗体1C11和2D3的原理;首先,依据编码纳米抗体的特异DNA序列设计引物,实现噬菌体中特异DNA序列扩增;然后,将免疫反应和PCR扩增反应相结合,建立了RT-PCR同步检测黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮的技术。研究结果显示,该方法检测黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮的检测限分别为0.03 ng/mL和0.09 ng/mL,加标回收率分别为80–118%和76.7–111%。最后,该检测技术被成功应用到玉米、大米、小麦、饲料中黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮的同步检测,且样品中毒素的检测结果与高效液相色谱法的检测结果一致。研究结果表明,通过纳米抗体噬菌体建立的两种毒素RT-PCR同步检测技术可为粮油产品污染物同步检测分析提供新的途径。2.创建了RT-PCR同步检测玉米中黄曲霉毒素及其产毒菌的技术方法。黄曲霉毒素属于剧毒、致癌的小分子物质,主要由曲霉属、黄绿组的黄曲霉和寄生曲霉代谢产生。噬菌体V2-5展示的纳米抗体可特异性识别黄曲霉毒素的单克隆抗体1C11,黄曲霉毒素合成关键基因nor-1（aflD）可作为黄曲霉、寄生曲霉的生物标志物,基于RT-PCR中Taqman检测原理并根据噬菌体V2-5和nor-1特异基因序列设计两对特异引物,最终实现黄曲霉毒素及其产毒菌的RT-PCR同步检测。结果显示该方法检测黄曲霉毒素及黄曲霉菌的检测限分别为0.02 ng/mL和8×102孢子/g。进一步用该检测方法检测了25份自然污染的玉米中黄曲霉素及其产毒菌的含量,检测结果与高效液相色谱法和平板计数法的检测结果一致。研究结果表明,以黄曲霉毒素与黄曲霉为例创建的RT-PCR同步检测技术,首次突破了粮油产品中小分子污染物与食源性微生物一直难以同步测定的瓶颈难题。3.筛选了可高效抑制黄曲霉生长和产毒的木霉菌株T60和T44,并初步探明其抑制机理。通过双重培养实验和木霉菌代谢产物的抑菌活性研究,评估了20株不同来源的木霉菌对黄曲霉的拮抗活性及其代谢产物对黄曲霉生长和产毒的抑制效果。首先,双重培养实验的研究结果发现深绿木霉（T.atroviride）T32和T50、哈茨木霉（T.harzianum）ITEM908和T61、多孢木霉（T.polysporum）T60和绿色木霉（T.viride）T62生长迅速,可通过对营养物质的竞争、生存空间的竞争和重寄生作用,完全抑制黄曲霉菌生长。其次,通过木霉菌代谢产物抑菌活性研究发现:CDA（Czapex Dox Agar）培养基培养木霉菌3–5天后,有15株木霉菌分泌到CDA中的代谢产物显着抑制黄曲霉生长,T60分泌的代谢产物可完全抑制黄曲霉生长,抑制率为100%;用花生培养基培养木霉菌株3–5天后,有14株木霉菌分泌到花生培养基中的代谢产物显着抑制黄曲霉产生黄曲霉毒素B1（AFB1）,哈茨木霉（T.harzianum）T44分泌的代谢产物抑制黄曲霉产毒的抑制率高达85±6%。研究结果表明:木霉菌可通过其拮抗活性和其代谢产物的抑菌活性抑制黄曲霉;其中部分木霉菌的代谢产物对黄曲霉具有很强的抑制作用,作为候选生防菌剂具有很高的应用价值。4.筛选出可高效降解黄曲霉毒素的里氏木霉（T.reesei）CGMCC3.5218,初步探明木霉菌降解黄曲霉毒素的作用机制并成功应用到粮油产品中黄曲霉毒素的降解。首先,实验比较了65株木霉菌对液体培养基中AFB1（50 ppb）的降解效果,筛选的CGMCC3.5218在含AFB1的液体培养基生长5天后,对浓度为50 ppb、500 ppb、10 ppm、15 ppm的AFB1的降解率分别为100%、95%、88%和66%;其在含浓度为500 ppb的AFB2、AFG1、AFG2的液体培养基生长7天后,对三种毒素的降解率分别为86%、88%和87%。进一步研究发现:CGMCC3.5218对AFB1的降解主要是细胞外代谢产物的酶促降解作用且活性酶为耐高温的非金属结合蛋白。最后,对CGMCC3.5218降解AFB1的培养条件进行优化,结果显示最适培养温度为28–37℃,培养基最适pH为4.5–8.3,多种含碳氮的培养基均适合做培养基质;在优化的培养条件下,CGMCC3.5218可高效降解花生粕、玉米和饲料中的黄曲霉毒素,可将自然污染的玉米中浓度为1657μg/kg的黄曲霉毒素降至安全水平（20μg/kg）。因此,里氏木霉CGMCC3.5218作为有效降解粮油产品中黄曲霉毒素的生物菌剂具有很高的应用价值。综上,本研究为粮油产品黄曲霉及其毒素污染的及时发现和有效防控提供了新方法,对抑制粮油产品黄曲霉及其毒素污染和保障消费安全具有重要理论意义与实用价值。
李敏[4]（2019）在《黄曲霉毒素M1两种高灵敏度酶免疫检测方法的建立及其双特异性抗体的制备》文中认为本文在对各个反应体系优化的基础上,建立了黄曲霉毒素M1（Aflatoxin M1,AFM1）的两种酶免疫学检测方法,包括联免疫吸附分析法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA）和化学发光酶联免疫吸附分析法（Chemiluminescence immunoassay,CLEIA）并通过免疫亲和柱-高效液相色谱法进行方法学评估。此外,在AFM1单抗的基础上,通过细胞融合法探索制备抗黄曲霉毒素M1（AFM1）/抗辣根过氧化物酶（HRP）的双特异性抗体,以建立基于双特异性抗体的AFM1-ELISA提高AFM1检测方法的灵敏度。1.酶联免疫吸附分析法的建立采用碳二亚胺法将AFM1与载体蛋白BSA偶联,并将偶联产物通过紫外扫描鉴定AFM1与BSA特征吸收峰,成功制备了AFM1-BSA人工抗原;并通过优化ELISA反应体系,确定AFM1抗原包被浓度为0.5μg/mL,抗体工作浓度为1:30000,酶标二抗浓度为1:500,5%脱脂奶为标准品配制液,样品提取物为乙腈,液体乳稀释比为1:1,奶粉稀释比为1:5。建立了AFM1的一步法竞争性ELISA抑制曲线,IC50为0.27ng/mL,该方法的定量检测限为0.043ng/mL,在液态奶、酸酸乳中得到较好的回收率为86.46%120.12%,变异系数为1.42%6.42%。2.化学发光酶联免疫吸附分析法的建立通过对CLEIA反应体系的酶标二抗浓度、离子强度、pH、有机溶剂浓度等的全面优化,建立了AFM1的一步法化学发光酶联免疫分析方法,其IC50为0.08ng/mL,定量检测限可达0.024ng/mL,检测时间仅需30min。并在奶制品中进行不同水平的加标回收进行方法学评价,在液态奶中回收率为81.46%109.08%,变异系数为0.81%7.27%。3.免疫亲和柱-高效液相色谱法的建立及验证通过对AFM1免疫亲和柱上样缓冲液的优化,在国标参数条件下,建立了高效液相色谱AFM1的标准曲线,检测限与定量限分别为0.075ng/mL,0.3ng/mL;在液态奶中加标回收率为87.50%99.85%,变异系数为0.72%12.77%,在奶粉中为78.76%96.14%,变异系数为2.95%7.05%。同时还将建立的ELISA、CLEIA两种方法学与HPLC进行了相关性研究（相关性分别为R2=0.98869、R2=0.99704）,并应用上述三种方法对10份未知奶样品进行了AFM1的含量检测,ELISA、CLEIA检测结果与HPLC检测结果一致,表明建立的方法可用于实际样品中AFM1的快速筛查。4.抗黄曲霉毒素M1/抗辣根过氧化物酶双特异性抗体的制备利用8-氮鸟嘌呤（8-AG）诱导分泌抗AFM1抗体的杂交瘤细胞,获得次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）缺陷细胞系,通过电融合将AFM1缺陷型细胞与HRP免疫的小鼠脾细胞融合。利用间接ELISA与桥联ELISA作为筛选体系对三瘤细胞进行筛选。初筛后得到28株抗HRP的细胞株,经扩大培养获得1株抗AFM1/抗HRP的双阳性细胞株,由于克隆细胞的不稳定性最终克隆化丢失。
许琳[5]（2018）在《农产品真菌毒素DNA诱导组装与多色免疫快速检测方法研究》文中认为真菌毒素是一类由真菌产生的有毒次生代谢产物,可致癌、致畸、致突变。真菌毒素可污染“农田到餐桌”的任一环节,防控难度大。由于我国农业环境气候差异大,真菌毒素混合污染的情况频繁发生,且多毒素联合毒性强,严重威胁人民群众生命健康。现场快速检测技术是农产品真菌毒素全程监管的重要技术手段,现有真菌毒素快速检测ELISA法、试纸条法等需要复杂的分离、洗涤等步骤,且多仅能用于单一毒素的检测,难以满足真菌毒素简便前处理以及混合污染现场同步检测的需求。因此,亟需建立真菌毒素快速简便检测技术。针对以上问题,我们研究建立了三种快速简便的免疫分析方法。主要研究内容和创新点如下:1.研究建立了黄曲霉毒素B1荧光共振能量转移免疫分析方法,无需任何分离步骤,简便、易操作,满足黄曲霉毒素B1快速简便的检测需求。基于荧光共振能量转移、胶体金的荧光猝灭特性以及竞争免疫反应,根据荧光值变化实现黄曲霉毒素B1定量检测。将胶体金作为荧光猝灭基团及抗体标记的支架,根据抗原抗体特异性反应,猝灭抗原上的羧基荧光素。该方法线性范围为10.0-60.0 nmol/L,检测限为8.6 nmol/L。该方法为均质检测,整个检测过程可以在同一个试管中完成,无需任何洗涤、分离,简化了操作步骤,可以广泛应用于黄曲霉毒素B1的现场检测。2.研究建立了黄曲霉毒素B1 DNA诱导组装荧光检测技术,显着降低了荧光背景值,首次实现真菌毒素等小分子DNA诱导组装荧光检测。结合DNA诱导组装技术、胶体金荧光猝灭特性和竞争免疫反应,建立DNA诱导组装荧光检测技术。该研究通过设计识别元件和信号元件,实现了DNA诱导组装技术在真菌毒素等小分子检测中的应用。该方法检测限为2.3 nmol/L,线性范围为5.0-50.0 nmol/L。将该方法应用于大米实际样品中黄曲霉毒素B1的检测,加标回收率为86.2%-101.6%。对荧光基团和猝灭基团之间的距离进行理论估算,结果表明与传统免疫荧光检测相比,该方法大大缩短了两者之间的距离,降低了约38%的荧光背景,提高了灵敏度。3.研究建立了真菌毒素混合污染多色免疫层析同步检测技术,实现三种真菌毒素混合污染的同步检测。研制出能够同时检测三种真菌毒素的多色同步免疫层析试纸条。利用不同颜色的微球标记不同的单克隆抗体,在三条检测线上分别固定黄曲霉毒素B1、T-2和玉米赤霉烯酮抗原,利用竞争免疫反应实现三种毒素的同步检测,其可视检测限分别为1.6、64.2、6.3 nmol/L。三种毒素之间无交叉反应,试纸条特异性好。该方法在玉米和饲料样品中的检测结果与HPLC-MS/MS分析结果具有良好的一致性。该方法仅通过辨别检测线颜色即可实现三种真菌毒素的半定量检测,操作简便、成本低。
蔡霞[6]（2016）在《抗黄曲霉毒素B1单链抗体FR区的构效关系研究》文中进行了进一步梳理真菌毒素（Mycotoxins）是指产毒的真菌污染农作物后,在适宜的温度、湿度环境下生长繁殖产生的一类有毒的次级代谢产物,对人和动物有极大的危害。其中,黄曲霉毒素（Aflatoxins,AFs）为常见的一种真菌毒素,它主要由产毒的黄曲霉（Aspergillus flavus）、寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）和集峰曲霉（Aspergillus nomius）等产生,多污染豆类、干果、花生和玉米等农产品,特别是在热带和亚热带地区。目前已经分离鉴定出来的黄曲霉毒素及其衍生物有20多种,其中黄曲霉毒素B1(AFB1的毒性最强,被世界卫生组织的国际癌症研究机构（IARC）划分为Ⅰ类致癌物质。为了避免AFB1的污染风险,几乎世界上所有的国家和地区都制定了 AFB1的强制限量标准。出于风险防范的目的,检测食品和饲料中AFB1的含量显得尤为重要。目前有许多方法可用于检测AFB1,主要包括薄层色谱法、液相色谱法和免疫学方法等。在这些方法中,免疫学方法由于其特异性强,灵敏度高,快速简便等优点被广泛地用来检测AFB1,但它需要高灵敏度和特异性的抗体。随着分子生物技术的不断发展,重组抗体特别是单链抗体（Single chain Fv antibody fragment,ScFv）由于其易于改造、制备过程较简单和表达量高等优点成为研究热点。然而,单链抗体与其亲本单克隆抗体相比,亲和力较低并且稳定性较差,从而导致在应用上具有局限性。研究抗原抗体间的反应,阐明单链抗体亲和力的影响机制,可为在基因水平上改造单链抗体,进一步提高其亲和力提供理论指导。本课题以实验室前期获得的单链抗体2C10氨基酸序列为基础,通过同源建模方法构建其三维结构模型,并将其与AFB1进行分子对接及对ScFv-2C10的CDR和FR区进行划分,预测ScFv-2C10与AFB1的结合位点,采用定点突变的方法对预测的氨基酸进行单点突变。将原始菌株和突变体均在大肠杆菌（E.coli）BL21（DE3）中诱导表达,并经纯化后,对突变前后单链抗体的亲和力进行分析。主要结果如下:1抗AFB1单链抗体的同源建模及分子对接以课题组获得的单链抗体（ScFv-2C10）VH和VL氨基酸序列为基础,采用同源建模的方法,通过目标序列同源建模模板的搜寻、目标序列与同源模板的多重序列比对、同源模型的构建和模型的评估、优化,得到一个比较合理的ScFv-2C10三维结构模型。为了探讨抗原抗体结合反应过程中起关键作用的氨基酸位点,将同源模型ScFv-2C10与AFB1进行分子对接,发现ScFv-2C10中氨基酸残基Arg-67、Asn-87和Lys-237与AFB!形成了氢键。随后将ScFv-2C10的CDR和FR区进行划分,重链及轻链均含有3个CDR区和4个FR区。基于以上研究,我们选择了 Arg-67、Asn-87、Lys-237以及重链和轻链CDR3区的极性氨基酸作为下一步研究的关键氨基酸。2抗AFB1单链抗体2C10突变体的构建针对预测的关键氨基酸残基,采用定点突变方法进行单点突变,将这些极性氨基酸突变为与其结构相似的非极性氨基酸。以课题组构建的pET-30a-pelB-ScFv-VH-linker-VL-2C10重组质粒为原材料,分别设计一对完全匹配的反向互补的、含突变的引物进行PCR扩增,获得含有突变位点的重组质粒。采用DpnⅠ限制性内切酶酶切PCR产物,将原始DNA质粒模板降解。将降解后的PCR产物转入E.coli trans5α感受态细胞,于LB/Kan固体平板过夜培养,经菌落PCR验证后送去测序。测序结果表明,成功获得14个突变体。3抗AFB1 ScFvs在E.coli BL21（DE3）的表达与性质分析将原始菌株及突变体均转入.coli BL21（DE3）感受态细胞中进行目的蛋白的诱导表达。目的蛋白经纯化后,采用考马斯亮蓝法对抗AFB1 ScFvs表达量进行定量分析,SDS-PAGE对抗AFB1 ScFvs进行表达分析,ELISA对抗AFB1 ScFvs的性质进行分析。结果表明ScFvs均在E.coli BL21（DE3）中成功表达,并以有活性的可溶性蛋白的表达形式存在。用ELISA对蛋白活性进行分析,突变体R67L的亲和常数较原始株提高约3倍,灵敏度较原始株提高约1倍。
孙清[7]（2017）在《食品及饲料中黄曲霉毒素的快速免疫检测试剂盒研究》文中研究说明黄曲霉毒素是一类由黄曲霉菌和寄生曲霉菌产生的有毒代谢产物,这类毒素毒性大,致癌能力强,理化性质稳定,污染广泛,即使是在现有先进的农业技术和食品加工工艺的条件下,仍然无法完全避免和消除黄曲霉毒素污染。农产品黄曲霉毒素污染已成为严重威胁我国大众健康的重大风险隐患,并且已经给我国经济造成了巨大的损失。因此,研究建立灵敏、准确、快速、便捷的黄曲霉毒素检测产品,为食品安全控制提供关键技术支持,具有广阔的应用前景和重要的现实意义。目前已有的黄曲霉毒素的仪器分析方法专业性要求高、时间长、设备昂贵,严重影响了黄曲霉毒素污染监测工作的开展。酶联免疫试剂盒和免疫检测试纸条由于具有使用方便、不需要昂贵设备、成本低廉的特点而在实际应用中受到广泛欢迎,但是目前现有产品的使用方便性、灵敏度等无法完全满足市场日益严格的要求。随着人们对食品安全要求的日益提高,研发灵敏度高、准确性好、简单易操作的黄曲霉毒素免疫快速检测技术和产品,对于保障农产品和食品安全、促进农业产业发展、破解贸易技术壁垒均具有重要的意义。本研究针对以上问题,研制出了针对黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1, AFB1）、黄曲霉毒素M1（Aflatoxin M1,AFM1）的单克隆抗体,并以此为基础,建立了针对食品、饲料及乳制品中黄曲霉毒素的快速检测方法,研制了配套的黄曲霉毒素酶联免疫试剂盒和免疫检测试纸条,为黄曲霉毒素污染的监控提供了灵敏、准确、简单、易操作、快速的检测手段。本文的主要研究内容和创新点如下：1.合成了AFB1-BSA完全抗原,抗原中AFB1与BSA分子的偶联比为14.5：1。利用抗原研制成功了可分泌抗AFB1特异性抗体的细胞株2A4。抗体的亲和常数高达7.9×109L/mol,并且2A4分泌的是针对AFB1的特异性抗体,与国内外所报道的抗AFB1的单克隆抗体进行了比较,该抗体灵敏度高、特异性好。2.通过优化包被缓冲体系、反应pH值、AFB1单克隆抗体包被浓度等试剂盒参数,研制成功了高灵敏度AFB1 ELISA检测试剂盒,该试剂盒的最低检测限(IC10)为7.6 pg/mL,IC50为66 pg/mL,线性范围为10～810 pg/mL,灵敏度与文献报道相比,具有显着提升。利用试剂盒对多种样品进行了加标回收实验,玉米、豆粕及鱼粉的AFB1添加回收率在108.4%～134.8%之间,批内相对标准偏差≤12.8%,批间相对标准偏差≤11.6%。试剂盒检测结果与HPLC-MS/MS结果相符。该试剂盒可以用于对粮食或饲料样品中黄曲霉毒素B1残留的检测。3.通过优化ELISA的反应模式、抗原抗体用量、样品提取液等试剂盒参数,研制成功了能检测婴幼儿食品中AFB1的高灵敏度ELISA试剂盒,该试剂盒的最低检测限(IC10)为5.5 pg/mL, IC50为24.0 pg/mL,线性范围为5～100 pg/mL。利用该试剂盒对多种婴幼儿辅助性食品进行了加标回收实验,婴幼儿营养米粉、豆粉及豆面的AFB1添加回收率在84.1%～95.2%之间,批内相对标准偏差≤9.3%,批间相对标准偏差≤7.4%。该试剂盒对实际样品中AFB,的检测能力不仅满足国内限量标准要求,同时也能满足更严格的欧盟限量要求。4.传统植物油中黄曲霉毒素B1的检测必须经过萃取、净化等样品前处理过程,操作复杂且需要消耗大量有机溶剂。本文建立了一种可直接检测油中AFB1的“绿色”免疫层析方法。以免疫层析试纸条为基础,按一定比例混合植物油和纯净水,然后用检测卡进行检测,就可以方便的通过肉眼确认油中的AFB1含量。使用该方法检测植物油中AFB1的含量,最低检测限可达1.5 μg/kg,并且通过改变水油比就可符合不同的AFB1限量标准。通过与国家标准方法进行比较,验证了方法的准确性。与此同时,因为方法操作简单,不需要有机溶剂,即使没有经过专业训练的人也能操作。因此,该方法不仅可用于实验室中AFB1检测也可用于家庭中植物油安全检测,具有广阔的应用前景。5.通过合成AFM1-BSA完全抗原并免疫小鼠,获得一株可分泌抗AFM1抗体的细胞株2F12。抗体的亲和常数高达1.8×109L/mol,与AFB1交叉率为40%。通过优化抗体包被浓度、酶标抗原浓度、标准品稀释液等试剂盒参数,研制成功了能同时检测液态奶、酸奶和奶粉中AFM1和AFB1总量的ELISA试剂盒,该试剂盒的最低检测限(IC10)为37pg/mL,IC50为211 pg/mL,线性范围为50～1500 pg/mL,对AFM1和AFB1的交叉反应率分别为100%和102%,对其它黄曲霉毒素的交叉反应率小于20%。利用建立的试剂盒对多种样品进行了加标回收实验,回收率在87.9%～109.1%之间,批内相对标准偏差在3.9%～10.8%之间,批间相对标准偏差≤11.1%。多次对比试验表明,试剂盒的检测结果与进口试剂盒相当。
王勇[8]（2016）在《黄曲霉毒素M1单克隆抗体的制备及其免疫学特性研究》文中指出本研究通过琥珀酰亚胺法利用经典杂交瘤技术建立抗AFM1单克隆抗体（m Ab）杂交瘤细胞株。高特异性的黄曲霉毒素M1m Ab的制备,为利用其建立敏感、快速和标准化的ELISA检测方法奠定了基础。
雷佳文[9]（2015）在《农产品中黄曲霉毒素新型免疫分析技术研究》文中研究表明黄曲霉毒素（Aflatoxin,AFT）是主要由黄曲霉和寄生曲霉产生,自然分布极为广泛的一类毒性超强的化合物,也是目前公认的最强的致癌物质,世界卫生组织（WHO）的癌症研究机构（IARC）于1993年将黄曲霉毒素划分为Ⅰ类致癌物。受黄曲霉毒素污染的农产品严重威胁消费者身体健康与生命安全。因此,开发针对这类致癌物的检测技术,为农产品和食品安全提供技术保障就变得十分重要。近几十年来,多种黄曲霉毒素的检测技术被开发出来,其中有HPLC,LC-MS/MS,以及免疫分析法等等。在这些方法中,免疫分析方法因为具有灵敏度高,特异性强,检测成本低廉等优点而成为检测领域的一个新兴热点研究方向。近些年来,本实验室先后成功开发了黄曲霉毒素荧光增强免疫亲和检测技术、黄曲霉毒素纳米金免疫层析检测技术和黄曲霉毒素铕时间分辨荧光免疫层析检测技术,并在农产品和食品等检测领域得到了广泛应用。随着技术的革新与进步,一些新的免疫分析技术也被不断开发出来。比如非标记免疫分析技术,只需要一步反应就可以完成检测,是一种直接、省时的检测方法;又比如免疫PCR技术,它是一种新型的免疫检测技术,能将ELISA的诸多优点与PCR扩增技术相结合,有着更高的灵敏度与更宽的线性范围;还有环介导的等温扩增技术,它是最近几年才被开发出来的新型的核酸扩增技术,比传统的PCR更灵敏,扩增效率更高,并且不需要特殊的仪器设备。本研究以实验室已经研制的抗黄曲霉单克隆抗体1C11以及抗独特型纳米抗体噬菌体V2-5为基础,建立了三种新型的免疫分析方法,为农产品中黄曲霉毒素的检测带来了新的思路与技术平台。本研究的主要内容与创新点如下:1.首次发现了黄曲霉毒素荧光免疫淬灭现象,并据此研究建立了基于抗体诱导荧光淬灭效应的黄曲霉毒素非标记免疫分析技术,该方法快捷,简单,成本低廉,只需要一步反应便可完成检测,有着十分广阔的应用前景。基于特异性免疫结合反应诱导的荧光淬灭效应,我们建立了一种简单,直接,非标记的免疫分析方法。作为模型分析物的AFB1,其内荧光能够被特异性的抗AFB1单克隆抗体淬灭,这种荧光淬灭效应被用来定量检测AFB1。AFB1的荧光值先被2,6-二甲基-β-环糊精增强,然后抗AFB1抗体1C11被加入到混合物里面,进行免疫反应。荧光扫描结果表明,在10%的甲醇水溶液中,与1C11反应完毕后,AFB1的荧光值明显地下降了。在最优参数的基础上,这种直接非标记的免疫分析技术被用来定量检测AFB1。我们建立了淬灭标准曲线,标准曲线有着很好的线性与相关性,R2=0.9998,线性范围为1-20 ng/m L,检测限为0.35ng/m L。本方法与HPLC进行了对比,结果表明本方法的回收率与HPLC的回收率相符,说明本方法能够应用于花生样品中AFB1的检测。综上,这种基于荧光淬灭效应的非标记免疫分析技术,可以被广泛应用于AFB1及其他有内荧光的物质的免疫检测。与传统的免疫分析方法相比,本方法十分简便并且省时;另外,本方法由于不需要剧毒的抗原,因此对环境十分友好,可以减少对操作人员健康的影响,并且节省检测成本。2.首次建立了基于荧光定量PCR的黄曲霉毒素免疫分析技术,并应用于花生、大米、玉米、饲料样品的实际检测,将原方法的灵敏度提升了4倍,给黄曲霉毒素的检测带来新的思路和发展方向。本研究利用抗黄曲霉毒素独特型纳米抗体噬菌体,设计了针对其编码纳米抗体基因序列的特异性引物,建立了基于荧光定量PCR的黄曲霉毒素免疫分析技术。这种新型的免疫分析技术能够把ELISA的诸多优点与PCR扩增技术整合起来。本方法的检测限为0.02 ng/m L,相比传统的噬菌体ELISA而言,灵敏度提升了4倍,另外,本方法的线性范围也更宽。本方法成功地应用到了花生、大米、玉米、饲料这四种黄曲霉毒素主要污染样品的检测中,添加回收率为77.05-122.16%。为了进一步验证本方法,将检测结果与HPLC方法进行了对比,在玉米和花生样品中,两种方法的相关性为0.991,说明两种方法有着很好的一致性。本研究表明,抗独特型纳米抗体噬菌体可以用来建立针对小分子污染物的高灵度荧光定量PCR检测技术,这也是荧光定量PCR方法首次应用于农产品中黄曲霉毒素的免疫检测。另外,基于重组噬菌体的这种独特的生物学特性,可以通过它建立农产品中多种真菌毒素的同步检测技术。3.建立了以环介导等温扩增技术为基础的黄曲霉毒素免疫分析方法,并应用于花生样品中黄曲霉毒素的检测,该方法简单、快捷、灵敏、经济且不需要大型仪器辅助,为黄曲霉毒素的现场快速检测提供了新的选择方案。基于抗体1C11与纳米抗体噬菌体V2-5,我们建立了基于环介导等温扩增（LAMP）的黄曲霉毒素免疫检测技术。LAMP反应在0.2 m L的PCR管中进行,反应体系由以下几种成份组成:d NTPs,甜碱,Mg SO4,p H8.8 Tris-HCl,KCl,（NH4）2SO4,Tween-20,DNA模版,四种特异引物（B3,F3,FIP,BIP）以及Bst DNA聚合酶。反应流程是将PCR管置于63 oC的恒温水浴锅中40min,然后于95 oC恒温2 min,使酶失活以终止反应。该方法用于检测黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的检测限分别为:0.1 ng/m L、0.1 ng/m L、0.2 ng/m L、1 ng/m L。免疫LAMP技术原理是将竞争的免疫反应与LAMP方法相结合,该方法的检测结果可以直接用肉眼判定,当指示剂颜色为紫罗兰时,为阳性结果,当指示剂为天蓝色时,为阴性结果。以花生样品为代表,将免疫LAMP方法与HPLC进行了对比,两种方法的结果一致。综上可知,免疫LAMP方法不需要大型仪器辅助,是一种简单、快捷、灵敏且经济的检测方法,并可以应用于农产品中黄曲霉毒素的免疫检测。
张勋[10]（2014）在《真菌毒素类高灵敏高通量快速检测方法研究》文中认为真菌毒素是一些真菌在生长过程中产生的致病性、致死性的次级代谢产物，在粮食生产、贮存、加工和流通环节都有可能因为保存条件不当污染真菌造成污染。由于大多数真菌素素的毒性剧烈，并具有致癌、致畸和致突变的“三致”作用，因此各种检测方法被开发用于检测粮食谷物中的各种真菌毒素。免疫分析法具有高灵敏、快速、高通量、多残留和现场检测的优势，现已发展成为真菌毒素检测快速筛查和检测的重要手段之一。本课题采用免疫学原理，将真菌毒素半抗原偶联到蛋白载体，通过免疫和细胞筛选，制备了特异性单克隆抗体的基础上，建立起黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素M1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇和T-2毒素六种物质的快速检测方法，主要研究内容如下：（1）将真菌毒素分子衍生后制备的半抗原，通过紫外、质谱等进行鉴定后，通过活性酯法或者CDI法与载体蛋白（血蓝蛋白、牛血清白蛋白和卵清蛋白）偶联，制备了六种真菌毒素半抗原的完全抗原；通过免疫BALB/c小鼠、细胞融合和亚克隆，总共获得8株针对六种真菌毒素特异性或群选型单克隆抗体。（2）对筛选得到的8株单克隆抗体的性质进行了鉴定，其亲和常数分别为黄曲霉毒素B14.2×109L/mol（11A9）和2.29×109L/mol（5C3）；黄曲霉毒素M11.28×109L/mol（G3D9）和2.29×109L/mol（H1）；赭曲霉毒素A1.09×109L/mol；玉米赤霉烯酮2.26×109L/mol；脱氧雪腐镰刀菌烯醇1.6×108L/mol；T-2毒素1.35×108L/mol。并测定了其抗体亚型和交叉反应率。（3）试验优化了包被抗原和一抗使用浓度、标准品稀释液的缓冲液的pH、离子强度、甲醇含量、一抗和二抗的反应时间、显色时间等ELISA条件。在最适ELISA条件下，测得抗体的IC50分别为：黄曲霉毒素B10.043±0.003ng/mL（11A9）和0.025±0.005ng/mL（5C3）；黄曲霉毒素M10.032±0.006ng/mL（G3D9）和0.035±0.005ng/mL（H1）；赭曲霉毒素A0.092±0.006ng/mL；玉米赤霉烯酮0.054±0.004ng/mL；脱氧雪腐镰刀菌烯醇31.60±2.89ng/mL；T-2毒素0.431±0.019ng/mL。（4）在建立的8株单克隆抗体细胞株基础上，建立了六种真菌毒素的ELISA，并通过添加回收对方法进行了验证，其回收率均在80%～120%之间，批内批间差异均小于20%。（5）通过优化酶解条件，制备了AFB1单抗的F（ab’）2片段，通过免疫兔子，制备得到AFB1的抗独特型抗体，并对其进行了鉴定。用来开发黄曲霉毒素无毒试剂盒；通过实际样品添加回收试验，其回收率在110%～130%之间，批内批间变异系数均小于10%。（6）制备了可用于快速现场检测的AFB1、AFM1、OTA、ZEN、DON和T-2生物毒素胶体金快速检测试纸条，其检测限LOD分别为0.2、0.1、0.2、1、50和5ng/mL，cut-off值分别为0.5、0.2、1.0、2.0、100和10ng/mL。（7）制备了可以同时检测4种真菌毒素（ZEN、T-2、AFB1和OTA）的试纸条，其LOD分别为2、16、1和2ng/mL，cut-off值分别为为4、32、2和4ng/mL。
二、抗黄曲霉毒素M_1的单克隆抗体细胞株的建立（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、抗黄曲霉毒素M_1的单克隆抗体细胞株的建立（论文提纲范文）
（1）黄曲霉毒素B1单克隆抗体的制备及其在中药材污染快速检测中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 黄曲霉毒素B_1概述 |
| 1.1.1 黄曲霉毒素的理化性质 |
| 1.1.2 黄曲霉毒素的危害性 |
| 1.1.3 黄曲霉毒素的限量标准 |
| 1.2 中药材中黄曲霉毒素B_1污染情况 |
| 1.2.1 国外污染情况 |
| 1.2.2 国内污染情况 |
| 1.3 黄曲霉毒素的检测方法 |
| 1.3.1 确证方法 |
| 1.3.1.1 薄层色谱法 |
| 1.3.1.2 高效液相色谱法 |
| 1.3.1.3 高效液相色谱-串联质谱法 |
| 1.3.2 免疫学检测技术 |
| 1.3.2.1 酶联免疫吸附法 |
| 1.3.2.2 胶体金免疫层析法 |
| 1.3.2.3 免疫传感器 |
| 1.3.2.4 其他检测方法 |
| 1.4 黄曲霉毒素B_1 抗原的设计 |
| 1.4.1 肟化法 |
| 1.4.2 半缩醛法 |
| 1.4.3 添加乙醇酸连接臂法 |
| 1.4.4 曼尼希法 |
| 1.5 本课题的研究目的及研究内容 |
| 第二章 黄曲霉毒素B_1单克隆抗体的制备 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 仪器、材料与试剂 |
| 2.2.1 仪器与材料 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 实验动物 |
| 2.2.4 溶液的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 AFB_1 完全抗原的制备 |
| 2.3.1.1 肟化法 |
| 2.3.1.2 半缩醛法 |
| 2.3.1.3 添加乙醇酸连接臂法 |
| 2.3.2 抗原的乳化及免疫 |
| 2.3.3 小鼠多抗血清效价的测定 |
| 2.3.4 细胞融合 |
| 2.3.4.1 饲养细胞的获取 |
| 2.3.4.2 脾细胞的获取 |
| 2.3.5 杂交瘤细胞的筛选 |
| 2.3.6 阳性杂交瘤细胞的克隆 |
| 2.3.7 单克隆抗体的制备 |
| 2.3.8 单克隆抗体性质的鉴定 |
| 2.3.8.1 抗体效价的测定 |
| 2.3.8.2 抗体灵敏度的测定 |
| 2.3.8.3 抗体亲和力常数的测定 |
| 2.3.8.4 抗体特异性的测定 |
| 2.3.8.5 抗体亚型的测定 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 AFB_1 完全抗原的鉴定 |
| 2.4.1.1 AFB_1 肟化物的鉴定 |
| 2.4.1.2 AFB_1 完全抗原UV鉴定 |
| 2.4.2 小鼠多抗血清效价的测定 |
| 2.4.3 杂交瘤细胞的筛选 |
| 2.4.4 阳性杂交瘤细胞的筛选及腹水纯化 |
| 2.4.5 单克隆抗体性质鉴定 |
| 2.4.5.1 抗体灵敏度的测定 |
| 2.4.5.2 抗体亲和力的测定 |
| 2.4.5.3 抗体特异性的测定 |
| 2.4.5.4 抗体亚型的测定 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 ELISA方法的建立及其在中药材酸枣仁黄曲霉毒素B_1 污染检测中的应用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 仪器、材料与试剂 |
| 3.2.1 仪器与材料 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 溶液的配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 最佳抗原及抗体稀释度的确定 |
| 3.3.2 抗原包被方式的选择 |
| 3.3.3 封闭液的选择 |
| 3.3.4 封闭时间的选择 |
| 3.3.5 酶标二抗最佳使用浓度的确定 |
| 3.3.6 酶标二抗最佳孵育时间的确定 |
| 3.3.7 最佳ic-ELISA方法流程的确定 |
| 3.3.8 样品测定 |
| 3.3.8.1 样品处理 |
| 3.3.8.2 基质效应的考察 |
| 3.3.8.3 样品加标回收试验 |
| 3.3.8.4 实际样品的检测 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 最佳抗原及抗体稀释度的确定 |
| 3.4.2 抗原包被方式的选择 |
| 3.4.3 封闭液的选择 |
| 3.4.4 封闭时间的选择 |
| 3.4.5 酶标二抗最佳使用浓度的确定 |
| 3.4.6 酶标二抗最佳孵育时间的确定 |
| 3.4.7 最佳ic-ELISA方法流程的确定 |
| 3.4.8 样品测定 |
| 3.4.8.1 基质效应的考察 |
| 3.4.8.2 基质匹配标准曲线的建立 |
| 3.4.8.3 加标回收率考察 |
| 3.4.8.4 精密度考察 |
| 3.4.8.5 实际样品检测及HPLC-MS/MS验证 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 胶体金免疫层析法的建立及其在中药材酸枣仁黄曲霉毒素B_1污染中的应用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 仪器、材料与试剂 |
| 4.2.1 仪器与试剂 |
| 4.2.2 实验试剂 |
| 4.2.3 溶液的配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 AFB_1 完全抗原的制备 |
| 4.3.2 胶体纳米金的制备 |
| 4.3.3 金标抗体的制备 |
| 4.3.3.1 最佳pH条件的确定 |
| 4.3.3.2 最佳抗体偶联量的确定 |
| 4.3.3.3 金标抗体重悬液的确定 |
| 4.3.3.4 金标抗体制备的流程 |
| 4.3.4 试纸条的组装 |
| 4.3.5 最佳抗原量的确定 |
| 4.3.6 抗原及二抗稀释液的确定 |
| 4.3.7 试纸条的测试 |
| 4.3.8 实际样品的测定 |
| 4.3.8.1 样品处理 |
| 4.3.8.2 样品稀释液的确定 |
| 4.3.8.3 样品加标回收试验 |
| 4.3.8.4 样品检测 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 AFB_1 完全抗原的鉴定 |
| 4.4.2 金标抗体的制备 |
| 4.4.2.1 最佳pH条件的确定 |
| 4.4.2.2 最佳抗体偶联量的确定 |
| 4.4.2.3 金标抗体重悬液的确定 |
| 4.4.3 最佳抗原量的确定 |
| 4.4.4 抗原及二抗稀释液的确定 |
| 4.4.5 试纸条的可视检测限及灵敏度的测试 |
| 4.4.6 试纸条的特异性检测 |
| 4.4.7 实际样品的测定 |
| 4.4.7.1 样品稀释液的确定 |
| 4.4.7.2 样品加标回收试验 |
| 4.4.7.3 样品检测 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 全文总结与展望 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 工作展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文及其他科研成果 |
（2）农产品典型真菌毒素生物识别材料与快速检测方法研究（论文提纲范文）
| 附件 |
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 食品中真菌毒素研究现状 |
| 1.1.1 毒性 |
| 1.1.2 限量 |
| 1.1.3 常规检测方法 |
| 1.2 真菌毒素生物传感分析技术及研究进展 |
| 1.2.1 识别元件 |
| 1.2.2 纳米材料与纳米结构用于信号响应及信号放大 |
| 1.2.3 真菌毒素的生物传感检测方法 |
| 1.3 本研究的目的和意义 |
| 1.4 本课题的主要研究内容 |
| 1.5 本课题的技术路线 |
| 第二章 基于单抗的光学与气压生物传感方法研究 |
| 第一节 伏马毒素单克隆抗体研制与灰度成像快速检测技术研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 实验仪器及耗材 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 融合用细胞、实验动物及器材 |
| 2.2.4 主要溶液与培养基的配制 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 伏马毒素B_1完全抗原的合成 |
| 2.3.2 伏马毒素B_1的动物免疫与杂交瘤细胞的制备 |
| 2.3.3 伏马毒素B_1抗原免疫效果评价 |
| 2.3.4 伏马毒素B_1阳性杂交瘤筛选方法 |
| 2.3.5 伏马毒素B_1抗体的生产 |
| 2.3.6 伏马毒素B_1抗体的特异性鉴定 |
| 2.3.7 伏马毒素B_1的酶联免疫吸附方法的建立 |
| 2.3.8 伏马毒素B_1的酶联免疫方法标准曲线的建立 |
| 2.3.9 纳米金探针的制备 |
| 2.3.10 伏马毒素B_1灰度成像纳米金试纸条的原理 |
| 2.3.11 灰度成像纳米金试纸条标准曲线的建立 |
| 2.3.12 灰度成像纳米金试纸条的检测 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 伏马毒素B_1抗原的免疫学鉴定 |
| 2.4.2 伏马毒素B_1杂交瘤细胞的筛选结果 |
| 2.4.3 伏马毒素B_1单克隆抗体7A11的特异性鉴定 |
| 2.4.4 伏马毒素B_1的ic ELISA条件的优化 |
| 2.4.5 伏马毒素B_1灰度成像方法的建立 |
| 2.4.6 伏马毒素B_1灰度成像方法与ic ELISA方法评价 |
| 第二节 基于单抗的真菌毒素与其他危害物同步检测技术研究 |
| 2.5 引言 |
| 2.6 材料 |
| 2.6.1 实验仪器及耗材 |
| 2.6.2 主要试剂及溶液 |
| 2.6.3 融合用细胞、实验动物及器材 |
| 2.6.4 主要溶液与培养基的配制 |
| 2.7 方法 |
| 2.7.1 甲萘威、克百威杂交瘤细胞制备 |
| 2.7.2 甲萘威、克百威阳性杂交瘤筛选 |
| 2.7.3 甲萘威、克百威单抗制备与纯化 |
| 2.7.4 Eu/Tb(Ⅲ)标记探针的制备 |
| 2.7.5 时间分辨荧光免疫纸层析同步传感方法建立 |
| 2.7.6 时间分辨荧光免疫纸层析同步传感方法原理 |
| 2.7.7 时间分辨荧光免疫纸层析同步传感方法评价 |
| 2.8 结果 |
| 2.8.1 甲萘威、克百威杂交瘤筛选结果 |
| 2.8.2 甲萘威、克百威单克隆抗体特性表征 |
| 2.8.3 Eu/Tb(Ⅲ)纳米探针的表征 |
| 2.8.4 样品前处理方法 |
| 2.8.5 时间分辨荧光免疫纸层析同步传感方法的优化 |
| 2.8.6 时间分辨荧光免疫纸层析同步传感方法特异性评价 |
| 2.8.7 时间分辨荧光免疫纸层析同步传感方法定量曲线 |
| 2.8.8 时间分辨荧光免疫纸层析同步传感方法回收率和实际样品检测 |
| 第三节 二乙酰镳草镰刀菌烯醇单克隆抗体研制与气压法免疫传感方法研究 |
| 2.9 引言 |
| 2.10 材料 |
| 2.10.1 实验仪器及耗材 |
| 2.10.2 实验试剂 |
| 2.10.3 融合用细胞、实验动物及器材 |
| 2.10.4 主要溶液与培养基的配制 |
| 2.11 方法 |
| 2.11.1 二乙酰镳草镰刀菌烯醇完全抗原的合成 |
| 2.11.2 二乙酰镳草镰刀菌烯醇动物免疫与杂交瘤细胞的制备 |
| 2.11.3 二乙酰镳草镰刀菌烯醇阳性杂交瘤细胞的筛选 |
| 2.11.4 二乙酰镳草镰刀菌烯醇单抗制备与纯化 |
| 2.11.5 铂金纳米仿生催化材料与识别探针的合成 |
| 2.11.6 气压免疫传感器的构建 |
| 2.11.7 气压免疫传感检测体系的优化 |
| 2.11.8 小麦样品的前处理 |
| 2.11.9 免疫气压法实际样品应用 |
| 2.11.10 高效液相色谱质谱联用法检测二乙酰镳草镰刀菌烯醇 |
| 2.12 结果 |
| 2.12.1 二乙酰镳草镰刀菌烯醇免疫效果与杂交瘤细胞研制 |
| 2.12.2 铂金纳米仿生催化材料与识别探针的鉴定 |
| 2.12.3 电化学方法对铂金纳米仿生催化材料催化活性的鉴定 |
| 2.12.4 铂金纳米催化材料探针标记条件的优化 |
| 2.12.5 免疫气压传感检测原理 |
| 2.12.6 免疫气压传感检测条件优化 |
| 2.12.7 免疫气压传感特异性 |
| 2.12.8 免疫气压传感回收率测定 |
| 2.12.9 免疫气压传感的应用 |
| 2.13 讨论 |
| 2.13.1 伏马毒素B_1与二乙酰镳草镰刀菌烯醇两种毒素半抗原设计与合成 |
| 2.13.2 真菌毒素单克隆抗体的研制 |
| 2.13.3 灰度成像纳米金免疫层析技术 |
| 2.13.4 气压免疫传感器的设计与条件优化 |
| 2.14 小结 |
| 第三章 基于纳米抗体无毒替代抗原传感分析方法研究 |
| 第一节 黄曲霉毒素M_1纳米抗体研制与丝网印刷电化学传感方法研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 实验仪器及耗材 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 实验溶液 |
| 3.2.4 引物 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 免疫羊驼与血清效价测定 |
| 3.3.2 总RNA的提取 |
| 3.3.3 cDNA第一链合成 |
| 3.3.4 重链可变区基因片段扩增 |
| 3.3.5 纳米抗体基因与pComb3X质粒的酶切与连接 |
| 3.3.6 重组的噬菌粒电转 |
| 3.3.7 纳米抗体文库的库容量与多样性鉴定 |
| 3.3.8 噬菌体展示文库的构建与滴度测定 |
| 3.3.9 噬菌体展示纳米抗体文库的构建 |
| 3.3.10 阳性纳米抗体竞争筛选和富集 |
| 3.3.11 阳性纳米抗体的鉴定 |
| 3.3.12 纳米抗体的表达与纯化 |
| 3.3.13 纳米抗体的特性鉴定 |
| 3.3.14 黄曲霉毒素M_1免疫传感器的构建 |
| 3.3.15 工作电极修饰的表征方法 |
| 3.3.16 无毒替代抗原免疫传感方法条件优化 |
| 3.3.17 免疫传感标准曲线与加标回收 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 羊驼血总RNA的提取与重链基因扩增 |
| 3.4.2 纳米抗体片段和载体pComb3X酶切鉴定 |
| 3.4.3 噬菌体纳米抗体文库的多样性鉴定 |
| 3.4.4 阳性噬菌体的筛选 |
| 3.4.5 阳性噬菌体的鉴定 |
| 3.4.6 纳米抗体VHH4-1-1和VHH2-3-1 的表达 |
| 3.4.7 纳米抗体VHH4-1-1和VHH2-3-1 特异性测定 |
| 3.4.8 丝网印刷碳电极检测原理 |
| 3.4.9 工作电极的修饰与电极表征 |
| 3.4.10 免疫电极的制备及工作条件优化 |
| 3.4.11 电化学传感器特异性、稳定性与准确度评价 |
| 第二节 基于无毒抗原AFB_1与ZEN时间分辨荧光混合污染检测技术 |
| 3.5 引言 |
| 3.6 材料 |
| 3.6.1 实验仪器及耗材 |
| 3.6.2 主要试剂 |
| 3.7 实验步骤 |
| 3.7.1 纳米抗体phages2-5和phages8#的纯化 |
| 3.7.2 Eu/Tb(Ⅲ)纳米颗粒探针的合成与鉴定 |
| 3.7.3 两种竞争模式的建立与优化 |
| 3.7.4 基于无毒替代抗原混合毒素时间分辨同步检测方法优化 |
| 3.8 结果与讨论 |
| 3.8.1 Eu/Tb(Ⅲ)纳米颗粒与探针的鉴定 |
| 3.8.2 Eu/Tb(Ⅲ)纳米探针偶联条件优化 |
| 3.8.3 两种竞争模式的结果比对 |
| 3.8.4 时间分辨荧光多毒素同步检测技术原理 |
| 3.8.5 基于无毒替代抗原时间分辨荧光检测技术准确度、重复性评价 |
| 3.8.6 玉米实际样品的检测 |
| 3.9 讨论 |
| 3.9.1 抗独特型纳米抗体替代抗原用于电化学免疫传感器 |
| 3.9.2 抗独特型纳米抗体替代抗原用于时间分辨荧光免疫层析技术 |
| 3.10 小结 |
| 第四章 基于适配体展青霉素侧向层析分析方法研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 实验仪器及耗材 |
| 4.2.2 实验试剂 |
| 4.2.3 主要溶液 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 适配体序列及前处理方法 |
| 4.3.2 适配体试纸条的制备 |
| 4.3.3 适配体试纸条原理 |
| 4.3.4 适配体试纸条的检测步骤 |
| 4.3.5 适配体的选择 |
| 4.3.6 适配体检测模式的选择 |
| 4.3.7 适配体浓度的优化 |
| 4.3.8 适配体试纸条条件优化 |
| 4.3.9 适配体检测缓冲液条件优化 |
| 4.3.10 适配体试纸条方法的鉴定 |
| 4.3.11 适配体试纸条检测样品前处理 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 适配体与竞争模式的选择 |
| 4.4.2 生物素-适配体与地高辛-互补链的浓度优化 |
| 4.4.3 适配体试纸条条件优化 |
| 4.4.4 适配体检测缓冲液配方优化 |
| 4.4.5 适配体试纸条的性能参数评价 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 三类生物识别材料用于农产品快速检测的性能比较 |
| 5.1 系列生物识别材料的研制 |
| 5.1.1 两种展青霉素适配体的比对结果 |
| 5.1.2 四类单克隆抗体的筛选结果 |
| 5.1.3 四种单抗与国内外报道同类抗体特性进行比较 |
| 5.1.4 抗独特型纳米抗体的筛选结果 |
| 5.1.5 适配体、单抗、纳抗的研制比较 |
| 5.2 系列生物传感器的开发 |
| 5.2.1 建立的生物传感器涉及到的农产品类别 |
| 5.2.2 建立的生物传感器固定化技术的选择 |
| 5.2.3 建立的生物传感器识别元件的选择 |
| 5.2.4 检测方法的选择 |
| 5.3 农产品中生物传感器发展趋势展望 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（3）粮油黄曲霉与毒素同步检测及木霉阻控技术研究（论文提纲范文）
| 博士学位论文评阅 人、答辩委员会签名表 |
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 黄曲霉毒素概述 |
| 1.1.1 黄曲霉毒素种类及其理化性质 |
| 1.1.2 黄曲霉毒素毒性及其危害 |
| 1.1.3 黄曲霉毒素限量标准 |
| 1.1.4 黄曲霉毒素生物合成 |
| 1.2 黄曲霉毒素检测技术研究进展 |
| 1.2.1 黄曲霉毒素薄层层析及仪器分析技术 |
| 1.2.2 黄曲霉毒素免疫分析技术 |
| 1.2.3 黄曲霉毒素生物传感器分析技术 |
| 1.2.4 黄曲霉毒素噬菌体展示介导免疫PCR检测技术 |
| 1.3 黄曲霉菌检测技术研究进展 |
| 1.3.1 黄曲霉菌概述 |
| 1.3.2 黄曲霉菌检测技术方法 |
| 1.4 黄曲霉及其毒素污染生物防控研究现状 |
| 1.4.1 生防微生物种类 |
| 1.4.2 生物防控作用机理 |
| 1.4.3 生防效果影响因子 |
| 1.5 本课题的研究目的和意义 |
| 1.6 本课题的主要研究内容 |
| 第二章 粮油黄曲霉毒素与玉米赤霉烯酮RT-PCR同步检测技术研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 仪器与耗材 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 主要缓冲液 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 纳米抗体噬菌体扩增 |
| 2.3.2 同步免疫反应条件优化 |
| 2.3.3 双重RT-PCR反应条件优化 |
| 2.3.4 RT-PCR同步检测AFT和 ZEN的技术评价 |
| 2.3.5 实际样品中AFT和 ZEN的 RT-PCR同步检测 |
| 2.3.6 样品中毒素的HPLC法测定 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 RT-PCR同步检测AFT和 ZEN的原理 |
| 2.4.2 同步免疫反应的条件优化 |
| 2.4.3 扩增效率评估 |
| 2.4.4 RT-PCR同步检测AFT和 ZEN的技术评价 |
| 2.4.5 实际样品中AFT和 ZEN的 RT-PCR同步检测 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 包被羊抗鼠抗体IgG的优势 |
| 2.5.2 噬菌体介导的RT-PCR同步检测技术优势及应用前景 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 玉米黄曲霉毒素及其产毒菌RT-PCR同步检测技术研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 仪器与耗材 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 主要缓冲液及培养基 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 纳米抗体噬菌体扩增 |
| 3.3.2 Nor-1参考基因制备 |
| 3.3.3 双重RT-PCR的反应条件优化 |
| 3.3.4 玉米中黄曲霉毒素RT-PCR检测标准曲线建立 |
| 3.3.5 玉米中黄曲霉菌RT-PCR检测标准曲线建立 |
| 3.3.6 黄曲霉毒素检测可靠性验证 |
| 3.3.7 黄曲霉菌检测可靠性验证 |
| 3.3.8 实际样品分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 双重RT-PCR反应条件优化 |
| 3.4.2 双重RT-PCR扩增效率 |
| 3.4.3 RT-PCR检测黄曲霉毒素的技术评价 |
| 3.4.4 RT-PCR检测黄曲霉菌的技术评价 |
| 3.4.5 RT-PCR技术在实际样品中同步检测的应用 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 基于nor-1基因检测黄曲霉菌的特异性和可靠性 |
| 3.5.2 噬菌体介导的RT-PCR同步检测小分子污染物和微生物的优势及应用前景 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 花生黄曲霉及其毒素污染木霉菌阻控技术研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 仪器与耗材 |
| 4.2.2 实验试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 菌株来源及活化 |
| 4.3.2 木霉菌与黄曲霉菌相互作用关系研究 |
| 4.3.3 木霉菌代谢产物对黄曲霉菌生长的影响研究 |
| 4.3.4 木霉菌代谢产物对黄曲霉菌产毒的影响研究 |
| 4.3.5 统计分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 木霉菌与黄曲霉菌生长速率 |
| 4.4.2 木霉菌与黄曲霉菌相互作用关系 |
| 4.4.3 木霉菌代谢产物对黄曲霉菌生长的影响 |
| 4.4.4 木霉菌代谢产物对黄曲霉菌产毒的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 粮油黄曲霉毒素污染木霉菌降解技术研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 仪器与耗材 |
| 5.2.2 实验试剂 |
| 5.2.3 主要溶液和培养基 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 木霉菌株来源及鉴定 |
| 5.3.2 不同木霉菌降解AFB1的能力差异分析 |
| 5.3.3 超高效降解黄曲霉毒素的木霉菌株筛选 |
| 5.3.4 里氏木霉CGMCC3.5218降解黄曲霉毒素的作用机理研究 |
| 5.3.5 里氏木霉CGMCC3.5218 降解实际样品中AFT的应用研究 |
| 5.3.6 统计分析 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 不同木霉菌降解AFB1的能力差异 |
| 5.4.2 超高效降解AFB1的木霉菌株筛选 |
| 5.4.3 里氏木霉CGMCC3.5218降解黄曲霉毒素的作用机理 |
| 5.4.4 里氏木霉CGMCC3.5218降解粮油产品中黄曲霉毒素的应用 |
| 5.5 讨论 |
| 5.5.1 不同木霉菌降解AFB1的能力差异 |
| 5.5.2 里氏木霉CGMCC3.5218对AFB1的作用机理 |
| 5.5.3 里氏木霉CGMCC3.5218的应用前景 |
| 5.6 小结 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）黄曲霉毒素M1两种高灵敏度酶免疫检测方法的建立及其双特异性抗体的制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1黄曲霉毒素M_1的概述 |
| 1.1.1 黄曲霉毒素M_1 的理化性质 |
| 1.1.2 黄曲霉毒素M_1 的危害 |
| 1.1.3 黄曲霉毒素M_1 的限量标准 |
| 1.1.4 黄曲霉毒素M_1 的来源 |
| 1.2黄曲霉毒素M_1检测方法与研究现状 |
| 1.2.1 薄层色谱法(Thin Layer Chromatography,TLC) |
| 1.2.2 高效液相色谱法(High performance liquid chromatography) |
| 1.2.3 免疫分析法(Immunoassay) |
| 1.2.3.1 放射免疫分析法(Radioimmunoassay) |
| 1.2.3.2 酶联免疫吸附方法(Enzyme-linked Immunosorbent Assay) |
| 1.2.3.3 胶体金免疫层析法(Gold immunochromatography assay).. |
| 1.2.3.4 时间分辨荧光免疫分析法(Time-resolved fluorescenceimmunoassay,TRFIA) |
| 1.2.3.5 量子点标记免疫分析法(Quantum dot immunoassay) |
| 1.2.4 化学发光法(ChemiLuminescence,CL) |
| 1.2.4.1 直接标记化学发光 |
| 1.2.4.2 酶联免疫化学发光 |
| 1.2.4.3 电化学发光 |
| 1.3 双特异性抗体的概述 |
| 1.3.1 双特异性抗体的制备方法 |
| 1.3.2 双特异性抗体的应用 |
| 1.4 本课题的研究意义 |
| 1.5 本课题的研究目的与内容 |
| 第2章 黄曲霉毒素M_1 酶联免疫吸附分析方法的建立 |
| 2.1 实验试剂与仪器 |
| 2.1.1 实验主要试剂 |
| 2.1.2 实验器材 |
| 2.1.3 实验所用溶液的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 AFM_1-BSA人工抗原的制备 |
| 2.2.2 最佳抗原包被浓度与抗体工作浓度的确定 |
| 2.2.3 酶标二抗最佳工作浓度的确定 |
| 2.2.4 间接竞争ELISA方法 |
| 2.2.5 标准品配制液的优化 |
| 2.2.6 AFM_1-ELISA标准曲线的建立 |
| 2.2.7 样品提取方法的优化 |
| 2.2.8 样品的加标回收 |
| 2.3 实验结果与分析 |
| 2.3.1 AFM_1 完全抗原的合成结果 |
| 2.3.2 抗原抗体工作浓度的确定 |
| 2.3.3 酶标二抗浓度的优化 |
| 2.3.4 标准品配制液的优化结果 |
| 2.3.5 标准曲线的建立 |
| 2.3.6 样品提取方法的优化结果 |
| 2.3.7 样品的加标回收结果 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 黄曲霉毒素M_1 化学发光酶联免疫分析方法的建立 |
| 3.1 实验材料与仪器 |
| 3.1.1 实验主要试剂 |
| 3.1.2 实验器材 |
| 3.1.3 实验所需溶液的配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 抗原包被浓度的选择 |
| 3.2.2 CLEIA反应体系优化 |
| 3.2.3 标准曲线的建立 |
| 3.2.4 在奶制品中的加标回收测定 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 抗原最佳包被浓度的确定 |
| 3.3.2 抗体最佳结合浓度的确定 |
| 3.3.3 酶标二抗浓度的优化 |
| 3.3.4 离子强度对CLEIA的影响 |
| 3.3.5 PH对CLEIA的影响 |
| 3.3.6 有机溶剂对CLEIA的影响 |
| 3.3.7 CLEIA工作曲线范围的确定 |
| 3.3.8 样品的加标回收 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 黄曲霉毒素M_1 免疫亲和柱-高效液相色谱法的建立 |
| 4.1 实验材料仪器 |
| 4.1.1 实验主要试剂 |
| 4.1.2 实验器材 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 色谱条件 |
| 4.2.2 标准曲线的绘制 |
| 4.2.3 样品的净化 |
| 4.2.4 上样缓冲液的优化 |
| 4.2.5 样品的前处理与加标回收 |
| 4.2.6 实际样品的检测 |
| 4.3 实验结果与分析 |
| 4.3.1 标准曲线的建立 |
| 4.3.2 上样缓冲液的优化结果 |
| 4.3.3 样品的加标回收 |
| 4.3.4 ELISA 、CLEIA与HPLC的方法学比较 |
| 4.3.5 未知奶制品中AFM_1 含量检测 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 抗黄曲霉毒素M_1/抗辣根过氧化物酶双特异性抗体的制备 |
| 5.1 实验材料与仪器 |
| 5.1.1 实验动物与细胞 |
| 5.1.2 实验主要试剂 |
| 5.1.3 实验器材 |
| 5.1.4 实验溶液的配制 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 小鼠免疫 |
| 5.2.2 小鼠血清效价测定 |
| 5.2.3 双特异性抗体的制备 |
| 5.2.3.1 抗AFM_1 杂交瘤细胞的次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)缺陷型细胞的诱导 |
| 5.2.3.2 免疫小鼠脾细胞的准备 |
| 5.2.3.3 细胞电融合 |
| 5.2.4 杂交瘤细胞的筛选与克隆 |
| 5.3 实验结果与分析 |
| 5.3.1 AFM_1-3F12 细胞复状结果 |
| 5.3.2 免疫小鼠血清效价的测定结果 |
| 5.3.3 AFM_1 细胞HGPRT缺陷型的诱导结果 |
| 5.3.4 三瘤杂交细胞的筛选 |
| 5.3.5 三瘤杂交细胞的克隆化结果 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果及所获荣誉 |
| 致谢 |
（5）农产品真菌毒素DNA诱导组装与多色免疫快速检测方法研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 真菌毒素的危害 |
| 1.1.1 黄曲霉毒素的危害 |
| 1.1.2 玉米赤霉烯酮的危害 |
| 1.1.3 T-2 毒素的危害 |
| 1.1.4 真菌毒素混合污染的危害 |
| 1.2 真菌毒素免疫分析方法研究进展 |
| 1.2.1 基于单(多)克隆抗体的分析方法 |
| 1.2.2 基于重组抗体的分析方法 |
| 1.3 真菌毒素前处理方法研究进展 |
| 1.3.1 固相萃取法 |
| 1.3.2 免疫亲和柱法 |
| 1.3.3 分子印迹法 |
| 1.3.4 QuEChERS法 |
| 1.3.5 免前处理检测方法 |
| 1.4 基于DNA调控的均质检测技术 |
| 1.4.1 DNA诱导组装技术 |
| 1.4.2 DNA诱导组装技术在小分子检测中的应用 |
| 1.5 本课题的研究目的和意义 |
| 1.6 本课题的主要研究内容 |
| 第二章 黄曲霉毒素B_1荧光共振能量转移快速检测技术 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 仪器及耗材 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 缓冲液 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 单克隆抗体的制备与表征 |
| 2.3.2 识别探针的制备与表征 |
| 2.3.3 信号探针的制备与表征 |
| 2.3.4 荧光共振能量转移分析方法的参数优化 |
| 2.3.5 黄曲霉毒素B_1-信号响应曲线的建立 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 荧光共振能量转移方法的原理 |
| 2.4.2 单克隆抗体的表征 |
| 2.4.3 识别探针的表征 |
| 2.4.4 信号探针的表征 |
| 2.4.5 荧光共振能量转移分析方法的建立 |
| 2.4.6 黄曲霉毒素B_1-信号对应关系 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 黄曲霉毒素B_1 DNA诱导组装荧光快速检测技术 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 仪器及耗材 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 缓冲液 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 单克隆抗体及DNA探针的设计与制备 |
| 3.3.2 识别元件的制备与表征 |
| 3.3.3 信号元件的制备与表征 |
| 3.3.4 DNA诱导组装荧光检测法的建立 |
| 3.3.5 大米实际样品分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 单克隆抗体表征 |
| 3.4.2 DNA探针的设计 |
| 3.4.3 胶体金表面单克隆抗体标记密度的测定 |
| 3.4.4 信号元件的鉴定 |
| 3.4.5 DNA诱导组装荧光检测法的建立 |
| 3.4.6 大米实际样品分析方法的建立 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 信号元件的设计 |
| 3.5.2 荧光供体和受体之间距离的估算 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 真菌毒素混合污染多色免疫层析同步快速检测技术 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 仪器及耗材 |
| 4.2.2 试剂 |
| 4.2.3 缓冲液 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 胶体金微球的制备及表征 |
| 4.3.2 单克隆抗体的制备及表征 |
| 4.3.3 单克隆抗体标记微球 |
| 4.3.4 多色免疫层析试纸条的构建 |
| 4.3.5 多色免疫层析试纸条的性能评价 |
| 4.3.6 多色免疫层析试纸条在玉米及饲料实际样品中的应用 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 胶体金微球的表征 |
| 4.4.2 单克隆抗体的表征 |
| 4.4.3 微球最适标记pH值的优化 |
| 4.4.4 试纸条的构建 |
| 4.4.5 多色免疫层析试纸条的性能分析 |
| 4.4.6 多色免疫层析试纸条在玉米及饲料实际样品中的应用 |
| 4.5 讨论 |
| 4.5.1 抗体特异性的选择 |
| 4.5.2 多色免疫层析试纸条的应用前景 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（6）抗黄曲霉毒素B1单链抗体FR区的构效关系研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 黄曲霉毒素 |
| 1.1 发现及分布 |
| 1.2 化学结构和理化特性 |
| 1.3 毒性及限量标准 |
| 1.4 常用检测方法 |
| 1.4.1 AFB_1的理化分析法 |
| 1.4.1.1 薄层色谱法 |
| 1.4.1.2 高效液相色谱法 |
| 1.4.1.3 基于理化性质的其他方法 |
| 1.4.2 AFB_1的免疫学分析法 |
| 1.4.2.1 免疫亲和柱法 |
| 1.4.2.2 酶联免疫吸附法 |
| 1.4.2.3 放射免疫测定法 |
| 1.4.2.4 胶体金免疫层析分析法 |
| 1.4.2.5 基于免疫学理论的其它方法 |
| 2 抗体技术的发展 |
| 2.1 抗体的结构与功能 |
| 2.2 多克隆抗体 |
| 2.3 单克隆抗体 |
| 2.4 基因工程抗体 |
| 2.4.1 单链抗体的简介 |
| 2.4.2 基因工程抗体亲和力的成熟 |
| 3 同源建模与分子对接 |
| 3.1 同源建模 |
| 3.2 分子对接 |
| 4 定点突变技术概括 |
| 5 本研究目的意义和内容 |
| 5.1 研究目的和意义 |
| 5.2 研究内容 |
| 第二章 抗AFB_1单链抗体的同源建模及分子对接 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 生物信息软件和数据库 |
| 2 方法 |
| 2.1 抗AFB_1单链抗体2C10的同源建模 |
| 2.1.1 目标序列同源建模模板的搜寻 |
| 2.1.2 目标序列与模板序列的多重序列比对 |
| 2.1.3 同源模型的构建 |
| 2.1.4 同源模型的能量最小化优化 |
| 2.1.5 同源模型结构可靠性的评估与分析 |
| 2.2 抗AFB_1单链抗体2C10三维模型的分子对接 |
| 2.2.1 受体蛋白的准备 |
| 2.2.2 配体小分子的准备 |
| 2.2.3 分子对接 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 抗AFB_1单链抗体2C10的同源建模 |
| 3.2 抗AFB_1单链抗体2C10蛋白模型的分子对接 |
| 3.3 抗体CDR及FR区的划分 |
| 4 小结与讨论 |
| 4.1 小结 |
| 4.1.1 单链抗体的同源建模 |
| 4.1.2 单链抗体与抗原的分子对接 |
| 4.1.3 单链抗体的CDR区和FR区的划分 |
| 4.2 讨论 |
| 4.2.1 同源模板的选择 |
| 4.2.2 抗体基因结构与亲和力的关系 |
| 第三章 抗AFB_1单链抗体2C10突变体的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 溶液配制 |
| 2.1.1 E.coli菌株培养相关溶液 |
| 2.1.2 琼脂糖凝胶电泳相关试剂 |
| 2.2 利用定点突变法制备ScFv-2C10突变体 |
| 2.2.1 重组质粒pET-30a-ScFv-2C10质粒的提取 |
| 2.2.2 定点突变法制备ScFv-2C10突变体 |
| 2.2.3 Dpn I降解模板质粒 |
| 2.2.4 降解模板后PCR产物转化 |
| 2.2.5 菌落PCR验证 |
| 2.2.6 基因测序 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 重组质粒的提取 |
| 3.2 定点突变法制备ScFv-2C10突变体 |
| 3.3 突变体菌落PCR验证 |
| 3.4 基因序列的测定 |
| 4 小结与讨论 |
| 4.1 小结 |
| 4.2 讨论 |
| 4.2.1 Dpn I消化模板 |
| 4.2.2 突变氨基酸的选择 |
| 第四章 抗AFB_1 ScFvs在E.coli BL21(DE3)的表达与性质分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 溶液配制 |
| 2.1.1 E.coli菌株培养相关溶液 |
| 2.1.2 感受态细胞制备相关溶液 |
| 2.1.3 蛋白表达、纯化相关溶液 |
| 2.1.4 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳相关溶液 |
| 2.1.5 考马斯亮蓝测蛋白含量相关溶液 |
| 2.1.6 ELISA相关溶液 |
| 2.2 抗AFB_1 ScFv-2C10及其突变体在E.coli中表达和性质分析 |
| 2.2.1 E.coli BL21(DE3)感受态细胞的制备 |
| 2.2.2 重组质粒蛋白的预表达鉴定 |
| 2.2.3 重组质粒蛋白的诱导表达与纯化 |
| 2.2.4 纯化蛋白的定量分析 |
| 2.2.5 抗AFB_1 ScFvs的性质分析 |
| 2.3 抗AFB_1单链抗体2C10突变体三维模型的分子对接 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 重组质粒蛋白的表达鉴定 |
| 3.2 ScFvs的纯化和定量分析 |
| 3.3 ScFvs的性质分析 |
| 3.4 抗AFB_1单链抗体2C10突变体三维模型的分子对接 |
| 4 小结与讨论 |
| 4.1 小结 |
| 4.1.1 ScFvs的纯化分析 |
| 4.1.2 ScFvs的亲和力分析 |
| 4.2 讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 1 主要结论 |
| 2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录1 VH和VL核苷酸序列 |
| 附录2 分子对接图 |
（7）食品及饲料中黄曲霉毒素的快速免疫检测试剂盒研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩写和符号清单 |
| 1 引言 |
| 2 文献综述 |
| 2.1 黄曲霉毒素简介 |
| 2.1.1 产生 |
| 2.1.2 结构 |
| 2.1.3 理化性质 |
| 2.1.4 急性毒性 |
| 2.1.5 致癌性 |
| 2.1.6 对农业的影响 |
| 2.1.7 限量标准 |
| 2.1.8 污染现状 |
| 2.2 黄曲霉毒素的检测技术 |
| 2.2.1 薄层色谱法 |
| 2.2.2 液相色谱或液质联用法 |
| 2.2.3 免疫分析法 |
| 2.3 黄曲霉毒素抗原合成和抗体制备研究进展 |
| 2.3.1 抗原制备 |
| 2.3.2 抗体制备 |
| 2.4 黄曲霉毒素酶联免疫技术研究进展 |
| 2.5 黄曲霉毒素胶体金免疫层析法研究进展 |
| 2.6 课题研究的目的和意义 |
| 3 黄曲霉毒素抗原合成及抗体制备 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 仪器及耗材 |
| 3.1.2 主要试剂和药品 |
| 3.1.3 实验动物与细胞 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 溶液配制 |
| 3.2.2 AFB_1肟的制备合成 |
| 3.2.3 AFB_1肟的提取 |
| 3.2.4 AFB_1O与载体蛋白的连接 |
| 3.2.5 AFB_1O-BSA鉴定 |
| 3.2.6 免疫程序 |
| 3.2.7 饲养细胞的收集和培养 |
| 3.2.8 细胞融合 |
| 3.2.9 细胞融合后的筛选和扩大培养 |
| 3.2.10 亚克隆 |
| 3.2.11 腹水的制备 |
| 3.2.12 抗体纯化 |
| 3.2.13 抗体鉴定 |
| 3.2.14 单克隆抗体的亲和力测定 |
| 3.2.15 灵敏度及交叉率测定 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 AFB_1肟的制备 |
| 3.3.2 抗原的合成及鉴定 |
| 3.3.3 免疫小鼠血清效价的鉴定 |
| 3.3.4 细胞株筛选 |
| 3.3.5 抗体的制备和鉴定 |
| 3.3.6 与同类型的单抗比较 |
| 3.4 小结 |
| 4 食品及饲料中AFB_1检测试剂盒的制备 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 仪器和耗材 |
| 4.1.2 主要试剂和药品 |
| 4.1.3 溶液配方 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 酶标抗原的合成 |
| 4.2.2 酶标板的制备 |
| 4.2.3 酶联免疫检测步骤 |
| 4.2.4 包被缓冲液的优化 |
| 4.2.5 最佳反应pH值的优化 |
| 4.2.6 抗体包被量、HRP-BSA-AFB_1用量的优化 |
| 4.2.7 标准品稀释液的优化 |
| 4.2.8 标准曲线的建立 |
| 4.2.9 实际样品检测 |
| 4.2.10 特异性测定 |
| 4.2.11 稳定性实验 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 包被缓冲液的优化 |
| 4.3.2 最佳反应pH值的优化 |
| 4.3.3 抗体包被量及HRP-BSA-AFB_1用量优化 |
| 4.3.4 标准曲线的建立 |
| 4.3.5 样品检测限 |
| 4.3.6 准确度和精密度 |
| 4.3.7 交叉反应率 |
| 4.3.8 HPLC-MS/MS与ELISA结果比对 |
| 4.3.9 储存稳定性 |
| 4.4 小结 |
| 5 婴幼儿食品中AFB1检测试剂盒的制备 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 仪器和耗材 |
| 5.1.2 主要试剂和药品 |
| 5.1.3 溶液配方 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 不同模式ELISA的比较 |
| 5.2.2 抗体及酶标抗原用量的优化 |
| 5.2.3 样品提取液的优化 |
| 5.2.4 标准曲线的建立 |
| 5.2.5 实际样品检测 |
| 5.2.6 特异性测定 |
| 5.2.7 稳定性实验 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 三种检测模式比较结果 |
| 5.3.2 一抗及酶标抗原用量的优化 |
| 5.3.3 样品提取液的优化 |
| 5.3.4 标准曲线的建立 |
| 5.3.5 样品检测限 |
| 5.3.6 准确度和精密度 |
| 5.3.7 交叉反应率 |
| 5.3.8 储存稳定性 |
| 5.3.9 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 6 植物油中AFB_1检测卡的制备 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 仪器和耗材 |
| 6.1.2 主要试剂和药品 |
| 6.1.3 溶液配方 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 胶体金的制备 |
| 6.2.2 胶体金的鉴定 |
| 6.2.3 抗体标记的胶体金的制备 |
| 6.2.4 检测试纸条制备 |
| 6.2.5 检测结果的分析 |
| 6.2.6 振荡时间和水/油比的优化 |
| 6.2.7 油中AFB_1的标准曲线测定 |
| 6.2.8 油中AFB_1的回收率测定 |
| 6.2.9 假阴性假阳性实验 |
| 6.2.10 样品验证 |
| 6.2.11 加速实验 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 胶体金制备 |
| 6.3.2 胶体金的鉴定及抗体标记 |
| 6.3.3 检测卡的制备 |
| 6.3.4 可能的检测原理 |
| 6.3.5 样品制备过程的优化 |
| 6.3.6 油中AFB_1的检测标准曲线 |
| 6.3.7 油中AFB_1的回收率测定 |
| 6.3.8 假阴性假阳性实验 |
| 6.3.9 样品验证 |
| 6.3.10 加速实验 |
| 6.3.11 与传统的方法比较 |
| 6.4 小结 |
| 7 AFM_1和AFB_1总量试剂盒的制备 |
| 7.1 材料 |
| 7.1.1 仪器和耗材 |
| 7.1.2 主要试剂和药品 |
| 7.1.3 主要试剂和药品 |
| 7.1.4 溶液配方 |
| 7.2 实验方法 |
| 7.2.1 抗原及抗体的制备 |
| 7.2.2 酶标板的制备 |
| 7.2.3 酶联免疫检测步骤 |
| 7.2.4 二抗、抗体和酶标抗原用量的优化 |
| 7.2.5 标准品稀释液的优化 |
| 7.2.6 标准曲线的建立 |
| 7.2.7 液态奶脱脂和不脱脂的影响测定 |
| 7.2.8 实际样品检测 |
| 7.2.9 与进口试剂盒的检测方法的比对 |
| 7.2.10 稳定性实验 |
| 7.3 结果与讨论 |
| 7.3.1 抗原和抗体的鉴定 |
| 7.3.2 抗原抗体用量的优化 |
| 7.3.3 标准曲线的建立 |
| 7.3.4 液态奶脱脂和不脱脂的影响测定 |
| 7.3.5 样品检测限、准确度和精密度 |
| 7.3.6 与进口试剂盒的检测方法的比对 |
| 7.3.7 稳定性实验 |
| 7.4 小结 |
| 8 结论 |
| 参考文献 |
| 附录A 缓冲液配方 |
| 附录B Bradford法测蛋白含量 |
| 附录C 非变性凝胶电泳操作流程 |
| 作者简历及在学研究成果 |
| 学位论文数据集 |
（9）农产品中黄曲霉毒素新型免疫分析技术研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 农产品小分子污染物免疫检测技术概述 |
| 1.1.1 农产品小分子污染物概述 |
| 1.1.2 小分子污染物免疫检测技术 |
| 1.2 黄曲霉毒素免疫检测技术研究现状 |
| 1.2.1 黄曲霉毒素概述 |
| 1.2.2 黄曲霉毒素免疫检测技术研究现状 |
| 1.3 黄曲霉毒素免疫检测技术发展趋势 |
| 1.3.1 绿色免疫分析方法 |
| 1.3.2 非标记的免疫分析方法 |
| 1.3.3 黄曲霉毒素纳米抗体技术 |
| 1.3.4 免疫分析方法与PCR方法的联用 |
| 1.3.5 免疫分析方法与环介导等温扩增方法的联用 |
| 第二章黄曲霉毒素免疫荧光淬灭效应及分析方法研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 仪器及耗材 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 杂交瘤细胞株及实验动物 |
| 2.2.4 主要缓冲液及培养基 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 抗体制备及纯化 |
| 2.3.2 AFB1荧光及淬灭效应 |
| 2.3.3 荧光增强剂的选择 |
| 2.3.4 基于荧光淬灭效应AFB1免疫分析方法的建立 |
| 2.3.5 基于荧光淬灭效应AFB1免疫分析方法在样品分析中的应用 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 抗体纯化效果鉴定 |
| 2.4.2 AFB_1的自身荧光强度 |
| 2.4.3 AFB_1的荧光淬灭效应 |
| 2.4.4 三种荧光增强剂的荧光增强效果 |
| 2.4.5 荧光增强剂的选择 |
| 2.4.6 基于荧光淬灭效应AFB1免疫分析方法的建立 |
| 2.4.7 样品添加回收测定 |
| 2.4.8 与HPLC方法进行结果对比 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 荧光增强剂的选择 |
| 2.5.2 抗体对黄曲霉毒素荧光淬灭机理 |
| 2.5.3 基于荧光淬灭效应的黄曲霉毒素免疫分析方法应用前景 |
| 2.6 小结 |
| 第三章黄曲霉毒素实时荧光定量PCR免疫分析方法研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 仪器及耗材 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 抗体和菌株 |
| 3.2.4 主要缓冲液和培养基 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 纳米抗体噬菌体V2-5 的扩增 |
| 3.3.2 荧光定量PCR参数优化 |
| 3.3.3 黄曲霉毒素实时荧光定量PCR免疫分析方法的建立 |
| 3.3.4 黄曲霉毒素实时荧光定量PCR免疫分析方法在样品检测中的应用 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 纳米抗体噬菌体V2-5 的ELISA鉴定 |
| 3.4.2 荧光定量PCR参数优化 |
| 3.4.3 黄曲霉毒素实时荧光定量PCR免疫分析方法的建立 |
| 3.4.4 黄曲霉毒素实时荧光定量PCR免疫分析方法在样品检测中的应用 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 抗独特型纳米抗体噬菌体的优点 |
| 3.5.2 黄曲霉毒素实时荧光定量PCR免疫分析方法灵敏度 |
| 3.5.3 基质效应 |
| 3.5.4 黄曲霉毒素实时荧光定量PCR免疫分析方法应用前景 |
| 3.6 小结 |
| 第四章黄曲霉毒素环介导等温扩增免疫分析方法研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 仪器及耗材 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.2.3 抗体和菌株 |
| 4.2.4 主要缓冲液和培养基 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 纳米抗体噬菌体V2-5 的扩增 |
| 4.3.2 引物的设计与选择 |
| 4.3.3 反应条件的优化 |
| 4.3.4 LAMP目视检测方法 |
| 4.3.5 黄曲霉毒素LAMP免疫分析方法的建立 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 引物的筛选 |
| 4.4.2 引物特异性测试 |
| 4.4.3 反应条件的优化 |
| 4.4.4 LAMP目视检测方法 |
| 4.4.5 黄曲霉毒素LAMP免疫分析方法的建立 |
| 4.5 讨论 |
| 4.5.1 LAMP引物设计 |
| 4.5.2 LAMP目视检测指示剂的选择 |
| 4.5.3 黄曲霉毒素LAMP免疫分析方法的灵敏度 |
| 4.5.4 黄曲霉毒素LAMP免疫分析方法的应用前景 |
| 4.6 小结 |
| 第五章全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（10）真菌毒素类高灵敏高通量快速检测方法研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 目录 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 立题背景 |
| 1.2 真菌生物毒素概述 |
| 1.2.1 黄曲霉毒素 |
| 1.2.2 赭曲霉毒素 |
| 1.2.3 玉米赤霉烯酮 |
| 1.2.4 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 |
| 1.2.5 T-2 毒素 |
| 1.3 真菌生物毒素检测技术的研究进展 |
| 1.3.1 仪器分析法 |
| 1.3.2 免疫化学分析法 |
| 1.4 本论文的主要研究工作 |
| 第二章 黄曲霉毒素 B1 单克隆抗体的制备及其 ELISA 检测方法的建立 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与仪器 |
| 2.2.1 药品与试剂 |
| 2.2.2 主要仪器与设备 |
| 2.2.3 主要溶液 |
| 2.2.4 实验动物和细胞 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 AFB1半抗原的设计与合成 |
| 2.3.2 AFB1完全抗原制备 |
| 2.3.3 小鼠免疫 |
| 2.3.4 小鼠血清检测 |
| 2.3.5 单克隆抗体的制备 |
| 2.3.6 单克隆抗体的性质鉴定 |
| 2.3.7 间接竞争 ELISA 方法的建立与优化 |
| 2.3.8 实际样品添加回收试验 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 半抗原的合成与结构鉴定 |
| 2.4.2 完全抗原的鉴定 |
| 2.4.3 动物免疫与检测 |
| 2.4.4 单克隆抗体的性质 |
| 2.4.5 间接竞争 ELISA 方法的建立与优化 |
| 2.4.6 实际样品添加回收试验 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 黄曲霉毒素 M1单克隆抗体的制备及其 ELISA 检测方法的建立 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与仪器 |
| 3.2.1 药品与试剂 |
| 3.2.2 主要仪器与设备 |
| 3.2.3 主要溶液 |
| 3.2.4 实验动物和细胞 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 AFM1半抗原的衍生 |
| 3.3.2 AFM1完全抗原的制备 |
| 3.3.3 小鼠免疫 |
| 3.3.4 小鼠血清检测 |
| 3.3.5 单克隆抗体的制备 |
| 3.3.6 单克隆抗体性质鉴定 |
| 3.3.7 AFM1间接竞争 ELISA 的建立与优化 |
| 3.3.8 实际样品添加回收试验 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 AFM1半抗原的合成鉴定 |
| 3.4.2 AFM1完全抗原的合成鉴定 |
| 3.4.3 小鼠免疫与检测 |
| 3.4.4 单克隆抗体的性质 |
| 3.4.5 AFM1间接竞争 ELISA 的优化 |
| 3.4.6 实际样品添加回收试验 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 赭曲霉毒素 A 单克隆抗体的制备及其 ELISA 检测方法的建立 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与仪器 |
| 4.2.1 药品与试剂 |
| 4.2.2 主要仪器与设备 |
| 4.2.3 主要溶液 |
| 4.2.4 实验动物和细胞 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 赭曲霉毒素 A 免疫抗原合成 |
| 4.3.2 赭曲霉毒素 A 包被抗原制备 |
| 4.3.3 小鼠免疫 |
| 4.3.4 小鼠血清检测 |
| 4.3.5 单克隆抗体的制备 |
| 4.3.6 单克隆抗体的性质鉴定 |
| 4.3.7 间接竞争 ELISA 方法的建立与优化 |
| 4.3.8 实际样品添加回收试验 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 OTA 免疫抗原的鉴定 |
| 4.4.2 OTA 包被抗原的鉴定 |
| 4.4.3 小鼠的免疫与检测 |
| 4.4.4 单克隆抗体的性质 |
| 4.4.5 OTA 间接竞争 ELISA 的优化 |
| 4.4.6 实际样品添加试验 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 玉米赤霉烯酮单克隆抗体的制备及其 ELISA 检测方法的建立 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与仪器 |
| 5.2.1 药品与试剂 |
| 5.2.2 主要仪器与设备 |
| 5.2.3 主要溶液 |
| 5.2.4 实验动物和细胞 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 玉米赤霉烯酮半抗原的设计与合成 |
| 5.3.2 玉米赤霉烯酮完全抗原制备 |
| 5.3.3 小鼠免疫 |
| 5.3.4 小鼠血清检测 |
| 5.3.5 单克隆抗体的制备 |
| 5.3.6 单克隆抗体的性质鉴定 |
| 5.3.7 间接竞争 ELISA 方法的建立与优化 |
| 5.3.8 实际样品添加回收试验 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 ZEN 半抗原的合成鉴定 |
| 5.4.2 ZEN 完全抗原的合成鉴定 |
| 5.4.3 小鼠的免疫与检测 |
| 5.4.4 单克隆抗体的性质鉴定 |
| 5.4.5 ZEN 间接竞争 ELISA 的优化 |
| 5.4.6 实际样品添加实验 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 脱氧雪腐镰刀菌烯醇单克隆抗体的制备及其 ELISA 检测方法的建立 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与仪器 |
| 6.2.1 药品与试剂 |
| 6.2.2 主要仪器与设备 |
| 6.2.3 主要溶液 |
| 6.2.4 实验动物和细胞 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 脱氧雪腐镰刀菌烯醇 DON 半抗原的设计与合成[145, 191, 192] |
| 6.3.2 脱氧雪腐镰刀菌烯醇完全抗原的合成 |
| 6.3.3 小鼠免疫 |
| 6.3.4 小鼠血清检测 |
| 6.3.5 单克隆抗体的制备 |
| 6.3.6 单克隆抗体的性质鉴定 |
| 6.3.7 间接竞争 ELISA 方法的建立与优化 |
| 6.3.8 实际样品添加回收试验[147, 194] |
| 6.4 结果与分析 |
| 6.4.1 DON 半抗原的合成鉴定 |
| 6.4.2 DON 完全抗原的合成鉴定 |
| 6.4.3 小鼠的免疫与检测 |
| 6.4.4 单克隆抗体的性质鉴定 |
| 6.4.5 DON 间接竞争 ELISA 的优化 |
| 6.4.6 实际样品添加实验 |
| 6.5 讨论 |
| 6.6 本章小结 |
| 第七章 T-2 毒素单克隆抗体的制备及其 ELISA 检测方法的建立 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 材料与仪器 |
| 7.2.1 药品与试剂 |
| 7.2.2 主要仪器与设备 |
| 7.2.3 主要溶液 |
| 7.2.4 实验动物和细胞 |
| 7.3 实验方法 |
| 7.3.1 T-2 毒素半抗原的合成 |
| 7.3.2 T-2 毒素完全抗原的合成 |
| 7.3.3 小鼠免疫 |
| 7.3.4 小鼠血清检测 |
| 7.3.5 单克隆抗体的制备 |
| 7.3.6 单克隆抗体的性质鉴定 |
| 7.3.7 间接竞争 ELISA 方法的建立与优化 |
| 7.3.8 实际样品添加回收试验 |
| 7.4 结果与分析 |
| 7.4.1 T-2 半抗原的合成鉴定 |
| 7.4.2 T-2 完全抗原的合成鉴定 |
| 7.4.3 小鼠的免疫与检测 |
| 7.4.4 单克隆抗体的性质鉴定 |
| 7.4.5 T-2 毒素间接竞争 ELISA 的优化 |
| 7.4.6 实际样品添加实验 |
| 7.5 本章小结 |
| 第八章 绿色无毒黄曲霉毒素 B1 免疫检测方法的建立 |
| 8.1 引言 |
| 8.2 材料与仪器 |
| 8.2.1 药品与试剂 |
| 8.2.2 主要仪器与设备 |
| 8.2.3 主要溶液 |
| 8.2.4 实验动物和细胞 |
| 8.3 实验方法 |
| 8.3.1 抗体的纯化 |
| 8.3.2 抗 AFB1单克隆抗体 F(ab')2片段的制备 |
| 8.3.3 F(ab')2片段的纯化 |
| 8.3.4 动物免疫 |
| 8.3.5 间接 ELISA 方法建立 |
| 8.3.6 抗独特型抗体的性质 |
| 8.3.7 添加回收试验 |
| 8.4 结论与分析 |
| 8.4.1 抗体纯化方法 |
| 8.4.2 F(ab’)2 片段的制备 |
| 8.4.3 F(ab’)2 片段的纯化 |
| 8.4.4 ELISA 方法的建立 |
| 8.4.5 抗独特性抗体的鉴定 |
| 8.4.6 实际样品添加回收试验 |
| 8.5 小结 |
| 第九章 适用于现场检测的真菌毒素胶体金试纸条的研制 |
| 9.1 引言 |
| 9.2 材料与仪器 |
| 9.2.1 药品与试剂 |
| 9.2.2 主要仪器与设备 |
| 9.2.3 主要溶液 |
| 9.3 实验方法 |
| 9.3.1 金纳米粒子的制备 |
| 9.3.2 标记抗体反应 pH 的优化[207-209] |
| 9.3.3 标记抗体用量的优化 |
| 9.3.4 T（test）线包被浓度的优化 |
| 9.3.5 多重试纸条金标抗体用量的优化 |
| 9.3.6 试纸条的组装 |
| 9.3.7 实际样品的检测 |
| 9.4 结论与分析 |
| 9.4.1 金纳米粒子的表征 |
| 9.4.2 标记抗体反应 pH 的优化 |
| 9.4.3 标记抗体用量的优化 |
| 9.4.4 T 线包被浓度的优化 |
| 9.4.5 多重试纸条金标抗体用量优化 |
| 9.4.6 实际样品的检测 |
| 9.5 讨论 |
| 9.6 本章小结 |
| 主要结论 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 作者在攻读博士学位期间发表的论文与专利 |
四、抗黄曲霉毒素M_1的单克隆抗体细胞株的建立（论文参考文献）
- [1]黄曲霉毒素B1单克隆抗体的制备及其在中药材污染快速检测中的应用[D]. 蒋佳伊. 江苏大学, 2020(02)
- [2]农产品典型真菌毒素生物识别材料与快速检测方法研究[D]. 唐晓倩. 中国农业科学院, 2020
- [3]粮油黄曲霉与毒素同步检测及木霉阻控技术研究[D]. 任显凤. 中国农业科学院, 2020
- [4]黄曲霉毒素M1两种高灵敏度酶免疫检测方法的建立及其双特异性抗体的制备[D]. 李敏. 江西科技师范大学, 2019(02)
- [5]农产品真菌毒素DNA诱导组装与多色免疫快速检测方法研究[D]. 许琳. 中国农业科学院, 2018(08)
- [6]抗黄曲霉毒素B1单链抗体FR区的构效关系研究[D]. 蔡霞. 华中农业大学, 2016(05)
- [7]食品及饲料中黄曲霉毒素的快速免疫检测试剂盒研究[D]. 孙清. 北京科技大学, 2017(05)
- [8]黄曲霉毒素M1单克隆抗体的制备及其免疫学特性研究[J]. 王勇. 大众标准化, 2016(04)
- [9]农产品中黄曲霉毒素新型免疫分析技术研究[D]. 雷佳文. 中国农业科学院, 2015(01)
- [10]真菌毒素类高灵敏高通量快速检测方法研究[D]. 张勋. 江南大学, 2014(12)